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Lieber User,

keine Garantie auf Vollständigkeit. Der Foliensatz Gentechnologie ist in dieser Arbeit
nicht berücksichtigt. Verwendung auf eigene Gefahr. Bei Rückfragen Emrah Eroglu.
a0557348@unet.univie.ac.at kontaktieren. Alleinige Nutzung der Fragen wird nicht
empfohlen da manches bei der Prüfung auch zu zeichnen ist. Jeder ist eingeladen
diese Arbeit zu verbessern. Würde mich freuen wenn diese Arbeit jemand den
Lernaufwand erleichtert.
Viel Erfolg bei der Prüfung.

Kontrollfragen:

1. Wie kann man Hfr isolieren und was sind Hfr, in welcher Rate kommt das vor,
welche Konsequenzen haben Hfr für Rezipienten, wie entstehen Hfr?

 Hfr sind High frequency of Recombination, dabei ist das Plasmid in das Chromosom integriert
 Kommt sehr selten vor, 10^-5
 Mann kann Hfr isoieren, indem man eine F+ a-b- mit einer F-c-d- auf ein Minimalmedium abstempelt,
dort wo Kolonien gewachsen sind, war auf der Masterplatte ein Hfr, so kann man anreichern.
 Hfr können Allele weitergeben, oder auch nicht, nicht aber die Fertilität.
 Hfr entstehen durch Rekombination von IS Stellen am Genom und am Plasmid, die HR.

2. Was ist der Unterschied zwischen groben und feinen Genmapping?


 Beim groben Genmapping werden eine F+ a+b+c+d+str- mit einer F-a-b-c-d-str+ Stämme gemischt
 Die Konjugation wird in bestimmten Zeitabständen durch starkes Schütteln unterbrochen und auf
Selektivplatten ausgestrichen
 Anahand der gewachsenen Kolonien kann man bestimmen ob die Marker aufgenommen worden sind
oder nicht, daher kann so die Reihenfolge der Marker bestimmen.
 Beim feinen Genmapping geht es mit der zeitlichen Disruption nicht, daher wird eine andere Methode
verwendet, die Crossing Over Rate wird bestimmt. Annahme wieder die selben Stämme wie oben. Nach
ca 25 min wird die Konjugation unterbrochen und die Flüssigkultur auf eine Selektivplatte ausgestrichen,
bei der eines der genannten AS fehlt. Dies wird mit alles AS gemacht, und aus dieser Masterplatte wird
auf die anderen Selektivplatten abgestempelt. Anhand der wachsenden Kolonien wird eine Statistik
gezogen, die erlaubt die Rekombinationsrate zu bestimmen.
 Konkret geht das so, dass wenn A und B näher zusammen sind, dann werden sie eher gemeinsam
ausgetauscht und bilden mehr Kolonien auf der Drop out Platte. Je weiter die Marker, umso weniger
Kolonien auf der Drop out Platte.

3. Erkläre das Konzept von F´, welche Vorteile hat es, wie kommt es dazu?

F´ entstehen, wenn in Hfr Zellen das Plasmid sich aus dem Genom wieder entfernt, bzw ausschneidet.
Dies geschieht auch durch homologe Rekombination. Allerdings kann es passieren, dass bei der
Rekombination nicht die IS Stellen des Plasmids und des Genoms miteinander Reagieren, sondern
ähnliche Stellen in der Nähe von der eigentlichen IS Stelle. Da kann es passieren, dass naheliegende
Gene vom Host mitgenommen werden. Wenn keine essentiellen Gene vom Plasmid verloren gehen,
kann das Plasmid normal weiter arbeiten.
Dieses Phänomen wird in der Biotechnologie gebräuchlich gemacht, indem man derartige Bibliotheken
erstellt. Es gibt international Bestellbare Bibliotheken von F´. Sie sind sehr effizient in der Anwendung
und leicht zu transferieren. Praktisches Anwendungsbeispiel ist Lac-.

4. Was ist sythetic Lethality, oder synthetischer Phänotyp und synthetic


deficiency?

Synthetic lethality arises when a combination of mutations in two or more genes leads to cell death,
whereas a mutation in only one of these genes does not.
5. Wie kommt es zu Mutationen, was sind auxotrophe, was prototrophe, was hat
Lederberg und Tantum endeckt, was sind permissive und Restriktive
Temperaturen?

Mutationen können spontan 10^-7 oder chemisch induziert 10^-2 vorkommen. Auxotrophe sind Mutanten
die nicht in der Lage sind, mindesten eine essentielle AS selber zu synthetisieren. Die AS muss in das
Medium zugegeben werden. Screenen kann man auf diese Mutanten indem man eine Drop out Platte
macht, mit einer fehlenden AS. Prototrophe sind MO die alle AS die sie brauchen selber synthetisieren
können.
Lederberg und Tantum haben durch zwei auxotrophe Mutantenstämme die jeweils auf einem
Minimalmedium nicht in der Lage sind zu überleben zusammen gemischt und ausplattiert, dabei
beobachtet, dass sich Kolonien formen. Ein Beweis für gegenseitigen Genaustausch.

6. Erkläre direktionalen Gentransfer, welche Auswirkungen hat Acridinorange,


wie wird aus einem Rezipienten ein Donor?

Gene können nur vom Donor + zum Rezipienten – übertragen werden. Der Ablauf ist immer in eine
Richtung. Donoren sind dabei Fertile MO die einen Fertilitätsfaktor tragen. Um auf den Empfänger zu
screenen muss der eine AB-Marker haben, der F+ nicht.
Acridinorange interkaliert mit der DNA und verhindert die Fertilität. Donoren verlieren ihre Gabe,
während mit Rezipienten nix passiert.
Aus einem Rezipienten kann ein Donor werden, wenn in der ersten Runde der Rezipient wie gewohnt
Allele vom Donor erhält und selber zum F+ wird. Dieser neue F+ kann mit einem Stamm vermsicht
werden, der auf ein anderes AB resistent ist, aber auf einen Marker minus ist.

7. Wie groß ist ein Episom, was alles beinhaltet sie, welche Eigenschaften hat
sie und wie kann man dessen Präsens physikalisch bestimmen?

Größe von 1000 bis 10^5 bp. Episom hat einen Ori, AB Gene, Gene für die Aufrechterhaltung seines
Systems wie zur Pilibildung, Infektionen ect.
Allgemeine Eigenschaften sind, dass sie infektiös ist, die F+ kann auf anderen Übertragen werden.
Fertilität geht damit nicht verloren und ist Replikativ. Geht nur durch Acridinorange verloren. Fertile
werden F+ und Rezipienten F- genannt. Fertilität ist vererbbar.
Die Präsens kann man durch Dichtegradientenzentrifugation messen, muss aber allerding dafür das
Bakteriem S.Mercenses verwenden, weil hier das Wirtsgenom von der Dichte her ein wenig weniger ist,
als das Plasmid. Mit E.Coli würde das nicht funktionieren.

8. Welche Phagen können welche Bakterien befallen, warum?

Die Phagen M13 und fd können Fertile MO befallen weil diese Phagen darauf beschränkt sind, den Pilus
zu erkennen. Daher werden nur männliche Angegriffen.

