Parte I

BIOLOGIA DO
DESENVOLVIMENTO
 FERRAMENTAS METODOLÓGICAS
PARA O ESTUDO DE PROBLEMAS DE
1
BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
Vera Lúcia da Silva Valente Gaiesky

Eletroforese ......................................................................................................................................................... 21
As tecnologias do DNA recombinante ............................................................................................................... 24
Hibridação in situ ................................................................................................................................................ 24
Reação em cadeia da polimerase (PCR) ............................................................................................................. 26
Vetores de clonagem e de expressão .................................................................................................................. 26
Transgenia ........................................................................................................................................................... 27
Outros métodos ................................................................................................................................................... 32

O avanço científico ocorrido na última metade do sé- ELETROFORESE

culo XX propiciou o desenvolvimento de muitas ferramen-
tas novas (técnicas e métodos) para o estudo da biologia do
desenvolvimento. O avanço sem precedentes do conhecimen-
to nessa área tem permitido sondar os processos e as molé-
culas envolvidos na complexa rede de interações responsá-
vel pela regulação gênica do desenvolvimento dos embriões.
Se, até a explosão das técnicas de biologia molecular,
o embriologista deveria contentar-se em observar e des-
crever o aspecto do embrião em seus diferentes momentos,
novas estratégias metodológicas têm permitido o estabele-
cimento das similaridades entre os estágios de vida de or-
ganismos até então considerados muito distantes, com base
na expressão de seus genes. O conhecimento da hierarquia
gênica e do incrível circuito de genes que ligam e desligam
a atividade de centenas de outros em uma ordem extrema-
mente precisa, além da caracterização de seus produtos, da
comparação de suas seqüências de bases e da maneira como
são regulados, tem revolucionado a biologia moderna e
aproximado, de forma definitiva, embriologistas, geneticis-
tas, bioquímicos e evolucionistas.
Cada nova ferramenta apresenta vantagens e desvan-
tagens, sendo que a sua adequação ao problema a ser estu-
dado deve ser decidida pelo pesquisador, dadas as particu-
laridades do organismo e o conhecimento da sua biologia.
Surgida nos anos 60, a eletroforese de proteínas, enzi-
máticas ou não, revolucionou o estudo da biologia do desen-
volvimento, na medida em que favoreceu a avaliação do elenco
de proteínas que são expressas em cada tecido no mesmo mo-
mento ou em um mesmo tecido ao longo do processo de de-
senvolvimento (Market e Ursprung, 1962). O princípio do
método é que as macromoléculas (e aqui também estamos fa-
lando de ácidos nucléicos, além das proteínas) são eletrica-
mente carregadas, de forma que podem migrar quando expos-
tas a um campo elétrico. Aplicadas em um meio suporte inerte
(gel de amido, de poliacrilamida ou de agarose), preparado
com soluções-tampão capazes de estabelecer o pH que facili-
te a separação das moléculas que fazem parte de uma amostra
(homogenado), vão migrar ou para o ânodo (eletródio positi-
vo) ou para o cátodo (eletródio negativo) de acordo com a sua
carga elétrica livre. Assim, moléculas com carga negativa vão
migrar para o ânodo e moléculas com carga positiva vão migrar
