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VO GENEXPRESSION

300123
SS12

Claudia Knoglinger

TEIL BLÄSI

(Alle Abbildungen wurden den Folien von Prof. Bläsi entnommen; dieses Skript ist
außerdem eine Zusammenstellung aus Sonnbert- Skript, Folien und Audiofiles)
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

- BLÄSI: FOLIENSATZ 1 -

3 Stufen der Genregulation

In allen Organismen ist die genetische


Information als DNA gespeichert. Diese
wird durch die Replikation an alle daraus
resultierenden Zellen weitergegeben. Um
nun daraus das Protein zu erhalten, muss
die DNA zuerst in mRNA umgeschrieben
werden, welche danach in Protein
translatiert wird. Je nachdem wie viel
dieser mRNA in Protein übersetzt wird, so
effektiv ist das Gen. Dies alles zusammen
nennt man Genexpression. Die
Genexpression muss oft geändert werden
als Anpassung an unterschiedliche
Umweltbedingungen (Temperatur,…).

Unterschiede Prokaryoten und Eukaryoten

Die Gene in Prokaryoten sind


meist in Operons angelegt.
Daher erhält man in diesem
Fall eine bicistronische
mRNA. Die Transkription &
Translation sind gekoppelt
(im Cytoplasma) und
unterliegen somit einer
Regulation.

Bei Eukaryoten befinden sich


Exons und Introns auf der DNA.
Die RNA PolII ist die wichtigste.
Beim Splicing werden die
Introns (Lariatstruktur)
entfernt und die Exons wieder
zusammengefügt (reife mRNA).
Die reife mRNA wird nun ins
Cytoplasma transportiert. Es
existieren alternative
Splicingvarianten als
Regulation.

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Translationssysteme: benötigte Faktoren

IF2 ist sehr konserviert in allen


Organismen. In Prok. ist die Anzahl
der Faktoren was die Initiation
betrifft wesentlich geringer als in
Eukaryoten. In Prokaryoten wird
das 5´Ende von einem Triphosphat
geschützt. In Eukaryoten befindet
sich das Cap (Methylguanosin) am
5´Ende. Dieses wird von IFs
erkannt und über diese Faktoren
wird das Ribosom rekrutiert.
Damit beginnt der Scanning
Mechanismus, der Komplex
wandert der mRNA entlang und
erwischt das erste Startcodon
(AUG). Es kommt zu einer Codon-
molecular mimikry: viele Moleküle sehen sich ähnlich Anticodon- Interaktion und damit
und binden an dieselben Stellen wird die Translation initiiert.

Ribosomale Rekrutierung an mRNA in Pro- und Eukaryoten

Anti- Shine-
Dalgarno

Anticodon- Loop

Shine- Dalgarno

Cap

Prokaryoten: Initiation der Translation beruht sehr stark auf rRNA/ mRNA Interaktionen.
Verschiedene Merkmale machen eine RBS aus: die Interaktion mit dem Startcodon wird von der
Initiator- tRNA bewerkstelligt. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die Shine- Dalgarno Sequenz

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(AGGAGGU; nach den Entdeckern 1974 benannt), welche komplementär zu einer ssRegion (nach
Helix 45) auf der 16S rRNA (rRNA der 30S UE) ist. Die SD ist in einem Abstand von 5-9 Basen upstream
vom Startcodon, dadurch wird die ribosomale UE so positioniert, dass die Initiator- tRNA genau über
dem AUG zu sitzen kommt. Die SD ist aber nicht immer 100% komplementär zur 16S rRNA und
bestimmt daher auch die Effizienz der Initiation der Translation. Die mRNA kann stark intramolekular
agieren, d.h. sie bildet Strukturen aus und diese können verhindern, dass das Ribosom sich auf die
Bindungsstelle setzen kann.

Eukaryoten: Initiation beruht sehr stark auf Protein/ Protein Interaktionen. Bei der Cap- abhängigen
Initiation erkennt zuerst eIF4E (euk. IF) das Cap (7- Methylguanin). eIF4A bindet downstream davon
an die mRNA. eIF4G interagiert mit dem 40S- Komplex. Sobald die UE gebunden hat, kommt es zum
Scanning und beim ersten AUG beginnt die Translation. Die IRES (=internal ribosomal entry site)-
abhängigen Initiation fand man zuerst bei Viren (Picornavirus hat mRNA ohne Cap). Man fand IRES-
Strukturen (starke Sekundärstrukturen) die ein Cap teilweise nachahmen. IFs binden an die IRES und
führen zum Binden der 40S UE. Diese IRES Sites befinden sich direkt vor dem AUG und schließen
dieses auch manchmal in die Struktur mit ein.

Translation in Prokaryoten

 Komponenten: mRNA, tRNA (übersetzendes Element zw. Codon und AS), Ribosomen, IF1-3
 Initiation: Regulatorische Mechanismen
 Elongation: EF (EfTu, EFTs, EFG)
 Termination: RF (RF1-3; RF= recycling factor), RRF

tRNA als Adapter für das Codon

Am 3´Ende findet man die


hochkonservierte CCA-
Erkennungsmerkmal Sequenz. An dessen Adenosin
für die Formylase; wird die AS kovalent
nicht gepaart gebunden Eine so beladene
tRNA wird als Aminoacyl-
tRNA bezeichnet. Met wird
vom Codon AUG kodiert und
dabei gibt es 2 verschiedene
tRNAs die für Met kodieren.
Die fMet- tRNA dient als
Initiator- tRNA wohingegen
Met- tRNA nur intern
GC: starke Bindung
Nur fMet- tRNA kann (Elongation) agieren kann. Die
zu Beginn auf der P- Site beiden Formen unterscheiden
sitzen sich in einigen Eigenschaften
(grün).

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Tertiärstruktur der tRNA: L- Form. ¼ der Nukleotide in


der tRNA sind modifiziert. Die tRNAs haben eine
Durchschnittslänge von 76 Nukleotiden. Durch
Interaktion des D- Loops und des TψC- Loops kommt es
zu dieser L- Form.

Die Modifikationen im Anticodon tragen zur Selektivität


bei und verstärken die WW von Anticodon und Codon.

Modifikation

Chromosomale Lokalisation von tRNA Genen in E.coli

Sie sind über das gesamte


Chromosom von E.coli
verteilt. Viele davon sind in
ribosomalen Operons
lokalisiert (rrn). In diesen
sind die rRNAs gekoppelt.

Unten: Von den beiden


Promotoren P1 und P2 wird
die RNA synthetisiert. Diese
Precursor- RNA wird dann
durch RNAsen prozessiert.

für kl. UE für gr. UE

tRNA Prozessierung
RNAseP

ACC

RNAseD

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Die tRNAs werden als lange Precursor hergestellt und durch 2 Enzyme prozessiert: RNAseP besteht
aus einem Protein und einer RNA (Ribonukleoprotein). Dabei ist die aktive funktionelle Komponente
die RNA. Sie katalysiert den Schnitt am 5´Ende, determiniert das 5´Ende. RNAseP ist hochkonserviert,
man findet sie in allen Organismen. RNAseD erkennt das 3´Ende und verdaut bis sie das CCA- Ende
erreicht hat.

Beladen der tRNA

Die AS wird durch eine kovalente Esterbindung an das


CCA- Ende (Adenosin) geladen. Dafür gibt es Aminoacyl-
tRNA- Synthetasen die diese Beladung durchführen.

Adenosin

Die Bedeutung der tRNA wird durch ihr Anticodon und


nicht durch seine AS determiniert: bindet die Synthetase
eine falsche AS kommt es zum Einbau einer falschen AS.

Synthetasen sind ganz spezifisch


für die einzelnen tRNAs, d.h. sie
müssen ganz genau erkennen,
welche tRNA bindet. Es gibt 3
Erkennungsstellen an so einer
Synthetase: Erkennungsstelle für
die tRNA, Erkennungsstelle für die
AS und eine AMP- Bindestelle. Für
diese Interaktionen sind nun auch
die verschiedenen Modifikationen
zuständig.

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Beispiel: Glutaminyl- tRNA- Synthetase- tRNA- Komplex

Es gibt nun für Glutamin


verschiedene tRNAs da es mehrere
Codons gibt, um Glutamin zu
decodieren. Daher müssen alle
tRNAs die Glutamin decodieren,
eine gemeinsame spezifische
Sequenz haben, die die Aminoacyl-
Synthetasen erkennen. Hier ist dies
das Nukleotid 20.

tRNA Synthetasen

In diesen Synthetasen gibt es 4 verschiedene


Domänen: katalytische Domäne (katalysiert
Bindung der AS an tRNA), …

Es 2 verschiedene Klassen von Synthetasen,


welche sich in der Art der Bindung an die tRNA
und dem Vorkommen als Monomere,
Homodimere, Homotetramere, Heterotetramere
unterscheiden.

Klasse I und Klasse II Aminoacyl- Synthetasen

Klasse I lagert sich


hauptsächlich in der
minor groove des
acceptor stems und
am Anticodon an
und Klasse II lagert
sich in der major
groove der
acceptor helix und
am Anticodon loop
an.

Klasse I Klasse II

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Schritte während des Beladens der tRNA

Bindestellen der
Synthetasen

Beladung einer tRNA: Bildung von Aminoacyl-AMP Veresterung der AS mit AMP Bindung der
tRNA an Aminoacyl-AMP Veresterung der AS mit dem 3' Ende der tRNA

Proofreading (bei falschen AS)

Da auch immer wieder falsch beladene tRNAs ankommen,


gibt es das sogenannte Proofreading das sicherstellt, dass
die richtig beladene tRNA gebunden wird. Die Erkennung
der richtigen tRNA durch Synthetasen wird in 2 Schritten
kontrolliert. Erstens hat das Enzym eine größere Affinität
für seine verwandte tRNA, zweitens ist die
Aminoacetylierung der inkorrekten tRNA sehr langsam.

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Wenn die Synthetase eine falsche AS bindet, benötigt


das Binden der verwandten tRNA Proofreading. Dies
passiert entweder durch eine Konformationsänderung,
welche zur Hydrolyse des inkorrekten Aminoacyl-
Adenylats führt, oder durch Transfer der AS zur RNA und
folgender Hydrolyse.

Das Proofreading der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen ist


ausgezeichnet: Die Fehlerrate liegt bei nur 1:60000.

Nonsense Suppression (anstelle eines Stopcodons wird trotzdem eine AS eingebaut)

Das UUG Codon wird durch ein Anticodon in Leucin


translatiert. Dies ist ein Mechanismus wie man Mutationen
in ein Protein hinein bringen kann. Wenn man nun statt
Leu eine andere AS in das Protein einbauen will, setzt man
statt UUG ein UAG hinein. UAG ist normalerweise ein Stop-
Codon. Nun stehen aber Suppressormutanten zur
Verfügung, welche tRNAs sind die in ihrem Anticodon ein
Nukleotid ausgetauscht haben. Diese tRNA kann an das
Stopcodon binden und anstelle des Leu ein Tyr in das
Protein einbauen. Damit kann man Punktmutationen in
einem Protein generieren. Es gibt in E.coli für alle 21 AS
Suppressor- tRNAs.

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Ribosomen

Prokaryotisches Ribosom mit 70S: S stammt


von Svedberg- Units. Die 30S RNA hat als
funktionelles Grundgerüst die 16S RNA, an
welche 21 verschiedene Proteine binden. S
steht hier für small Subunit. Die Proteine der
großen UE haben das Präfix L für large Subunit.
Schon während der Transkription kommt es zur
schrittweisen Assemblierung der ribosomalen
Proteine. Dabei gibt es Checkpoints, welcher
sicherstellen, dass die Assemblierung zu einem
bestimmten Zeitpunkt richtig abläuft. Die 50S
UE hat das Peptidtransferase- Zentrum, in dem
es zur Peptidbindung kommt.
wird durch das gleiche Gen kodiert
kommt in der gr. und kl. UE vor

1999 wurde die Struktur des bakteriellen Ribosoms vorgestellt und V. Rhamakrisnan, J. Steitz und A.
Jonath bekamen dafür den Nobelpreis (2009). Man kann die Komplexe kristallisieren und durch
Röntgenstrukturanalyse untersuchen. Diese Strukturen geben uns einen Einblick was die Funktionen
sein könnten. Warum war diese Strukturauflösung so wichtig?

Da das Ribosom hochkonserviert ist und


viele funktionelle Bereiche hat, ist es ein
gutes Ziel für verschiedene Antibiotika.
Antibiotika inhibieren die Translation und
durch das Kennen der Struktur kann man
spezifischere Antibiotika herstellen.

Braun: rRNA; bunt: Proteine Das


Peptidyltransferase- Zentrum besteht nur
aus rRNA, das beweist wieder, dass die
katalytische Domäne die RNA ist.

Übersicht über das ganze 70S Ribosom

In einem Ribosom können nie 3 tRNAs gleichzeitig


binden. Entweder sie sind A- und P- Site
gebunden oder P- und E- Site gebunden.

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Strukturelles Mapping der 16S RNA durch „chemical probing“

Die rRNA besteht aus variablen und konservierten


Bereichen.

Die Sekundärstruktur der 16S RNA kann man in


verschiedene Domänen einteilen: body, shoulder
(central domain), head (3´mature).

Hier an diesen einzelsträngigen


Bereichen können die Reagenzien
binden.

Helix 44 ist wichtig für den


Kontakt mit der 50S UE

Chemical probing: Schematisch dargestellte


RNA: diese bildet eine Helix aus in der die
Nukleotide interagieren. Die Bereiche die
interagieren sind nun geschützt gegen
Chemikalien die Nukleotide angreifen. Die
verwendeten Chemikalien sind modifizierende
modifiziertes Nukleotid
Reagenzien wie Kethoxal, DMS oder CMCT. Sie
modifizieren freie Nukleotide. In den meisten
Fällen ist die Modifizierung eine Methylierung.

Wie kann man diese Methylierungen nun detektieren? Man macht


sich ein Enzym aus Viren zu Nutze: Reverse Transkriptase. Dieses
Enzym schreibt die RNA in eine cDNA um. Man hat einen kurzen
radioaktiv markierten Primer (spez. Oligonukleotid) damit die RT
am 3´Ende des Primers ansetzen kann. Die RT kann nicht über ein
modifiziertes Nukleotid drüber lesen und es kommt zum Abbruch
der RT- Reaktion.

Freie 16S rRNA und 16S


rRNA wie sie in 30S UE
vorhanden ist.

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23S rRNA

Peptidyl- Transferase-
Zentrum: hier kommt am
Ende die wachsende
Peptidkette raus

Grau: rRNA, bunt: ribosomale Proteine. Hier


sieht man sehr gut, dass sich die ribosomalen
Proteine an der Außenseite anlagern. S12 ist
das einzige Protein das an der Subunit-
Interface zu finden ist und intern gebunden ist.
Es interagiert mit IF2 und trägt zum
Proofreading bei.

Binden von Antibiotika an die 30S UE (A. Jonath)

ASL= Anticodon
stem loop.
Antibiotika binden
genau in der
Coding- Region
und inhibieren
diese Funktion.

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Die für die Translation benötigten


Komponenten: eine bakterielle Zelle ist
vollgestopft mit Synthesemaschinen.

Wenn sich Zellen schnell vermehren


brauchen sie auch mehr Ribosomen. Dies
unterliegt einer strikten Kontrolle.

1:1 Ratio

Einstellen der Ribosomen und der tRNA auf physiologische Bedürfnisse

Stop des Ribosoms mitten in


der Translation
Wie kommt man nun zu dieser stöchiometrischen Relation?
Es gibt einen Mechanismus, der versichert, dass rRNA und
ribosomale Proteine in gleicher Menge vorhanden sind:
stringent response (stringent= strikt). Wenn es der Zelle
schlecht geht, wird gleichzeitig die Transkription der rRNA/
tRNA inhibiert und auch die Promotoren für ribosomale Proteine lahmlegt. Es wird alles gleichzeitig
heruntergefahren. Das System muss nun erkennen, ob Ribosomen gebraucht werden oder nicht. Um
ein neues Ribosom herzustellen braucht die Zelle extrem viel Energie und wenn es der Zelle schlecht
geht und Ribosomen nicht gebraucht werden, möchte die Zelle diese Energie natürlich einsparen.
Um das zu koordinieren, gibt es den stringent response. Er basiert auf der Aktivität von 3 Proteinen,
das wichtigste dabei ist das relA. Dies ist ein Protein das pppGpp (Guanosinpentaphosphat)
synthetisiert, wenn das Ribosom stoppt.

