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300123
SS12
Claudia Knoglinger
TEIL BLÄSI
(Alle Abbildungen wurden den Folien von Prof. Bläsi entnommen; dieses Skript ist
außerdem eine Zusammenstellung aus Sonnbert- Skript, Folien und Audiofiles)
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
- BLÄSI: FOLIENSATZ 1 -
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
Anti- Shine-
Dalgarno
Anticodon- Loop
Shine- Dalgarno
Cap
Prokaryoten: Initiation der Translation beruht sehr stark auf rRNA/ mRNA Interaktionen.
Verschiedene Merkmale machen eine RBS aus: die Interaktion mit dem Startcodon wird von der
Initiator- tRNA bewerkstelligt. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die Shine- Dalgarno Sequenz
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
(AGGAGGU; nach den Entdeckern 1974 benannt), welche komplementär zu einer ssRegion (nach
Helix 45) auf der 16S rRNA (rRNA der 30S UE) ist. Die SD ist in einem Abstand von 5-9 Basen upstream
vom Startcodon, dadurch wird die ribosomale UE so positioniert, dass die Initiator- tRNA genau über
dem AUG zu sitzen kommt. Die SD ist aber nicht immer 100% komplementär zur 16S rRNA und
bestimmt daher auch die Effizienz der Initiation der Translation. Die mRNA kann stark intramolekular
agieren, d.h. sie bildet Strukturen aus und diese können verhindern, dass das Ribosom sich auf die
Bindungsstelle setzen kann.
Eukaryoten: Initiation beruht sehr stark auf Protein/ Protein Interaktionen. Bei der Cap- abhängigen
Initiation erkennt zuerst eIF4E (euk. IF) das Cap (7- Methylguanin). eIF4A bindet downstream davon
an die mRNA. eIF4G interagiert mit dem 40S- Komplex. Sobald die UE gebunden hat, kommt es zum
Scanning und beim ersten AUG beginnt die Translation. Die IRES (=internal ribosomal entry site)-
abhängigen Initiation fand man zuerst bei Viren (Picornavirus hat mRNA ohne Cap). Man fand IRES-
Strukturen (starke Sekundärstrukturen) die ein Cap teilweise nachahmen. IFs binden an die IRES und
führen zum Binden der 40S UE. Diese IRES Sites befinden sich direkt vor dem AUG und schließen
dieses auch manchmal in die Struktur mit ein.
Translation in Prokaryoten
Komponenten: mRNA, tRNA (übersetzendes Element zw. Codon und AS), Ribosomen, IF1-3
Initiation: Regulatorische Mechanismen
Elongation: EF (EfTu, EFTs, EFG)
Termination: RF (RF1-3; RF= recycling factor), RRF
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Modifikation
tRNA Prozessierung
RNAseP
ACC
RNAseD
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Die tRNAs werden als lange Precursor hergestellt und durch 2 Enzyme prozessiert: RNAseP besteht
aus einem Protein und einer RNA (Ribonukleoprotein). Dabei ist die aktive funktionelle Komponente
die RNA. Sie katalysiert den Schnitt am 5´Ende, determiniert das 5´Ende. RNAseP ist hochkonserviert,
man findet sie in allen Organismen. RNAseD erkennt das 3´Ende und verdaut bis sie das CCA- Ende
erreicht hat.
Adenosin
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tRNA Synthetasen
Klasse I Klasse II
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Bindestellen der
Synthetasen
Beladung einer tRNA: Bildung von Aminoacyl-AMP Veresterung der AS mit AMP Bindung der
tRNA an Aminoacyl-AMP Veresterung der AS mit dem 3' Ende der tRNA
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Ribosomen
1999 wurde die Struktur des bakteriellen Ribosoms vorgestellt und V. Rhamakrisnan, J. Steitz und A.
Jonath bekamen dafür den Nobelpreis (2009). Man kann die Komplexe kristallisieren und durch
Röntgenstrukturanalyse untersuchen. Diese Strukturen geben uns einen Einblick was die Funktionen
sein könnten. Warum war diese Strukturauflösung so wichtig?
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23S rRNA
Peptidyl- Transferase-
Zentrum: hier kommt am
Ende die wachsende
Peptidkette raus
ASL= Anticodon
stem loop.
Antibiotika binden
genau in der
Coding- Region
und inhibieren
diese Funktion.
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1:1 Ratio
Wie kommt es nun so einer sogenannten Ielling- Reaktion? Die Zellen wachsen zum Beispiel in einem
Nährmedium, in dem plötzlich eine AS fehlt. Dadurch kann die korrespondierende tRNA nicht mehr
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mit der AS beladen werden und es entstehen unbeladene tRNA eine nicht beladene tRNA sitzt an
der A- Site, daher kommt es nicht zum Transfer der Peptidkette und die Translations- Reaktion ist
unterbrochen (Ribosom steht). Es kommt zur Konformationsänderung und zur Interaktion mit relA.
relA macht nun pppGpp
(Hungersignal), welches
an die RNA- Pol bindet
und verhindert, dass sie
an den Promotoren 1-2
transkribieren kann. SpoT
ist ein bifunktionelles
Enzym.
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Neu synthetisierte
Proteine in Bakterien
starten mit Formyl-
Met, aber die
Formylgruppe und
manchmal auch das
Met wird während
der Proteinsynthese
entfernt.
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IF1
Loop 530
Helix 44
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cDNA, die der Länge der mRNA entspricht. Mit 30S UE und fMet-tRNA erhält man eine kürzere cDNA
die als Toeprint- Signal bezeichnet wird. Das 3' Ende der verkürzten cDNA entspricht der Position, an
der die 30S UE an die mRNA gebunden ist. Über Southern- Blot kann die verkürzte cDNA mit der
normalen cDNA verglichen und die Position bestimmt werden. Je nachdem wie hoch die
Ribosomenkonzentration gewählt wird, wird die Masse der mRNAs mehr oder weniger mit einem
ternären Komplex besetzt sein. Das wiederum resultiert in untersch. Toeprinting- Signalen.