para o cátodo, e quanto maior a carga elétrica de uma molécu-
la, mais rápida será a sua movimentação no meio suporte.
A mobilidade das moléculas, entretanto, pode ser afe-
tada por outras das suas propriedades ou das combinações
de moléculas sob escrutínio. O tamanho, por exemplo, de-
terminará que as moléculas maiores movimentem-se mais
22 Sonia Maria Lauer de Garcia e Casimiro García Fernández
lentamente que as menores, assim como algumas formas de
moléculas também vão determinar se a migração será mais
rápida ou mais vagarosa.
Uma vez introduzidas as amostras em ranhuras ou
em posições específicas do meio suporte, um campo elétri-
co é aplicado no gel e as moléculas começam a migrar atra-
vés do meio, dentro de um período de tempo característico
para cada tipo de amostra. Após esse tempo, sob condições
controladas de exposição ao campo elétrico, as moléculas
vão se separar ao longo da chamada zona eletroforética,
transversalmente ao ponto de aplicação, formando “zonas”
ou “bandas” distintas de acordo com o seu tamanho, forma
e carga (Figura 1.1).
Quando as proteínas a serem estudadas são enzimá-
ticas, sua revelação é feita usando-se uma solução histoquí-
mica colorante que contém o substrato da enzima acoplado
com um co-fator NAD e um sal de tetrazólio que, reduzido,
resultará na precipitação de formazan, permitindo a forma-
ção de uma mancha ou banda. O substrato da enzima, na
presença dessas substâncias, será oxidado, e o sal será redu-
zido, formando uma mancha no local, para onde migraram
as bandas correspondentes à atividade enzimática.
Proteínas totais expressas em um determinado tecido
ou em um determinado estágio do desenvolvimento podem
A. Inserção do homogenado
D.
B. Eletroforese (+)
DH-I
(–)
(–)
Figura 1.1 Aplicação de amostras (homogenados de técidos ou órgãos) em gel para eletroforese de proteínas. A) Inserção de uma
amostra no gel. B) Migração das amostras em suas respectivas canaletas sob corrente elétrica. C) Localização da enzima na super-
fície do gel. D) Aspecto das zonas de migração ou “bandas” da lactato desidrogenase de camundongos. (Modificada de Markert e
Ursprung, 1971.)
ser detectadas por meio de coloração do gel resultante com
corantes como o nitrato de prata, que revela um amplo es-
pectro de proteínas de diferentes pesos moleculares (o que é
obtido por comparação do padrão de migração da amostra
com o de uma outra amostra-controle, cujos tamanhos dos
fragmentos são conhecidos). Por outro lado, essa abordagem
não permite avaliar per se se essas proteínas estão sendo
sintetizadas no momento em que as amostras foram proces-
sadas ou se já haviam sido formadas anteriormente; se têm
diferentes meias-vidas ou diferentes taxas de síntese ou degra-
dação tecido-específicas. Somente após o desenvolvimento
de técnicas de marcação de proteínas com isótopos radioati-
vos que as proteínas nascentes naquele momento ou naquele
tecido específico puderam ser detectadas por eletroforese.
Por essa técnica, o animal ou o tecido isolado é expos-
to a uma solução contendo um aminoácido radioativamente
marcado, como a metionina carregada com S35, que vai se
integrar às cadeias polipeptídicas que estão se formando nos
ribossomos, mas não às já formadas. Expondo o gel onde as
proteínas radioativamente marcadas migraram a um cassete
contendo filme de raios X, que será posteriormente revelado
com reagentes comumente utilizados em fotografia, as bandas
aparecerão na região correspondente à sua migração devido
à impressão da radioatividade sobre os sais de prata do filme.
C. Localizando a enzima na superfície do gel
NITRO–BT H
(Formazan)
PMS H
Piruvato DPN H
DPN
Lactato
Músculo cardíaco
2
3
5
-9 -5 -1 +12 +21 Adulto
 Embriologia 23