9. Erkläre Rolling circle Replication.

RCR ist eine Strategie der Replikation, die von Plasmiden und Phagen verwendet wird. Dabei wird an
nur einem Strang ein Nick eingefügt, von einer sogennanten Nickase (Tra1). Das Protein bleibt am
5´Ende kovalent gebunden und assoziiert mit der Zellwand. Am 3´OH Ende kann nun eine
Polymerisierung der DNA erfolgen. Das Protein transloziert die DNA in das F- bis es am OriT ankommt,
wo die RCR stoppt. Die Ligiation und der Schnitt wird ebenfalls vom Tra1 übernommen, auch im
Rezipienten. Im Rezipienten wird die ssDNA per Okazaki Fragementen vervollständigt. Während im
Donor über die freie 3´OH eine permanente Synthese stattfindet.

10. Die drei mendelischen Regeln und Bedeutung, Ausnahmen, was waren
Mendels explizite Erfindungen, und was war der Schlüssel zum Erfolg.

Uniformitätsregel: Kreuzt man zwei unterschiedliche Individuen die jeweils Homozygot sind, so sind die
Nachkommen alle gleich in Bezug auf ihr Genotyp und Phänotyp. Also Uniform, und Heterozygot.
Spaltungsregel: Kreuzt man nun diese genannten Nachkommen, so stellt sich eine Aufspaltung der
Merkmale in einem Verhältnis von 3:1 ein, wenn es sich um eine Doninant/rezessiven Erbgang handelt.
Intermediärer Erbgang, wo beide Merkmale gleich stark zum Ausdruck kommen, werden in einem
Verhältnis von 1:2:1 beobachtet.
Spaltungsregel: Zwei Merkmale werden unabhängig von einander Vererbt. Bsp Ohrenlänge und
Fellfarbe. In der F2 Generation können hier wieder Homozygote auftreten.
Problem: UR gilt nur für genetisch nicht verkoppelte Gene. Zwei Gene sind dann nicht genetisch
gekoppelt, wenn sie unter 50 cm liegen. 1 cM bedeuted, (Centi Morgan) dass die Wahrscheinclihekeit 1
CO pro Meiose beträgt.
Seine Erfindungen: Es existieren Gene, die abzählbare Einheiten darstellen. Eltern haben zwei Alle von
Jedem Gen , wenn sie Diploid sind. Gameten tragen ein Allel, das mit 50% P vorkommt.
Er hatte Glück weil er die Erbse als Modellorganismus verwendete. Die Merkmale sind alle Monogen,
daher sie sind von einem einzigen Lokus abhängig. Er legte große Versuchsreihen an, gute Statistik.
Konnte vor Fremdbestäubung schützen. Pflanzen sind eigenhäusig, die männlichen und weiblichen
Parts sind getrennt. Kann sich selber, oder auch durch Fremdbestäubung fortpflanzen.

11. Erkläre den Vorgang der natürlichen Transformation und den Mechanismus
der der Elektroporation und der chemischen Transformation zugrunde liegt.

Am Beispiel einer gram neg. Bakteriums. Es gibt auf der Oberfläche des Bakteriums vier bis sechs
Erkennungsstellen an die die DNA bindet. Ein Strang wird abgebaut und nur eines gelangt ins
Cytoplasma. Es kommt zur homologen Rekombination an der passenden Stelle und der Strang im
Genom wird abgebaut. Kommt es nun zur Teilung der Zelle, hat eines der Tochterzellen die
aufgenommene DNA, während die zweite der ursprünglichen Mutterzelle ident ist.
Elektroporation wird der Flussigkultur ein Stromschlag gegeben, dass transiente Löcher in die Zellwand
bringt, die umliegenden Plasmide die in hoher Zahl vorkommen, können in die Zelle diffundieren. Dabei
wird der Bilayer, der eine eigene elektrischen Ladung durch die Hydrophilen Köpfe und Lipophielen
Schwänze hat, beim Stromschlag verändert, das die Konformation des Bilayers beeinträchtigt. Ähnlichen
Effekt haben die Bivalenten Ionen wie Kalzium und Magnesium. Es kommt immer zur Ladungsänderung
der Membran, sodass die Konformaiton des Bilayers verändert wird.

12. Wie kann man den PFU Wert bestimmen?

PFU bedeutet, Plaque forming unit. Mit der Anzahl der Plaques kann man den Phagentiter in einer
Probe bestimmen. Dazu nimmt man ca. 200 nichtinfizierte Zellen und gibt die Phagen dazu um zu
amplifizieren. Danach zentrifugiert man das ganze und nimmt das Phagenlysat ab. Damit werden
Verdünnungsreihen gemacht (etwa 1:10). Mit diesen Verdünnungsreihen werden 10^7 saubere Zellen
infiziert und auf eine Platte ausgestrichen. Die Menge der Zellen und die Nährstoffe im Medium sollten
so ausgewählt sein, dass sich die Bakterien nur bestimmte male Teilen können. Nicht zu oft. Überall dort
wo nun Spots entstehen, war ein einfiziertes Bakterium das von einer Phage befallen war. Diese teilte
sich und die Phage ebenso und befallte die Nachbarbakterien, bis der Wachstum zu ende war. Anhand
der nun entstandenen Plaques kann man über die Verdünnung rückschließen wie viel Phagen in der
Probe waren.

13. Bei einer Superinfektion können sich zwei mutierte Phagen gegenseitig durch
Verwendung der zellulären Maschinerie über HR Rekombinieren und bilden
auf der Platte einen Phänotyp. Erkläre wie das abläuft?

Von einer Superinfektion spricht man, wenn ein Bakterium von mehreren Phagen, bis zu 10 auf einmal
befallen wird. Unterschiedliche Phänotypen wie große/kleine, klare/trübe Plaque kann durch
Rekombination der Phagen in der Zelle entstehen. Meist kommen aber nur wenige Phänotypen zum
vorschein, +/+.

14. Welche Bakterienstämme eignen sich für die Phagengenetik besonders gut
und warum? Wofür werden die einzelnen Stämme verwendet? Was suggeriert
das Vorkommen von mehr +/+, also je mehr +/+ bedeutet, dass…

In der Phagengenetik werden die Bakterienstämme E.c.B und E.c.K verwendet. B Stämme haben die
Eigenschaft, dass sie eine tRNA Mutation tragen und der Phage erlauben, trotz Mutation die volle Länge
an Protein zu translatieren. Sie erkennen keine UGA oder andere Stopcodons.
K Stämme hingegen erlauben nur Wildtypen zu wachsen. +/+, daher eignet sich der B Stamm für die
amplifikation der Phagen und der K Stamm für die Selektion auf +/+
Je mehr +/+ auf einer K-Platte vorkommen desto weiter die beiden Gene voneinander entfernt.

15. Was war Benzers Entdeckung und womit arbeitete er? Benzer führte den
Begriff Cistron ein, was ist denn das?
Benzer war ein toller Mann, er hatte einen Umhang an,.. nein Scherz bei seite.
Benzer arbeitete mit Phagen die eine rII Mutation hatten. Er konnte durch komplementierungstest die
Phagengene auf ein tripplet genau kartieren. Cistron ist eine feinere Beschreibung von Gen, und
bedeuted, dass dieses Gen keine weitere Komplementation zulässt.