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Dr. Leder
Codons sind der universelle gen. Code, er ist bis auf wenige Ausnahmen in jedem Organismus gleich.
Der gen. Code ist redundant (=mehrfach vorhanden), es gibt meist mehrere tRNAs die für eine AS
codieren. Es gibt 64 tRNAs (61 tRNAs für AS sowie 3 Stopcodons- tRNAs (UAA, UAG, UGA)). Nicht
jedes Codon wird in gleicher Anzahl verwendet bzw. übersetzt. AGA wird im Vergleich mit AGG zu
0,1% zu Arg translatiert.
Häufig gebrauchte Produkte: werden durch häufig vorkommende Codons kodiert. Selten oder in
geringer Konzentration benötigte Produkte (z.B. Repressoren): werden durch selten vorkommende
Codons kodiert, es findet sich auch eine entsprechend geringe tRNA- Konzentration für dieses Codon.
Wobble Hypothese: An der 3. Stelle des Codons / Anticodons sind neben den normalen GC bzw. AU
Bindungen noch andere Paarungen möglich. Aus diesem Grund hat die letzte Stelle eines Codons die
geringste Aussage über die zugehörige AS.
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- BLÄSI: FOLIENSATZ 2 -
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Spezialisierte Ribosom-
Systeme: präferentielle
Translation einer einzigen
mRNA Spezies durch eine
Subpopulation von
mutierten Ribosomen in
E.coli.
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Position 1192). Dieser vermittelt eine Resistenz gegen Spectinomycin. Abschließend wurde dem
Plasmid ein Reportergen (hGH, menschliches Wachstumshormon) mit einer eine Anti-SD Sequenz
hinzugefügt. Wurde nur das Reportgen mit Anti-SD Startsequenz in wt E.coli eingebracht, fand keine
Translation statt, die wt Ribosomen interagierten nicht mit der Anti-SD Sequenz. Wurden
Reportergen mit Anti-SD Startsequenz und 16S rRNA mit SD- Sequenz und Basenaustausch wt E.coli
eingebracht und diese auf Medium mit Spectinomycin gezüchtet, so erhielt man das Hormon. Durch
das Spectinomycin waren nur die eingebrachten Ribosomen funktionsfähig, weiters konnte die SD
Sequenz auf der 16S rRNA mit der Anti-SD Sequenz des Reportergens interagieren und Translation
stattfinden. Ähnlich kann man Protein-Protein-Interaktionen identifizieren. Findet man in einem
Protein eine Mutation, die nur mit einer Mutation in einem anderen Protein funktionsfähig ist, kann
man Annehmen, dass an dieser Stelle zwischen den beiden Proteinen Interaktion stattfindet.
Sekundärstruktur
Man nimmt verschiedene Reagenzien, welche nach spezifischen Basen in der RNA schneiden, aber
nur dann wenn diese Basen einzelsträngig vorliegen. Zunächst werden in ausreichender Menge
mRNA (1012-1014) und 30S UE vermischt, es bilden sich Komplexe durch Bindung der SD + Anti-SD
Sequenzen auf 30S UE und mRNA. Anschließend werden Reagenzien hinzugefügt, die nur
ungepaarte Nukleotide modifizieren können (sounds familiar). An der Stelle an der mRNA und 30S
einen Komplex bilden kann die mRNA nicht modifiziert werden. Dazu ist zu sagen, dass zufällige,
einzelne Basen modifiziert werden, es werden nicht alle ungepaarten Basen einer mRNA modifiziert.
Modifizierung: DMS – A, CMTC – U, Kethoxal – G. Werden anschließend die Komplexe getrennt und
zur mRNA Primer und Reverse Transkriptase hinzugefügt, erhält man je nachdem wo die
Transkriptase durch eine zufällige Basenmodifikation abbrechen muss, unterschiedlich lange Stücke
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cDNA. Wird die cDNA auf einem Gel ausgewertet, erhält man durch die unterschiedliche Länge eine
Vielzahl an Banden, allerdings wird sich keine Bande an der Position der SD Sequenz finden, da hier
die Reagenzien niemals modifizieren konnten und die Reverse Transkriptase daher hier auch niemals
abbrechen musste.
Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Translation ist die Initiation, d.h. je besser das
Ribosom die Translationsdeterminanten (SD, Startcodon) erkennt, desto besser & schneller wird die
mRNA translatiert & desto mehr Protein erhält man. Es gibt versch. Parameter die das beeinflussen:
1. Start Codon: wie gut es decodiert wird von der Initiator- tRNA
2. SD: wie komplementär die SD ist
3. S1: ribosomales Protein
4. SD < > AUG: Abstand
5. Sekundärstrukturen: können verhindern, dass Ribosom binden kann
6. Sequenzen die sich in der Nähe der TIR (translationalen Initiationsregion) befinden
7. Translationale Repressoren
8. Riboregulation
9. Andere Kontrollmechanismen
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Isolierung & Analyse von Phagen RNA- Fragmenten crosslinked an S1 durch UV- Bestrahlung:
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wird sequenziert. Die Sequenzierung der erhaltenen mRNA ergab, dass die Sequenz an der S1 bindet
eine U-reiche Sequenz ist, die upstream des translationalen Startpunktes (der SD Sequenz) liegt.
S1 wird für die Translationsinitiation der mRNAs mit einem strukturierten 5´UTR benötigt
UTR: untranslated region/ ompA: Banden werden mit zunehmender S1 Konzentration intensiver. cI:
Banden bleiben bei steigender S1 Konzentration in etwa gleich. ompA mRNA: S1 abhängig;
Sekundärstruktur an 5' UTR. cI mRNA: S1 unabhängig; keine Sekundärstruktur in 5' UTR.
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Regulation der Expression des Bakteriophagen T4 Lysozyms: Bildung einer Sekundärstruktur hängt
vom Transkriptionsstart ab
Inhibitorische Stem- loop Strukturen: unterschiedliche Stimuli fürs Öffnen und Schließen
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Toeprint-
Analyse der
S+, M1L,
M3L und
M1,3 L
Allele.