Uma variante dessa técnica é a eletroforese em gel sob
condições desnaturantes (SDS-eletroforese), que é feita em
géis de poliacrilamida contendo sódio dodecil sulfato (SDS).
O tratamento do homogenado protéico é feito com SDS e
com um agente redutor como β-mecaptoetanol antes da cor-
rida eletroforética. O β-mercaptoetanol reduz as pontes
dissulfídicas, dissocia as subunidades de polipeptídeos e
afrouxa a estrutura secundária das proteínas, enquanto o SDS
liga-se aos polipeptídeos, formando complexos que migram
à medida que assumem formas uniformes, cuja carga é de-
terminada pelo próprio SDS. Submetidos a esse tratamento,
todos os polipeptídeos apresentarão proporções de carga/
massa similares, eliminando-se as diferenças de forma, de
modo que apenas o peso molecular é que determinará as
diferenças de migração (Figura 1.2). O peso molecular das
proteínas migradas é normalmente obtido por intermédio de
comparação das bandas da amostra com um marcador-pa-
drão colocado a migrar no gel em uma canaleta ao lado da-
quelas que contêm as amostras sob estudo (Figura 1.2).
Um refinamento dessas técnicas foi desenvolvido poste-
riormente (O'Farrel, 1975) e corresponde à chamada eletrofo-
rese bidimensional. Esse método corresponde à submissão
de uma amostra, que já foi sujeita à eletroforese, a uma se-
gunda migração efetuada sob um novo conjunto de condi-
ções e sob nova direção, perpendicular à da primeira dimen-
são. Por esse protocolo, as proteínas são primeiramente se-
paradas por isoeletrofocalização. Entende-se por ponto isoelé-
trico (pI), o pH em que uma proteína é eletricamente neutra
e, conseqüentemente, não migra. Com base nesse princípio
simples, inicialmente uma amostra é submetida à eletrofo-
rese em um tubo fino contendo gel de poliacrilamida com
um gradiente de pH estável, menor no ânodo e maior no
cátodo. Assim, nessa primeira dimensão, as proteínas mi-
gram no gradiente de pH sob corrente elétrica até que atin-
jam o seu pH, estagnado aí. O tubo com o gel é, então,
inserido em um gel de poliacrilamida e sujeito à eletroforese
horizontal, onde as proteínas, já separadas por ponto isoelé-
trico, serão separadas de acordo com o seu peso molecular
(Figura 1.3). Essa é uma técnica poderosa para identificar
proteínas estágio ou tecido-específicas de dentro de uma
amostra muito heterogênea.
Quando se está trabalhando com ácidos nucléicos (tan-
to DNA como RNA), a separação das suas diferentes fra-
ções é feita por “filtragem molecular” (molecular sieving),
já que a proporção carga/massa é praticamente a mesma
para todos os ácidos nucléicos. Assim, pequenas molécu-
las vão migrar mais rapidamente do que grandes molécu-
las. Nesse caso, pode-se usar tanto géis de agarose quanto
de poliacrilamida como meios suporte, sendo que esses úl-
timos permitem uma separação mais acurada, às vezes até
propiciando a resolução de bandas que diferem em um úni-
co nucleotídeo.