Wie kommt es nun so einer sogenannten Ielling- Reaktion? Die Zellen wachsen zum Beispiel in einem
Nährmedium, in dem plötzlich eine AS fehlt. Dadurch kann die korrespondierende tRNA nicht mehr

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mit der AS beladen werden und es entstehen unbeladene tRNA eine nicht beladene tRNA sitzt an
der A- Site, daher kommt es nicht zum Transfer der Peptidkette und die Translations- Reaktion ist
unterbrochen (Ribosom steht). Es kommt zur Konformationsänderung und zur Interaktion mit relA.
relA macht nun pppGpp
(Hungersignal), welches
an die RNA- Pol bindet
und verhindert, dass sie
an den Promotoren 1-2
transkribieren kann. SpoT
ist ein bifunktionelles
Enzym.

Translationale Autoregulation von ribosomalen Protein- Genen

Markiert sind die Bereiche,


die wichtig für die Bindung
von S7 an das Ribosom sind.
S7 ist ein ribosomales
Protein, dessen
Repressoren autoreguliert
sind. Ist ausreichend rRNA
vorhanden, assoziiert S7 mit
einer Sekundärstruktur der
16S rRNA. Ist die S7
Konzentration höher als die
der 16S rRNA, bindet das
freie S7 an die eigene mRNA
an einer der 16S rRNA
ähnlichen Sekundärstruktur
und inhibiert so die eigene
Translation. Dabei ist zu
beachten, dass S7 eine
höhere Affinität zur 16S
rRNA als zur eigenen mRNA
aufweist, dadurch wird S7
immer an 16S rRNA
gebunden sein, wenn sie in
ausreichenden Mengen
vorliegt.

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Translations- Initiation in Prokaryoten benötigt formylierte fMet- tRNAfMet

fMet-tRNAf hat einige Eigenschaften die sie als


Initiator- tRNA kennzeichnen und von anderen
unterscheiden.

fMet-tRNAf wird durch Formylierung der Met-tRNA


generiert. Dabei wird Formyl- Tetrahydrofolat als
Cofaktor verwendet.

Neu synthetisierte
Proteine in Bakterien
starten mit Formyl-
Met, aber die
Formylgruppe und
manchmal auch das
Met wird während
der Proteinsynthese
entfernt.

Nur die fMet-tRNAf kann bei der


Initiation (30S) verwendet werden
und nur andere Aminoacyl- tRNAs
(aa-tRNA) können bei der Elongation
(70S) verwendet werden.

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Funktionen der Initiationsfaktoren IF 1- 3

Prinzipieller Ablauf der Initiation: 30S UE


komplexieren mit IF1 und IF3. Bindung von IF2-GTP
an den Komplex. IF2- überwachte Bindung von
fMet-tRNA an die P-Site. Bindung der 50S UE,
Bildung des 70S Ribosoms unter GTP-Hydrolyse und
Konformationsänderung, IF2-3 werden freigesetzt.

IF1: besetzt die A- Stelle

IF2: tRNAi Bindung/ Selektion auf tRNAi

IF3: kinetische Diskriminierung gegen Elongator


tRNAs (gegen alle Codons die keine Startcodons
sind); Konformationsänderungen in der 30S UE;
verhindert Assoziation von 30S/ 50S UE

IF1 ist ein sehr kleines


Protein (ca. 70AS). Er
bindet an der A- Site. IF1
blockiert zusammen mit
IF2 die rib. A- Site während
der Translationsinitiation.

Durch Chemical Probing


kann ermittelt werden,
dass IF1 die A-Site besetzt:
IF1 zu Ribosomen
hinzufügen, DMS dazu,
Reverse Transkription,
man findet keine
Methylierungen an der A-
Site der 16S rRNA IF1
muss also dort binden.

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IF1 gebunden an die 30S ribosomale


UE

IF1 und strukturelle


Homologe:

Protein aus Euk. cold- shock- protein

(A) Struktur von IF1


gebunden an die 30S
UE

IF1
Loop 530

Helix 44

IF2 erkennt fMet- tRNA- fMet, stimuliert die Bindung an


die P- Stelle und diskriminiert durch die Kraft der
Formylgruppe. IF2 stimuliert die Bindung der tRNAi an
das Ribosom, es bindet die tRNAi über seine C-terminale
Domäne.

IF2 ist der größte


IF in Prokaryoten
(multi- domain-
protein; MW ~80
000).

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IF3 ist ein „fidelity- Faktor“: er hat 2 Domänen


die einen flexiblen Linker haben. Er bindet mit
dem N- terminalen Ende an den Kopf der rib.
UE und mit dem C- terminalen Ende an den
Körper Head- to- Body- movement. Diese
Konformation kann nur eine Initiator- tRNA
überstehen.

IF3- Diskriminierung gezeigt anhand eines Reportergen- Assays

Dieser fidelity- Faktor hat


auch eine Autoregulation.
IF3 diskriminiert gegen nicht-
kanonische AUU (bzw. alle
Startcodons außer AUG).
Eine Bindung von IF3 führt zu
Konformationsänderung im
Ribosom, AUU wird dadurch
nicht mehr als Startcodon
erkannt. IF3 diskriminiert
gegen alle Startcodons mit
Ausnahme von AUG, durch
die Konformationsänderung kann nur noch fMet-tRNA an der P-Site binden. Ist die IF3 Konzentration
in der Zelle hoch ist, wird AUU als Startcodon nicht akzeptiert. Ist die Konzentration niedrig, wird
auch AUU als Startcodon akzeptiert. Nachdem die mRNA die für IF3 codiert selbst ein AUU als
Startcodon verwendet, reguliert sich die Synthese von IF3 somit selbst.

IF3- Diskriminierung gezeigt anhand des Toeprinting- Assays

Es wird eine mRNA mit


bekannter Sequenz und
eine rRNA- Bindungsstelle
verwendet. Passend dazu
wird ein Primer mit 32P-
Markierung synthetisiert.
Eine hohe Konzentration
mRNAs mit 30S UE und
fMet-tRNA werden
gemischt und RT,
rad. Markierung markierte Primer und
Nukleotide hinzugefügt.
Die 30S UE bildet mit
fMet-tRNA und mRNA einen ternären Komplex. Dieser ist so stabil, dass die RT an der Bindungsstelle
des Ribosoms abbricht. Ist keine 30S UE an die mRNA gebunden, erhält man mittels der RT eine

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cDNA, die der Länge der mRNA entspricht. Mit 30S UE und fMet-tRNA erhält man eine kürzere cDNA
die als Toeprint- Signal bezeichnet wird. Das 3' Ende der verkürzten cDNA entspricht der Position, an
der die 30S UE an die mRNA gebunden ist. Über Southern- Blot kann die verkürzte cDNA mit der
normalen cDNA verglichen und die Position bestimmt werden. Je nachdem wie hoch die
Ribosomenkonzentration gewählt wird, wird die Masse der mRNAs mehr oder weniger mit einem
ternären Komplex besetzt sein. Das wiederum resultiert in untersch. Toeprinting- Signalen.

Selektion von Initiator tRNA durch E.coli IFs


Führt man einen Toeprint-Assay mit
untersch. 30S UE und einem tRNA-Mix durch, so
tRNAs erhält man durch die Reverse
Transkriptase viele unterschiedlich
lange cDNA- Stücke, da die 30S UE mit
jeweils verschiedenen tRNAs irgendwo
auf der mRNA an den tRNAs
passenden Codons einen Komplex
bildet. Fügt man zu 30S UE und tRNAs
zusätzlich IF3 in ausreichender
nur mehr das Signal
Konzentration hinzu, erhält man fast
das AUG entspricht
ausschließlich gleich lange cDNA
Stücke, da IF3 für fMet-tRNA
diskriminiert und sich der ternäre Komplex daher nur über dem AUG Startcodon der mRNA bilden
wird. Mit Hilfe dieses Tests kann auch auf andere in trans agierende Proteine in Bezug auf
translationale Initiation getestet werden. Das abgebildete Experiment zeigt, dass IF3 auch gegen
AUGs ohne SD- Sequenz diskriminiert und somit tatsächlich nur AUGs als Startcodon zulässt.

Initiation der Proteinsynthese in Bakterien

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Interaktionen der Initiator tRNA

(A) (A) Oberflächen-


Darstellung der Initiator-
tRNA: die Regionen mit
den dargestellten
Komponenten der
translat. Maschinerie
sind in rot dargestellt
(B) und die
Nukleotidpositionen auf
der tRNA stehen neben
der Struktur. (B)
Detaillierte Darstellung
der Interaktion zwischen
Initiator- tRNA und dem
Ribosom: Links ist eine
Oberflächen-
Darstellung, welche die wichtigsten Stellen für Interaktionen in rot zeigt. Rechts die Initiator- tRNA
auf dem 70S Ribosom (tRNA in rot, mRNA in gelb, 16S rRNA in cyan, 23S rRNA in grau).

Entschlüsselung des genetischen Codes

Durch die 4 Basen erhält man 64 Möglichkeiten


der Codierung. Zunächst wird das Enzym
Polynukleotid- Phosphorylase benötigt, das
Nukleotide miteinander verknüpft. Nachdem bei
einem Gemisch aller vier RNA Basen (A, G, C, U)
nicht vorhersagbar ist, welche Sequenz man
erhält, wurde zunächst mit homogenen
Nukleotiden gearbeitet. Im konkreten Fall mit U,
man erhielt Poly- U-RNA Sequenzen. Aus E.coli
wurden Extrakte isoliert, welche die gesamte
Translationsmaschinerie enthielten, mit den Poly-
U Sequenzen vermischt und anschließend jeweils
eine radioaktiv markierte AS hinzugefügt.

Dr. Ochoa, Dr. Nirenberg:

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

mRNA: Daraufhin wurde geprüft, welche AS mit den


Poly- U- RNAs translatiert wurde indem das Gemisch
nach einiger Zeit durch einen Nitrozellulosefilter
geschickt wurde. Nicht- gebundene tRNA passiert
Filter, gebundener ternärer Komplex (Ribosome,
tRNA, mRNA) passiert den Filter nicht. Durch
radioaktiv markierte AS konnte der Komplex
nachgewiesen werden. So wurde ermittelt, dass
Poly- U für die AS Phe codiert.

Dr. Leder

Der genetische Code

Codons sind der universelle gen. Code, er ist bis auf wenige Ausnahmen in jedem Organismus gleich.
Der gen. Code ist redundant (=mehrfach vorhanden), es gibt meist mehrere tRNAs die für eine AS
codieren. Es gibt 64 tRNAs (61 tRNAs für AS sowie 3 Stopcodons- tRNAs (UAA, UAG, UGA)). Nicht
jedes Codon wird in gleicher Anzahl verwendet bzw. übersetzt. AGA wird im Vergleich mit AGG zu
0,1% zu Arg translatiert.

Häufig gebrauchte Produkte: werden durch häufig vorkommende Codons kodiert. Selten oder in
geringer Konzentration benötigte Produkte (z.B. Repressoren): werden durch selten vorkommende
Codons kodiert, es findet sich auch eine entsprechend geringe tRNA- Konzentration für dieses Codon.

Wobble Hypothese: An der 3. Stelle des Codons / Anticodons sind neben den normalen GC bzw. AU
Bindungen noch andere Paarungen möglich. Aus diesem Grund hat die letzte Stelle eines Codons die
geringste Aussage über die zugehörige AS.

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- BLÄSI: FOLIENSATZ 2 -

Ribosomenrekrutierungssignal auf prokaryotischer mRNA: Wie findet man den richtigen


Start/ reading frame?

Auf der mRNA der beiden Phagen


befinden sich überlappende Gene. Wie

können diese Gene nun doch separat in


Proteine übersetzt werden? Das
Ribosom muss vor dem AUG Signale
erkennen, damit es binden kann. Jedes
Gen muss also eine eigene RBS haben.
Die SD ist komplementär zum 3´Ende
der 16S rRNA. Mithilfe dieser Interaktion
kann das Ribosom den Start erkennen.
Die Shine- Dalgarno/ Anti- SD Interaktion

Die RBS auf der mRNA kann vom


Initiationskomplex wiedergefunden werden.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Biochemischer Nachweis SD/ Anti- SD Interaktion durch Footprinting

Reagiert Sauerstoff mit Fe3+-Ionen, erhält


man Wasserstoffperoxid, das weiter zu
Wasserstoffhydroxylionen und
.
Hydroxyradikalen reagiert. OH spalten
Ribose an C1 und C4 und greifen damit auch
das Rückgrat der RNA an. Mittels OH. kann
dadurch ungeschützt vorliegende RNA an
zufälligen Stellen gespalten werden. mRNA
wurde an einem Ende markiert und mit
Ribosomen und Radikalen vermischt. Aus
der erhaltenen Lösung wurden die mRNA
Fragmente isoliert und mittels Gel getrennt. Dabei zeigte es sich, dass Banden
in einem best. Bereich fehlten – in diesem Bereich also keine Spaltung der
mRNA stattgefunden hatte und nur größere oder kleinere mRNA Fragmente vorlagen. Dieser Bereich
wurde durch das Ribosom überdeckt und war für die Radikale nicht zugänglich. Der Bereich der vom
Ribosom verdeckt war erstreckte sich von -35 bis +20 in Bezug auf das AUG Startcodon der mRNA.

Genetischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion

Spezialisierte Ribosom-
Systeme: präferentielle
Translation einer einzigen
mRNA Spezies durch eine
Subpopulation von
mutierten Ribosomen in
E.coli.

Zum Nachweis der direkten


Interaktion von SD und
Anti-SD wurde eine
komplementäre Mutation
in vitro durchgeführt. Es
wurde das rru-Operon auf
ein Plasmid kloniert. Dabei
wurde die Anti-SD Sequenz
der 16S rRNA zu einer SD
Sequenz verändert. E.coli besitzt sieben Operons für die Transkription von rRNA, es sollen aber nur
die durch das Plasmid eingebrachten rRNA Transkripte funktionsfähig sein. Zu diesem Zweck wurde
ein weiterer Basenaustausch auf der 16S rRNA des Plasmids vorgenommen (Mutation C →U an

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Position 1192). Dieser vermittelt eine Resistenz gegen Spectinomycin. Abschließend wurde dem
Plasmid ein Reportergen (hGH, menschliches Wachstumshormon) mit einer eine Anti-SD Sequenz
hinzugefügt. Wurde nur das Reportgen mit Anti-SD Startsequenz in wt E.coli eingebracht, fand keine
Translation statt, die wt Ribosomen interagierten nicht mit der Anti-SD Sequenz. Wurden
Reportergen mit Anti-SD Startsequenz und 16S rRNA mit SD- Sequenz und Basenaustausch wt E.coli
eingebracht und diese auf Medium mit Spectinomycin gezüchtet, so erhielt man das Hormon. Durch
das Spectinomycin waren nur die eingebrachten Ribosomen funktionsfähig, weiters konnte die SD
Sequenz auf der 16S rRNA mit der Anti-SD Sequenz des Reportergens interagieren und Translation
stattfinden. Ähnlich kann man Protein-Protein-Interaktionen identifizieren. Findet man in einem
Protein eine Mutation, die nur mit einer Mutation in einem anderen Protein funktionsfähig ist, kann
man Annehmen, dass an dieser Stelle zwischen den beiden Proteinen Interaktion stattfindet.

Biochemischer Nachweis der SD-Anti-SD-Interaktion durch chemical probing in- vitro

Sekundärstruktur

Man nimmt verschiedene Reagenzien, welche nach spezifischen Basen in der RNA schneiden, aber
nur dann wenn diese Basen einzelsträngig vorliegen. Zunächst werden in ausreichender Menge
mRNA (1012-1014) und 30S UE vermischt, es bilden sich Komplexe durch Bindung der SD + Anti-SD
Sequenzen auf 30S UE und mRNA. Anschließend werden Reagenzien hinzugefügt, die nur
ungepaarte Nukleotide modifizieren können (sounds familiar). An der Stelle an der mRNA und 30S
einen Komplex bilden kann die mRNA nicht modifiziert werden. Dazu ist zu sagen, dass zufällige,
einzelne Basen modifiziert werden, es werden nicht alle ungepaarten Basen einer mRNA modifiziert.
Modifizierung: DMS – A, CMTC – U, Kethoxal – G. Werden anschließend die Komplexe getrennt und
zur mRNA Primer und Reverse Transkriptase hinzugefügt, erhält man je nachdem wo die
Transkriptase durch eine zufällige Basenmodifikation abbrechen muss, unterschiedlich lange Stücke

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

cDNA. Wird die cDNA auf einem Gel ausgewertet, erhält man durch die unterschiedliche Länge eine
Vielzahl an Banden, allerdings wird sich keine Bande an der Position der SD Sequenz finden, da hier
die Reagenzien niemals modifizieren konnten und die Reverse Transkriptase daher hier auch niemals
abbrechen musste.