16. Benzer kreuzte die Mutanten 8, 17, 21 und 26 durch Superinfektion


gegeneinander, mit dem Lysat infizierte er E.c.B und E.c.K und kam auf
folgende Werte über Crossing Over Raten. Was haben diese Zahlen zu
bedeuten?

8 17 21 26
8 1,3 1,0 0,7
17 2,2 0.7
21 1,9
26

Diese Zahlen geben die Rekombinationshäufigkeiten an. Anahnd der Daten kann man eine Genkarte
erstellen. Die Reihenfolge der Gene wäre in diesem Fall 17 26 8 21

17. Benzer entdeckte auch, dass es Mutationen gibt, die mit anderen Allelen nicht
Rekombinieren, daher sind das wohl Deletionen gewesen. Skizziere die
Reihenfolge der Gene nach dieser Rekombinationshäufigkeit.

8 17 21 26 X Y Z
8 1,3 1,0 0,7 0,5
17 2,2 0.7 0,4 0,9
21 1,9 0,6 1,4
26 0,1
X
Y
Z

Besser auf die Folien schauen, dann kommt man drauf.

18. Annahmen es sei der Lokus rIIA und rIIB. In einem Fall führen wir eine
Superinfektion durch wobei sich A-/B+ und A-/B+ ergibt, im zweiten Fall haben
wir A-/B+ und A+/B-. Diese Kombinationen wachsen auf E.c.K, welches
komplementiert und warum? Weitere Annahme dass die Mutationen in einem
Fall rezessiv, und im anderen Fall dominant sind, was passiert.

A-B+ und A-B+ wird nicht komplementieren und stirbt ab, weil kein funktionelles Protein codiert wird,
dass ggf. den Schaden decken könnte. Im zweiten Fall wird wohl eine Komplementation passieren, weil
zumindest je ein funktionelles Protein codiert wird. Aber das ganze funktioniert immer nur dann, wenn
die Mutationen rezessiv sind, dominanten Muationen werden nicht komplementiert.

19. Wenn die Marker a und b zunahe beieinander sind, ist es sehr schwer zu
identifizieren ob – oder +. Da hilft ein einfacher Rezessiv/dominant-Test. Wie
geht man vor?

Man führt eine Superinfektion durch und nimmt das Lysat. Dies wird nun mit ca 1000 Zellen gemischt
und auf eine E.c.B und E.c.K Platte ausgestrichen. Wie gewohnt wachsen auf B alle Zellen, auf K nur
WT Zellen. Ist das der Fall, geht es weiter mit dem nächsten Schritt.
Im zweiten Fall macht man eine Superinfektion von ca 100 E.c.K Zellen und streicht sie direkt aus,
kommt es zur Komplementation, so wachsen alle Kolonien auf der Platte, kommt es zu keiner
Komplementation aufgrund der dominanz der Mutation, so wächst keine einzige Kolonie auf der Platte.
Damit wäre geklärt ob die Mutationen rezessiv oder dominant sind.
20. Erkläre den Infektions und Lysezyklus von P22. Welche Mechanismen wendet
die Phage an, über Erkennung des Bakteriums bis hin zur Replikation? Sechs
Schritte.

Phage bindet an O Antigen an der Bakterienoberfläche. Ds Lineare DNA wird eingeschleust ins
Cytoplasma. Dort werden die homologen Enden der DNA miteinander rekombniert, es resultiert ein
ringförmiges DNA. Nun kommt es zur Theta Replikation, etwa 20 Kopien. Danach werden frühe mitlere
Gene exprimiert,  Phagenbestandteile. Replikation der DNA geht weiter mit RCR, es bildet
concatemere DNA. Mehrere DNA auf einem einzigen Strang. Jetzt wird die DNA in den Phagenkopf
verpackt und geschnitten. Wenn der Kopf augefüllt ist, kommen Spikes dran, Reifung und Lyse. 100-200
Phagen pro Zyklus.

21. Wie erfolgt der Assemblierungspathway der Bakteriophage P22.


Coat, Pilot, Portal und Scaffold Proteine bilden das Kapsid, die Scaffoldproteine werden abgebaut und
die concatemere DNA wird in den Kopf eingeschleust, das Portal wird mit Tailspikes assoziiert und die
Phage ist infektiös.

22. Die P1 Phage kann im Zuge der Transduktion Wirtsgenom mitnehmen, warum
macht sie diesen Fehler? Wieviel kann sie max. mitnehmen?
Sie kann das, weil sie schlampig ist, anstatt der pac Site erkennt sie ähnliche Sequenzen und packt
damit Wirts DNA mit. Ob die mitgenommenden DNA nun dominant oder rezessiv sind, kann getestet
werden indem ein Bakterium damit infiziert wird und anschließend Selektiert auf den Marker. Co
Transduktion kommt vor wenn die Gene nahe beieinander liegen, unter 100 kb entfernung. Je näher die
Gene beieinander, umso eher die Co Transduktion. Bei einem Zyklus können bis zu 120 kb
mitgenommen werden.

23. Wie kann man testen ob die Phage Wirtsgenom mitgenommen hat? Erkläre
das Transduktionsprotokoll.

WT Donoren werden mit P1 infiziert (thr+, leu+, ile, val+)


Mit dem Lysat werden Rezipienten die auf die genannten AS – sind gemischt und Lyse abgewartet
Lösung wird auf eine Masterplatte (ohne eines der AS) ausgestrichen, worauf Kolonien wachsen.
Aus der MP wird auf jede AS eine Drop out Plate gemacht.
Das Verhältnis der Kolonien wird paarweise von zwei AS erstellt.
Die prozentualen Ergebnisse entsprechen der Distanz der Gene.

24. Wofür eignen sich P1 und P22 und wofür Lambda?

P1 und P22 für Generelle Transduktion Genomstücke werden zufällig vom Phagen aufgenommen,
Lambda für spezielle Transduktion, bestimmte Regionen des Genoms gehen mit.

25. Lambda hat zwei Lebenszyklen, welche, wann und wie kommt das zustande,
welche Proteine spielen eine wichtige Rolle, erkläre die Insertion der Phagen
DNA. Welche Proteine codieren frühe und späte Gene?