KD neb tro wil equ ins pau

83

70

50

32
26

25 37 25 37 25 37 25 37 37 25 25 37

Temperatura (oC)

Figura 1.2 Aspecto de um auto-radiograma de um gel submetido à eletroforese (SDS-PAGE) de proteínas sintetizadas em diferen-
tes temperaturas (25o e 37o C) extraídas da glândula salivar de larvas de Drosophila nebulosa (neb), D. tropicalis (tro), D. willistoni
(wil), D. equinoxialis (equ), D. insularis (ins) e D. paulistorum (pau). As proteínas foram previamente marcadas por incubação das
glânulas com metionina -35S. Os pesos moleculares das proteínas após a migração foram obtidos por comparação com o marcador
de peso molecular aplicado na canaleta à esquerda. (Modificada de Bonorino et al., 1993.)
24 Sonia Maria Lauer de Garcia e Casimiro García Fernández
A IEF B
88 90
71
88 71 73
73
60
AC
SDS
AC 45
31
Figura 1.3 Auto-radiogramas de géis submetidos à eletroforese
bidimensional, onde as amostras correspondem a proteínas de
estresse expressas em embriões de rato de mesmo estágio, em
condições controle (A) e submetidos a 42o C por 10 min (B). Os
embriões foram marcados com metionina [35 S] durante 60 min a
38o C, antes de serem submetidos ao choque térmico. As proteí-
nas foram extraídas e separadas por isoeletrofocalização em uma
dimensão e por SDS-PAGE na outra dimensão. O controle foi
mantido continuamente a 38o C. As setas indicam as diferenças
de expressão das proteínas de estresse: hsps 71, 73 e 88 entre
as duas amostras e a manutenção do nível de expressão da actina
(Ac). (Modificada de Walsh et al., 1991.)
AS TECNOLOGIAS DO DNA
RECOMBINANTE
Foi no final da década de 70 e, principalmente, a partir
da de 80, contudo, que ocorreu um avanço sem precedentes
no acesso direto aos genes por meio do estabelecimento das
assim chamadas tecnologias do DNA recombinante. Suas
aplicações para o estudo de problemas de biologia do desen-
volvimento foram imediatas.
Entre as principais ferramentas desenvolvidas destacam-
se a obtenção, a caracterização e a comercialização das enzi-
mas de restrição (ou endonucleases de restrição), que têm a
potencialidade de cortar moléculas de DNA em pedaços cor-
respondentes a certas seqüências de bases específicas. Cerca
de duas centenas de enzimas de restrição já são conhecidas e
comercializadas de forma que, junto com o conhecimento
advindo do estudo da estrutura, da função e da especificidade
das DNA-polimerases e das DNA-ligases, foi tornando-se pos-
sível a manipulação das seqüências codificadoras e regula-
tórias dos genes de interesse para o desenvolvimento.
O avanço teórico e o aperfeiçoamento técnico e instru-
mental que facilitaram o estudo da complementaridade entre
as bases dos ácidos nucléicos (DNA e RNA), por sua vez,
favoreceu o uso em larga escala do pareamento de pedaços
de genes (ou genes completos) de um organismo para son-
dar a sua homologia com partes do genoma inteiro do mes-
mo ou de diferentes organismos, mais ou menos relaciona-
dos, em ensaios de hibridação (ou hibridização) de ácidos
nucléicos. Tais seqüências, aqui consideradas como son-
das (probes), puderam, então, ser encontradas em quais-
quer genomas, bem como pôde ser decifrada a organização
dos genes que as portam (por exemplo, se elas têm ou não
os sítios reconhecidos pelas enzimas de restrição conser-
vados em comparação com o genoma dos organismos ori-
ginais de onde o DNA foi extraído).
O estudo dessas homologias por hibridação (ou hibri-
dização) pode ser realizado tanto anelando a sonda desnatu-
rada (com a dupla hélice aberta) com o DNA-alvo extraído,
fragmentado pelas endonucleases de restrição e submetido
à eletroforese, quanto com células em suspensão com cor-
tes de tecidos em lâminas, ou com embriões inteiros (whole
mount). Naturalmente, a visualização da região homologa-
da com a sonda em cromossomos, tecidos e órgãos intactos
dos embriões é mais difícil do que com a amostra de DNA
purificado, uma vez que, nesses casos, há inúmeros obstá-
culos à hibridação representados pelas moléculas envolvi-
das na organização da cromatina, dos tecidos e dos órgãos
para o encontro da sonda com a seqüência homóloga a ela.
Assim, a hibridação da sonda com o DNA-alvo extraí-
do é mais facilmente estudada pela técnica conhecida como
Southern blot (Southern, 1975), método este que consiste
em submeter uma amostra de DNA isolado de um doador,
fragmentado com as enzimas de restrição apropriadas para
obtenção de fragmentos de diferentes tamanhos, à separa-
ção por eletroforese em gel de agarose e coloração com bro-
meto de etídeo (um composto que se intercala na dupla héli-
ce, emite fluorescência e é visualizado sob luz ultravioleta).
O gel é fotografado e imerso em uma solução de hidróxido
de sódio, que vai promover a desnaturação dos fragmentos
de DNA, que serão transferidos por capilaridade para um
pedaço de uma membrana de náilon ou de nitrocelulose. A
sonda a ser utilizada será marcada radioativamente ou não e
hibridada com o DNA desnaturado transferido para a mem-
brana. Após serem dadas as condições e o tempo para que a
sonda encontre (ou não) a seqüência de bases a ela comple-
mentar no DNA-hospedeiro, essa membrana é lavada para
eliminação do excesso da sonda que não se ligou ao DNA.
O rigor com que essa membrana é lavada para eliminar mais
ou menos seqüências com diferentes graus de homologia do
DNA-teste com a sonda é denominada estringência. Se a
sonda for marcada radioativamente ou com compostos que
emitem luz, o padrão de hibridação na membrana será reve-
lado por auto-radiografia (Figura 1.4).
Uma variante dessa técnica, denominada Northern
blot, usa como sonda uma seqüência de RNA e oportuniza
o rastreamento da existência de um transcrito processado,
sendo expresso em uma amostra de DNA genômico.
HIBRIDAÇÃO IN SITU
Conseqüência natural do desenvolvimento das técnicas
de hibridação de ácidos nucléicos isolados foi o aperfeiçoa-
mento das técnicas de hibridação in situ. Elas correspondem
 Embriologia 25

