PERMANENTE RECURSOS GENÉTICOS NOTA 955

marcadores será de gran valor para la descripción de la estructura genética de la Suffolk, Reino Unido. Disponible en http://www.cefas.co.uk/publications/ acuática /

población, la conectividad y la demografía de DAB alrededor de las Islas aemr57.pdf.

Salón TA (1999) Bioedit: una alineación de secuencias biológicas fácil de usar,
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editores y programa de análisis para Windows 95/98 / NT. (Http: //
de datos, y proporcionar un fondo genético neutral con la que los marcadores
www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Nucleic Acids Symposium Series, 41, 95-98.
genéticos de adaptación se pueden comparar.

Lyons BP, Stewart C, Kirby MF análisis (2000) 32P-postlabelling

Agradecimientos
Niklas Tysklind fue apoyado por una beca conjunta-CEFAS Bangor Universidad. Este
trabajo fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Medio Ambiente Alimentación y
Asuntos Rurales (DEFRA): subvención no. ME3206.
referencias
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© 2009 Los Autores
Compilación de los artículos © 2009 Blackwell Publishing Ltd

Nueva loci microsatélites para el tiburón martillo festoneado en peligro de

extinción, Sphyrna lewini

Holly A. Nance, TOBY S *. DALY-ENGEL † y Peter B. MARKO *

* Departamento de Ciencias Biológicas, 132 Long Hall, Universidad de Clemson, Clemson, Carolina del Sur 29634, EE.UU., † Hawaii Institute of Marine Biology, PO Box 1346,
Kaneohe, Hawai 96744, EE.UU.

Resumen

Aislamos 15 marcadores microsatélites para el tiburón martillo, Sphyrna lewini.

Loci fueron probados en 80 especímenes de S. lewini a partir de cuatro muestras del Pacífico Oriental. El número de alelos por
locus oscilaba entre el 6 a 31 (media = 14). niveles observados y esperados de heterocigosidad por locus variaron desde 0,39
hasta 0,91 (media = 0,70) y desde 0,54 hasta 0,90 (media = 0,76), respectivamente. No hay pares de loci estaban en desequilibrio
gamético después de la corrección de Bonferroni de α. Un locus mostró significativamente menor heterocigosidad de lo esperado
bajo proporciones de Hardy-Weinberg en dos poblaciones, posiblemente causadas por alelos nulos.

palabras clave: genética de la conservación, elasmobranquios, la pesca, la migración, la estructura de la población

Recibido el 29 de septiembre de 2008; la revisión de noviembre de 2008 aceptado el 10 de

El tiburón martillo, Sphyrna lewini, es una especie circuntropicales (Compagno 1984)

figuran como 'en peligro de extinción a nivel mundial' en la Lista Roja de la UICN.

Correspondencia: Holly A. Nance, Fax: 864-656-0435; E-mail: hnance@clemson.edu Aunque los desembarques de S. lewini han disminuido en los últimos años (por ejemplo

Vooren et al. 2005; Dudley y

956 PERMANENTE RECURSOS GENÉTICOS NOTA

tabla 1 Las secuencias de cebador para la nueva Sphyrna lewini loci de microsatélites. T un se recocido de temperatura. H mi y H O se promedian esperada y observada heterocigosis en las cuatro
muestras del Pacífico Oriental, y PAG- los valores se dan como la gama a través de las cuatro muestras *

Lugar Secuencia del cebador (5 ' - 3 ') No la adhesión. alelos Rango (pb) T un ( ° C) H mi HO PAG valor

SLE013 F: ATGTTTATGACCATACGTGCG FJ236873 10 302-350 60 0.67 0.55 0,05-0,91

R: TTGATTGGCATTCAGTGACC

SLE018 F: ACAGAAACAGAACGAGGGACA FJ236878 6 208-258 60 0.65 0.40 0,00-0,90

R: TGGGTTGGCATTGAACAGAA

SLE025 F: CTCAGGCTAGTTGCACAGAAA FJ236874 31 234-398 57 0.90 0.91 0,96-0,10

R: TCAACTCCCCACAATCCCAT

SLE027 F: GAGACCAGCCAAAGGAAAAA FJ236879 13 420-459 60 0.70 0.61 0,03 hasta 0,84

R: ATGCCATATTCATCCAGGCAC

SLE028 F: TTTGGAGACATTGCAGAAAG FJ236875 25 226-281 55 0.84 0.88 0,06 a 0,83

R: CACTTGGGACTACACACACTG

SLE033 F: TTGGTCAATGTCCTCTTGCA FJ236876 11 261-299 57 0.79 0.80 0,16-0,60

R: CCCATGCTGTTTTGTTCTTTG
SLE038 F: AGCCTACTTCTGCCACATTTT FJ236877 14 419-475 60 0.80 0,73 0,06-0,63
R: AATCAAAGTTCCTGCAGTCCT