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Translation ist die Initiation, d.h. je besser das
Ribosom die Translationsdeterminanten (SD, Startcodon) erkennt, desto besser & schneller wird die
mRNA translatiert & desto mehr Protein erhält man. Es gibt versch. Parameter die das beeinflussen:

Parameter die die Translationsinitiation einer kanonischen prok. mRNA beeinflussen

1. Start Codon: wie gut es decodiert wird von der Initiator- tRNA
2. SD: wie komplementär die SD ist
3. S1: ribosomales Protein
4. SD < > AUG: Abstand
5. Sekundärstrukturen: können verhindern, dass Ribosom binden kann
6. Sequenzen die sich in der Nähe der TIR (translationalen Initiationsregion) befinden
7. Translationale Repressoren
8. Riboregulation
9. Andere Kontrollmechanismen

1. Flexibilität des Start Codons

In Bakterien sind 90% der


Startcodons ATGs. Man
findet aber auch GTG (Valin)
und TTG (Leucin). Das hängt
damit zusammen, dass in der Wooble- Position andere Basen erlaubt sind. Sie werden aber trotzdem
durch die fMet-Initiator- tRNA erkannt, daher wird immer ein Met am Anfang eingebaut. IF1-3 stellen
sicher, dass immer die Initiator- tRNA am Anfang benutzt wird auch wenn ein GTG oder TTG Codon
vorhanden ist.

2. Stärke der SD/Anti- SD Interaktion

Die SD/ Anti- SD


Interaktion ist bei
gram- schwächer als
bei gram+. Wenn sie
zu stark (100%) ist,
geht es nicht mehr
weiter.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

3. Ribosomales Protein S1 (einziges rib. Protein mit einer zugeordneten Funktion)


S1 ist das größte Protein (61kDa) der
30S UE. Es bindet schwach an das
Ribosom durch Protein- Protein-
Interaktion. Ist das einzige Protein das
bei gram– nicht direkt an die 16S rRNA
bindet, sondern an das S2 Protein.
Über 6 RNA- bindende Domänen geht
es Bindungen mit der mRNA ein. S1
weist sogenannte RNA unfolding
capacity auf, es wird angenommen,
dass es einfache mRNA Sekundärstrukturen auflösen kann. Trennt man S1 vom Ribosom, kann dieses
nicht mehr an die mRNA binden, es findet keine Translation statt.

Isolierung & Analyse von Phagen RNA- Fragmenten crosslinked an S1 durch UV- Bestrahlung:

mRNA, 30S UE, fMet-


tRNA und IF3 werden
vermischt, es bilden
sich stabile Komplexe.
Anschließend wird
Crosslinking mittels
UV durchgeführt:
Aminogruppen die
eine WW mit mRNA
eingehen werden
dadurch permanent
mit der mRNA
verbunden. Durch
Zugabe von SDS oder
EDTA wird der ternäre
Komplex aufgetrennt,
nur Proteine die im
Zuge des Crosslinkings
fix mit mRNA
verbunden wurden
bleiben an der mRNA.
Aus der Mischung wird die mRNA grob über einen Succrosegradienten abzentrifugiert und die mRNA
aus dieser Fraktion über eine Sepharose-Protein-A Säule mittels AK gegen S1 getrennt. Freiliegende
mRNA wird durch RNAse vernichtet, durch S1 gebundene und damit unzugängliche mRNA bleibt
dabei intakt. Die verbleibende mRNA wird am 5' Ende markiert, es wird erneut SDS oder Harnstoff
hinzugefügt, wodurch sich S1 mit der mRNA vom AK löst, S1 + mRNA werden isoliert. Abschließend
wird die Lösung mit ProteinaseK versetzt, die das Protein S1 abbaut, die verbleibende mRNA Sequenz

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

wird sequenziert. Die Sequenzierung der erhaltenen mRNA ergab, dass die Sequenz an der S1 bindet
eine U-reiche Sequenz ist, die upstream des translationalen Startpunktes (der SD Sequenz) liegt.

Nukleotid Sequenzen innerhalb


von Qβ (A) und fr (B) RNAs sind
in der Interaktion mit dem S1
Protein involviert.

S1 wird für die Translationsinitiation der mRNAs mit einem strukturierten 5´UTR benötigt

UTR: untranslated region/ ompA: Banden werden mit zunehmender S1 Konzentration intensiver. cI:
Banden bleiben bei steigender S1 Konzentration in etwa gleich. ompA mRNA: S1 abhängig;
Sekundärstruktur an 5' UTR. cI mRNA: S1 unabhängig; keine Sekundärstruktur in 5' UTR.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

4. Abstand zwischen SD und Startcodon


Man eine unterschiedliche Anzahl an As zwischen die
SD und dem Startcodon gesetzt und erhielt
unterschiedlich starke Signale für diesen ternären
Komplex. Optimal ist ein Abstand von 7As (Toeprint-
Signal).

5. Sekundärstrukturen der mRNA können die Translationsinitiation durch Maskierung


der SD und/oder des Startcodons inhibieren
Da die SD oder AUG schon gebunden ist
(maskiert) kann das Ribosom nicht mehr
binden.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Regulation der Expression des Bakteriophagen T4 Lysozyms: Bildung einer Sekundärstruktur hängt
vom Transkriptionsstart ab

Lysozym ist am Ende


der Replikation des
Phagens wichtig, weil
es zur Freisetzung der
Phagen aus dem Wirt
beiträgt. Dieses Gen
wird durch einen
frühen und einen
späten Promotor
abgelesen. Bei mRNA-
1 kann das Ribosom
durch Ausbildung der
Sekundärstruktur
nicht binden. Das ist
nötig, weil der late Promotor für die Lyse verantwortlich ist und der Phage nicht gleich zu Beginn den
Wirt zerstören will. Daher wird die Translation des late Promotors zu diesem Zeitpunkt blockiert.
Später (mRNA-2) kann das Ribosom binden und Translation kann starten.

Inhibitorische Stem- loop Strukturen: unterschiedliche Stimuli fürs Öffnen und Schließen

Man hat im Prinzip 3


verschiedene Mechanismen wie
solche Strukturen aufgelöst
werden können. Die
Sekundärstrukturen sind nie
100% auf allen mRNAs
ausgebildet, d.h. man spricht hier
von „breathing“, sie gehen auf
und wieder zu. Auch
Umweltbedingungen führen
dazu, dass Sekundärstrukturen
aufgehen. Man spricht dann von
einem Thermosensor.
Sekundärstrukturen können auch
allosterisch reguliert werden
(Riboswitches).

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Das dual-start motif in λS

Das λS Gen weist 2 Initiationsstellen auf, wodurch 2


untersch. Genprodukte erzeugt werden können.
Die Regulation erfolgt über 2 SD Sequenzen: SD-
Met1 und SD-Met5 sind untersch. gut für
Ribosomen zugänglich; SD-Met1 liegt in einer
Sekundärstruktur. Das führt zu untersch.
Expression der 2 Produkte. Im Phagen λ liegt die SD
Sequenz des Lysegens S in einer solchen
Sekundärstruktur, Lyse kann nur stattfinden, wenn
die Sekundärstruktur aufgelöst wird.

Toeprint-
Analyse der
S+, M1L,
M3L und
M1,3 L
Allele.

Translationsregulation durch RNA- Thermosensoren

Translationale Regulation durch T- vermittelte Veränderungen


in der RNA- Struktur im L. monocytogenes prfA Gen. Listeria
ist ein humanes pathogenes Bakterium, welches
Lebensmittelvergiftungen hervorruft. Es reguliert seine Gene
so, dass sie nur im Wirt exprimiert werden. Die
Schlüsselfunktion dabei ist die Temperatur. PrfA ist ein TF der
die Expression der Virulenzgene aktiviert. Dies macht er aber
nur bei 37°C und nicht bei 30°C.

Die mRNA Struktur unterdrückt dabei die prfA Translation.


Die inhibitorische Struktur schmilzt bei 37°C.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Molekulare Ursache für die Temperaturmessung durch einen RNA- Thermometer:

Das ROSE- Element (repressor of


heat- shock gene expression) ist
anwesend am 5´UTR von kleinen
heat- shock Genen in vielen
gram- Bakterien wie Rhizobia,
E.coli und Salmonella.

Riboswitches (transkriptionelle/ translationale Attenuation)

Terminator bewirkt das


Abfallen der Pol

RNA- Abschnitte die eine unterschiedliche Konformation/ Sekundärstrukturen annehmen können in


Abhängigkeit von niedermolekularen Liganden (Vitamine, Stoffwechselprodukten,…). Der Vorteil ist,
dass es keine Proteinfaktoren oder tRNA Moleküle braucht. Transkriptionelle/ translationale
Attenuation: Dabei wird die Ablesung und Übersetzung der DNA in mRNA während der Transkription
bei der Proteinbiosynthese verzögert. Dies geschieht dadurch, dass Ribosomen Einfluss auf die
Sekundärstruktur der mRNA ausüben und somit bestimmen, ob die RNA-Polymerase über einen
Attenuatorbereich ("Dämpfungsbereich") hinweg transkribieren kann. Beispiel: das trp-Operon in
E.coli bedient sich der Attenuation als Genregulationsmethode. Bei hoher Konzentration der AS Trp
in der Zelle wird die Transkription gestoppt. Ist der Trp-Spiegel abgesunken, so wird die Transkription
wieder in Gang gesetzt.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Organisation von Riboswitches

Bindedomäne (Aptamer,
strukturierte Bindetasche):
Ligand bindet mit hoher
Affinität/ Spezifität und eine
regulatorische Domäne
(Expressions- Plattform):
reagiert wenn Ligand an das
Aptamer gebunden ist und
die Konformationsänderung
verändert dann die
Genexpression.

Riboswitch Klassen

Methylgruppendonator

z.B.: Vitamine- Biosynthese, AS- Stoffwechsel, Purin Stoffwechsel

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

SAM hat verschiedene Rollen in der Regulation der Met- Biosynthese

Gram-: ohne SAM liest die Pol die Gene ab, kommt SAM dazu bindet es an einen Repressor und der
aktive Repressor blockiert die Gene (verhindert ablesen von Promotor).

Gram+: SAM bindet an einen Riboswitch, ein Terminationsloop entsteht und es kommt zur
transkriptionellen Attenuation/ Termination (RNA nicht mehr transkribiert).

Bestätigung des transkriptionellen Attenuationsmodells in einem metl- Riboswitch

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Die thi- Box

Thiaminpyrophosphat (TPP; Cofaktor von Schlüsselenzymen im


Kohlenstoff Stoffwechsel) bindet an das Aptamer, wenn es in
ausreichender Menge vorhanden ist. Die Struktur des 5´Bereiches
des nächsten Gens wird dadurch so umgefaltet, dass die SD wieder
in der Sekundärstruktur zum Liegen kommt und translational
inhibiert wird.

Regulation der Thiamin-


Biosynthese in E.Coli
(translationale Kontrolle)

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Thiamin Biosynthesegene und mögliche Mechanismen der Riboswitch Kontrolle

In- Line Probing

rad. Markierung

RNA 1x ohne Ligand und 1x mit Ligand werden ohne Enzym (Autohydrolyse) gemischt und auf ein Gel
aufgetragen. RNA mit Ligand formiert sich zu einer anderen Struktur, d.h. da wo RNA gepaart ist,
kommt es nicht so leicht zu einer spontanen Hydrolyse der RNA als in Bereichen die einzelsträngig
sind.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

6. Sekundärstrukturen in TIR
Gen aus einem T4- Phagen. Nach der SD kommt eine
Sekundärstruktur, die den Abstand zwischen SD und
Anti- SD (SC) verkürzt, da dieser nicht zu groß sein darf
(Erinnerung zuvor: ca. 7 Basen). Diese
Sekundärstruktur ermöglicht also erst die Initiation der
Translation.

Sequenzen in TIR beeinflussen die Translationsinitiationsfrequenz

SD

=Ribosomenbindungsstelle

=Translationale Initiationsregion

In der Regel ist die TIR ACU- reich.

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Die downstream Box

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Mit Hilfe von Mutationen wurde


downstream des AUG- Startcodons
eine Region ausgemacht, die als
"downstream-box" bezeichnet
wurde. Es wurde postuliert, dass
diese mit einem speziellen Bereich
(stem-loop) der 16S rRNA
interagieren kann; dieser Bereich auf
dem Ribosom wurde als anti-
downstream-box bezeichnet. Die downstream-box sollte die Interaktion zwischen SD und Anti-SD
Sequenz erleichtern. Es ergeben sich dabei aber zwei logische Probleme: Die Anti-SD Sequenz liegt
ungepaart und frei zugänglich vor, während die Anti-downstream-box bereits gepaart in einer
Sekundärstruktur vorliegt. Rein aus sterischen Gründen ist damit eine Interaktion zwischen
downstream-box und 16S rRNA nicht möglich.

Funkt. Bedeutung von RNA- Interaktionen bei der Auswahl von Translationsinitiations- Codons

(A) Modell für die SD Interkation der mRNA mit der 16S rRNA anti-SD Region
(B) Modell für die DB- vermittelte Interaktion der mRNA mit der 16S rRNA anti- DB Region

Eine Röntgenstudie zeigt, dass eine räumliche Interaktion zwischen DS Box und 16S rRNA nicht
möglich ist. Durch komplementäre Mutationen in DS Box und 16S rRNA konnte die Existenz dieser
Box ausgeschlossen werden. Durch chemical probing kann ebenfalls bewiesen werden, dass es keine
Interaktion zwischen DS Box und 16S rRNA gibt.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

7. Translationale Repressoren und Aktivatoren

Repressoren sind in der Regel Proteine die im Bereich der RBS binden können und verhindern, dass
das Ribosom bindet. Das Coat- Protein des Bakteriophagen R17 bindet an sein eigenes Gen, d.h.
wenn genug Coat- Protein gemacht wurde für die Replikation, wird das Gen ab geschalten. Bei
Bakteriophage T4 bildet sich ein Pseudoknoten (Bereiche der RNA, wo loops noch einmal
Interaktionen mit Einzelstrangbereichen machen; spielt auch eine Rolle beim frame shifting) aus. Hier
dient der Pseudoknoten als Nukleierungspunkt für das Protein 32 und in kooperativer Weise binden
andere Proteine, bis die SD überdeckt ist und das Ribosom nicht mehr binden kann.

Aktivatoren führen zur Bindung von Proteinen upstream eines Hairpins in dem sich SD-Sequenz
befindet. SD Sequenz wird frei, Ribosomen können binden. Die SD Sequenz kann auch durch
endonucleolytische Schnitte freigesetzt werden.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

T4 Gen 32 Autoregulation

ssb Protein

Translationale Repressoren dienen häufig der Regulation von akzessorischen Elementen. Bsp: Gen 32
des Phagen T4 codiert für ein Einzelstrangprotein. Dieses Gen ist auf mRNA-Ebene autoreguliert.
Wurden ausreichend Protein 32 Monomere erzeugt, binden diese an sogenannte Pseudoknoten
(speziell gefaltete RNA-Strukturen). Nach der Bindung an den Pseudoknoten können weitere
Monomere binden, bis die SD Sequenz erreicht wurde, wodurch das Ribosom nicht mehr binden
kann und die Translation inhibiert wird.

Autoregulation der Translation balanciert das ribosomale Proteinlevel mit der rRNA Synthese

1. ribosomale Proteingene sind


in Operons organisiert.
2. die meisten Operons
enthalten Gene für kl. und gr. UE
Proteine.
3. Manche nicht- ribosomale
Proteine welche ebenfalls in
diese Operons kodiert sind
spielen eine Rolle im
Translationsprozess.
4. Ein Gen in jedem Operon
(dunkelblau) agiert als Regulator.
5. In jedem Fall ist das reg.
Protein ein rRNA Bindeprotein.
6. Gene stehen unter einer
translationalen Feedback
Regulation durch das
Regulatorprotein.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Beispiel S15: Für jedes Operon gibt es eine reg. Sequenz, welche
ähnlich zur Sequenz auf der rRNA ist. Liegt S15 in höherer
Konzentration als 16S rRNA vor, inhibiert es seine eigene
Translation.