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Bindedomäne (Aptamer,
strukturierte Bindetasche):
Ligand bindet mit hoher
Affinität/ Spezifität und eine
regulatorische Domäne
(Expressions- Plattform):
reagiert wenn Ligand an das
Aptamer gebunden ist und
die Konformationsänderung
verändert dann die
Genexpression.
Riboswitch Klassen
Methylgruppendonator
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Gram-: ohne SAM liest die Pol die Gene ab, kommt SAM dazu bindet es an einen Repressor und der
aktive Repressor blockiert die Gene (verhindert ablesen von Promotor).
Gram+: SAM bindet an einen Riboswitch, ein Terminationsloop entsteht und es kommt zur
transkriptionellen Attenuation/ Termination (RNA nicht mehr transkribiert).
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rad. Markierung
RNA 1x ohne Ligand und 1x mit Ligand werden ohne Enzym (Autohydrolyse) gemischt und auf ein Gel
aufgetragen. RNA mit Ligand formiert sich zu einer anderen Struktur, d.h. da wo RNA gepaart ist,
kommt es nicht so leicht zu einer spontanen Hydrolyse der RNA als in Bereichen die einzelsträngig
sind.
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6. Sekundärstrukturen in TIR
Gen aus einem T4- Phagen. Nach der SD kommt eine
Sekundärstruktur, die den Abstand zwischen SD und
Anti- SD (SC) verkürzt, da dieser nicht zu groß sein darf
(Erinnerung zuvor: ca. 7 Basen). Diese
Sekundärstruktur ermöglicht also erst die Initiation der
Translation.
SD
=Ribosomenbindungsstelle
=Translationale Initiationsregion
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Funkt. Bedeutung von RNA- Interaktionen bei der Auswahl von Translationsinitiations- Codons
(A) Modell für die SD Interkation der mRNA mit der 16S rRNA anti-SD Region
(B) Modell für die DB- vermittelte Interaktion der mRNA mit der 16S rRNA anti- DB Region
Eine Röntgenstudie zeigt, dass eine räumliche Interaktion zwischen DS Box und 16S rRNA nicht
möglich ist. Durch komplementäre Mutationen in DS Box und 16S rRNA konnte die Existenz dieser
Box ausgeschlossen werden. Durch chemical probing kann ebenfalls bewiesen werden, dass es keine
Interaktion zwischen DS Box und 16S rRNA gibt.
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Repressoren sind in der Regel Proteine die im Bereich der RBS binden können und verhindern, dass
das Ribosom bindet. Das Coat- Protein des Bakteriophagen R17 bindet an sein eigenes Gen, d.h.
wenn genug Coat- Protein gemacht wurde für die Replikation, wird das Gen ab geschalten. Bei
Bakteriophage T4 bildet sich ein Pseudoknoten (Bereiche der RNA, wo loops noch einmal
Interaktionen mit Einzelstrangbereichen machen; spielt auch eine Rolle beim frame shifting) aus. Hier
dient der Pseudoknoten als Nukleierungspunkt für das Protein 32 und in kooperativer Weise binden
andere Proteine, bis die SD überdeckt ist und das Ribosom nicht mehr binden kann.
Aktivatoren führen zur Bindung von Proteinen upstream eines Hairpins in dem sich SD-Sequenz
befindet. SD Sequenz wird frei, Ribosomen können binden. Die SD Sequenz kann auch durch
endonucleolytische Schnitte freigesetzt werden.
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T4 Gen 32 Autoregulation
ssb Protein
Translationale Repressoren dienen häufig der Regulation von akzessorischen Elementen. Bsp: Gen 32
des Phagen T4 codiert für ein Einzelstrangprotein. Dieses Gen ist auf mRNA-Ebene autoreguliert.
Wurden ausreichend Protein 32 Monomere erzeugt, binden diese an sogenannte Pseudoknoten
(speziell gefaltete RNA-Strukturen). Nach der Bindung an den Pseudoknoten können weitere
Monomere binden, bis die SD Sequenz erreicht wurde, wodurch das Ribosom nicht mehr binden
kann und die Translation inhibiert wird.
Autoregulation der Translation balanciert das ribosomale Proteinlevel mit der rRNA Synthese
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Beispiel S15: Für jedes Operon gibt es eine reg. Sequenz, welche
ähnlich zur Sequenz auf der rRNA ist. Liegt S15 in höherer
Konzentration als 16S rRNA vor, inhibiert es seine eigene
Translation.
SD
Das rib. Protein S15 aus E.coli moduliert seine eigene Translation durch Abfangen des Ribosoms an
der mRNA Initiationsladungsstelle. Es entsteht ein Pseudoknoten der die RBS maskiert.
Toeprinting Assay
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Toeprinting S15
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CsrA kann im Bereich der RBS binden (A- reiche Sequenzen). Solange CsrA bindet, wird das Gen nicht
translatiert.
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Interaktion von CsrA durch die nicht- kodierende reg. RNA CsrB
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8. Riboregulation
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Cis- kodierte RNAs sind immer in der Nähe des Gens oder überlappen mit dem Gen, während trans-
kodierte RNAs ganz woanders im Chromosom kodiert sein können.
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Werden durch den gleichen gen. Loci kodiert wie ihr Zielgen. Sie
haben das Potential perfekte Duplexes zu bilden.
(=Antisense RNA)
Cis- kodierte reg. RNA wird oft von Plasmiden, Phagen und
Transposons benutzt. Sie regulieren Plasmid- Copy- number,
Konjugation, post- segregationales killing, Temperatur- Phagen-
Entwicklung und Transposition.
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Toxingenen die sich auf Plasmiden befinden. Es wird dabei sichergestellt, dass nur Bakterien
überleben, die das Plasmid behalten. Das als hok bezeichnete Gen kodiert für ein Toxin, das die
Zellmembran zerstört. Für die Translation von hok ist ein Upstream liegendes, als mok bezeichnetes
Gen notwendig (positive translationale Kopplung). Zu der mok mRNA wird vom Plasmid eine als sok
bezeichnete Antisense RNA erzeugt, die an mok bindet und dadurch die Translation von hok
verhindert. Im Gegensatz zur mok-hok mRNA ist die sok Antisense RNA sehr instabil und muss vom
Plasmid ständig neu transkribiert werden. Geht das Plasmid verloren, wird die sok Antisense RNA
schneller abgebaut als die mok-hok mRNA, hok kann translatiert werden.