Lambda Phage kann Lytisch oder Lysogen vorkommen. Im lytischen Fall kommt es zur sofortigen Lyse
des Bakteriums nach der Infektion. Es werden early Genes translatiert und transkribiert, im nächsten
Schritt werden die Phagen DNA repliziert und die late Genes transkribiert, zusammengepackiert,
maturiert und lysiert.
Im Lysogenen ist es so, dass so genannte cI Proteine als einzige Proteine exprimiert werden, sie
repprimieren alle anderen Gene und verhindern die Lyse. Bei der Teilung der Bakterienzelle werden die
integrierten Virengenome mit in die Tochterzelle vererbt. Bei Stress, bsp UV löst SOS Response aus,
wird cI durch Rec A abgebaut und die anderen Gene werden translatiert. Es kommt zur Synthese von
Phagenbestandteilen und schließlich zur Lyse. Dafür werden nach Abbau der cI die Proteine Int und
Xist exprimiert, die die DNA aus dem Wirtsgenom rausschneiden. Danach werden frühe und mittlerer
Gene transkribiert um Phagenbestandteile zu produzieren.
26. Erkläre die Aktivierung von RecA und die Konsequenzen davon.
RecA wird aktiviert um den Lyseprozess zu aktivieren, denn RecA degradiert die c1 Proteine. Das SOS
System wird vom Repressor LexA ruhiggestellt. Kommt es zum Damage wo ein Signal ausgelöst wird,
wird LexA von RecA-Coprotease gespalten und die nachfolgenden Gene unteranderem auch RecA
werden zur transkription frei gesetzt. Solange bis das Signal, bsp T-Dimer repariert ist. Bis dahin wird
RecA-Co Protease transkribiert und spaltet LexA. Wenn Signal weg ist, ist wieder SOS Response ruhig
gestellt
Wie wird Rec A coprotease aktiviert? Wenn die DNA durch UV stark beschädigt wird, kommt es zur
einzelstrangbildung, an dem die RecA binden kann, und das ist der Punkt, hiert wird die Proteaseaktivität
frei und ermöglicht die Spaltung des LexA Repressors. Der Punkt ist, das RecA an Einzelstrang DNA
bindet. Net vergessn.

27. Welche Gene hat die Phage Lambda in seinem Genom?

Einerseits braucht es ein Gen für den Lysogenen Lebenszyklus, das c1 Gen. Um in den
lytischen Prozess zu wechseln muss es sich aus dem Wirtsgenom ausschneiden können,
daher Lamnda Int und Xis.

28. Erkläre den Infektionszyklus von Lambda.

Lambda erkennt eine Erkennungsstelle an der Oberfläche des Bakteriums


Dort sticht sie die DNA ein. DNA wird über ein Zuckertransportkanal ins Cytoplasma transportiert
Die lineare DNA hat an den Enden COS Sequenzen die Rekombinieren, Ligase macht Ring aus der
DNA. Jetzt kommt eine Gyrase vom Wirtsgenom und macht einen neg. Coil in die Phagen DNA
Das löst bei der DNA die dehybridisierung aus, es kann nun an der DNA die mittleren early Genes
abgelesen werden wobei N und cro Gene exprimiert werden.
Cro bindet an OR3 um die expressio von c1 zu verhindern.
N bindet an Nut stellen, das verhindert den Stop der Transkription und verlängert das Transkript.

cII schaltet den Lysogenen Pathway an, ist es nicht vorhanden, geht Phage in die Lyse. Viel cAMP ist
vorhanden wenn es der Zelle schlecht geht, cAMP ist ein Messenger wodurch eine Protease gehemmt
wird, das in weiterer Folge cII stabilisiert.

29. Erkläre die Site specific Recombination zwischen Lambda und


Wirtschromosom.

Lambda Genom brauch das sogenanne Int Protein, das von Int Gen transkribiert wird für die Integration
in das Wirtsgenom. Für das ausschneiden, wenn es in den lytischen Weg einschlagen möchte, braucht
es auch den Int, aber noch zusätzlich das Xist Protein.
Manchmal kommt es vor, dass beim Ausschneiden an anderen Stellen es zu Exision kommt, dabei wird
Wirts-DNA mit genommen statt die eigene. Wenn die Int Gene dabei nicht verloren gehen, kann der
Phage das Genom in ein anderen Wirtsgenom einpacken, aber sich nicht mehr selber ausschneiden,
wenn kein Xist Gen mehr da ist, daher braucht sie einen so genannten Helfer Phagen, der die Xist zur
verfügung stellt.

30. Wie kommt es zur Rekombination von Wirts-DNA und Phagen-DNA

Auf sogenannte attB (BOB) bei E.Coli und attP (POP) bei Lambda. In der O Stelle ist eine 15 bp Region
wo es zur tatsächlichen Crossover kommt, die anderen beiden Stellen neben O sind für homologe
Rekombination verantwortlicht. Kathalysiert wird das ganze über die Integrase. Fehlt das attB, so kann
mit einer geringeren Affinität an einer ähnlichen Stelle rekombiniert werden.

31. Nenne einige Rekombinasen und zu welchem System sie gehören.

Int gehören zur Bakteriophage Lambda bindet an attB


Cre gehören zur P1 bindet an loxP
Flp
Diese genannten Proteine sind Site specific recombinases. Das cre/lox System ist in der Gentechnologie
ein weit verbreitetes Werkzeug geworden. Beide haben katalytische Tyrosine.

32. Topoisomerasen und Rekombinasen arbeiten ähnlich, erkläre wie.

Es kommt immer zu einem nucleophilen Angriff von OH auf P.


Im ersten Schritt greift das freie OH des Tyrosins an die Phosphodiesterbrücke der DNA
Dann kommt es zur Rotation, -ve oder +ve coil
Schließlich greift die freie OH der DNA an den P-Tyr Bindung und der DNA Strang ist wieder ligiert
Int Proteine arbeiten ähnlich wie Topoisomerasen. Int ligieren die DNA aber cis, anstatt in trans wie es
die Topoisomerasen der Klasse I machen.

33. Worauf basiert die Gatewaye Technologie?

System dahinter ist, das attB und attP System bei der Rekombination von Lambda und E.Coli Genom.
Die Spezifität ist durch die kurze Basenfolge von 7 Nc.
Mit dieser Technologie erspart man sich das Verdauen und Ligieren und ausserdem ist die Technik sehr
zuverlässig. Es gibt vier Klassen von att´s : attB, attL, attR, attP
ccdB Gene erlauben negativkontrolle.
attB und attP Reagieren gemeinsam mithilfe von BP Clonase.
Es gibt att-B, -P, -R, -L sites. Nur bestimmte können mit seinem kompatiblen Gegenstück interagieren
und reagieren. Mit Hilfe dieser Kombination kann man simultan mehrere, bis zu vier Gene gleichzeitig in
einen Vektor klonieren und schließlich eine positiv, sowie eine negativ Probe durch führen. Die
Rekombinationseffizienz nimmt mit zunehmender Anzahl der Gene ab.

34. Welche Probleme treten bei der Co-Transfektion auf?


Probleme bei Co-Tranfektion: Man hat bsp zwei Plasmide, auf denen zwei unterschiedliche Genprodukte
mit unterschiedlichen Farben wie mRFP und EGFP markiert sind und man macht eine Co-Transfektion
bei einer tierischen Zelle. Abhängig davon welches Protein exprimiert wird, kommt es zur
entsprechenden Floureszenz. Problem ist aber, dass manche Zellen die eine, andere Zellen die anderen
Vektoren und noch andere beide Plasmide aufnehmen und dementsprechen ein falsches Signal liefern.
Daher verwendet man Gateway um das Problem zu verhindern. Beide Fusionsproteine sind auf einem
Plasmid und kann bei Mikroskopie voneinander unterschiedliche angeregt werden.

35. Was versteht man unter Red alpha und Red beta Genen?

Das recombineering System kommt auch vom Lambda Phagen. Redalpha/Redbeta initiate double-
stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Red alpha Beta sind 5´-
3´Exonuclease/annealing Proteine.
Mechanismus der Rekombination: dsDNA wird von Red-alpha 5´-3´ Verdaut. Das ssDNA wird von Red-
beta gebunden und dies führt zur Stranginvasion.
Je größer der homologe Arm für die Rekombination, umso wahrscheinlicher die Rekombination.