SD

Ternärer Komplex binärer Komplex

Das rib. Protein S15 aus E.coli moduliert seine eigene Translation durch Abfangen des Ribosoms an
der mRNA Initiationsladungsstelle. Es entsteht ein Pseudoknoten der die RBS maskiert.

Toeprinting Assay

In vitro bindet ein Ribosom an


mRNA und bildet gemeinsam
mit der fMet-tRNA einen stab.
ternären Komplex. Fügt man
RT sowie Primer (am 3' Ende
der mRNA) hinzu, erhält man
ein cDNA Signal, das in der
Regel 15nt vom A des AUG
entfernt ist. Je nachdem wie
lang das Signal tatsächlich ist,
kann ermittelt werden, wie gut
das Ribosom gebunden hat.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Toeprinting S15

Mischt man lediglich mRNA und 30S UE und fügt


keine Initiator tRNA hinzu, bindet die 30S UE nur
aufgrund der SD-Anti-SD Interaktion auf der mRNA
(binärer Komplex). Mittels Reverser Transkriptase
erhält man hier eine cDNA, die bis +10 an das AUG
heranreicht (im Gegensatz zu +15 des ternären Komplexes mit Initiator tRNA). Fügt man 30S UE und
fMet-tRNA hinzu, erhält man ein Signal bei +17 - es konnte ein stabiler ternärer Komplex gebildet
werden. Fügt man 30S UE, fMet-tRNA und S15 hinzu, erhält man ein Signal bei +10, es wird also kein
stabiler ternärer Komplex gebildet, aber die 30S UE selbst kann noch an die mRNA binden.

Threonyl-tRNA-Synthetase (beladen tRNA mit AS)

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Überlagerung der ThrRS- thrS mRNA auf dem


Ribosom- thrS mRNA Komplex.

Das glgCAP Operon

Die Synthese von ADP-


Glukose durch ADP- Glukose-
Pyrophosphorylase (kodiert
durch das E.coli glgC Gen)
definiert sowohl den
entscheidenden Schritt der
Glykogensynthese als auch
den geschwindigkeits-
bestimmenden Schritt des
Pathways: Glucose-1-P + ATP
↔ADP-Glucose + PPi.

Der glg Leader

CsrA kann im Bereich der RBS binden (A- reiche Sequenzen). Solange CsrA bindet, wird das Gen nicht
translatiert.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

P. aeruginosa RsmE bindet an die mRNA Zielstelle

RsmE reguliert unter anderem verschiedene Virulenzgene.

Mögliche Interaktionen von CsrA mit dem glg 5´leader

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Interaktion von CsrA durch die nicht- kodierende reg. RNA CsrB

Sekundärstruktur Vorhersage für die CsrB RNA

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

CsrB RNA funktioniert als Antagonist der CsrA Reaktion

In der stationären Phase macht es keinen Sinn Kohlenstoff zu speichern.

8. Riboregulation

Cis und trans- Antisense RNAs.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Regulation durch Antisense RNAs

Die RNA ist komplementär zur RBS und


kann binden Ribosom kann nicht
binden.

RBS ist durch eine intramol.


Sekundärstruktur maskiert und wird
dadurch aufgemacht, dass eine RNA
am Nebenstrang bindet.

RNA bindet und RNAse macht


Schnitt RNA Degradierung.

Bindet die RNA wird die Ribonuklease-


Bindungsstelle maskiert.

2 Typen von Riboregulatoren: cis und trans antisense RNAs

Cis- kodierte RNAs sind immer in der Nähe des Gens oder überlappen mit dem Gen, während trans-
kodierte RNAs ganz woanders im Chromosom kodiert sein können.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Cis- kodierte kleine RNAs

Werden durch den gleichen gen. Loci kodiert wie ihr Zielgen. Sie
haben das Potential perfekte Duplexes zu bilden.

(=Antisense RNA)

Cis- kodierte reg. RNA wird oft von Plasmiden, Phagen und
Transposons benutzt. Sie regulieren Plasmid- Copy- number,
Konjugation, post- segregationales killing, Temperatur- Phagen-
Entwicklung und Transposition.

Tn10 erzielt Antisense- Kopiekontrolle durch überlappende Promotoren

Wenn die Kopienzahl von Tn10 hoch


ist, dann wird auch viel von der
Antisense- RNA gemacht und diese
kann basenpaaren mit RBS was dazu
führt, dass die Transposase nicht
translatiert wird.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Cis- antisense Mechanismus: negative Regulation

Unter Cis-Antisense versteht man,


dass 2 RNAs von Promotoren
transkribiert werden, die konvergent
liegen und dadurch eine sich
ergänzende Sequenz aufweisen. Es
wird in so einem Fall eine
funktionelle mRNA von einem
Promotor aus transkribiert.
Zusätzlich wird eine weitere RNA von
einem weiteren Promotor aus in
Gegenrichtung transkribiert, die
durch überlappende Sequenzen an die mRNA
binden kann und eine Interaktion mit Ribosomen
verhindert (neg. Regulation).
Beispiel: Replikationskontrolle von R1-Plasmiden
dr. Antisense- RNA copA. Das R1 Plasmid codiert
über das Gen repA die eigene Replicase. Upstream
des repA Gens liegen die Gene copB sowie tap, es
wird von allen 3 Genen eine mRNA erzeugt, die als
copT bezeichnet wird. In Gegenrichtung wird die
Antisense- RNA copA transkribiert. copT und copA
bilden Sekundärstrukturen aus, über die sie
zunächst interagieren, um anschließend eine stabile
ds Bindung einzugehen, wodurch die Translation
der Gene tap und repA verhindert wird. Die Translation von repA ist an die Translation von tap
gebunden, es findet sich also sowohl Antisense Regulation als auch auch translative Kopplung.

Cis-acting antisense RNA Mechanismus

Antisense RNAs binden oft


nicht in linearer Form an die
zugehörige mRNA, sondern
translational gekoppelt bilden wie bei der
Regulation von repA durch
Ausbildung von
Sekundärstrukturen
sogenannte "kissing loops",
über die Antisense und
zugehörige mRNA
aneinander binden. Ein
Beispiel für Antisense RNA
findet sich in Bakterien bei
der Kontrolle von

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Toxingenen die sich auf Plasmiden befinden. Es wird dabei sichergestellt, dass nur Bakterien
überleben, die das Plasmid behalten. Das als hok bezeichnete Gen kodiert für ein Toxin, das die
Zellmembran zerstört. Für die Translation von hok ist ein Upstream liegendes, als mok bezeichnetes
Gen notwendig (positive translationale Kopplung). Zu der mok mRNA wird vom Plasmid eine als sok
bezeichnete Antisense RNA erzeugt, die an mok bindet und dadurch die Translation von hok
verhindert. Im Gegensatz zur mok-hok mRNA ist die sok Antisense RNA sehr instabil und muss vom
Plasmid ständig neu transkribiert werden. Geht das Plasmid verloren, wird die sok Antisense RNA
schneller abgebaut als die mok-hok mRNA, hok kann translatiert werden.

Trans- kodierte regulatorische RNAs

Sind generell nicht genetisch an den Loci


ihres Ziels gekoppelt. Sie bilden
unvollkommene Duplexes und können
multiple Ziele via alternativer
Basenpaarung beeinflussen.

Bakterielle Stressantworten werden oft durch trans- kodierte reg. RNAs vermittelt

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Small RNAs spielen


bei der Genregulation
auf translationaler
Ebene eine wichtige
Rolle. Wird die Zelle
Stress ausgesetzt,
werden sie
transkribiert und
dadurch bestimmte
Gene im Gegensatz
zu RNAi sowohl aus-
als auch
eingeschalten. Beispiele: RpoS codiert für den Faktor σ38, der in der stationären Phase erzeugt wird
und notwendig ist, verschiedene Virulenzfaktoren zu aktivieren. Die rpoS mRNA weist bei der RBS
eine Sekundärstruktur auf die Translation verhindert. Die kleine regulatorische RNA DsrA löst die
Sekundärstruktur auf und ermöglicht die Synthese von RpoS (positive Translationskontrolle durch
DsrA). Beispiel: FlhA mRNA translatiert für einen transkriptionalen Aktivator. Die kleine
regulatorische RNA OxyS bindet an die RBS von FlhA, wodurch dieses nicht mehr translatiert werden
kann (negative Translationskontrolle durch OxyS). Kleine regulatorische RNAs spielen in der Kontrolle
der Initiation der Translation eine wichtige Rolle, Vorkommen und Wirkungsziele sind dabei nur
schwer zu ermitteln. DsrA beispielsweise ermöglicht nicht nur die Translation von RpoS, sondern
inhibiert auch die Translation eines transkriptionalen Aktivators (hns), der eine Reihe weiterer Gene
in der stationären Phase aktiviert.

Wichtig für diese Art der Regulation ist das Hfq- Protein.

Hfq

Es wurde gezeigt, dass es wichtig für die Replikation eines RNA- Phagen
ist. Hfq ist ein Sm- ähnliches RNA- Bindeprotein (spielen auch eine Rolle
im nukleären Splicing). Es ist reichlich vorhanden, Hitze- stabil und ein
ringröhrenförmiges hexameres Protein.
Es interagiert mit sehr vielen unterschiedlichen kleinen RNA- Molekülen
um RNA- Stabilität zu beeinflussen und RNA- RNA- Interaktionen zu
vermitteln. Es interagiert außerdem mit RNAP und dem ribosomalen
Protein S1.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Hfq schützt sRNAs vor RNAse E Spaltung

Gibt man zu sRNA RNAse E wird diese gespalten. Gibt man nun Hfq dazu, blockiert man die
Spaltstelle.

Hfq agiert als RNA Chaperon

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Hfq stimuliert Annealing

Hfq erleichtert RNA- RNA- Interaktionen

Funktionelle Aktivierung und Inaktivierung durch trans- kodierte reg. RNAs

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

mRNA Silencing: das sodB- RyhB Paradigma

Superoxid- Dismutase

Wie erwähnt ist Eisen als Cofaktor für aktive Zentren multipler Enzyme essentiell. Entzieht man
Bakterien Eisen (z.B. durch Chelierung mittels EDTA), werden sie sich bald den unsichtbaren
Engelschören anschließen, denn: Das Gen sodB codiert für das Enzym Superoxid-Dismutase. Dieses
wandelt Superoxid in H2O2 um, um die Zelle vor oxidativem Stress zu bewahren. Superoxid-
Dismutase benötigt dazu Fe3+. Anm: das produzierte H2O2 wird durch andere Enzyme weiter
abgebaut, da H2O2 DNA schädigt. Die Aufnahme von Eisen wird durch das Protein Fur reguliert. hfq
reguliert die Translation von Fur und dadurch indirekt die Produktion der Superoxid-Dismutase, die
Eisen benötigt. In einem hfq-Stamm ist sowohl die Konzentration von Fur als auch von Superoxid-
Dismutase erhöht. Bei langsamem Wachstum wird viel hfq produziert, dadurch wird die
Konzentration von Fur niedrig gehalten. Eine niedrige Fur Konzentration aktiviert
Oberflächenrezeptoren, die Eisen aus der Umgebung aufnehmen. Liegt wenig Eisen und damit
inaktives Fur vor, kann die small RNA RhyB transkribiert werden. RhyB inaktiviert Gene, deren
Produkte Eisen benötigen z.B. bindet es an die RBS von sodB und verhindert dessen Translation. Ist
RhyB an SodB gebunden, wird sodB leicht durch RNase E gespalten und abgebaut werden.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

RyhB- sodB Basenpaarung kreiert eine neue RNAse E Spaltstelle in der sodB 5´kodierenden Region

Zunächst wird geprüft, wo sodB ohne RhyB gespalten wird. sodB mRNA wird mit Ribosomen und
RNase E sowie speziell erzeugten Sonden vermischt. Diese Sonden sind komplementär zu kurzen
Strecken der mRNA. Kann eine Sonde nicht an die mRNA binden, fand an dieser Stelle ein Schnitt
durch die mRNA statt, die Sequenz der Sonde ist damit Komplementär zur RNase E Schnittstelle. Es
fand sich eine Spaltstelle bei Codon 30. Dem Gemisch werden hfq und RhyB hinzugefügt und erneut
mit Sonden geprüft. Es fand sich dabei in sodB eine andere Spaltstelle bei +12 (nahe am Startcodon).
Durch Bindung von hfq und RhyB an die mRNA wird Ribosomenbindung verhindert, eine neue
Spaltstelle für RNAse E freigelegt und dadurch die Wahrscheinlichkeit einer Spaltung erhöht.

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RNaseIII Spaltung von RyhB wird durch Basenpaarung mit sodB mRNA stimuliert

RhyB kann durch RNase III gespalten werden,


wenn es an sodB mRNA gebunden ist. In einem
RNase III-Stamm, in dem durch eine Mutation
RNase III bei Temperaturerhöhung inaktiviert
wird, wird die RhyB RNA bei erhöhter Temperatur
wesentlich stabiler im Vergleich zu Temperaturen
in denen RNase III funktioniert.

Initiale Schritte der sodB und RyhB Inaktivierung

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Modell für den sRNA/mRNA Turnover

RyhB- regulierte Gene

bfr und ftn kodieren bakterielles Ferritin (Eisenspeicherprotein). Das sdh CDAB Operon kodiert
Succinat- DH. acnA und fumA kodieren Aconitase und Fumarase. sodB kodiert eine Eisen enthaltende
Superoxid- Dismutase.

mRNA Aktivierung:: Das rpoS-DsrA Paradigma

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Aktivierung durch ncRNA

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Ein Netzwerk von ncRNAs kontrolliert die Synthese von Außenmembran Proteinen

9. Andere Mechanismen

Translationale Kupplung

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Translationale Kopplung erfolgt häufig bei überlappenden Genen.

Negative translationale Kopplung: Liegen die Gene A und B überlappend vor und weist Gen A eine
stärkere RBS als Gen B auf, wird Gen A verhältnismäßig stärker translatiert werden als Gen B.

Positive translationale Kopplung: Die Translation eines Gens ist für die Translation eines weiteren
Gens notwendig. Beim Phagen Lambda liegen einige Gene nicht überlappend vor, allerdings befinden
sich Start und Stopcodon eines Gens in unmittelbarer Nähe des Startcodons eines zweiten Gens,
dessen SD Sequenz durch eine Sekundärstruktur der mRNA zunächst nicht zugänglich ist. Wird das
erste Gen translatiert, öffnet das Ribosom diese Sekundärstruktur in der sich die SD des zweiten Gens
befindet. Dadurch kann das zweite Gen erst translatiert werden, nachdem das erste Gen translatiert
wurde (positive translationale Kopplung).

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Positive translationale Regulation in Phage MS2

Translationale Attenuation

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Erythromycin bindet an Domäne V


der 23S rRNA in der 50S UE des
Ribosoms und inhibiert Translokation.

Chloramphenicol bindet ebenfalls


an die 50S UE des Ribosoms und
inhibiert das Binden der AS Enden
an die tRNA und somit die Bildung
einer Peptidbindung. Toxizität vor
allem im Knochenmark als
Ergebnis der Inhibierung der
mitochondrialen Proteinsynthese.