Bakterielle Stressantworten werden oft durch trans- kodierte reg. RNAs vermittelt
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Wichtig für diese Art der Regulation ist das Hfq- Protein.
Hfq
Es wurde gezeigt, dass es wichtig für die Replikation eines RNA- Phagen
ist. Hfq ist ein Sm- ähnliches RNA- Bindeprotein (spielen auch eine Rolle
im nukleären Splicing). Es ist reichlich vorhanden, Hitze- stabil und ein
ringröhrenförmiges hexameres Protein.
Es interagiert mit sehr vielen unterschiedlichen kleinen RNA- Molekülen
um RNA- Stabilität zu beeinflussen und RNA- RNA- Interaktionen zu
vermitteln. Es interagiert außerdem mit RNAP und dem ribosomalen
Protein S1.
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Gibt man zu sRNA RNAse E wird diese gespalten. Gibt man nun Hfq dazu, blockiert man die
Spaltstelle.
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Superoxid- Dismutase
Wie erwähnt ist Eisen als Cofaktor für aktive Zentren multipler Enzyme essentiell. Entzieht man
Bakterien Eisen (z.B. durch Chelierung mittels EDTA), werden sie sich bald den unsichtbaren
Engelschören anschließen, denn: Das Gen sodB codiert für das Enzym Superoxid-Dismutase. Dieses
wandelt Superoxid in H2O2 um, um die Zelle vor oxidativem Stress zu bewahren. Superoxid-
Dismutase benötigt dazu Fe3+. Anm: das produzierte H2O2 wird durch andere Enzyme weiter
abgebaut, da H2O2 DNA schädigt. Die Aufnahme von Eisen wird durch das Protein Fur reguliert. hfq
reguliert die Translation von Fur und dadurch indirekt die Produktion der Superoxid-Dismutase, die
Eisen benötigt. In einem hfq-Stamm ist sowohl die Konzentration von Fur als auch von Superoxid-
Dismutase erhöht. Bei langsamem Wachstum wird viel hfq produziert, dadurch wird die
Konzentration von Fur niedrig gehalten. Eine niedrige Fur Konzentration aktiviert
Oberflächenrezeptoren, die Eisen aus der Umgebung aufnehmen. Liegt wenig Eisen und damit
inaktives Fur vor, kann die small RNA RhyB transkribiert werden. RhyB inaktiviert Gene, deren
Produkte Eisen benötigen z.B. bindet es an die RBS von sodB und verhindert dessen Translation. Ist
RhyB an SodB gebunden, wird sodB leicht durch RNase E gespalten und abgebaut werden.
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RyhB- sodB Basenpaarung kreiert eine neue RNAse E Spaltstelle in der sodB 5´kodierenden Region
Zunächst wird geprüft, wo sodB ohne RhyB gespalten wird. sodB mRNA wird mit Ribosomen und
RNase E sowie speziell erzeugten Sonden vermischt. Diese Sonden sind komplementär zu kurzen
Strecken der mRNA. Kann eine Sonde nicht an die mRNA binden, fand an dieser Stelle ein Schnitt
durch die mRNA statt, die Sequenz der Sonde ist damit Komplementär zur RNase E Schnittstelle. Es
fand sich eine Spaltstelle bei Codon 30. Dem Gemisch werden hfq und RhyB hinzugefügt und erneut
mit Sonden geprüft. Es fand sich dabei in sodB eine andere Spaltstelle bei +12 (nahe am Startcodon).
Durch Bindung von hfq und RhyB an die mRNA wird Ribosomenbindung verhindert, eine neue
Spaltstelle für RNAse E freigelegt und dadurch die Wahrscheinlichkeit einer Spaltung erhöht.
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RNaseIII Spaltung von RyhB wird durch Basenpaarung mit sodB mRNA stimuliert
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bfr und ftn kodieren bakterielles Ferritin (Eisenspeicherprotein). Das sdh CDAB Operon kodiert
Succinat- DH. acnA und fumA kodieren Aconitase und Fumarase. sodB kodiert eine Eisen enthaltende
Superoxid- Dismutase.
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
Ein Netzwerk von ncRNAs kontrolliert die Synthese von Außenmembran Proteinen
9. Andere Mechanismen
Translationale Kupplung
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Negative translationale Kopplung: Liegen die Gene A und B überlappend vor und weist Gen A eine
stärkere RBS als Gen B auf, wird Gen A verhältnismäßig stärker translatiert werden als Gen B.
Positive translationale Kopplung: Die Translation eines Gens ist für die Translation eines weiteren
Gens notwendig. Beim Phagen Lambda liegen einige Gene nicht überlappend vor, allerdings befinden
sich Start und Stopcodon eines Gens in unmittelbarer Nähe des Startcodons eines zweiten Gens,
dessen SD Sequenz durch eine Sekundärstruktur der mRNA zunächst nicht zugänglich ist. Wird das
erste Gen translatiert, öffnet das Ribosom diese Sekundärstruktur in der sich die SD des zweiten Gens
befindet. Dadurch kann das zweite Gen erst translatiert werden, nachdem das erste Gen translatiert
wurde (positive translationale Kopplung).
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Translationale Attenuation
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Stop bewirkt eine Konformationsänderung der bereits translatierten mRNA, wodurch sich wiederum
die folgende Sekundärstruktur auflöst. Nach dem Auflösen der Sekundärstruktur löst sich das
Ribosom nicht von der mRNA sondern translatiert weiter und kann so die Enzyme zur Trp-
Biosynthese erzeugen. Es handelt sich hier um eine Mischung zwischen translativer und
transkriptiver Attenuation.