SLE045 F: AGGATGGGATTCAGTGACAGA FJ236880 5 403-411 60 0.66 0.57 0,01-0,96

R: AATAAGCTCAAAGGGCTGGA

SLE053 F: AAGTCAAAAGCTGTGTGCGA FJ236881 21 407-457 57 0.84 0.79 0,06-0,79

R: ATTCCCCACATACATTCCCCA

SLE054 F: CTGACACTGCCAATTTGCAT FJ236882 9 186-206 60 0.54 0.39 0,06-0,78

R: CCAACTGGAGTTGTCAATCCA

SLE071 F: TCAGACGGTGGTACGTACACA FJ236883 13 236-285 60 0.75 0.58 0,01 a 0,54

R: TGACCCTTTTGGATTGAAGGA

SLE077 F: TTCCCTCTCAGAGTGACATTG FJ236884 29 218-317 55 0.90 0.91 0,53-0,78

R: CCTTTCCTCCATACACAAACA
SLE081 F: ATGTTCATCATCCGAGACAGG FJ236885 8 384-402 60 0.80 0,81 0,62-0,99
R: CCAAACACACGTATCTGCACCCA

SLE086 F: TACAGACAGATTTCAGTGTGT FJ236886 6 350-361 60 0,71 0.67 0,18 a 0,62

R: ACGAATACGCATTCATACAC

SLE089 F: TTACCACAGTTTGTGTGGGTG FJ236887 13 172-204 60 0.85 0.91 0,25 a 0,85

R: AAGTTTCAGTGTCAGTGTGC

* Heterocigosis se calcularon de forma individual para cada una de las cuatro muestras del Pacífico Oriental y promediados entre esas cuatro muestras. Sin embargo, su asociado PAG Los
valores no se promediaron y se presentan aquí como el rango de menor a mayor.