Translationale Attenuation findet


sich häufig bei Resistenzgenen z.B.
beim CAT-Gen von B.subtilis. CAT
codiert für Chloramphenicol-
Acetyltransferase, das
Chloramphenicol inaktiviert, indem
es einen Acetylrest anhängt. CAT
mRNA liegt immer in ausreichender
Konzentration in der Zelle vor, um
sofort reagieren zu können, wenn
das Bakterium mit Chloramphenicol
in Berührung kommt. Würde die
mRNA allerdings in Abwesenheit
von Chloramphenicol translatiert,
würde die Zelle ständig Energie
aufwenden müssen. zur Kontrolle
der Translation besitzt die mRNA
eine Leader Sequenz, die für 6-7 AS
codiert. Das Ribosom translatiert
diese kurze Sequenz und löst sich
anschließend wieder von der mRNA
ab.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Transkriptionale Attenuation findet sich häufig bei


Genen und Operons, die mit der Biosynthese zu tun
haben. Diese Gene bzw. Operons besitzen eine
Leadersequenz, die mehrfach für die AS codiert,
deren Biosynthese durch die nachfolgenden Gene
erfolgt. Bsp: Trp-Operon. Die mRNA des Operons
bildet nach der Leader Sequenz eine
Sekundärstruktur. Ist ausreichend Trp vorhanden,
translatiert das Ribosom die Leadersequenz und löst
sich durch die folgende Sekundärstruktur wieder ab.
Steht wenig Trp zur Verfügung, ist auch die Trp-tRNA
Konzentration niedrig und das Ribosom muss die
Translation der Trp-Leadersequenz stoppen. Der

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Stop bewirkt eine Konformationsänderung der bereits translatierten mRNA, wodurch sich wiederum
die folgende Sekundärstruktur auflöst. Nach dem Auflösen der Sekundärstruktur löst sich das
Ribosom nicht von der mRNA sondern translatiert weiter und kann so die Enzyme zur Trp-
Biosynthese erzeugen. Es handelt sich hier um eine Mischung zwischen translativer und
transkriptiver Attenuation.

Zusammenfassung was Translation in Prokaryoten beeinflussen kann

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

- BLÄSI: FOLIENSATZ 3 -

Leaderless mRNA und ribosomale Rekrutierung

5´-AUGNNNNNNN-//-3´ Leaderless mRNAs weisen keine SD Sequenz auf, sondern starten


direkt mit dem Startcodon AUG oder mit nur wenigen
Bakterien Nukleotiden davor. Sie ist in allen Organismen, sowohl in Pro- als
auch in Eukaryoten translatierbar. Sie kommen vor allem in gram +
 Gram- 6-8
Bakterien vor, hier vor allem bei Genen, die Resistenz gegen
 Gram+ ~35
selbst produzierte Antibiotika verleihen. Bringt man leaderless
Archaea mRNA in gram- Bakterien ein, so kann diese translatiert werden,
normale mRNA aus gram- Bakterien kann in gram+ Bakterien
 Crenarchaeota > allerdings nicht translatiert werden, da sie S1 benötigt, das viele
 Euryarchaeota 5-10/ > gram+ Bakterien nicht besitzen. Bei Archaea z.B. bei Sulfolobus
solfataricus sind ca. 70% aller mRNAs monocistronisch und
Eukarya 4
leaderless, es handelt sich dabei um nichtkanonische mRNA. In
Organellen 9-10 Mitochondrien sind alle mRNAs leaderless, sie weisen eine
bakterienähnliche translationale Maschinerie auf.

Translation von leaderless mRNA in heterologen Translationssystemen

cI weist ist eine mit AUG beginnende leaderless mRNA auf. In Versuchen konnte sie in E.coli,
Sulfolobus und Reticulocytenlysat aus Kaninchenaugen translatiert werden. OmpA mRNA aus E.coli
ist bei Versuchen im direkten Vergleich damit nur in E.coli, aber nicht in Sulfobolus oder Eukaryoten
translatierbar. Es wird daher angenommen, dass es sich bei leaderless mRNA um eine alte Form von
mRNA handelt, bevor sich ribosomale Bindungsstellen entwickelten.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Die db- adb Interaktion existiert nicht (Downstream- anti Downstream Box)

Werden leaderless mRNAs durch den 30S- Initiator- tRNA Komplex erkannt?

Bei geringer IF2 Konzentration findet sich selten fMet-tRNA Bindung an Ribosomen. Bei hoher IF2
Konzentration findet sich häufige fMet-tRNA Bindung an Ribosomen.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

In vitro Translations- Wettbewerbsassay mit zunehmenden IF2 Konzentrationen

OmpA mRNA und cI mRNA werden in vitro translatiert. Abhängig von der hinzugefügten IF2
Konzentration steigt bzw. sinkt die Translation der cI mRNA, während die OmpA mRNA von der IF2
Konzentration unabhängig konstant translatiert wird. Die Konzentration von cI steigt proportional zur
IF2 Konzentration, während OmpA von der IF2 Konzentration unabhängig ist.

Selektion eines 5´terminalen AUGs und einer internen kanonischen RBS in Anwesenheit
eines IF2 und eines mutanten F2 Proteins

Leaderless mRNA

Normale mRNA
wird in jedem Fall
translatiert

 -IF2: keine Bindung von Ribosom und tRNA an leaderless mRNA, keine Translation.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

 IF2 wt: Bindung an leaderless mRNA, Translation

Es wird eine mRNA erzeugt, die mit einem Startcodon (quasi leaderless) beginnt und zusätzlich
downstream eine SD Sequenz mit normalem AUG Startcodon aufweist. Wird damit ein Toeprint
Assay durchgeführt (ausreichend mRNA, 30S UE, Initiator-tRNA, anschließend reverse Transkriptase),
wird sich folgendes Geschehen auf wundersame Weise zutragen: ohne IF2 (Spalte –IF2) erhält man
ein Toeprint Signal, das der Bildung des ribosomalen Komplexes nur an der downstream liegenden
Ribosomenbindungsstelle aufweist. Wird IF2 hinzugefügt (Spalte IF wt), erhält man sowohl ein
Toeprint Signal für die Ribosomenbindungsstelle als auch für das einsam liegende Startcodon. Fügt
man mutiertes IF2 hinzu (IF R700T), das die Initiator-tRNA nur schlecht an das Ribosom bindet, erhält
man so gut wie kein Toeprint Signal für das einsam liegende Startcodon. Damit ist ersichtlich, dass IF2
für die Translation von leaderleass mRNA notwendig ist.

Translationskontrolle einer leaderless mRNA

 Keine downstream cis- Elemente


 IF2 (stimuliert)
 Andere Komponenten der Translationsmaschinerie?

Translationsinitiationsfaktor 3

Fidelity Faktor: 70S Dissoziationsfaktor; beschleunigt die


Rate der Codon- Anticodon Interaktion an der P- Stelle;
diskriminiert nicht- kanonische Startcodons (AUU) und
30S Initiationkomplexe an 5´AUGs?

Sorgt dafür, dass ein Komplex nur dort gebildet wird, wo


sich tatsächlich eine RBS befindet. IF3 diskriminiert gegen
alle Codons außer AUG und verändert zu diesem Zweck
die Konformation des Ribosoms. Im Versuch mit
leaderless mRNAs die als Startcodon AUU benutzen, sinkt
die Translation wenn IF3 hinzugefügt wird, da das
Ribosom durch die Konformationsänderung leicht von der
mRNA abdiffundiert. Experiment: Beweis, dass IF3 gegen leaderless mRNA selektioniert (Toeprint).
Spezielle mRNA mit AUG am 5'-Ende und einem weiteren AUG mit vorgelagerter SD (siehe vorne) 5'-
AUG-SD-AUG-3'. + Ribosom + tRNAi. Ein Toeprint assay ergibt zwei Banden für beide AUGs. Die
Zugabe von IF3 mit anschließendem Toeprint Assay ergibt nur eine Bande für das AUG mit SD
Sequenz.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Die translationale Effizienz von leaderless mRNA wird bei erhöhten Level von IF3 in vivo
erniedrigt

LacZ hat eine kanonische RBS und steigert intrazellulär die Menge an IF3.

Das rel. Level an IF2 und IF3 bestimmt die translationale Effizienz eines leaderless
Reportergens in vivo

Expression von Leaderless


mRNA:

+IF2, +IF3 … normale


Expression

-IF2, +IF3 … niedrigste


Expression

+IF2, -IF3 … höchste


Expression

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Vermehrte Expression einer leaderless tetR-lacZ Fusion im infC (IF3) mutanten Stamms

Mittels Plasmid wird ein


leaderless tetR-LacZ
Fusionsgen eingebracht
und die Expression der ß-
Galactosidase überprüft.
Im Vergleich zum
Wildtyp findet sich in IF3
Mutanten eine höhere
Expressionsrate der
leaderless mRNA.

Kinetische Unterscheidung von 30S Initiationskomplexen an 5´AUGs

leaderless mRNAs können


im Vergleich nur schwach
mit der 30S UE interagieren

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Translationsinitiationswege in Bakterien

Die Translationsinitiation von leaderless mRNA wird nicht intrinsisch kontrolliert, sondern durch
Komponenten der Translationsmaschinerie.

Sind nicht- dissoziierte 70S Ribosomen fähig am 5´terminalen Startcodon Translation zu


initiieren?

Translationsinitiation mit 70S Ribosomen am 5´terminalen Startcodon und nicht am


internen Start

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Cross- linking von 70S Monosomen resultiert in der selektiven Translation von leaderless cI
mRNA

Nach Aktivierung des Ribosomenrecyclingfaktors steigt das Level der 70S Monosomen

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Unter diesem Bedingungen wird die leaderless cI mRNA preferentiell translatiert

Transfer von wachsenden Zellen von 37°C auf 10-15°C löst eine Kälteschockantwort aus

Zellwachstum und Proteinsynthese stoppt und setzt sich nach 1-4h mit niedrigerer Rate fort. Cold-
shock- Proteine (CspA, CspB, CspG, CspI, CsdA, RbfA) werden induziert. Proteine welche involviert in
der housekeeping Transkriptions-/ Translationskontrolle involviert sind werden induziert.

Seite 72
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Bakterien sind als Einzeller stark für Kälte anfällig und müssen sich vor den Folgen tiefer
Temperaturen schützen. E.coli besitzt beispielsweise Mechanismen, die es auch noch bei 5°-10°C
lebensfähig halten, auch wenn dabei der Stoffwechsel verlangsamt wird. Zur Regulation auf
Translationsebene werden bei tiefen Temperaturen sogenannte cold shock proteins erzeugt. Es
handelt sich dabei um RNA Chaperone bzw. Chaperonine, die verhindern, dass sich RNA bei tiefen
Temperaturen fehlerhaft faltet bzw. eine solche Faltung verhindert, um die mRNA translatierbar zu
halten.

Ineffiziente Translation

Hauptproblem: schlechte Translationseffizienz. RBS


und Startcodon binden Ribosom unzureichend.
Erhöhte Sekundärstrukturen (keine RBS). Langsame
Kinetik.

CspA Familie

7kD; 10% CS Proteinsynthese; 5 antiparallele β- Stränge; RNA-


binding Motive in β2 und β3; bindet RNA mit niedriger Affinität,
ohne Sequenzspezifität; aromatische Reste an der Oberfläche sind
wichtig für die Nukleinsäurebindung; erhöhte Translationsrate der
mRNA; erhöhte Anfälligkeit der RNA durch RNAsen; CspB, CspG, CspI
sind mit CspA verwandt

Cold- shock Proteine erleichtern die Translation (Initiation) weil sie wie RNA- Chaperone
wirken

Seite 73
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Von Initiation zur Elongation

Zu Beginn der Elongation müssen die Initationsfaktoren vom


Ribosom gelöst werden. Anschließend bindet eine 50S UE,
es wird der 70S Initiationskomplex gebildet, in dem fMet-
tRNA an der P-Site gebunden und die A-Site unbesetzt ist,
da hier IF2 die Bindung von tRNAs bisher verhindert hat. Für
die Elongation sind die Faktoren EF-Tu, EF-Ts und EF-G
essentiell. Diese Faktoren sind für Bakterien spezifisch, es
gibt kaum Homologien zu eukaryotischen Faktoren. Daher
wäre hier ein guter Ansatzpunkt für Antibiotika. Viele
Imidazolverbindungen stören die Interaktion zwischen EF-
Tu und EF-T, Kirromycin bindet EF-Tu an das Ribosom,
wodurch die weitere Translation unterbrochen wird.

Jedes Ribosom hat eine Bindungsstelle für mRNA und 3 Bindestellen für tRNA Moleküle

Die P- Stelle hält die tRNA mit der wachsenden Polypeptidkette. Die A- Stelle (Aminoacyl- tRNA
Bindungsstelle, jede Aminoacyl- tRNA mit Ausnahme der Initiator- fMet- tRNA bindet hier) trägt die
tRNA mit der nächsten AS. Entladene tRNAs werden an der E- Stelle (Exit) wieder entlassen.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

GTP GDP +Pi

Wie wird Peptidelongation gesteuert?

T w o Themen

1) 2 G Proteine
2) Peptidyl- Transferase

Elongationszyklus

Elongationsfaktoren: EF-Tu, EF-Ts,


EF-G; EF-Tu & EF-G sind kleine
GTP- Bindeproteine

Farben: large ribosome subunit,


cyan; small subunit, pale yellow;
EF-Tu, red; EF-G, blue. tRNAs,
gray, magenta, green, yellow,
brown.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Ablauf der Elongation: Eine aa-tRNA (Aminoacyl-tRNA) kommt und wird durch aktives EF-Tu-GTP
(rot) gebunden (Ausnahme: fMet-tRNA). EF-Tu-GTP bringt die aa-tRNA zur A-Site eines Ribosoms,
dessen P-Site bereits besetzt ist. Bindet eine aa-tRNA in der A-Site, wird die tRNA ohne AS aus der E-
Site freigesetzt. Das gebundene GTP wird gespalten, EF-Tu-GDP wird freigesetzt, ist in dieser Form
inaktiv und bindet deshalb aa-tRNA nicht effizient. Um den Faktor EF-Tu wieder in die aktive Form zu
überführen, wird durch den Faktor EF-Ts das gebundene GDP mit GTP ausgetauscht. Nachdem eine
aa-tRNA an der A-Site gebunden hat und EF-Tu sich vom Ribosom gelöst hat, wird die
Polypeptidkette von der tRNA in der P-Site mit der neuen AS der tRNA in der A-Site verknüpft. Es gibt
keine Peptidyltransferase, die Peptidbindungen knüpft, dieser Vorgang wird von der 50S UE
durchgeführt, die rRNA dient als Ribozym. Im Detail wird ein durch das Ribozym dirigierter
nucleophiler Angriff durch die AS in der A-Site auf die C-terminale Carboxylgruppe der Peptidkette in
der P-Site durchgeführt. Anschließend bindet das Motorprotein EF-G, das das Ribosom unter
Hydrolyse von GTP um ein Codon weiterschiebt, EF-G löst sich wieder vom Komplex ab. Die
unbeladene tRNA liegt jetzt in der E-Site und kann das Ribosom verlassen, die tRNA mit der
Polypeptidkette liegt in der P-Site, die A-Site ist leer.

Elongation der Translation in Bakterien

Das Anticodon der aa-tRNA bindet an die A-Site


der 30S UE. Codon-Anticodon-WW bewirken eine
Konformationsänderung von EF-Tu und die
Hydrolyse von GTP. EF-Tu ist in der Lage,
Proofreading zu vermitteln. Bringt EF-Tu eine aa-
tRNA zur A-Site, deren Anticodon das aktuelle
Codon der mRNA nicht vollständig bindet, liegt EF-
Tu nicht korrekt in das Ribosom eingebettet, GTP
wird nicht gespalten und der Faktor dissoziiert mit
der tRNA wieder ab, bevor die AS in das Peptid
eingebaut werden kann.

Seite 76
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Wenn die aa-tRNA durch EF-Tu an die A-


Stelle des Ribosoms geliefert wurde, wird
GTP zu GDP+ Pi hydrolysiert, was die
Dissoziation von EF-Tu fördert. Die
Hydrolyse hängt von der Codon- Anticodon
Erkennung ab.

Ternärkomplex Dissoziation in A- Stelle

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Der Mechanismus von EF- Tu

Die Ribosomenstruktur und der Mechanismus der Translation

Drittes Bild: Anscheinend ist die neu mit der Peptidylkette beladene ehemalige Aminoacyl-tRNA
schon irgendwo auf A- und P-Site. EF-G-GTP sorgt für die endgültige Translokation zur P-Site.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Die Peptidyltransferase Reaktion

Puromycin Reaktion

Die Rolle des Ribosoms im Peptidyltransfer

Das Peptidyltransferasezentrum liegt in der 23S


rRNA der 50S Untereinheit. Hier kommen sich
Amino- und Carboxylgruppen einander physisch so
nah, dass eine Bindung mittels
Konformationsänderung der umgebenden RNA
vermittelt werden kann.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Proteine existieren weit vom PTF- Zentrum

EF-G-GTP bindet in
der Nähe der A-
Stelle. Das Binden
von EF-G-GTP schiebt
die tRNA mit dem
wachsenden
Polypeptid von der A-
zur P- Stelle.
Unbeladene tRNA in
der P- Stelle wird an
die E-Stelle verschoben. Solange tRNAs an mRNA durch Codon- Anticodon Basenpaarung gebunden
ist, wandert die mRNA relativ zum Ribosom.