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- BLÄSI: FOLIENSATZ 3 -
cI weist ist eine mit AUG beginnende leaderless mRNA auf. In Versuchen konnte sie in E.coli,
Sulfolobus und Reticulocytenlysat aus Kaninchenaugen translatiert werden. OmpA mRNA aus E.coli
ist bei Versuchen im direkten Vergleich damit nur in E.coli, aber nicht in Sulfobolus oder Eukaryoten
translatierbar. Es wird daher angenommen, dass es sich bei leaderless mRNA um eine alte Form von
mRNA handelt, bevor sich ribosomale Bindungsstellen entwickelten.
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Die db- adb Interaktion existiert nicht (Downstream- anti Downstream Box)
Werden leaderless mRNAs durch den 30S- Initiator- tRNA Komplex erkannt?
Bei geringer IF2 Konzentration findet sich selten fMet-tRNA Bindung an Ribosomen. Bei hoher IF2
Konzentration findet sich häufige fMet-tRNA Bindung an Ribosomen.
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OmpA mRNA und cI mRNA werden in vitro translatiert. Abhängig von der hinzugefügten IF2
Konzentration steigt bzw. sinkt die Translation der cI mRNA, während die OmpA mRNA von der IF2
Konzentration unabhängig konstant translatiert wird. Die Konzentration von cI steigt proportional zur
IF2 Konzentration, während OmpA von der IF2 Konzentration unabhängig ist.
Selektion eines 5´terminalen AUGs und einer internen kanonischen RBS in Anwesenheit
eines IF2 und eines mutanten F2 Proteins
Leaderless mRNA
Normale mRNA
wird in jedem Fall
translatiert
-IF2: keine Bindung von Ribosom und tRNA an leaderless mRNA, keine Translation.
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
Es wird eine mRNA erzeugt, die mit einem Startcodon (quasi leaderless) beginnt und zusätzlich
downstream eine SD Sequenz mit normalem AUG Startcodon aufweist. Wird damit ein Toeprint
Assay durchgeführt (ausreichend mRNA, 30S UE, Initiator-tRNA, anschließend reverse Transkriptase),
wird sich folgendes Geschehen auf wundersame Weise zutragen: ohne IF2 (Spalte –IF2) erhält man
ein Toeprint Signal, das der Bildung des ribosomalen Komplexes nur an der downstream liegenden
Ribosomenbindungsstelle aufweist. Wird IF2 hinzugefügt (Spalte IF wt), erhält man sowohl ein
Toeprint Signal für die Ribosomenbindungsstelle als auch für das einsam liegende Startcodon. Fügt
man mutiertes IF2 hinzu (IF R700T), das die Initiator-tRNA nur schlecht an das Ribosom bindet, erhält
man so gut wie kein Toeprint Signal für das einsam liegende Startcodon. Damit ist ersichtlich, dass IF2
für die Translation von leaderleass mRNA notwendig ist.
Translationsinitiationsfaktor 3
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
Die translationale Effizienz von leaderless mRNA wird bei erhöhten Level von IF3 in vivo
erniedrigt
LacZ hat eine kanonische RBS und steigert intrazellulär die Menge an IF3.
Das rel. Level an IF2 und IF3 bestimmt die translationale Effizienz eines leaderless
Reportergens in vivo
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Vermehrte Expression einer leaderless tetR-lacZ Fusion im infC (IF3) mutanten Stamms
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Translationsinitiationswege in Bakterien
Die Translationsinitiation von leaderless mRNA wird nicht intrinsisch kontrolliert, sondern durch
Komponenten der Translationsmaschinerie.
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Cross- linking von 70S Monosomen resultiert in der selektiven Translation von leaderless cI
mRNA
Nach Aktivierung des Ribosomenrecyclingfaktors steigt das Level der 70S Monosomen
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
Transfer von wachsenden Zellen von 37°C auf 10-15°C löst eine Kälteschockantwort aus
Zellwachstum und Proteinsynthese stoppt und setzt sich nach 1-4h mit niedrigerer Rate fort. Cold-
shock- Proteine (CspA, CspB, CspG, CspI, CsdA, RbfA) werden induziert. Proteine welche involviert in
der housekeeping Transkriptions-/ Translationskontrolle involviert sind werden induziert.
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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)
Bakterien sind als Einzeller stark für Kälte anfällig und müssen sich vor den Folgen tiefer
Temperaturen schützen. E.coli besitzt beispielsweise Mechanismen, die es auch noch bei 5°-10°C
lebensfähig halten, auch wenn dabei der Stoffwechsel verlangsamt wird. Zur Regulation auf
Translationsebene werden bei tiefen Temperaturen sogenannte cold shock proteins erzeugt. Es
handelt sich dabei um RNA Chaperone bzw. Chaperonine, die verhindern, dass sich RNA bei tiefen
Temperaturen fehlerhaft faltet bzw. eine solche Faltung verhindert, um die mRNA translatierbar zu
halten.
Ineffiziente Translation
CspA Familie
Cold- shock Proteine erleichtern die Translation (Initiation) weil sie wie RNA- Chaperone
wirken
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Jedes Ribosom hat eine Bindungsstelle für mRNA und 3 Bindestellen für tRNA Moleküle
Die P- Stelle hält die tRNA mit der wachsenden Polypeptidkette. Die A- Stelle (Aminoacyl- tRNA
Bindungsstelle, jede Aminoacyl- tRNA mit Ausnahme der Initiator- fMet- tRNA bindet hier) trägt die
tRNA mit der nächsten AS. Entladene tRNAs werden an der E- Stelle (Exit) wieder entlassen.