Fragmentos de DNA clivados com enzimas de restrição

Gel
Ânodo

Separação dos fragmentos por tamanho por meio de

eletroforese em gel de agarose

Maior Cátodo

Menor

Tratamento do gel para desnaturar o DNA e transferên-

cia para uma membrana de náilon ou de nitrocelulose

Sonda marcada Membrana de náilon

Os fragmentos desnaturados são reanelados com uma

fita de DNA marcado e a membrana é exposta a um filme
de raios X

Cada banda revelada no filme corresponde a um frag-

mento de DNA que possui uma seqüência complemen-
tar à da sonda

Filme de raios X

Figura 1.4 Esquema dos passos seguidos para análise de moléculas de DNA de duas amostras pela técnica de Southern blot.
(Modificada de Berg e Singer, 1992.)
26 Sonia Maria Lauer de Garcia e Casimiro García Fernández
às ferramentas mais poderosas para rastrear os locais (célu-
las e campos presuntivos) de expressão gênica nos embriões.
Com essa ferramenta é possível entender de que modo a
atividade gênica está guiando o desenvolvimento, uma vez
que permite observar os padrões de atividade de genes de
interesse no tempo (ao longo do desenvolvimento embrioná-
rio) e no espaço (células, tecidos e regiões mais amplas do
embrião). A hibridação in situ tem o poder de detectar o
local onde moléculas de mRNA estão sendo transcritas de
genes em atividade. Por meio dessa técnica, uma sonda
(probe) complementar ao RNA (cDNA) que está sendo
transcrito vai hibridar (isto é, parear-se fortemente) com
ele. Assim, a sonda servirá para indicar o local de ação do
mRNA complementar na fatia do tecido ou no embrião com-
pleto. Novamente aqui, no caso de a sonda ser marcada ra-
dioativamente, sua detecção será feita por auto-radiografia.
Quando se utilizam métodos não-radioativos como, por
exemplo, corantes, o local de expressão dos genes de inte-
resse é detectado como uma área, célula ou tecido de colora-
ção diferente daquela de fundo, enquanto sondas marcadas
enzimaticamente por meio de anticorpos compostos são re-
veladas por uma mistura com o seu substrato e reveladas
histoquimicamente (Figura 1.5).
br
G1 ant
int
G1
T1
T1 A1
G1
A1
A B C
Figura 1.5 Embriões de Tribolium em três estágios de desen-
volvimento. As células estão expressando o gene engrailed
(hachureado) como uma faixa em cada segmento do corpo, à
medida que eles vão se formando. A) No estágio inicial, só par-
tes da cabeça são visíveis, como os segmentos gnatais (G1). B)
No estágio intermediário, já se formaram os segmentos gnatais,
(G1), torácicos (T1) e abdominais (A1). C) No estágio tardio, to-
dos os segmentos já estão formados. br, ant e int correspondem,
respectivamente, a cérebro, antenas e segmentos intercalares.
(Modificada de Sulson e Anderson, 1996.)
*Plasmídeo: molécula extracromossômica de DNA circular, que ocorre normalmente no genoma de bactérias e de algumas leveduras.
REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
Depois de uma seqüência de DNA haver sido isolada,
clonada e seqüenciada, o processo inverso àquele usado pelos
métodos de hibridação também pode ser empregado. Assim,
segmentos selecionados de DNA podem ser seletivamente
amplificados do genoma de um organismo-teste pelo método
conhecido como reação em cadeia da polimerase (PCR= poli-
merase chain reaction). Esse método foi estabelecido no iní-
cio dos anos 90 (Griffin e Griffin, 1993) e tornado possível
pela descoberta do potencial de uso da DNA polimerase da
bactéria Thermus aquaticus, uma enzima Taq-DNA-polimerase
termoestável, capaz de promover ciclos de replicação de DNA
sob condições desnaturantes, ou seja, sob altas temperaturas.
A técnica de PCR propicia a obtenção in vitro de milhares ou
milhões de cópias de uma seqüência de bases presente em um
DNA genômico em um curto período de tempo (horas).
Resumidamente, essa técnica requer uma amostra de DNA
genômico, primers (seqüências iniciadoras da replicação) das
regiões conservadas do gene que se quer identificar e amplifi-
car no genoma de interesse para funcionarem como molde,
um aparelho denominado termociclador, programável para
indução de ciclos de replicação alternados de tempo e de
temperatura aos quais será submetida a amostra, além da enzima
Taq-DNA-polimerase, que irá promover a amplificação da-
quela fração do DNA que possui homologia com o molde.
Esses primers ou moldes são desenhados a partir de seqüênci-
as conservadas de genes já descritos e disponíveis em bancos
de dados, conhecidos como GenBank e sintetizados nos pró-
prios laboratórios de biologia molecular ou sob encomenda
por empresas especializadas em biotecnologia (Figura 1.6).
Variantes desse método (como o RT-PCR quantitati-
vo) têm permitido avaliar diferenças quantitativas na expres-
são de certos genes em amostras coletadas ou em diferentes
momentos do desenvolvimento ou em diferentes tecidos e
órgãos nos mesmos estágios.
VETORES DE CLONAGEM E
DE EXPRESSÃO
Para a obtenção de várias cópias de uma seqüência iso-
lada, é necessário fazer uma clonagem molecular. Esse pro-
cesso envolve a ligação enzimática de pedaços do DNA iso-
lado do organismo de interesse com o DNA dos chamados
vetores de clonagem (plasmídeos*, vírus e bacteriófagos)
dotados de seqüências capazes de promover a sua replicação
autônoma dentro das células hospedeiras onde são introdu-
zidos (normalmente cepas modificadas da bactéria Esche-
richia coli por meio de um processo chamado transforma-
ção). Os plasmídeos, além de se replicarem autonomamente
 Embriologia 27

Segmento a ser amplificado

5' 3'
3' 5'
3' 5' 5' 3'

DNA desenrolado
5' + 5'
iniciadores Ciclo 1

5' 5'
3' 3'

DNA-polimerase

5' 5'
3' 3'
+ DNA desenrolado + +
Ciclo 2
3' iniciadores + 3'
5' DNA-polimerase 5'

5' 5'
3' 3'
+ +
3' 3'
5' 5'
+ DNA desenrolado + + Ciclo 3
3' iniciadores + 3'
5' DNA-polimerase 5'
+ +
5' 5'
3' 3'

3' 5' 5' 3'