Molekulare Nachahmung (mimikry) zwischen EF-Tu und EF-G

Durch
Röntgenstruktur-
Analyse ist
bekannt, dass sich
die Faktoren EF-G
sowie EF-Tu das
aa-tRNA gebunden
hat strukturell sehr
ähnlich sind. Man
spricht in diesem
Zusammenhang
von molecular
mimicry, die
ähnliche Form
ermöglicht

Seite 80
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Interaktion mit derselben Site (A-Site). Gemeinsamkeiten von EF-Tu und EF-G: sind sich strukturell
sehr ähnlich; beide sind aktiv wenn GTP gebunden und inaktiv wenn GDP gebunden ist; es kann nur
entweder EF-Tu oder EF-G an Ribosom binden

Wird GTP durch das ähnliche Molekül GMP-PCP ersetzt, ist EF-G-GMP-PCP zwar in der Lage an die A-
Site zu binden. Ohne die Hydrolyse von GTP verläuft aber die Translokation sehr langsam und EF-G
wird nicht (oder nur schlecht?) freigesetzt.

Einbau einer unüblichen AS: die 21. AS: Selenocystein ist die biologische Hauptform von
Selen (Se)

Bei Selenocystein handelt es sich um Cystein, das mit Selen modifiziert wurde. Selen wird im aktiven
Zentrum einiger Enzyme benötigt; z.B. Deiodinase, Glutathionperoxidase zur Inaktivierung freier
Radikale in Säugern, Formatregulon zum Formatabbau in E.coli. Die tRNA für Selenocystein wird
folgendermaßen erzeugt. Eine spezielle tRNA, sec-tRNA, bindet zunächst über eine spezifische
Aminoacyl-tRNA Synthetase Serin. Ein Enzym wandelt die tRNA in Aminoacrylyl-tRNA um. Ein
weiteres Enzym hängt Cystein und Selen an, wodurch Selenocysteyl-tRNA entsteht, die jetzt als tRNA
für Selenocystein dient.

Seite 81
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Translationaler Umkodierungsmechanismus

Se-Cys Insertion/ Selenoprotein synthesis

Diese Enzyme katalysieren oft Oxidationen / Reduktionen. Enthalten meist ein Selenocystein, das
einen Teil des aktiven Bereichs darstellt.

Die Gene die für diese


Enzyme kodieren,
enthalten Stopcodons:
Selenocystein wird in der
mRNA über ein Stopcodon
codiert. Im Normalfall
können diese Proteine
daher nicht translatiert
werden. In Bakterien
wurde zusätzlich zu EF-Tu,
EF-T und EF-G ein weiterer
Elongationsfaktor, SELB,
gefunden. SELB hat
dieselbe Funktion wie EF-
Tu, nur dass es einzig
Selenocysteyl-tRNA bindet
und zur A-Site des
Ribosoms transportiert. Das Anticodon der sec-tRNA komplementiert das Stopcodon der mRNA und
kann an der A-Site binden. Zur Bindung von SELB an die A-Site des Ribosoms ist noch ein zusätzlicher
Faktor nötig, um zwischen normalen Stopcodons und für Selenocystein codierenden Codons
unterscheiden zu können.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Modell einer Selenocystein Insertion durch Bakterien

In Bakterien bildet die mRNA direkt nach einem


Stopcodon, das für Selenocystein codiert, eine
Sekundärstruktur (Hairpin) aus. Erst durch die
Bindung an diese Hairpinstruktur ermöglicht es
SELB an die A-Site des Ribosoms binden zu können.
In Archae und Eukaryoten bildet sich diese
Sekundärstruktur am Ende der mRNA aus, SelB
bindet daran, führt eine Konformationsänderung
der mRNA durch und fügt die Selenocysteyl-tRNA
erst bei dem dafür vorgesehenen Stopcodon hinzu.

tRNAsec und SelB

SELB unterscheidet sich von EF-Tu durch eine zusätzliche Domäne am deren C-terminalem Ende,
über welche die spezifische Sekundärstruktur der mRNA (SECIS) gebunden wird.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Insertion von Selenocystein am UGA- Codon benötigt ein Selenocystein Insertionselement


(SECIS)

SECIS wird von SELB erkannt.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Programmiertes Frameshifting (Besonderheit während Translationsinitiation

Das Protein bewegt sich um eine Base vorwärts oder rückwärts auf der mRNA und ändert dadurch
den reading frame.

 +1 Frameshifting: E.coli release factor 2


 -1 Frameshifting: E.coli dnaX

Das programmierte +1 Frameshifting im decodieren der E.coli Gene für RF2

RF2 (Release Factor)


bindet in der A-Site an
UGA Stopcodons und
terminiert die Translation,
indem die Polypeptidkette
auf ein H2O übertragen
und dadurch freigesetzt
wird. Autoregulation: Im
Beispiel terminiert RF2 die
Translation der eigenen
mRNA an einem nach
einigen Codons liegenden
Stopcodon UGA relativ rasch, wenn
seine Konzentration hoch
genug ist. Liegt RF2 in
geringer Konzentration
vor, stoppt das Ribosom
am UGA, ohne dass die
Translation sofort durch RF2 abgebrochen wird. Upstream dieses UGA befindet sich eine SD ähnliche
Sequenz, das Ribosom bindet an dieser Sequenz neu und startet die Translation neu. Durch diese
Wanderung des Ribosoms kommt es zu einem +1 frameshift, wodurch das Ribosom das Stopcodon
an dem eszunächst gestoppt war, nicht mehr als UGA sondern als GAC liest und weiter translatieren
kann. Der reading frame stimmt hier also nicht mit dem tatsächlich synthetisierten Produkt überein.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Frameshifting im E.coli dnaX Gen

Die τ- UE (normale Translation) und die γ- UE (-1 Frameshifting) sind vom dnaX Gen abgeleitet. Es
wird gleich viel von beiden UE produziert.

Normalerweise wird das


dnaX Gen vollständig
translatiert, als Produkt
entsteht die γ- UE der DNA
Pol III. Es kann sich aber
eine Hairpinstruktur
ausbilden, an der die
Translation verzögert wird.
Weiter Upstream findet
sich eine SD ähnliche
Sequenz. Wenn die 16S
rRNA anti-SD Sequenz im
Zuge der Verzögerung
daran bindet, kommt es zu
einem -1 Frameshift. Durch
den Frameshift wird ein
bisher als GAA gelesenes
Codon zu einem UGA, die Translation wird vorzeitig abgebrochen. Das so freigesetzte Protein dient
als τ- UE der DNA Pol III.

Seite 86
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

dnaX Frameshifting Kassetten aus verschiedenen Bakterien

Die Kassette für dnaX ist sehr konserviert in den verschiedenen Bakterien.

+1 Frameshifting in Säugern

In Säugern werden Polyamine mittels


Ornithindecarboxylase (OCD) aus Ornithin
erzeugt. Die Konzentration von Polyaminen
muss reguliert werden, da sie an mRNA binden
können und dadurch Pseudoknoten bilden, die
Ribosomen verzögern und dadurch für
frameshifts notwendig sind. OCD wird durch ein
Antizym abgebaut. Die mRNA des Antizyms
weist ein frühes Stopcodon auf, an dem die
Translation üblicherweise vorzeitig
abgebrochen wird. Ist die
Polyaminkonzentration hoch, erzeugen die
Polyamine in der mRNA des Antizyms einen
Pseudoknoten, der die Translation vor dem UGA
verzögert, das Ribosom führt einen +1 frame
shift durch, statt dem Stopcodon wird GAU
gelesen, die Translation kann fortgeführt und
Antizym erzeugt werden. OCD wird abgebaut,
es wird kein neues Polyamin erzeugt.

Seite 87
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Translationale Introns

Unter translationalen Introns versteht


man mRNA-Bereiche, die vom Ribosom
während einer laufenden Translation
übersprungen werden. Dabei kann das
Ribosom im Leserahmen bleiben d.h.
ganze Codons überlesen oder in einen
anderen Leserahmen wechseln.

Beispiel T4 Gen 60: Hier bildet sich im


codierenden Bereich der mRNA eine
Sekundärstruktur. Das Ribosom
ignoriert diesen einige hundert nts
langen Bereich und translatiert nur die
ungebunden vorliegenden Bereiche
der mRNA, ohne die Translation zu
unterbrechen. Beispiel Repressor trpR:
Der Repressor besitzt am N-terminalen
Ende eine Dimerisierungs- am C-
terminalen Ende eine DNA-
Bindungsdomäne und ist als Dimer
aktiv, wenn die mRNA dieses
Repressors normal translatiert wird. In
10-15% der Fälle wird ein Teil der
mRNA (55nt) nicht translatiert und das
Ribosom geht nach dem Ende des
ignorierten Stückes um -1 versetzt in
einen anderen Leserahmen über. Dem auf
diese Art erzeugte Repressor fehlt die C-
terminale DNA-Bindungsdomäne. Dieser
Repressor kann mit normal translatierten
Repressoren ein Dimer bilden, das Dimer
kann aber nicht mehr an DNA binden und
seine Funktion ausüben. Auf diese Art wird
die Konzentration des effektiven Repressors
in der Zelle reguliert.

Vermutet man ein Translationales Intron, führt man im Leserahmen ein Stopcodon in diese
Intronsequenz ein. Handelt es sich tatsächlich um ein Intron, wird die Translation nicht unterbrochen,
man erhält trotz eingeführtem Stopcodon ein Produkt, da das Intron vom Ribosom übersprungen
wird.

Seite 88
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

T4 DNA- Topoisomerase Gen 60 Umgehung

Anforderungen:

Passende GGA- Codons die einen 50nt


CodingCAP flankieren; ein Stopcodon; ein
wachsendes Peptidsignal

Bypassing Schritte

Seite 89
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Translationstermination

Bakterien:

RF1: UAA/ UAG


RF2: UAA/ UGA
RF3: stimuliert RF1+ RF2

Bei Prokaryoten finden sich drei Releasefaktoren RF1-3. RF1 bindet die Stopcodons UAA und UAG, F2
bindet UAA und UGA. RF3 stimuliert die Bindung von RF1 bzw. RF2. Die Releasefaktoren haben
strukturelle Ähnlichkeit mit EF-Tu und EF-G, da auch sie an der A-Site binden (molecular mimicry).

Ein post- Terminations rib. Komplex ist der Guanin- Nukleotid- Exchange- Factor für Peptid
RF3

Seite 90
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Recycling von Ribosomen: der Ribosomenrecycling- Faktor (rrf)

rrf ... ribosome recycling


factor, ähnelt strukturell
den Elongations- und
Releasefactoren, im
Gegensatz zu diesen
wandert er aber nicht in die
A-Site, sondern interagiert
außerhalb mit dem
Ribosom. Ist RF3
vorhanden, bindet rrf an
das Ribosom. EF-G dringt in
die A-Site ein, das Ribosom
wird unter GTP Verbrauch
vorwärts geschoben,
wodurch sich die 50S UE
von der 30S UE ablöst und
freigesetzt wird. Die 30S UE
ist immer noch an die mRNA gebunden. Interagiert sie mit IF3, das ja gegen alle tRNAs außer fMet-
tRNA diskriminiert, löst sich auch die 30S UE von der mRNA, da sich an dieser Stelle kein AUG
befindet. rrf ist bei einer Temperatur von 28°C aktiv und inaktiviert sich ab einer Temperatur von
42°C. Ab einer Temperatur von 42°C können Ribosomen somit nicht mehr von mRNA gelöst werden,
die Zelle wird absterben. rrf kommt in Prokaryoten und Archaea vor, nicht aber in Eukaryoten, hier
wäre wieder eine gute Ansatzmöglichkeit für Antibiotika.

Kristallstruktur des rrf von Thermotoga maritima: ein tRNA Mimic

(A) RRF zeigt


Ähnlichkeit mit
tRNA und mit
Domäne 3-4 von
EF-G.

(B) links EF-G,


rechts EF-Tu +
tRNA

Seite 91
VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Die finalen Schritte der70S Disassemblierung benötigt EF-G + IF3

Schritt 4 … RRF bindet an die


A-Site.

Schritt 5 … RRF und EF-G


bewirken mittels GTP-
Hydrolyse die Dissoziation der
50S UE vom 70S Ribosom.

Schritt 6 … IF3 bindet an die


30S UE und, löst die
deacetylierte tRNA ab und
verhindert eine
Reassoziierung von 30S und
50S UE.

- BLÄSI: FOLIENSATZ 4 -

Transkription- Translation- Degradation

Wie und wann kommt es zur Degradierung?

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Chemische und funktionelle Halbwertszeiten von mRNA

Chemical half-lives of mRNA


transcripts correspond to 50%
decrease in the concentration
of the corresponding full-
length transcripts after
Versuch in E.coli: man setzt Rifampicin zu- man extrahiert transcription has been
mRNA zum Zeitpunkt 0 (ohne Rifampicin) und mittels Northern blocked, e.g., inhibition of
Blot erhält man ein Signal das proportional zur Menge ist. Das RNA polymerase by
macht man zu den unterschiedlichsten Zeitpunkten. rifampicin.

unterschiedliche mRNA- Stabilität in E.coli

Unterschiedliche mRNA- Stabilität von: individuellen monocistronischen mRNAs; Segmenten


innerhalb polycistronischen Transkripten (Bsp.: 3 Gene  das mittlere wird weniger stark gebraucht
als die beiden anderen)

In Prokaryoten liegt die Halbwertszeit von mRNA zwischen Sekunden und einigen Minuten, in
Eukaryoten kann sie von 30 Minuten bis zu 25 Stunden betragen. Der hohe Turnover in Bakterien
ergibt sich durch das schnelle Wachstum.

Functional half-lives correspond to 50% decrease in the capacity of the corresponding transcripts to
support the synthesis of full-length proteins after transcription has been blocked, e.g., inhibition of
RNA polymerase by rifampicin.

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E.coli RNAsen

 Endoribonukleasen: RNAseE, RNAseIII, RNAseP, RNAseI, RNAseHI und HII


 Exoribonukleasen: PNPase, RNAseII, Oligoribunuklease, RNAsePH, RNAseD, RNAseR,
RNAseBN, RNAseT

RNAsen sind für Prozessierung von RNA (insbesonders tRNA) sowie für den Abbau von RNA
verantwortlich. Exoribonucleasen bauen mRNA vom Ende her ab, Endoribonucleasen spalten mRNA
in der Sequenz. Prokaryoten besitzen nur Exoribonucleasen, die mRNA vom 3' Ende her abbauen.
Eukaryoten haben sowohl Exoribonucleasen die mRNA vom 3' Ende, als auch solche, die vom 5' Ende
her abbauen.

mRNA Zerfall in E.coli: RNAsen

Viele sind beteiligt an der Prozessierung der tRNA.

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E.coli RNAseE

Das wichtigste
Enzym in gram-
das am mRNA
Turnover beteiligt
ist die RNAseE. Es
erkennt das
5´Ende der mRNA.

Effekt der 5´Basenpaarung auf die Stabilität der ompA mRNA

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Die Arginin- reiche RNA- Bindedomäne der RNAseE behält die Ziel- RNA bis die katalytische
Domäne die Spaltung vollendet hat

E.coli Polynukleotid- Phosphorylase (PNPase)

Es handelt sich hier um eine Exoribonnuklease die von


3´nach 5´abbaut.

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Stabilitäts Determinanten von mono- und polycistronischen Transkripten

Die intercistronischen Regionen können die Stabilität der Transkripte beeinflussen. In diesen
intercistronischen Regionen kommen Stabilitätsdeterminanten vor. Dabei handelt es sich um
Sekundärstrukturen. Daher können Exonukleasen diese Bereiche kaum abbauen.

5´Stabilitäts Determinanten

Dieser Bereich lässt sich viel schneller abbauen als der


Bereich in den Sekundärstrukturen, daher erhält man
unterschiedliche Ausbeuten an Proteinen

3´Stabilisatoren

Auch hier sind Stabilitäts- Sekundärstrukturen vorhanden. Die Halbwertszeit steigt dann an.