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T w o Themen
1) 2 G Proteine
2) Peptidyl- Transferase
Elongationszyklus
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Ablauf der Elongation: Eine aa-tRNA (Aminoacyl-tRNA) kommt und wird durch aktives EF-Tu-GTP
(rot) gebunden (Ausnahme: fMet-tRNA). EF-Tu-GTP bringt die aa-tRNA zur A-Site eines Ribosoms,
dessen P-Site bereits besetzt ist. Bindet eine aa-tRNA in der A-Site, wird die tRNA ohne AS aus der E-
Site freigesetzt. Das gebundene GTP wird gespalten, EF-Tu-GDP wird freigesetzt, ist in dieser Form
inaktiv und bindet deshalb aa-tRNA nicht effizient. Um den Faktor EF-Tu wieder in die aktive Form zu
überführen, wird durch den Faktor EF-Ts das gebundene GDP mit GTP ausgetauscht. Nachdem eine
aa-tRNA an der A-Site gebunden hat und EF-Tu sich vom Ribosom gelöst hat, wird die
Polypeptidkette von der tRNA in der P-Site mit der neuen AS der tRNA in der A-Site verknüpft. Es gibt
keine Peptidyltransferase, die Peptidbindungen knüpft, dieser Vorgang wird von der 50S UE
durchgeführt, die rRNA dient als Ribozym. Im Detail wird ein durch das Ribozym dirigierter
nucleophiler Angriff durch die AS in der A-Site auf die C-terminale Carboxylgruppe der Peptidkette in
der P-Site durchgeführt. Anschließend bindet das Motorprotein EF-G, das das Ribosom unter
Hydrolyse von GTP um ein Codon weiterschiebt, EF-G löst sich wieder vom Komplex ab. Die
unbeladene tRNA liegt jetzt in der E-Site und kann das Ribosom verlassen, die tRNA mit der
Polypeptidkette liegt in der P-Site, die A-Site ist leer.
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Drittes Bild: Anscheinend ist die neu mit der Peptidylkette beladene ehemalige Aminoacyl-tRNA
schon irgendwo auf A- und P-Site. EF-G-GTP sorgt für die endgültige Translokation zur P-Site.
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Puromycin Reaktion
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EF-G-GTP bindet in
der Nähe der A-
Stelle. Das Binden
von EF-G-GTP schiebt
die tRNA mit dem
wachsenden
Polypeptid von der A-
zur P- Stelle.
Unbeladene tRNA in
der P- Stelle wird an
die E-Stelle verschoben. Solange tRNAs an mRNA durch Codon- Anticodon Basenpaarung gebunden
ist, wandert die mRNA relativ zum Ribosom.
Durch
Röntgenstruktur-
Analyse ist
bekannt, dass sich
die Faktoren EF-G
sowie EF-Tu das
aa-tRNA gebunden
hat strukturell sehr
ähnlich sind. Man
spricht in diesem
Zusammenhang
von molecular
mimicry, die
ähnliche Form
ermöglicht
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Interaktion mit derselben Site (A-Site). Gemeinsamkeiten von EF-Tu und EF-G: sind sich strukturell
sehr ähnlich; beide sind aktiv wenn GTP gebunden und inaktiv wenn GDP gebunden ist; es kann nur
entweder EF-Tu oder EF-G an Ribosom binden
Wird GTP durch das ähnliche Molekül GMP-PCP ersetzt, ist EF-G-GMP-PCP zwar in der Lage an die A-
Site zu binden. Ohne die Hydrolyse von GTP verläuft aber die Translokation sehr langsam und EF-G
wird nicht (oder nur schlecht?) freigesetzt.
Einbau einer unüblichen AS: die 21. AS: Selenocystein ist die biologische Hauptform von
Selen (Se)
Bei Selenocystein handelt es sich um Cystein, das mit Selen modifiziert wurde. Selen wird im aktiven
Zentrum einiger Enzyme benötigt; z.B. Deiodinase, Glutathionperoxidase zur Inaktivierung freier
Radikale in Säugern, Formatregulon zum Formatabbau in E.coli. Die tRNA für Selenocystein wird
folgendermaßen erzeugt. Eine spezielle tRNA, sec-tRNA, bindet zunächst über eine spezifische
Aminoacyl-tRNA Synthetase Serin. Ein Enzym wandelt die tRNA in Aminoacrylyl-tRNA um. Ein
weiteres Enzym hängt Cystein und Selen an, wodurch Selenocysteyl-tRNA entsteht, die jetzt als tRNA
für Selenocystein dient.
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Translationaler Umkodierungsmechanismus
Diese Enzyme katalysieren oft Oxidationen / Reduktionen. Enthalten meist ein Selenocystein, das
einen Teil des aktiven Bereichs darstellt.
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SELB unterscheidet sich von EF-Tu durch eine zusätzliche Domäne am deren C-terminalem Ende,
über welche die spezifische Sekundärstruktur der mRNA (SECIS) gebunden wird.
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Das Protein bewegt sich um eine Base vorwärts oder rückwärts auf der mRNA und ändert dadurch
den reading frame.
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Die τ- UE (normale Translation) und die γ- UE (-1 Frameshifting) sind vom dnaX Gen abgeleitet. Es
wird gleich viel von beiden UE produziert.
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Die Kassette für dnaX ist sehr konserviert in den verschiedenen Bakterien.
+1 Frameshifting in Säugern
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Translationale Introns
Vermutet man ein Translationales Intron, führt man im Leserahmen ein Stopcodon in diese
Intronsequenz ein. Handelt es sich tatsächlich um ein Intron, wird die Translation nicht unterbrochen,
man erhält trotz eingeführtem Stopcodon ein Produkt, da das Intron vom Ribosom übersprungen
wird.
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Anforderungen:
Bypassing Schritte
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Translationstermination
Bakterien:
Bei Prokaryoten finden sich drei Releasefaktoren RF1-3. RF1 bindet die Stopcodons UAA und UAG, F2
bindet UAA und UGA. RF3 stimuliert die Bindung von RF1 bzw. RF2. Die Releasefaktoren haben
strukturelle Ähnlichkeit mit EF-Tu und EF-G, da auch sie an der A-Site binden (molecular mimicry).
Ein post- Terminations rib. Komplex ist der Guanin- Nukleotid- Exchange- Factor für Peptid
RF3
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- BLÄSI: FOLIENSATZ 4 -
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In Prokaryoten liegt die Halbwertszeit von mRNA zwischen Sekunden und einigen Minuten, in
Eukaryoten kann sie von 30 Minuten bis zu 25 Stunden betragen. Der hohe Turnover in Bakterien
ergibt sich durch das schnelle Wachstum.