36. Wie kann man das Subklonieren von längeren Genstücken bewerkstelligen?

Dazu verwendet man Primer, die Homolog zu bestimmten Stellen auf dem Zielvektor sind. Die Primer
synthetisieren gegenläufig und Enden als Produkt eines linearen Fragments. Die homologen Stellen
interagieren mit dem Zielvektor und es kommt zum Replacement. Diese Methode ist notwendig für BAC
Libraries. BAC sind Baterial Artifical Chromosomes. Darin kann man eucaryotischen DNA verpacken. In
BAC kann man große DNA Stücke, bis zu 300 kb aufnehmen
BAC´s enhalten P1/loxP Stellen für die Rekombination und einige Restriktionsstellen
Und weil das ganze so effizient ist, kann man das ganze automatisieren. Auf Titerplatten befinden sich
dann viele verschiedene Plasmide in jeder Kammer.

37. Aus welchen Bausteinen besteht die DNA? Ribonucleotid reductasen?

Pyrimidine: Cytosin, Thymine


Purine: Adenin, Guanine
Ribonucleotidreductasen führen am wachsenden DNA Strang am letzen Nucleotid eine
Reduktiosreaktion durch, so dass aus einem Ribonucleotid eine Desoxyribonucleotid wird.

38. Was zeigt das pulse chase experiment?

Mit diesem Experiment kann man bestimmen, ob die Replikation direktional oder bidirektional verläuft.
Anfangs wird der Reaktion markierte Nc zugegeben und später nichtmarkierte. Durch allmähliche
Abnahme der Intensität des Signals kann man bestimmen in welcher Richtung die Replikation verläuft.

39. Wie erfolgt die Termination in zirkulären Chromosomen, welche Proteine sind
involviert, was ist die Aufgabe der Proteine?
Because bacteria have circular chromosomes, termination of replication occurs when the two replication
forks meet each other on the opposite end of the parental chromosome. E coli regulate this process
through the use of termination sequences which, when bound by the Tus protein, enable only one
direction of replication fork to pass through. As a result, the replication forks are constrained to always
meet within the termination region of the chromosome

40. Welche Gentechnische Anwendung gibt es für die Rolling cirlcle amplification?

Padlock Probes are used for molecular biology techniques to detect specific regions of Genome.
Padlock probes are single stranded DNA molecules with two 20-nucleotide long segments
complementary to the target connected by a 40-nucleotide long linker sequence.
When the target complementary regions are hybridized to the DNA target, the padlock probes also
become circularized.
Padlock probes are designed such that the target complementary regions span the entire target region
upon hybridization, leaving no gaps. Thus, padlock probes are only useful for detecting DNA molecules
with known sequences.
Nilson demonstrated the use of padlock probes to detect numerous DNA targets, including a
synthetic oligonucleotide and a circular genomic clone. Padlock probes have high specificity towards
their target and can distinguish target molecules that closely resemble one another.
Since ligation requires the ends of the probe to be immediately adjacent to one another when hybridized
to the target, the 3bp deletion in the mutant prevented successful ligation. Padlock probes were also
successfully used for in situ hybridization to detect alphoid repeats specific to chromosome 12 in a
sample of chromosomes in metastasis state. Here, traditional, linear oligonucleotide probes failed to
yield results. Thus, padlock probes possess sufficient specificity to detect single copy elements in
the genome

41. Wie kann man testen ob eine DNA semikonservativ oder non prozessiv
repliziert? Mit welchen physikalischen Methoden kann man eine Detektion
durchführen? Wie hießen die Entdecker?

Meselson & Stahl


Mit diesem Experiment kann man überprüfen ob die DNA semikonservativ oder non-prozessiv Repliziert.
Dafür wird DNA für mehrere Generationen auf N-15 gezüchtet. Dann wird es für eine Generatio in N-14
gezüchtet. Diese Generation wird weitere male auf N-14 gehalten. Anschließen kann man durch eine
Dichtegradientenzentrifugation bestimmten ob semikonservativ oder nicht.

42. In welche Schritte kann man die Replikationsinitiation unterteilen?


ORI Erkennung. ORC bindet an ORI
Schmelzen der dsDNA
Entwinden durch Helikasen
Rekrutierung von verschiedenen Replikationsfaktoren wie Pol, ssBP,….

43. Wie viele Polymerasen gibt es, vergleich die Pol I, II,III. Gemeinsamkeiten und
unterschiede.

Es gibt sechs verschiedene. Alle Pol könne 5´zu 3´ Polymerisieren und haben eine 3´zu
5´Exonucleaseaktivität. Pol I kommt am häufigsten vor, pro Zelle 400 und hat eine 5´zu
3´Exonucleaseaktivität. Pol lll ist die schnellste, 30.000 nt/min.
44. Skizziere die procaryotische
Replikationsgabel mit all seinen
involvierten Proteinen, gib auch die
Richtung der Synthesen an,
beschrifte die Orientierung der
DNA.

45. Zeichne die eucaryotischen


Replikationsgabel mit all seinen
involvierten Proteinen.

46. Es gibt insgesamt mindestens neun Replikationsfaktoren, die alle eine


definierte Aufgabe haben, zähl auf und erkläre dabei.
Gyrase: Topo II, relaxiert +ve Supercoils
Helicase: DnaB, schmelzt ds-Strang auf und bildet +ve Supercoils
Primase: DnaG, synthetisiert Primer für Okazakifragementsynthese am Laggingstrand
SSBs: Einzelstrangbindeproteine
Tau-Faktor: 2x Hält die beiden Polymerasen zusammen.
Beta-Clamp: 2x Hält die Polymerase am DNA-Strang
Pol III: 2x Syntetisiert die DNA
Pol I: Entfernt RNA Primer und füllt Lücken mit DNA.
Ligase: Ligiert die Okazakifragmente.

47. Erkläre in einzelnen Schritten die Erkennung vom OriC, aufschmelzen und
rekrutierung von den einzelnen Faktoren in richtiger Reihenfolge, und das
Zusammenspiel der einzelnen Faktoren.
Replikationsstart:
OriC enthält AT Reiche wdh, DnaA Binderegionen und eine IHF Bindestelle
DnaA initiator associating protein (DiaA) tetramere und IHF fördern die Bindung von ATP-DnaA
Molekülen, was zum lokalen Aufschmelzen des Doppelstranges führt.
Helicase (DnaB) wird geladen und schmilzt weiter auf.
Polymerase-rekrutierung:
DNA-Primase (DnaG) wird geladen und synthetisiert Primer.
DNA Pol III Holoenzym besteht aus der Pol III UE und der Beta-Clamp (DnaN)
Holoenzym wird geladen und synthetisiert die komplementären DNA Stränge
Nach der Synthese der Okazaki Fragmente verbleibt die Clamp an der DNA, und Pol III ladet eine
andere Clamp an die Stelle des nächsten Primers um das nächste Okazaki Fragment zu synthetisieren.
Beta Clamp und Hda verhindern mehrfaches Abfeuern.Nach der Fertigstellung eines
Okazakifragments, verbleibt die Clamp an der DNA und bindet ADP-DnaA homologe Proteine (Hda) .
Dieser Komplex (ADP-Hda-Clamp-DNA) fördert die DnaA –ATP Hydrolyse.
Das führt zu ADP-DnaA was die Entwindung am OriC verhindert.