5' 3' 3' 5'
+ + +
5' 3' 3' 5'
3' 5' 5' 3'
DNA desenrolado +
+ +
5' iniciadores + Ciclo 4
3' 3' 5'
3' 5' DNA-polimerase
5' 3'
+ +
3' 5' 5' 3'
5' 3' 3' 5'

Figura 1.6 Amplificação de segmentos de DNA através de reação em cadeia da polimerase. (Modificada de Berg e Singer, 1992.)

no genoma das bactérias, estão associados à resistência a
antibióticos e, assim, o isolamento das bactérias transforma-
das das não-transformadas em placas de cultura é feito pelo
uso de antibióticos. As bactérias que não contêm plasmídeo
(não-transformadas), portanto sensíveis ao antibiótico, se-
rão eliminadas, restando e crescendo em cultura apenas aque-
las bactérias resistentes, que foram transformadas.
Quando além de se desejar clonar o gene, também quer-
se analisar o seu produto, são necessários os chamados veto-
res de expressão (pró e eucariotos, dependendo da natureza
e da complexidade da seqüência que foi clonada). Por exem-
plo, para expressão em procariotos, normalmente as bactérias
E. coli e Bacillus subtilis são vetores adequados, assim como
leveduras cumprem bem a exigência de vetores para expres-
são de genes eucarióticos. A existência de certas caracterís-
ticas moleculares do plasmídeo, por exemplo, possuir uma
seqüência promotora forte, é fundamental para o sucesso da
expressão do gene nele inserido (Figura 1.7).
TRANSGENIA
Animais (e plantas) geneticamente modificados pela
inclusão de um gene clonado de outro indivíduo (da mesma
28 Sonia Maria Lauer de Garcia e Casimiro García Fernández

A Origem da replicação

Gene para resistência a

um antibiótico

Inserto do gene
estranho

Gene estranho

Captura pela célula

hospedeira

Divisão celular

B
Promotor da
β-galactosidade cDNA do gene
que se quer
expressar

mRNA
Gene para
resistência à
ampilicina

Origem do
plasmídeo

Figura 1.7 Vetores de clonagem e de expressão. A) Plasmídeos bacterianos usados como vetores para multiplicação de insertos
de DNA estranho. B) Características de um vetor de expressão: a seta grande indica o gene estranho que se quer expressar.
(Modificada de Berg e Singer, 1992.)

espécie ou não) constituem os chamados organismos transgêni-
cos. A transgenia, por sua vez, é uma maneira poderosa para
se testar in vivo a função de seqüências gênicas as mais variadas
e a sua conservação funcional entre organismos diferentes,
resolver problemas relacionados com a regulação da expressão
de certos genes de interesse para o desenvolvimento, assim
como para identificar suas seqüências regulatórias e codificado-
ras, além de sondar os domínios de expressão de vários genes.
O sucesso da transgenia depende de que a inserção de
um gene clonado em um embrião hospedeiro integre-se e se
replique nas sucessivas divisões celulares e passe a ser reco-
nhecido e regulado pela células hospedeiras. Se a transfor-
mação (inserção bem-sucedida do gene estranho no DNA
das células hospedeiras) ocorrer nas células que vão origi-
nar a linhagem germinativa do embrião, o transgene passará
para as gerações seguintes. Cruzando-se o organismo transgê-
 Embriologia 29

nico com outro organismo de uma linhagem que não porta o
transgene, pode-se monitorar o seu efeito no desenvolvimento
das gerações subseqüentes.
Em camundongos, genes que condicionam mutações
no desenvolvimento são comumente introduzidos em um
embrião selvagem na fase de blastocisto para que venham a
fazer parte de células tronco embrionárias. Essas células são
obtidas de culturas permanentes derivadas de embriões
mutantes (muitos deles letais embrionários) e, quando intro-
duzidas em um embrião selvagem inicial, vão contribuir para
formar tanto os seus tecidos somáticos, quanto a sua linhagem
germinativa. As células-tronco embrionárias em cultura, por
sua vez, podem ser geneticamente manipuladas de forma a
se induzir mutações nos genes de desenvolvimento sob escru-
tínio, introduzir doses a mais ou a menos desses genes, além
de produzir mutações que façam com que a seqüência original
do gene perca completamente a sua função (nocaute ou knock
out do gene original). Assim, a expressão do(s) transgene(s)
no embrião transformado (quimera*) vai depender de quantas
células transformadas se inserirem corretamente no embrião
hospedeiro, promovendo variações de natureza quantitativa
na atividade desse gene (Figura 1.8).