Functional half-lives correspond to 50% decrease in the capacity of the corresponding transcripts to
support the synthesis of full-length proteins after transcription has been blocked, e.g., inhibition of
RNA polymerase by rifampicin.
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E.coli RNAsen
RNAsen sind für Prozessierung von RNA (insbesonders tRNA) sowie für den Abbau von RNA
verantwortlich. Exoribonucleasen bauen mRNA vom Ende her ab, Endoribonucleasen spalten mRNA
in der Sequenz. Prokaryoten besitzen nur Exoribonucleasen, die mRNA vom 3' Ende her abbauen.
Eukaryoten haben sowohl Exoribonucleasen die mRNA vom 3' Ende, als auch solche, die vom 5' Ende
her abbauen.
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E.coli RNAseE
Das wichtigste
Enzym in gram-
das am mRNA
Turnover beteiligt
ist die RNAseE. Es
erkennt das
5´Ende der mRNA.
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Die Arginin- reiche RNA- Bindedomäne der RNAseE behält die Ziel- RNA bis die katalytische
Domäne die Spaltung vollendet hat
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Die intercistronischen Regionen können die Stabilität der Transkripte beeinflussen. In diesen
intercistronischen Regionen kommen Stabilitätsdeterminanten vor. Dabei handelt es sich um
Sekundärstrukturen. Daher können Exonukleasen diese Bereiche kaum abbauen.
5´Stabilitäts Determinanten
3´Stabilisatoren
Auch hier sind Stabilitäts- Sekundärstrukturen vorhanden. Die Halbwertszeit steigt dann an.
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Beim Degradosom handelt es sich nicht um eine einzige RNAse, sondern um einen Komplex.
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Ein Trick wie Transkripte von Bakterien mit einer 3´seitigen Sekundärstruktur dennoch abgebaut
werden können ist die Verwendung von PAPI. Dieses hängt Poly- A- Schwänze an das 3´Ende. Diese
wirken nun destabilisierend, weil sie Bindungsstellen für Nukleasen sind.
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Je länger allerdings ein Poly A Schwanz nach einem Stem- Loop ist, desto schneller kann die mRNA
abgebaut werden, da die Bindung des Degradosoms an das 3' Ende besser wird und in Folge mittels
Helicase den Stem- Loop auflösen kann.
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Ribosomen
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Eine effiziente SD- Sequenz aber nicht Translation ist für die lacZ mRNA Stabilität in E.coli
wichtig
Die SD Sequenz eines lacZ Gens wird durch eine effizientere SD Sequenz ersetzt (gelb markiert). Über
die effizientere SD Sequenz bildet sich ein starker ternärer Komplex, Ribosomen sind häufig an mRNA
gebunden, die mRNA wird stark translatiert. Das Degradosom kann nicht schneiden, da
translatierende Ribosomen Ansatz- und Schnittstellen verdecken. Im Versuch steigt die Halbwertszeit
der mRNA mit einer effizienten SD Sequenz auf 2,8 Minuten. Wird die SD Sequenz so verändert, dass
Ribosomen nur schlecht daran binden können, verkürzt sich die Halbwertszeit auf 1,3 Minuten. Die
Halbwertszeit einer mRNA steigt mit der Translationsrate, je stärker sie translatiert wird, desto
stabiler wird sie. Mittels Chloramphenicol, das die Translation verzögert, lässt sich die Stabilität von
mRNA ebenfalls erhöhen, da Ribosomen länger an die mRNA gebunden bleiben.
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Trans- Translation
mRNA weist normalerweise ein Stopcodon am Ende der codierenden Sequenz auf. Exonukleasen die
vom 3' Ende her mRNA abbauen entfernen Stopcodons, sie stehen nicht mehr für den Abbruch der
Translation zur Verfügung. Wird eine mRNA ohne Stopcodon von Ribosomen translatiert, bleiben
diese am Ende der mRNA gebunden ohne sich zu lösen. Zur Auflösung dieser Situation werden die
speziellen RNAs tmRNA oder SsrA verwendet. Es handelt sich dabei um eine 10S RNA, die wie eine
tRNA mit Alanin beladen ist, weiters aber noch eine spezielle RNA Sequenz aufweist ("Tag Sequenz"),
die vom Ribosom translatiert werden kann und mit einem Stopcodon endet. tmRNA tritt in die
ribosomale A-Site ein (EF-Tu wird benötigt), das bereits translatierte Polypeptid wird auf Alanin
übertragen. Anschließend wird die Sequenz der 10S RNA translatiert, über das Stopcodon werden
Polypeptid freigesetzt und das Ribosom von der mRNA gelöst. Durch die "Tag" Sequenz ist das
Polypeptid für den Abbau durch Proteasen markiert.
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tmRNA Struktur
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Modell für die Bindung, spontane Denaturierung und Degradierung eines SsrA- tagged
Substrats durch Tsp- Protease
Zusammenfassung
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In Eukaryoten sind Transkription und Translation räumlich getrennt, Transkription findet im Nucleus
statt, das Transkript wird modifiziert und ins Cytosol transportiert, wo die Translation stattfindet. Das
Transkript von Eukaryoten ist nicht direkt translationsfähig, sondern in codierende Exons und nicht
codierende Introns aufgeteilt. Diese Introns müssen zuerst aus der mRNA entfernt werden, bevor
eine Translation stattfinden kann.
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Splicing ist ein 2 Schritte Prozess der viele weitere Schritte involviert
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Gruppe I und Gruppe II Introns: Organellen und Bakterien falten sich in eine typische
Sekundärstruktur
3 Klassen von Splicing Reaktionen verlaufen über 2 Transesterifizierungen. Zuerst attackiert eine freie
OH- Gruppe die Exon 1- Intron junction. Danach attackiert das OH welches am Ende von Exon 1
entstanden ist die Intron- Exon 2 Junction.