48. Welche globale Aufgabe hat die Dam-Methyltransferase und welche


spezifische in Bezug auf die Replikation?

Da eine lebende Zelle ihre Integrität nur erhalten kann, wenn die genetische Information sinnvoll ist,
sollte sie in der Lage sein, fremde DNA zu erkennen und zu eliminieren. Dies wird häufig durch ein
System aus zwei Enzymgruppen gewährleistet: Die DNA-Methyltransferasen und
die Restriktionsendonukleasen
Vollmethylierte oriC ist ein Substrat für die Initiation.
Hemimethylierter oriC bindet an Membran, nicht für Initiation verfügbar.

49. Welche Bedeutung hat die m6A, Methylierung an der N-6 Stelle für bakterielle
Zellprozesse?

 Verteidigung gegen Bakteriophagen und Transposons


 Regulation der Chromosomenreplikation, Chromosomenseggregation und Reorganisation des Nucleoid
nach der DNA Replikation.
 DNA Strang Unterscheidung für mismatchrepair
 Regulation des Transfers von Plasmiden bei Conjugation
 Die Verpackung von Phagen DNA in Kapside
 Transkriptionelle Regulation von fimbrial Operons und anderen virulenten Genen.

50. Erkläre in einzelnen Schritten die Basepair repair.

 MutS erkennt den mismatch


 MutH erkennt den methylierten Strang
 Mut L wechselwirkt mit beiden
 MutH schneidet den Tochterstrang
 Helicase und Einzelstrangexonuclease entfernen den Tochterstrang bis über die Fehlgepaarte Base
hinaus
 DNA Polymerase und Ligase reparieren die Lücke.
 Tochterstrang wird methyliert

51. Statement, keine Frage: Hypermethylierte CpG Island führen zur Repression
der Expression von Tumor-suppressor-Genes, das in folge zu Krebs führt.
Hypomethylierung von pericentromerischen Heterochromatin führt zu
genomischen Instabilität im Zuge der mitotic recombination.

52. Wie viele eucaryotische Polymerasen gibt es? Welche Bedeutung haben die
alpha und delta Polymerasen?

Eukaryotes have at least 15 DNA Polymerases:


Pol α (also called RNA primase): forms a complex with a small catalytic (PriS) and a large noncatalytic
(PriL) subunit, with the Pri subunits acting as a primase (synthesizing an RNA primer), and then with
DNA Pol α elongating that primer with DNA nucleotides. After around 20 nucleotides elongation is taken
over by Pol ε (on the leading strand) and δ (on the lagging strand).
Pol δ: Highly processive and has proofreading 3'->5' exonuclease activity. Thought to be the main
polymerase involved in lagging strand synthesis, though there is still debate about its role
Pol β: Implicated in repairing DNA, in base excision repair and gap-filling synthesis.
53. Erkläre die wichtigsten Schritte während des Zellzykluses, welche Phasen gibt
es, wie können diese unterteilt werden, welche Proteine sind essentiell dafür?
Erkläre dazu beispielsweise den Übergang von G1 auf S das durch einen
externen Signal ausgelöst wurde.

Zellzyklus gibt es vier Phasen: G1, S-Phase, G2 Phase (diese drei sind die Interphase) und die Mitose.
Die M-Phase ist in zwei unterteilt, in die Chromosomenaufteilung und Zellaufteilung.
Zwei wichtige Proteine, CDK und Cycline sind für die Regulation des Zellzyklus verantwortlich.
Während cdk kontinuiertlich synthetisiert werden, treten cycline nur in bestimmten Phasen der Zelle auf.
Tritt nun ein Signal auf, dass die G1-cyclin-CDK aktiviert, so wird die Zelle für die S-Phase vorbereitet
um die DNA zu replizieren. Dafür werden die Gene die notwendig sind für die Synthese aktiviert,
während inhibierende Proteine vom G1-cyclin-CDK für die Degradation reguliert werden.
Aktive S-cyclin-CDK Komplexe phosphorylieren die pre-replication-complexe die währende der G1-
Phase am ORI assembliert wurden. Diese Phosphorylierung hat zwei Gründe, eineseits wird das pre-
replication-complex aktiviert und andererseits wird die weitere komplexbildung verhindert. Dieser Event
garantiert dass nur einmal pro Zyklus eine replikation stattfinden kann.

54. Was ist das pre-replication-coplex? Aus welchen Proteinen setzt es sich
zusammen? Wofür sind die einzelnen Proteine zuständig. Mach eine Skizze.

 ORC ist ein Hexamer das an oriC bindet


 Cdc6 und cdc1 sind regulatorische Proteine
 MCM Minichromosomemaintanance MCM2-7 haben
helicaseaktivität
 Assemblierung erfolgt in der G1 Phase und die MCM werden
Phosphoryliert –> Synthese
 Wenn S-Phase beginnt, geht cdc6 weg, CDT1 wird abgebaut und
MCM verlassen auch die Gabel
 ORC bleibt während dem gesamten Zyklus am ORI gebunden
 MCM spielt große Rolle bei der Initiation und Elongation der
Replikationsgabel.

55. Was sind license factors, was bewirken sie?


Dazu gehören die cdc1 und cdt6 Proteine, die dem ORI erlauben die Replikation zu starten indem sie
den pre-replication-cpmplex binden. Sie werden nur in der G1 Phase synthetisiert. Das gewährleistet,
dass der Start der Replikation nur einmal erfolgt.

56. Wofür ist Geminin zuständig?


Geminin wird in der S-Phase synthetisiert und fungiert als negativregulator der DNA Replikation.
Geminin ist das Substrat für APC (Anaphase promoting complex) In der G2 Phase verhindert Geminin
die wiederassemblierung von MCM in dem sie am cdc1 bindet. Dieser Event verhindert die doppelte
Abfederung.

57. Welche Proteine sind für den Übergang vom pre-RC zur Replikation
zuständig?

Mcm10p, CDK, DDK, Cdc45, Sld3, and RPA arerequired for this transition.
CDK und DDK Kontrollieren den ORI Unwinding.
58. Während des Zellzykluses werden Proteine ab und aufgebaut, dafür sind zwei
Komplexe essentiell, welche sind das, und von welchen anderen Proteinen
werden sie aktiviert?

Während des Zellzykluses werden Proteine ab und aufgebaut, dafür sind zwei Komplexe essentiell:
APC/C und SCF Komplex: Sind Ubiquitin E3 Ligasen, die markierte Proteine degradieren. Sie haben
eine wichtige Rolle im Zellzyklus bei der Ubiquitinierung. APC/C kontrolliert metaphase-anaphase
Übergang und wird von Cdc20 und Cdh1 aktiviert. SCF kontrolliert der Übergang von G1/S und G2/M
und wird von Cdc4 aktiviert.
59. Was ist Solexa?