Simpfendorfer 2006; Martínez-Ortiz et al. 2007), la frecuencia de S. lewini y zygaena
sphyrna aletas subastadas en Hong Kong los mercados de pescado sigue siendo alta,
que comprende casi el 5% del peso de las aletas mercado total (Clarke et al. 2006).
En consecuencia, se necesitan datos sobre la estructura de valores, las tasas de
migración, y las estimaciones del tamaño de la población para diseñar estrategias
efectivas de conservación. Especies específicas de marcadores de microsatélites
proporcionan un medio de obtención de estos datos para taxones amenazados y en
peligro. Por tanto, hemos aislado y caracterizado 15 loci de microsatélites para S.
lewini utilizando protocolos de enriquecimiento de la biblioteca-Clark y Brazeau
(2005), modificado a partir de las estrategias desarrolladas por Kandpal et al. ( 1994).
La biblioteca se construyó usando ADN genómico extraído de dos tiburones juveniles
de Kaneohe Bay, Hawaii. Se digirió el ADN usando el Sau 3 enzima A, y fragmentos
correspondientes a 400-1500 pb se seleccionaron mediante la reducción de ADN
digerido de un 3% de agarosa gel. Sau 3 enlazadores A eran
ligaron al ADN de tamaño seleccionado, y estos fragmentos se enriquecieron por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el ADN Engine dyad Peltier
Thermal Cycler (MJ Research Inc.). El ADN enriquecido se hibridó con una sonda
marcada con biotina que contiene una secuencia CA-repetición. Enriquecimiento
de estos fragmentos de la sonda de orientación se realizó utilizando matriz
Vectrex Avidina D (Vector Laboratories). No específicamente fragmentos unidos
se elimina a través de una serie de lavados rigurosos, seguido de elución y
amplificación por PCR de fragmentos enriquecidos-CA.
Los fragmentos de la biblioteca de CA enriquecida fueron clonados mediante la
transformación Escherichia coli con el producto de la biblioteca enriquecida usando
el TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen Corp.). Las colonias se presentaron a la
Universidad de Clemson Instituto de Genómica (CUGI) para la secuenciación en un
ABI 3130 (Applied Biosystems), y posteriormente examinados por motivos
CA-repetición de las Sequencher (GeneCodes Corp.). Noventa pares
 PERMANENTE RECURSOS GENÉTICOS NOTA 957
de cebadores fueron diseñados para las secuencias que contienen regiones de
repetición, utilizando Web Primer (Universidad de Stanford). Loci productos de
amplificación produciendo de tamaño esperado en geles de agarosa fueron
amplificados utilizando cebadores marcados con colorante fluorescentes. Un
protocolo de tres cebadores se utilizó (Hauswaldt y Glenn 2003; R. Toonen,
comunicación personal.) En la que las siguientes secuencias fueron unidos a
cebadores correspondientes etiquetas marcadas con colorante para incorporados
en la PCR inversa: 6-FAM-GGAAACAGCTATGACCAT, VIC-
CAGTCGGGCGTCATCA, NED-ACCAACCTAGGAAACACAG,
PET-GGCTAGGAAAGGTTAGTGGC. Estos loci se optimizaron en una muestra
mayor de individuos. En general, PCR se 12 μ volumen total L, con 1 × GoTaq
amortiguar,
0.5 μ L cebador directo, 0,05 μ L sin marcar cebador inverso,
0.45 μ L marcado con colorante de la etiqueta inversa (cebadores en 5 μ metro concentración),
0,125 μ L de 10% de Triton X-100, 40 μ metro dNTPs,
0,35 U GoTaq polimerasa (Promega), y 0.5 μ ADN L. Termociclado perfiles
para cada locus diferían en temperatura de hibridación (Tabla 1), pero todo
comenzó con desnaturalización a 95
° C (4 min), 30-40 ciclos de 95 ° C (1 min), 55-60 ° C (1 min), y 70 ° C (1
min), seguido por una extensión final a 70 ° C (10 min).
productos marcados con fluorescencia se llevaron a cabo en un
secuenciador capilar ABI 3130, con el estándar de tamaño LIZ600 (Applied
Biosystems) y se analizaron con GeneMapper (Applied Biosystems). Loci que
amplificaron consistentemente se analizaron adicionalmente en Micro-Inspector
(Van Oosterhout et al. 2004) a prueba de errores de genotipado y para ayudar en
la identificación de posibles alelos nulos. Arlequin (Schneider et al. 2000) se
utilizó para probar las desviaciones de (HW) proporciones de Hardy-Weinberg y
para calcular observados y esperados heterocigosis. GENEPOP (Raymond y
Rousset 1995) se utilizó para probar para gametic-desequilibrio entre todos los
pares de loci.
Un total de 15 loci se caracterizaron y se encontró que polimórfica entre 80
individuos de S. lewini a partir de cuatro muestras diferentes del Pacífico Oriental.
Los datos de estos loci, incluyendo secuencias de los cebadores, el número de
alelos, gama de alelos, la temperatura de recocido, heterocigosis observadas y
esperadas, y PAG los valores se dan en la Tabla 1. Todos los motivos fueron
interrumpidos o CA repite imperfectos. Las secuencias de cada uno de
microsatélites se pueden ver en GenBank (números de acceso de la Tabla 1).
Siete loci (SLE013, SLE018, SLE027, SLE045, SLE053, SLE054, y SLE071) tenían
valores significativamente diferentes de heterocigosis observadas y esperadas. Sin
embargo, se encontró que las desviaciones de HW proporciones en estos loci en dos de
cuatro poblaciones como máximo, lo que sugiere factores demográficos pueden ser
responsables. Sólo un locus (SLE018) mostró evidencia de alelos nulos en dos
poblaciones. No desequilibrio gamético significativa fue detectada a través de todos los
pares de loci después de la corrección de Bonferroni de α. Tenemos la intención de
utilizar estos marcadores para analizar las poblaciones de S. lewini a escalas grandes,
globales ya lo largo de los márgenes más pequeños y continentales.
Agradecimientos
G. Clarke y D. Brazeau en la Universidad de Florida, Gainesville, a condición de instrucción
sobre los protocolos de enriquecimiento de la biblioteca. CUGI personal realiza todos
secuenciación y genotipado. R. Toonen, B. Bowen,
K. Holanda en el Instituto de Biología Marina de Hawai ofreció apoyo y conocimiento útil.
gracias especial a P. Klimley, F. Galvan-Magaña, M. Hoyos, L. Mejía, S. Jorgensen, P.
Ahuja, A. Vega,
I. Zanella, y D. Chacon-Rojas para la ayuda en la recogida de muestras. Los fondos
provenían de la NSF otorga DEB03-44419 y OCE05-50526 a PB Marko, OCE06-23678 a R.
Toonen, y OCE04-53167 a
B. Bowen. Esta es Contribución Técnica N ° 5554 de la Universidad de Clemson
Experimento Estación; este material está basado en trabajo apoyado por CSREES / USDA,
bajo el número de proyecto SC-1.700.342.
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