Nukl- Splicing und GruppeII Splicing involviert die Bildung von ähnlichen Sekundärstrukturen. Die
Sequenz ist jedoch beim nukl. Splicing spezifischer. Gruppe II splicing benutzt Positionen die
möglicherweise von Purin oder Pyrimidin besetzt werden kann.
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3´End Formation
PAP: Poly-A-Polymerase
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- BLÄSI: FOLIENSATZ 5 -
mRNA
Translation in Eukaryoten
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Der eukaryotische IF eIF1 sowie der Faktor aeIF1 in Archaea sind homolog dem prok. Faktor IF3 und
diskriminieren somit gegen alle tRNAs außer für AUG bzw. unterstützen die Bindung der Initiator-
tRNA an die 40S UE. eIF2 ist ein Komplex aus 3 UE und transportiert die Initiator-tRNA zum Ribosom.
Durch Spaltung von GTP kann es wie IF2 wieder aus dem Ribosom freigesetzt werden. eIF2B recycelt
eIF2 indem es bei diesem GDP mit GTP austauscht. Viren können bewirken, dass eIF2B GDP
permanent bindet und nicht mehr zur Aktivierung von eIF2 zur Verfügung steht. eIF3 unterstützt die
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Bindung der 40S UE an die mRNA. eIF4 ist eine Helikase, die Sekundärstrukturen der mRNA
aufzulösen, damit das Ribosom die mRNA ungestört translatieren kann. eIF4B fördert die die Aktivität
der Helikase. eIF4e bindet die CAP Struktur. eIF4F dient als Adapterprotein mehrerer Faktoren.
Translationsinitiation in Eukaryoten
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Rekrutierung und enthält Bindestellen für m´G CAP- Bindeprotein eiF4E, eIF4A, das Poly (A)
Bindeprotein (PABP) und die eIF4E Kinase MNK1. 4E-BP konkurriert mit eIF4G um die Bindung an
eIF4E. Phosphorylierung von 4E- BP schwächt die eIF4E Bindung, dies erlaubt es eIF4E mit eIF4G zu
interagieren und Translation zu promoten. Phosphorylierung von eIF2α konvertiert eIF2 in einen
Inhibitor seines Guanin- Nukleotid exchange factor eIF2B.
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Basenpaarung
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Caspase (Apoptose)
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Klassifizierung eines tier. Picornavirus. Die prinzipiellen Gattungen sind in bold gezeigt. Mit
Ausnahme des Mengovirus gibt es für jede Spezies mehrere verschiedene Stämme oder Serotypen.
Der phylogenetische Baum basiert auf dem Vergleich von Nukleotidsequenzen einer Capsid- Protein
coding regions.
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Schematische Illustration einer eukaryotischen mRNA Translation und major Stellen der viralen
Regulation.
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Coordinate regulation of
transferrin receptor and
ferritin synthesis through
translational controls
operated by the iron-
responsive elements (IREs)
and by the iron regulatory
proteins IRP1 and IRP2.Only
one IRE is present in the 5'-
UTR of ferritin mRNA. When
cellular iron is scarce, IRP
molecules are available for
binding the 5' IRE; initiation
of translation is prevented;
and ferritin synthesis is
inhibited. By contrast, presence of abundantintracellular iron prevents binding of IRPs to the 5' IRE
and allows efficient mRNA translation to proceed (green arrow). Five IREs are present in the 3'-UTR
of transferrin receptor (TfR) mRNA. When cellular iron is scarce, bindingof one or more IRPs to the
IREs in the 3'-UTR stabilizes TfR mRNA and increases TfR translation. Conversely, when iron is
abundant, very few IREs are occupied by IRPs, and TfR mRNA is rapidly degraded.
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Eukaryoten besitzen
Endonucleasen sowie
Exonucleasen, die mRNA
nicht nur vom 3' Ende
sondern auch vom 5'
Ende her abbauen
können. Wie schon
erwähnt, ist die Stabilität
von eukaryotischer mRNA
durch CAP und PolyA im
Vergleich mit
prokaryotischer mRNA
erhöht. mRNA liegt über CAP, Poly A, PABP und eIF4G gebunden zirkulärisiert vor. Je länger der Poly
A Schwanz ist bzw.je öfter das 3' UTR motif vorkommt, desto stabiler wird die mRNA. Das 5' Ende ist
daher üblicherweise für Exonuclease nicht zugänglich. Für den Abbau muss diese Zirkularisierung
gelöst werden. Der PolyA Schwanz wird so weit verkürzt, dass keine Interaktion zwischen PABP und
eIF4G mehr stattfinden kann. Anschließend wird der Methyl-7-Guanosyl-Rest des CAP durch ein
decapping enyzme entfernt. Erst jetzt kann die mRNA vom 5' Ende oder auch vom 3' Ende her
abgebaut werden.
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T ½ … Halbwertszeit
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Bereits während dem Spleißen binden Proteinkomplexe (EJC) oberhalb der Splice sites an die mRNA,
die anschließend aus dem Nukleus transportiert wird. Im Cytosol binden weitere Proteinfaktoren an
die mRNA. Wird dabei ein Stopcodon entdeckt, wandert der Faktor hUpf1 downstream entlang der
mRNA. Kommt er dabei an einen EJC, war das Stopcodon vorzeitig, hUpf1 wird phosphoryliert und
beschleunigt decapping und Abbau der mRNA.
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Eine weitere Variante des Abbaus von mRNA mit vorzeitigen Stopcodons ist, dass der Abbau durch
Interaktionen des Ribosoms ausgelöst wird. Kommt das Ribosom während der Translation an ein
Stopcodon, prüft es entweder selbst, ob sich downstream cis-aktive Sequenzen befinden
(downstream sequence element mit gebundenem Protein), die anzeigen, dass es sich bei dem
Stopcodon um einen Fehler handeln muss und initiert in diesem Fall decapping und Abbau von
beiden Enden her (bei Hefe). Bei Säugetieren wird der Faktor UPF1 vom Ribosom an einem
Stopcodon rekrutiert, der wie oben bereits beschrieben downstream wandert und den Abbau der
mRNA initiert, wenn er einen EJC erreicht.
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siRNA Expression
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