Eine Sequenzierungsmethode
 DNA wird zufällig fragmentiert (mit Ultraschall)
 An beiden Enden werden sogenannte Adapter ligiert.
 Das ganze wird auf einem Gel getrennt und die richtige Länge (~300 bp) werden aus dem Gel eluiert
 Diese DNA Fragmente dienen nun als Template
 Dazu werden nun P5 und P7 Primer in einer PCR Reaktion dazugegeben.
 Diese beiden Primer synthetisieren an den Strang einen Adapter
 Beide Adapter können an den Flow Cell binden.
 Das ganze sieht dann so aus: P5 – SBS Adaptor- Sequence of Interest- SBS Adaptor- P7. Das ganze ds
 Fragmente werden nun über den Flow cell geschüttet, Fragmt binden zufällig irgendwo auf der Flow cell.
 Aus dem nun gebundene DNA Fragment, das sequenziert werden soll, wird ein Antiparaleller Strang
synthetisiert, als Primer dienen die capture Oligos.
 Dieser Strang hybridisiert wieder an einem Adaptor auf der flow cell und dient als Matrize für weitere
Kopien. Es werden ca 1000 Kopien gemacht (das ganze war eine Festphasen PCR)
 Amplifikation durch „Bridge Amplification“. Es bildet sich ein Cluster
 Jetzt beginnt erst die Sequenzierung
 Nun kommen die Sequenzierungsprimer dazu, und pro Zeiteinheit eine markierte Base und es wird eine
sehr accurate Polymerase verwendet.
 Pro Zyklus wird immer nur eine Base eingebaut.
 Mittels Fluoreszensmikroskopie wird die Base für jeden Cluster bestimmt
 Farbstoff wird abgebaut damit nächste Base eingebaut werden kann
 Das ganze geht so weiter
 Zu Lange Sequenzen führen zu Fehler, Sequenzierqualität hängt von der Qualität des Templates, von
der Polymerase und der Abtrennung des Farbstoffes ab.
 Die erhaltenen Date müssen schlussendlich Aligned werden.

60. Was ist Hi-C?

Das ist eine Methode zur Bestimmtung der 3-dim Struktur von Chromosomen und Genomen, indem die
Sequenz der DNA die mit Proteinen interagiert durch sequenzierung bestimmt und anhand der DNA
Daten einen Katalog erstellt. Diese Methode lässt mit einem Blick die Proteininteragierenden DNA
Fragmente analysieren.
Ablauf:
 Crosslinken der DNA mit den Proteinen, durch Zugabe von Formaldehyd
 Restriktionsverdau um sicherzustellen, dass nur Proteinassoziiertes DNA vorhanden ist
 Ligation der freien Enden mit Biotinmarkierung wird schließlich durchgeführt
 Auf diese Weise erhält man eine Reihe von Protein-DNA gebundenen Fragmenten
 Diese Bibliothek stellt die Sammlung von DNA Fragmenten, die ursprünglich nahe beieinander lagen.
 Die Proteine werden entfernt und über bleiben die DNA Fragmente, diese werde Sequenziert und ein
Katalog über mit Proteinen interagierenden DNA erstellt.
 Diese Stellen die mit Proteinen interagieren, lassen voraussagen über die Struktur des Genoms
machen.

61. Worauf basiert die 454 Sequenzierungsmethode?

Bei dieser Methode werden vier Enzyme verwendet:


DNA Polymerase Elongiert den wachsenden Strang
ATP Sulfyrulase Synthetisiert ATP
Luciferase Konvertiert ATP zu Licht
Apyrase Entfernt die überflüssigen Nc
Ablauf: Die Reaktion ist eine DNA Strangelongation. Es wird DNA synthetisiert in dem zu bestimmten
Zeiten immer vier Basen einer bestimmten Sorte der Reaktion zugegeben werden ( bsp 4 St. Adenin,
dann 4 St. Guanin) Jedes mal wenn die Polymerase ein Nucleotid einbaut, wird dabei ein Pyrophosphat
frei PPi. Dieses Pyrophosphat wird von der ATP Sulfyrulase aufgenommen und zu ATP synthetisiert. Die
Luciferase nimmt nun das ATP auf und sendet dabei Licht ab. Abhängig davon wie viele Nc eingebaut
wurden in den Strang, werden entsprechend viele Pyrophosphate abgespalten die von der Sulfyrulase
aufgenommen wird. Entsprechend höher oder niedriger ist auch dann die Lichtintensität die von der
Luciferase abgesendet wird. Das ausgesendete Licht wird detektiert und als Peak wahrgenommen. Wird
bsp ein Nc eingebaut, kommt einfaches Lichtsignal, werden 3 Nc eingebaut, kommt dreifaches
Lichtsignal das einen dreifachen Peak ausmacht. Kommt kein Signal, dann wurden nicht die
entsprechend richtigen Nc in die Reaktion zugegeben. Das Signal wird von einer CCD Kamera
aufgenommen. Die Aufgabe der Apyrase ist, dass sie die nichtaufgebrauchten Nc entfernt.

Praktischer Ablauf:
DNA wird fragmentiert und mit Adaptoren an beiden Enden versehen. Adaptor A und B
Adaptor B hat ein Biotin und wird gebraucht für die Immobilisierung auf dem Bead
Danach wird die DNA dehybridisiert und auf den Beads immobilisiert
Die Beads beinhalten nun die DNA Bibliothek und werden mit einer Emulsion vermischt, dass die
geannten Enzyme beinhaltet.
In der Emulsion läuft die PCR Reaktion ab und dann kommt das ganze in eine Microtiter Platte
Mit kleineren Beads wird die immobilisierte Enzyme tragen kommen auch in die Microtiterplate
Über einen Nc-Resevoir wird in bestimmten Zeiten entsprechende Nc in die Reaktion gepumpt und von
einer Kamera die Lichtreaktion gemessen, von einem Compter werden die Signale als Peaks
interpretiert.

Vorteile der Methode:


6
10 reads in 8 Stunden. Nachteile der Methode:
GC-reiche Regionen sind kein Problem Repetetive Bereiche die über 300 Basenpaaren
Methode ist Fähig, Mutationen in einem gehen, können nicht überbrückt werden und
Amplicon-pool zu erkennen, das für müssen als einzeln Behandelt werden.
klinische Forschung, besonders bei HIV
und Krebs interessant sein kann.

62. Was ist recombineering system?


[1]
Recombineering (recombination-mediated genetic engineering) is a genetic and molecular
biology technique based on homologous recombination systems. It has been developed in E. coli and now is
expanding to other bacteria species and is used to modify DNA in a precise and simply manner. The
procedure is widely used for bacterial genetics, in the generation of target vectors for making a
conditional mouse knockout, and for modifying DNA of any source often contained on a bacterial artificial
chromosome (BAC)

63. Was ist Ends in und Ends out Recombination in Hefe?

Integration of linearized plasmids into yeast chromosomes has been used as a model system for the
study of recombination initiated by double-strand breaks. The linearized plasmid DNA recombines
efficiently into sequences homologous to the ends of the DNA. This efficient recombination occurs both
for the configuration in which the break is in a contiguous region of homology (herein called the ends-in
configuration) and for ``omega'' insertions in which plasmid sequences interrupt a linear region of
homology (herein called the ends-out configuration). The requirements for integration of these two
configurations are expected to be different. We compared these two processes in a yeast strain
containing an ends-in target and an ends-out target for the same cut plasmid. Recovery of ends-in
events exceeds ends-out events by two- to threefold. Possible causes for the origin of this small bias
are discussed. The lack of an extreme difference in frequency implies that cooperativity between the
two ends does not contribute to the efficiency with which cut circular plasmids are integrated. This may
also be true for the repair of chromosomal double-strand breaks.