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3´Stem- loop Strukturen schützen mRNA vor 3´Exonuklease

mRNA Zerfall in E.coli

Reinigung der Degradosom- Komponenten

Beim Degradosom handelt es sich nicht um eine einzige RNAse, sondern um einen Komplex.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

E.coli RNA- Degradosom

RnlB Helikase (bricht Sekundärstrukturen auf)

Helikase- erleichterter Abbau einer internen RNA stem- loop


Struktur: Ohne die RNA- Helikase- Aktivität ist die
Fortbewegung der Exonuklease (gelb) blockiert durch die
stem- loop Struktur. Die RNA- Helikase hydrolysiert ATP um
den stem- loop aufzuwinden, was wiederum den Abbau
durch die Exonuklease erleichtert.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Binden an RNAseE stimuliert RhlB ATPase


Aktivität.

E.coli Poly (A) Polymerase I (PAPI)

Ein Trick wie Transkripte von Bakterien mit einer 3´seitigen Sekundärstruktur dennoch abgebaut
werden können ist die Verwendung von PAPI. Dieses hängt Poly- A- Schwänze an das 3´Ende. Diese
wirken nun destabilisierend, weil sie Bindungsstellen für Nukleasen sind.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Abbau von stem- loops mit unterschiedliche langen Poly- A- Schwänzen

Je länger allerdings ein Poly A Schwanz nach einem Stem- Loop ist, desto schneller kann die mRNA
abgebaut werden, da die Bindung des Degradosoms an das 3' Ende besser wird und in Folge mittels
Helicase den Stem- Loop auflösen kann.

30S UE und Endoribonukleasen konkurrieren um das 5´UTR des E.coli Transkripts

mRNA Stabilität und Translation

1. Transkriptionale Entkopplung (schwache RBS, T7- RNA- Pol)


2. Trans- Translation

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Demaskierung von Nuklease- sensitive Stellen durch Desynchronisation von Transkription


und Translation

Ribosomen

Sequenz und Sekundärstruktur der E.coli ompA 5´UTR

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Das Ribosom schützt das 5´Ende vor RNAseE Spaltung

Eine effiziente SD- Sequenz aber nicht Translation ist für die lacZ mRNA Stabilität in E.coli
wichtig

Die SD Sequenz eines lacZ Gens wird durch eine effizientere SD Sequenz ersetzt (gelb markiert). Über
die effizientere SD Sequenz bildet sich ein starker ternärer Komplex, Ribosomen sind häufig an mRNA
gebunden, die mRNA wird stark translatiert. Das Degradosom kann nicht schneiden, da
translatierende Ribosomen Ansatz- und Schnittstellen verdecken. Im Versuch steigt die Halbwertszeit
der mRNA mit einer effizienten SD Sequenz auf 2,8 Minuten. Wird die SD Sequenz so verändert, dass
Ribosomen nur schlecht daran binden können, verkürzt sich die Halbwertszeit auf 1,3 Minuten. Die
Halbwertszeit einer mRNA steigt mit der Translationsrate, je stärker sie translatiert wird, desto
stabiler wird sie. Mittels Chloramphenicol, das die Translation verzögert, lässt sich die Stabilität von
mRNA ebenfalls erhöhen, da Ribosomen länger an die mRNA gebunden bleiben.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Trans- Translation

mRNA weist normalerweise ein Stopcodon am Ende der codierenden Sequenz auf. Exonukleasen die
vom 3' Ende her mRNA abbauen entfernen Stopcodons, sie stehen nicht mehr für den Abbruch der
Translation zur Verfügung. Wird eine mRNA ohne Stopcodon von Ribosomen translatiert, bleiben
diese am Ende der mRNA gebunden ohne sich zu lösen. Zur Auflösung dieser Situation werden die
speziellen RNAs tmRNA oder SsrA verwendet. Es handelt sich dabei um eine 10S RNA, die wie eine
tRNA mit Alanin beladen ist, weiters aber noch eine spezielle RNA Sequenz aufweist ("Tag Sequenz"),
die vom Ribosom translatiert werden kann und mit einem Stopcodon endet. tmRNA tritt in die
ribosomale A-Site ein (EF-Tu wird benötigt), das bereits translatierte Polypeptid wird auf Alanin
übertragen. Anschließend wird die Sequenz der 10S RNA translatiert, über das Stopcodon werden
Polypeptid freigesetzt und das Ribosom von der mRNA gelöst. Durch die "Tag" Sequenz ist das
Polypeptid für den Abbau durch Proteasen markiert.

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tmRNA Struktur

links eine tRNA für Ala. Rechts


die tmRNA die sehr der tRNA für
Ala ähnelt im oberen Bereich
und kann daher mit der Ala-
tRNA – Synthetase beladen
werden. Die komplexe untere
Struktur enthält gleichzeitig eine
mRNA.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Potentieller Mechanismus der SsrA Rekrutierung

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Abbau des SsrA- tagged Substrats durch den ClpXP- Komplex

Der Komplex erkennt das Protein und baut es ab.

Modell für die Bindung, spontane Denaturierung und Degradierung eines SsrA- tagged
Substrats durch Tsp- Protease

Zusammenfassung

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REGULATION VON GENEXPRESSION IN EUKARYOTEN

In Eukaryoten sind Transkription und Translation räumlich getrennt, Transkription findet im Nucleus
statt, das Transkript wird modifiziert und ins Cytosol transportiert, wo die Translation stattfindet. Das
Transkript von Eukaryoten ist nicht direkt translationsfähig, sondern in codierende Exons und nicht
codierende Introns aufgeteilt. Diese Introns müssen zuerst aus der mRNA entfernt werden, bevor
eine Translation stattfinden kann.

mRNA Prozessierung: nukleäres Splicing

hnRNA (heterogene nukleäre RNA) existiert als Ribonukleo-


Proteinpartikel, welches in einer Serie von beads organisiert ist.

Vor der Entfernung der


Introns wird diese so
genannte prä-mRNA
modifiziert. Am 5' Ende wird
eine so genannte CAP-
Struktur angebracht, am 3'
Ende werden bis zu 200 A
angehängt (PolyA-Schwanz).
Diese Modifikationen sind für
die Translation der mRNA
essentiell. Der Vorgang bei
dem die Introns aus der prä-
mRNA entfernt und die Exons
zusammengefügt werden,
wird als Spleißen (splicing)
bezeichnet und durch einen
Komplex (Spliceosom)
durchgeführt, der aus
Proteinen und RNAs (hnRNAs,
snRNAs) besteht.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Kennzeichen von nukl. prä- mRNA Introns

Sie haben kurze


Konsensussequenzen
an der Exon- Intron
Grenze. Diese
Sequenzen sind wichtig
damit das Slicen
stattfinden kann.

Wird eine mRNA aus der gesamten RNA einer


eukaryotischen Zelle mittels Northern Blot untersucht
und entsprechend markiert, so findet sich nicht eine,
sondern mehrere Banden, je nachdem wie viele Introns
bereits aus der prä-mRNA gespleißt wurden.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Splicing ist ein 2 Schritte Prozess der viele weitere Schritte involviert

Das Spliceosom erkennt die für das Splicen


notwendigen 5' (GU) und 3' (AG) Sites auf der
mRNA, bringt sie in räumliche Nähe und vermittelt
so eine Transesterifizierung mit zwei aufeinander
folgenden nucleophilen Angriffen. Im Intron findet
sich eine so genannte Branch Site, die ein A enthält.
Das OH dieses As führt einen nucleophilen Angriff
auf die Phosphoesterbindung der 5' Site durch. Es
entsteht die Lariatstruktur und ein freies OH an der
5' Site. Dieses freie OH der 5' site führt einen
dirigierten nucleophilen Angriff auf die 3'Site des
Introns durch, wodurch das Lariat freigesetzt und
die beiden Exons miteinander verknüpft werden.
Das freigesetzte Lariat wird für den Abbau wieder in
lineare Form überführt. Lariat ist mittels
Gelelektrophorese gut nachzuweisen.

Nukl. Splicing passiert in 2


Transesterifizierungsreaktionen in welcher ein freies OH
eine Phosphodiesterbindung angreift.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

U1 snRNA hat eine basengepaarte Struktur, die


verschiedene Domänen kreiert. Das 5´Ende bleibt
dabei ss und kann mit der 5´splicing site
basenpaaren.

Spleißen ist kein enzymatischer, sondern ein


autokatalytischer, das Spliceosom bringt die
miteinander interagierenden Teil in räumliche
Nähe, damit die Aktion ablaufen kann. Der
Vorgang wird durch RNAs vermittelt, die durch
gebundene Proteine korrekt positioniert werden.
hnRNAs müssen aus dem Zellkernexportiert
werden, im Cytosol binden sie an die benötigten
Proteine und werden anschließend wieder in den
Nukleus importiert. snRNAs des Spliceosoms
müssen für Faltung ins Cytoplasma transportiert
werden. Für diesen Transport werden zahlreiche
Exportproteine benötigt. Im Cytoplasma werden
die snRNAs freigesetzt, die Faltung wird durch hfq
ähnliche SM Proteine und RNasen durchgeführt.
Durch Importproteine werden die gefalteten
snRNAs zurück in den Nukleus transportiert.

Die Splicing Reaktion


schreitet über diskrete
Schritte voran, in
welchen die Sliceosom-
Bildung die Interaktion
mit Komponenten die
die Konsensussequenz
erkennen involviert.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

U6- U4 Paarung ist inkompatibel mit U6- U2


Paarung. Wenn U6 das Spliceosom betritt, ist es mit
U4 gepaart. Verlassen von U4 führt zu einer
Konformationsänderung in U6, ein Teil der
freigegebenen Sequenz bildet einen Hairpin (grau)
und ein anderer Teil (schwarz) paart mit U2. Weil
ein benachbarter Teil von U2 schon mit der branch
site gepaart ist, bringt dies U6 in Juxtaposition
(Nebeneinanderstellung) mit dem Branch.

Spliceosome sind ellipsoide Partikel mit einigen


diskreten Regionen.

Spliceosomale UsnRNP Biogenese, Struktur und Funktion

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Gruppe I und Gruppe II Introns: Organellen und Bakterien falten sich in eine typische
Sekundärstruktur

3 Klassen von Splicing Reaktionen verlaufen über 2 Transesterifizierungen. Zuerst attackiert eine freie
OH- Gruppe die Exon 1- Intron junction. Danach attackiert das OH welches am Ende von Exon 1
entstanden ist die Intron- Exon 2 Junction.

Nukl- Splicing und GruppeII Splicing involviert die Bildung von ähnlichen Sekundärstrukturen. Die
Sequenz ist jedoch beim nukl. Splicing spezifischer. Gruppe II splicing benutzt Positionen die
möglicherweise von Purin oder Pyrimidin besetzt werden kann.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Gruppe I Introns: self- splicing, autosplicing

Nuklei von niedr. Eukaryoten, fungalen Mitochondrien, Phage T4, Bakterien

Splicing des Tetrahymena 35S rRNA Precursor


kann mittels Gelelektrophorese verfolgt
werden. Das Entfernen des Introns wird durch
das Auftauchen einer schnell wandernden
schmalen Bande offenbart. Wenn sich die
Introns zirkularisieren wandern sie langsamer
was man an der höheren Bande sieht.

Self- Splicing passiert durch


Transesterifizierungsreaktionen in
welchen Bindungen direkt
ausgetauscht werden. Die Bindungen
welche in jedem Schritt entstehen
sind durch die schattierten Boxen
dargestellt.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Gruppe I Introns haben eine gemeinsame


Sekundärstruktur, welche durch 9 basengepaarte
Regionen gebildet wird. Die Sequenzen der
Regionen P4 und P7 sind konserviert und
identifizieren die individuellen Sequenzelemente
P, Q, R und S. P1 wird durch Paarung zwischen
dem Ende des linken Exons und dem IGS des
Introns gebildet.

Splicing Ansatz in vivo

Dazu plaziert man ein Tetrahymena Intron ind


die β- Galaktosidase coding Sequenz von E.coli.
Die Synthese von β- Galaktosidase kann getestet
werden, indem man eine Komponente zugibt die
sich blau färbt durch das Enzym. Die Sequenz
wird durch einen Bakteriophagen getragen,
daher bedeutet die Anwesenheit von blauen
Plaques erfolgreiches Splicing.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

3´End Formation

Die AAUAAA- Sequenz ist notwendig für die


Spaltung um eine 3´Ende für die Polyadenylierung
zu erhalten.

Der 3´prozessierende Komplex besteht aus mehreren


Aktivitäten. CPSF und CstF bestehen aus mehreren UE. Die
anderen Komponenten sind Monomere. Die totale Masse
beträgt >900kDa.

PAP: Poly-A-Polymerase

CPSF: erkennt AAUAAA

CF: cleavage factors

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

- BLÄSI: FOLIENSATZ 5 -

mRNA

Wie schaut eine


eukaryotische mRNA
aus? Am wichtigsten ist
die CAP- Struktur (7-
Methylguanin) am
5´Ende. Nach der
Transkription wird
Polyadenyliert was die
mRNA stabilisiert.

Translation in Eukaryoten

Eukaryotische Ribosomen wandern vom


5´Ende der mRNA zur RBS, welche ein AUG
Initiationscodon enthält.

Wie findet das Ribosom den


Translationsstart? 40S UE bildet einen
Komplex aus Met-tRNAi, eIF2 und GTP. Dieser
Komplex bindet an die CAP Struktur der
mRNA. Auch in eukaryotischer mRNA finden
sich in der Umgebung des Startcodons
gewisse Konsensussequenzen (Kozak
Sequenz), die dem Ribosom ermöglichen den
Start zu erkennen (obwohl eigentlich immer
das erste AUG vom 5' Ende her das
Startcodon ist). Im Gegensatz zu Prokaryoten
werden die Interaktionen zwischen Ribosom
und Sequenz nicht zwischen RNA-mRNA
sondern Protein-mRNA gebildet.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Das CAP blockiert das 5´Ende der mRNA und kann an


verschiedenen Positionen methyliert sein.

Die CAP Struktur befindet sich am 5' Ende der mRNA


und besteht aus einem methylierten Guanylrest. Diese
Struktur ist für die Bindung des Ribosoms an die mRNA
nötig und erhöht die Halbwärtszeit der mRNA. Der
Guanylrest wird mittels Guanyltransferase angebracht
und an Position 7 durch eine Methyltransferase
methyliert. In allen höheren Eukaryoten wird weiters
die Base, die auf das angebrachte Guanin folgt, an
Position 2 mittels O-Methyltransferase methyliert.

Poly (A) RNA kann von anderen RNAs durch


Fraktionierung auf Sepharose- Oligos (dT) getrennt
werden.

Eukaryotische mRNA lässtsich über den PolyA


schwanz isolieren. Man erzeugt mittels Phenol-
Chlorophorm ein Lysat und bindet die mRNAs über
eine Säule mit Poly T-Oligonucleotiden. Durch eine
hohe Salzkonzentration kann diese Bindung gelöst
und die mRNAs isoliert werden. Der PolyA Schwanz
ist sowohl für die Stabilität der mRNA als auch für
die Initiation der Translation von Bedeutung.

Der eukaryotische IF eIF1 sowie der Faktor aeIF1 in Archaea sind homolog dem prok. Faktor IF3 und
diskriminieren somit gegen alle tRNAs außer für AUG bzw. unterstützen die Bindung der Initiator-
tRNA an die 40S UE. eIF2 ist ein Komplex aus 3 UE und transportiert die Initiator-tRNA zum Ribosom.
Durch Spaltung von GTP kann es wie IF2 wieder aus dem Ribosom freigesetzt werden. eIF2B recycelt
eIF2 indem es bei diesem GDP mit GTP austauscht. Viren können bewirken, dass eIF2B GDP
permanent bindet und nicht mehr zur Aktivierung von eIF2 zur Verfügung steht. eIF3 unterstützt die

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Bindung der 40S UE an die mRNA. eIF4 ist eine Helikase, die Sekundärstrukturen der mRNA
aufzulösen, damit das Ribosom die mRNA ungestört translatieren kann. eIF4B fördert die die Aktivität
der Helikase. eIF4e bindet die CAP Struktur. eIF4F dient als Adapterprotein mehrerer Faktoren.