Ovo fertilizado

DNA do gene de
interesse

Pró-núcleo
DNA microinjetado
no pró-núcleo

DNA integra-se no
genoma e os pró-
núcleos são
fusionados

Ovos injetados no oviduto

da mãe substituta
Ovo injetado

Camundongos
transgênicos

DNA isolado da cauda

da prole é digerido DNA injetado é
com enzimas de identificado com uma
restrição, submetido à sonda específica
eletroforese e analisa-
do por Southern blot

transplantes transplantes
sem sucesso bem-sucedidos

Figura 1.8 Produção de camundongos transgênicos. (Modificada de Berg e Singer, 1992.)

*Quimera é um animal constituído de células de duas ou mais fontes diferentes (pares de genitores diferentes), sendo, portanto, constituído de
uma mistura de células geneticamente diferentes.
30 Sonia Maria Lauer de Garcia e Casimiro García Fernández

Outra maneira de gerar camundongos transgênicos con-
siste em injetar um fragmento de DNA contendo o gene cuja
função deseja-se conhecer diretamente no núcleo do ovo re-
cém-fertilizado. A vantagem de se trabalhar com células-
tronco embrionárias, entretanto, além da sua maior viabili-
dade, é a possibilidade de se selecionar na cultura aquelas
células que foram previamente transformadas, aumentar seu
número e, então, introduzi-las no estágio de blastocisto do
embrião selvagem.
A construção de moscas transgênicas do gênero
Drosophila também tem contribuído de forma marcante para
o progresso da biologia do desenvolvimento animal. Mos-
cas transgênicas do gênero Drosophila são construídas pela
inserção de uma seqüência de DNA conhecida diretamente
nos cromossomos do embrião hospedeiro por meio de um
vetor, no caso uma seqüência genética móvel, ou transposon*.
Essas seqüências, aparentadas com os vírus, ocorrem natu-
ralmente no genoma de certas linhagens e têm a notável ca-
pacidade de mudarem de lugar ao longo dos cromossomos.
Se introduzidas no genoma de linhagens que não os portam,
elas serão inseridas ao acaso no genoma hospedeiro, mas se
forem geneticamente engenheiradas para conterem, além do
seu próprio gene de mobilização (que codifica uma enzima
chamada transposase), os genes de interesse que se quer es-
tudar por meio de um processo conhecido como transforma-
ção mediada por elemento P, o embrião produzirá uma mos-
ca transgênica (Figura 1.9). Se o elemento P geneticamente
modificado for inserido na parte posterior do embrião, para
onde muito cedo vão migrar as células polares que originarão
as gônadas, as células germinativas conterão o gene que se
deseja estudar, transmitindo-o às gerações subseqüentes e
permitindo o estudo da sua segregação. Freqüentemente, as
seqüências inseridas portam um gene marcador de uma carac-
terística morfológica visível, como o alelo selvagem white+,
que condiciona olhos vermelhos. A inserção do transgene
em um embrião mutante para esse gene (white-) que condi-
ciona olhos brancos em homozigotos, por sua vez, pode ser
monitorada pelo aparecimento da cor vermelha (que indica
que o inserto foi incorporado com sucesso) ou branca (que
indicará a não-incorporação do inserto) nos olhos das mos-

Gene clonado
com o elemento P

Elemento P

Microinjeção no
embrião da mosca

Cromossomos da mosca

Transferência do elemento P
portando o gene clonado

Cromossomo

Embrião da mosca portando

o gene em seu genoma

Figura 1.9 Produção de moscas transgênicas pela modificação da linhagem germinativa de embriões pela inserção de um ele-
mento P, portando um gene que se quer estudar. O gene carregado pelo elemento P é funcional e o do genoma hospedeiro é uma
forma mutante, não-funcional. O aparecimento da forma selvagem do gene na prole das moscas transformadas indica que o proces-
so foi bem-sucedido. (Modificada de Wolpert et al., 1998.)

*Transposon é uma seqüência de DNA que possui a capacidade de se inserir em um local diferente do cromossomo ou pela inserção de uma cópia
da seqüência original ou pela sua excisão e reinserção em outro local do genoma (mobilização).