64. Welche Möglichkeiten gibt es, genetische Information auf menschlichen Zellen zu
übertragen?
a- Eine Methode ist Übertragung von gen Information über Retroviren. Diese haben eine RT und vermehren
sich über ein DNA Intermediat. Die Integration der DNA in das Hostgenom erfolgt zufällig, das ist der
wesentliche Nachteil, denn wenn die Transposition in eine Tumorsuppressorgen erfolgt, dann kann Krebst
entstehen.
Mit diesem Ansatz konnte man bereits X-Scid (Patienten können kein Krankheitserreger erkennen)
bekämpfen. Gentherapie funktioniert, aber 5 von 20 Patienten bekamen Leukemie. Die spezifische
Integration könnte man mit Zink-finger Proteinen herbeiführen, die an der Major groove der DNA spezifisch
interkalieren.
b-Adenovirus wäre ein Ansatz, aber die dsDNA des Virus integriert nicht in die Host DNA. Nur für transiente
Zustände und akute Vorfälle wie bei Krebs brauchbar. Aber der Adenoassoziierte Virus ist interessant, der
den Adenovirus braucht für die replikation weil es sich selber nicht teilen kann, weil es so klein ist. Das
schöne ist, dass dieser Virus nicht pathogen ist, und sein Genom 4,5 kb ganz spezifisch in Chromosom 19
inseriert.
c- Wie kann man Tumorwachstum verhindern? Indem man AAV einsetzt und microRNA in die Zellen
transportiert. Dabei wird die Stilllegung bzw. Dämpfung der Expression von Proteinen veranlasst. Ziel ist es,
die betreffenden Gene die die Proliferation auslösen zu deaktivieren.

65. Erkläre was Krebs ist, in Zusammenhang mit dem Zellzyklus.

Krebs ist eine Krankheit des Zellzykluses.


Der Zellzyklus besteht aus den Phasen, G1 (Zelle wächst und bereitet sich auf S-Phase vor), S (=Synthese
von Chromosmen), G2 (Zelle wächst und bereitet sich auf Mitose vor) und Mitose. Zellen die sich nicht mehr
teilen (Neuronen sind in der G0 Phase). Cycline werden permanent auf und abgebaut und aktivieren die
kInasen, von diesen sind die CDK-Kinasen abhängig. Am bedeutendsten für Krebs sind die G2 Kinasen. Die
Regulation der Cycline erfolgt durch äussere Einflüsse. Bei Hefe bsp abhängig vom Nährstoff. Bei tierischen
Zellen nicht von Nahrung abhängig, sondern von Mitogenen, das sind Proteine die die Zellteilung anregen.
Wenn nun ein Growth Factor Mitogen kommt und die Signaltransduktionskaskade anwirft, entsteht am Ende
der Kaskade die Aktivierung von G1/S und CDK. Also Zelle beginnt zu Replizieren. Problem ist, dass im
Zuge der Signaltransduktionskaskade Protooncogene vorhanden sind, die zu Oncogenen (Ras, Raf, Myc.)
werden können. Das passiert wenn sie eine Mutation tragen, die sie dauerhaft aktiviert. Der aktive Zustand
wird normalerweise von Signalen herbeigeführt. Als gegenspieler dazu gibt es die Tumorrespressorgene die
die Teilung supprimieren (Retinoblastoma).

66. Erkläre Krebs in Zusammenhang mit der Genexpression und Ansätze wie man
dagegen ankämpfen kann.

Krebs kann auch durch falsche Genexpression hervorkommen.


Dagegen wird die Methode mit non-coding RNA´s verwenet. ncRNA. Zwei bekannte Pathways sind
siRNA (small Interference) und miRNA (microRNA) um die Genexpression runter zu regulieren. Beide
genannten RNA´s haben einen komplementären Abschnitt zur Ziel mRNA an dessen 3´ untranslatierte
Region sie binden und einen Hairpinloop.
Mit miRNA werden die beteiligten Proteine an der Translation gehemmt oder durch zerschneiden der
mRNA komplett abgebaut, abhängig von der komplämentarität des Ziel-mRNA und miRNA.
siRNA ist ein ds RNA das von einem DICER zerschnitten wird und mit einem RISC Komplex assoziiert.
Der komplementäre mRNA bindet an siRNA und AGO (zusätzliche Komponente der RISC) zerstört das
mRNA. Mit dieser Methode kann ma die genannten RNA´s über virale Vektoren in die Zelle einschleusen
und betreffende Proteine bei der Bildung von Krebs verhindern.

68. Warum war Janainah ach so gut?


Untersuchte die effizienz von miRNA replacement thrapy für Leberkrebs
Er entdeckte dass, HCC (Hepatocellular carcinoma cells) reduzierte Expression von miR-26a, einem
miRNA zeigten, dass in anderen Geweben sehr stark exprimiert wird
In Leberzellen die Krebs haben zeigten bei in vitro Studien, dass die Expression von diesem miRNA die
Zelle zum Zellzyklusarrest induziert indem direkt die Cycline D2 und E2 die Zielproteine sind.
Systematische Anwendung von diesen miRNA in Maus HCC mit Hilfe von AAC zeigte eindeutige
Inhibierung von Krebszellenproliferation, Induktion von tumorspezifischer Apoptose, weiteres war es
nicht notwendig toxische Sachen anzuwenden. Diese Entdeckung zeigt, dass möglicherweise die
genannten miRNA in Geweben hoch exprimiert und toleriert wird, aber in erkrankten Zellen ist die
miRNA schwach exprimiert. Daher könnte diese Strategie eventuell generell gegen Krebstherapie
verwendet werden.

What, Janaiah thought, if we could reestablish miR-26a expression in a tumor cell line,
and because it was more interesting, he chose a human liver tumor cell line (HepG2).
So he cloned miR-26a into a retroviral vector AAV and expressed it in HepG2 cells (zum Überprüfen
machte er GFP markierte Konstrukte)
To test, whether their growth would be affected, he did FACS analysis.
For FACS the DNA of the cells is labelled with a fluorescent dye and then the DNA content of
thousends of cells is measured to give a profile showing the fraction of cells with G1, S-phase
and G2 content.
If the cells would slow down only a little bit, he would be able to see this with the profile.....
Die verschwundenen Zellen gingen in die Apoptose.

Funktion von miRNA:


Sind in posttranskriptionellen Genregulation involviert und nicht codierende mRNA mit 21 bis 23 nt.
miRNA besitzt eine 3´-UTR Region die spezifisch an die Ziel mRNA bindet.
Die miRNA wird als pre-miRNA transkribiert und über den Drosha-Faktor zu 70-80 nt lange precursen
prozessiert. Dann kommt das in das Cytoplasma. Dort kommt ein Dicer der den precursor zu 17- 24 nt
langen Stücken schneidet. Es bildet sich ein Einzelstrang. Abhängig von der Komplementarität kommt es
entweder zur Hemmung der mRNA oder totalen Abbau.