Translationsinitiation in Eukaryoten

Der eukaryotische 40S Translationsintiationskomplex

Protein- Protein Interaktion bei


Translations- IFs erleichtern die
Assemblierung des Translations-
intiations- Komplexes. eIF2 bindet
Met- tRNAfMet (rot) an die 40S UE. eIF3
ist ein multi- UE- Komplex und die
eIF3c UE interagiert mit eIF1 und eIF5.
In Hefe bindet eIF5 direkt an eIF4G.
eIF1, eIF1A, eIF2, eIF3, eIF5 und eIF5B
binden irgendwann während der Translationsintiation an die 40S UE. Es ist wahrscheinlich, dass
eIF5B und eIF2 niemals simultan mit der 40S UE interagieren. eIF4G dient als Adaptor für mRNA

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Rekrutierung und enthält Bindestellen für m´G CAP- Bindeprotein eiF4E, eIF4A, das Poly (A)
Bindeprotein (PABP) und die eIF4E Kinase MNK1. 4E-BP konkurriert mit eIF4G um die Bindung an
eIF4E. Phosphorylierung von 4E- BP schwächt die eIF4E Bindung, dies erlaubt es eIF4E mit eIF4G zu
interagieren und Translation zu promoten. Phosphorylierung von eIF2α konvertiert eIF2 in einen
Inhibitor seines Guanin- Nukleotid exchange factor eIF2B.

Ribosomale Rekrutierung an mRNA in Pro- und Eukaryoten

Unter Stressbedingungen wird die αUE


von eIF2 induziert. GEF kann sich nicht
mehr ablösen, durch GEF ist keine
Austausch von GTP mit GDP möglich. Es
findet keine Translation statt, da eIF2 im
inaktiven Zustand keine tRNAi liefern
kann.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

RNA Sensoren: Regulation von IFN- gamma durch neg. Feedback

Humane IFN- γ mRNA aktiviert PKR über einen


Pseudoknoten- Sensor um seine eigene
Translation zu inhibieren.

(A) Pseudoknoten in 5´UTR der humanen IFN- γ


mRNA

Basenpaarung

(B) Autoregulation der IFN- γ Synthese. IFN- γ


mRNA Translation, welche abhängig von eIF2 ist,
liefert IFN- γ welches mehr RNA- dependent
protein kinase (PKR) Expression in der Zelle erhält
und kreiert ein neg. Feedback loop. Inaktive PKR
bindet an den Pseudoknoten, was zu einer lokalen
PKR Aktivierung führt. Die resultierende
Phosphorylierung von eIF2α blockiert weitere
Translation von IFN- γ mRNA.

Eukaryotische Ribosomen benötigen IF1 und 1A um Initiationscodons zu lokalisieren

Komposition und Reinigung von Proteinen welche in


der Translationsinitiation verwendet werden.

(a), (c) Überblick der Proteine die verwendet werden


um Translationsinitiation wiederherzustellen.

(b) Reinigungsschema für eIF1 und eIF1A. Das SDS-


PAGE Gel wird mit Coomassie- Blue gefärbt.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Assemblierung und Toeprint Analyse von


ribosomalen Komplexen auf der β- Globin mRNA.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Mechanismen der Translationsinitiation in Eukaryoten

Scanning: Die CAP Struktur muss für die


40S UE zugänglich sein. Störende
Sekundärstrukturen werden unter ATP
Verbrauch mittels Helicase aufgelöst.
Wenn die 40S UE an CAP gebunden ist,
wandert sie bis zu einem Startcodon oder
einer Kozak Sequenz unter ATP-
Verbrauch an der mRNA entlang.
Sekundärstrukturen werden durch
Helicase entwunden.

Reinitiation: Kommt ein Ribosom an ein


Stopcodon, löst sich die 60S UE ab, die
40S UE bleibt gebunden und wandert
unter ATP Verbrauch weiter an der
mRNA entlang. Kommt es dabei zu einem
Startcodon, kann tRNAi und im Anschluss
ein 60S UE binden und Translation erneut
aufgenommen werden. "Jumping" ...
wurde bisher nicht bewiesen. Das
Ribosom bindet am CAP und springt
direkt zum AUG. Das wäre vorstellbar,
wenn die mRNA nicht linear vorliegt.

Internal Initiation: Wurde ursprünglich


bei Viren entdeckt (Picornavirus, s.u.).
Durch virale Proteasen wird der
eukaryotische Translationsfaktor elF4G gespalten, es kann keine CAP abhängige Translation mehr
stattfinden. Die viruseigene mRNA ist von CAP unabhängig und initiiert Translation an einer IRES
(Internal ribosom entry site). IRES sind Sekundärstrukturen in der 5' NCR (Non coding region, am 5'
Ende der mRNA) von Picornaviren, das Ribosom kann an dieser Sekundärstruktur andocken.

Interne Initiation in vir. mRNAs

Caspasen spalten im Zuge


der Apoptose beinahe an
derselben Stelle.

Caspase (Apoptose)

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Picornavirale mRNAs haben kein 5´CAP

Klassifizierung eines tier. Picornavirus. Die prinzipiellen Gattungen sind in bold gezeigt. Mit
Ausnahme des Mengovirus gibt es für jede Spezies mehrere verschiedene Stämme oder Serotypen.
Der phylogenetische Baum basiert auf dem Vergleich von Nukleotidsequenzen einer Capsid- Protein
coding regions.

IRES: interne Ribosomeneintrittsstelle

Modell für die interne Initiation von Picornavirus


RNAs:

Interne Initiation benötigt IRES (internal


ribosomal entry site). Dabei handelt es sich um
komplexe Sekundärstrukturen der mRNA, die
gemeinsam mit Proteinfaktoren eine
Ribosomenbindung ermöglichen. Denkbar ist,
dass Ribosomen über IRES entweder direkt an
AUG binden oder von IRES aus auf der mRNA
entlang wandern, bis sie an ein AUG gelangen.

Die 3D Struktur der IRES wird vermutlich durch RNA-RNA


und RNA-Protein Interaktionen bestimmt. RNA-binding
Proteins binden an bestimmten Sequenzen der mRNA,
dimerisieren und stabilisieren dadurch IRES-Strukturen.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Schematische Repräsentation von EMCV, FMDV


und TMEV IHRES Domänen H-L. Gezeigt sind
Bindungsstellen für PTB (dicke, graue Linie) und
ITAF45.

Schematische Illustration einer eukaryotischen mRNA Translation und major Stellen der viralen
Regulation.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Virale Mechanismen der translationalen Reprogrammierung

Leaky scanning und Frameshifting

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Kontrolle durch Leaky Scanning, Termination und Reinitiationsereignisse

Funktionelle Recodierung an der MuLV gag-pol Junction

Synthesis of the MuLV Gag protein


terminates at the gagstop codon
(top). However, approximately 5% of
the time, the elongating ribosome will
read through the gagstop codon to
produce the Gag-Pol polyprotein
(bottom). During this process, the
gagstop codon is redefined to encode
glutamine and is shown by the
presence oftRNA Gln at the redefined
UAG codon. Stop codon redefinition is
dependent on specific downstream
sequences and a 3'-proximalpseudoknot structure. The elongating ribosome eventually melts out the
pseudoknot to complete Gag-Pol synthesis. Low-frequency gag-polstop codon redefinition is
essential for MuLV replication. Figure adapted with modification from references 12 and 108.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Negative regulatorische Elemente in der 5´UTR der mRNA welche möglicherweise


Translation reprimieren

Translationale Pathophysiologie: ein neuer molekularer Mechanismus menschlicher


Krankheit

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Regulation der Translationsinitiation in Eukaryoten

Eisen ist für die katalytische


Funktion vieler Enzyme (z.B.
Aconitase im Citratzyklus)
essentiell. Transferrin dient als
Eisentransporter, Ferritin als
Eisenspeicher. Bei Eisenmangel
werden Transferrin-Rezeptoren
(TR) zur Aufnahme von Eisen
benötigt. Hat Aconitase kein
Eisen gebunden, weil die
Konzentration zu niedrig ist,
kann es stabil an das 3' Ende der
TR mRNA binden, die mRNA
wird stabilisiert, TR können
translatiert werden. Weiters
bindet Aconitase bei
Eisenmangel an das 5' Ende der
Ferritin mRNA, wodurch dessen Translation verhindert wird. Bei Eisenüberschuss hat Aconitase Eisen
gebunden und kann nicht an die jeweiligen mRNAs binden, Ferritin wird translatiert, TR nicht.

Coordinate regulation of
transferrin receptor and
ferritin synthesis through
translational controls
operated by the iron-
responsive elements (IREs)
and by the iron regulatory
proteins IRP1 and IRP2.Only
one IRE is present in the 5'-
UTR of ferritin mRNA. When
cellular iron is scarce, IRP
molecules are available for
binding the 5' IRE; initiation
of translation is prevented;
and ferritin synthesis is
inhibited. By contrast, presence of abundantintracellular iron prevents binding of IRPs to the 5' IRE
and allows efficient mRNA translation to proceed (green arrow). Five IREs are present in the 3'-UTR
of transferrin receptor (TfR) mRNA. When cellular iron is scarce, bindingof one or more IRPs to the
IREs in the 3'-UTR stabilizes TfR mRNA and increases TfR translation. Conversely, when iron is
abundant, very few IREs are occupied by IRPs, and TfR mRNA is rapidly degraded.

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Eukaryotische Elongation und Termination: geringe Unterschiede zwischen Eukaryoten


und Prokaryoten (Eukaryoten: nur ein Release- Faktor)

Die Elongation in Eukaryoten läuft


analog zu Prokaryoten ab,
esexisitieren Homologe zu EF-Tu und
EF-G. Die Termination in Eukaryoten
benötigt nur einen Releasefaktor im
Gegensatz zu den drei
Releasefaktoren in Prokaryoten.
Einige bakterielle Toxine können
eukaryotische EFs modifizieren. z.B.
das Diphterietoxin überträgt einen
Ribosylrest auf die seltene AS
Diphtamid, die im Elongationsfaktor
eEF2 (Homologzu EF-G) vorkommt.
Dadurch wird eEF2 inaktiviert, die
Translation wird gestoppt. EF-G im
Bakterium selbst weist kein
Diphtamid auf und ist daher nicht
vom Toxin betroffen. In der eukaryotischen Translation sind noch viele Punkte ungeklärt,
beispielsweise ist noch nicht bekannt, wie Ribosomen von der mRNA dissoziieren, wenn sie das
Stopcodon erreicht haben.

mRNA Stabilität in Eukaryoten

Eukaryoten besitzen
Endonucleasen sowie
Exonucleasen, die mRNA
nicht nur vom 3' Ende
sondern auch vom 5'
Ende her abbauen
können. Wie schon
erwähnt, ist die Stabilität
von eukaryotischer mRNA
durch CAP und PolyA im
Vergleich mit
prokaryotischer mRNA
erhöht. mRNA liegt über CAP, Poly A, PABP und eIF4G gebunden zirkulärisiert vor. Je länger der Poly
A Schwanz ist bzw.je öfter das 3' UTR motif vorkommt, desto stabiler wird die mRNA. Das 5' Ende ist
daher üblicherweise für Exonuclease nicht zugänglich. Für den Abbau muss diese Zirkularisierung
gelöst werden. Der PolyA Schwanz wird so weit verkürzt, dass keine Interaktion zwischen PABP und
eIF4G mehr stattfinden kann. Anschließend wird der Methyl-7-Guanosyl-Rest des CAP durch ein
decapping enyzme entfernt. Erst jetzt kann die mRNA vom 5' Ende oder auch vom 3' Ende her
abgebaut werden.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Frühzeitige Translationstermination löst mRNA decapping aus

T ½ … Halbwertszeit

Frühzeitige Termination führt zum Abbau


von mRNA. Wird z.B. in Hefe bei einer
mRNA mit bekannter Halbwertszeit ein
vorzeitiges Stopcodon eingefügt (2. Gel),
sinkt die HWZ der mRNA. Wird diese
Mutation in einen Hefestamm eingebracht,
der keine funktionelle 5' →3' Exonuclease
besitzt, steigt die HWZ wieder an (3. Gel).
Ein Abbau durch vorzeitige Stopcodons
wird demnach vom 5' Ende her initiiert.
Fehlerhafte Stopcodons lassen sich durch
das im Vergleich mit DNA-Pol weniger
effiziente Proofreading der RNA-Pol
erklären. Es gibt zwei unterschiedliche
Varianten wie der Abbau vorzeitiger
Stopcodons eingeleitet werden kann.

mRNA Turnover in Hefe

Translation initiation is strongly


stimulated by interactions between Pab1p
and the eIFG4 initiation factor. Transient
disruption of these interactions may allow
slow deadenylation of the mRNA. Pab1p
also interacts with other translation
initiation factors, possibly including
Mrt1p/Pat1p/Spb10p. After
deadenylation to A 10or less, the mRNA is
degraded. In the major pathway, Mrt1p
probably recruits the Lsm1p/Spb8p
protein to the mRNA, presumably as a
component of an Lsm complex. This
interacts with Dcp1p and Dcp2p,
promoting decapping and 5′→3′
degradation by Xrn1p. In an alternative
pathway, the mRNA is degraded 3′→5′ by
the exosome complex. This also requires
cofactors — the Ski2p, Ski3p and Ski8p proteins — but their order of action and function in recruiting
and/or stimulating the exosome complex are unknown.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Nonsense- vermittelter Zerfall

Bereits während dem Spleißen binden Proteinkomplexe (EJC) oberhalb der Splice sites an die mRNA,
die anschließend aus dem Nukleus transportiert wird. Im Cytosol binden weitere Proteinfaktoren an
die mRNA. Wird dabei ein Stopcodon entdeckt, wandert der Faktor hUpf1 downstream entlang der
mRNA. Kommt er dabei an einen EJC, war das Stopcodon vorzeitig, hUpf1 wird phosphoryliert und
beschleunigt decapping und Abbau der mRNA.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Eine weitere Variante des Abbaus von mRNA mit vorzeitigen Stopcodons ist, dass der Abbau durch
Interaktionen des Ribosoms ausgelöst wird. Kommt das Ribosom während der Translation an ein
Stopcodon, prüft es entweder selbst, ob sich downstream cis-aktive Sequenzen befinden
(downstream sequence element mit gebundenem Protein), die anzeigen, dass es sich bei dem
Stopcodon um einen Fehler handeln muss und initiert in diesem Fall decapping und Abbau von
beiden Enden her (bei Hefe). Bei Säugetieren wird der Faktor UPF1 vom Ribosom an einem
Stopcodon rekrutiert, der wie oben bereits beschrieben downstream wandert und den Abbau der
mRNA initiert, wenn er einen EJC erreicht.

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Regulatorische RNAs/ siRNAs und miRNAs

RNAi: RNA- vermittelte Interferenz

In Eukaroyten induziert doppelsträngige


dsRNA den sequenz-spezifischen Abbau
der mRNA. PTGS: post transcriptionalgene
silencing RNAi (RNA mediated
interference)

Doppelsträngige RNA hat im Cytosol nix zu


suchen, es stammt vermutlich von Viren
und wird daher durch einen speziellen
Proteinkomplex (Dicer) in 21nt lange
Stücke zerschnitten. But wait, there's
more! Die Teile der dsRNA werden in die
Einzelstränge aufgetrennt und von einem
weiteren Proteinkomplex (RISC)
gebunden. Zumindest eine Hälfte dieser
gebundenen RNA ist komplementär zu der
von ihr transkribierten mRNA. Der
Komplex kann auf diese Art an die sich im Cytosol befindliche mRNA des Virus binden und diese
zerschneiden. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von PTGS (post transcripitional gene
silencing).

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VO Genexpression_Bläsi (Knoglinger SS12)

Unter Gen Knockdown versteht man


den Vorgang, die Translation des
Zielgens durch RNAi auszuschalten.
Dazu bringt man DNA in den
Organismus ein, dessen Transkript
RNA einerseits einen Teil der mRNA
des Zielgens enthält und andererseits
so weit mit sich selbst
bindet(Antisense RNA), dass dadurch
eine scheinbare dsRNA entsteht, die
durch RNAi erkannt, geschnitten und
verwendet wird, um die mRNA des
Zielgens zu zerschneiden.

siRNA Expression

 für vorübergehende Expression: duplexRNA kann an Zellen geliefert werden


 für stabile Expression: ein Vektor mit der DNA um hairpin RNA zu produzieren
 der Vektor kann ein Plasmid, Retrovirus oder Adenovirus sein

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