cas adultas da geração seguinte. Com essa metodologia, pode
ser avaliado o efeito de doses extras de genes, a sua expressão
sob influência de seqüências regulatórias selvagens ou mu-
tantes, além de o efeito de novos genes (ou genes cognatos
ao que se quer avaliar).
Uma variante dessa técnica consiste em usar um gene
marcador bioquímico acoplado ao elemento P engenheirado
que vai transformar o embrião hospedeiro. Esse marcador,
também chamado de gene-repórter, vai ter sua expressão re-
velada por coloração histoquímica, indicando que o inserto
ao qual ele está acoplado inseriu-se com sucesso no genoma
hospedeiro, sinalizando pela coloração revelada, a região, o
tecido ou as células embrionárias onde o gene de interesse
está se expressando (Figura 1.10). O uso de genes repórteres
tem sido amplamente utilizado em embriões de camundon-
gos e de outros animais.
Entre os genes-repórteres mais freqüentemente empre-
gados para a construção de animais transgênicos está o lacZ
(que codifica a enzima bacteriana β-galactosidade). A reve-
lação da atividade enzimática desse gene marcador colore
de azul as células, os tecidos e os órgãos do embrião que ex-
pressam o transgene.
Também tem sido comumente utilizada em Drosophila,
a seqüência promotora de genes de resposta a estresses físi-
cos e químicos (heat shock), que são chamados de promoto-
res “fortes”, pois induzem a expressão dos genes a eles adja-
centes sem a ajuda de seqüências enhancers (ou aumenta-
doras), comuns em genes de eucariotos. O uso de transgenes
acoplados a um promotor de heat shock (já que foram des-
cobertos em genes condicionadores de proteção contra os
Figura 1.10 Embrião de camundongo transgênico de 12 dias.
A parte hachureada corresponde à expressão do gene myoD, por
meio do gene repórter bacteriano β-galactosidade sob controle
da seqüência enhancer nos mioblastos. (Modificada de Golhamer
et al., 1995.)
Embriologia 31
efeitos de modificações bruscas da temperatura do meio) per-
mite que se induza a expressão dos genes a ele adjacentes
simplesmente aumentando a temperatura da câmara de cul-
tivo do organismo.
O impacto causado pelo sucesso dos sistemas de trans-
ferência de genes em mamíferos e em leveduras também
contribuiu para o desenvolvimento de tecnologias para pro-
dução de plantas transgênicas, cuja aplicabilidade ao ren-
dimento das plantas de lavoura foi imediato.
As plantas, pela sua maior plasticidade desenvol-
vimental, oferecem muitas facilidades para a obtenção de
embriões transgênicos. Vários métodos são atualmente dis-
poníveis para transformação de plantas. A maneira mais
“natural” possível de obtenção de plantas transgênicas con-
siste na transfecção de células vegetais em cultura com a
bactéria Agrobacterium tumefasciens, que é capaz de for-
mar tumores em forma de galhas bem-conhecidas nas plan-
tas. Esse processo, que também ocorre na natureza, foi uti-
lizado pelos melhoristas para a produção controlada de plan-
tas transgênicas à medida em que contém um plasmídeo-
Ti, que possui os genes necessários à proliferação das célu-
las responsáveis pela formação do “calo” (callus). Se genes
de interesse agronômico, por exemplo o que confere resis-
tência a uma determinada doença, ou um gene importante
para o desenvolvimento precoce da floração de uma plan-
ta, for inserido no Ti e a bactéria que o porta for induzida a
infectar uma cultura de células vegetais, ele vai funcionar
como um vetor de transformação muito eficiente. Uma vez
que células diferenciadas em culturas de tecidos vegetais
podem originar uma planta adulta completa devido à con-
servação da sua totipotência, as células geneticamente mo-
dificadas podem originar plantas transgênicas com suas
células transformadas pela infecção com o Agrobacterium,
inclusive na sua linhagem germinativa, permitindo a ob-
tenção de cultivares transgênicos estáveis.
Cabe salientar, entretanto, que esse método tem a sua
potencialidade máxima para plantas dicotiledôneas, não
sendo o ideal para monocotiledôneas. Nesses casos, de-
vem ser feitos ajustes metodológicos ou usar outros méto-
dos de transformação (Draper e Scott 1991).
Outra abordagem bastante atual, entre várias outras dis-
poníveis para produzir plantas transgênicas, usa o recurso
da chamada biobalística, que consiste no bombardeamento
de células de plantas em cultura, com partículas recobertas
com seqüências do DNA que se quer inserir e estudar na
planta receptora. Essas partículas, que consistem de peque-
nas esferas de tungstênio ou ouro, são carregadas com DNA-
vetor (a “construção”) e espalhadas na superfície de uma
placa móvel ou de uma “bala” plástica (“macroprojétil”).
Submetido ao impacto de uma bomba de vácuo, o “ macro-
projétil” é disparado contra uma placa de retenção, permitindo
que seja desacelerado e que os “microprojéteis” (as esferas
com o DNA vetor) sejam arremessados contra a superfície
das células vegetais a serem transformadas, penetrando no
seu interior.
32 Sonia Maria Lauer de Garcia e Casimiro García Fernández
O sucesso da transformação das plantas deve ser
monitorado da mesma forma como é feito nas células animais,
por meio do uso de marcadores genéticos (principalmente
locos enzimáticos), detectados pela sua expressão diferencial
em células transformadas ou não, ou por meio de genes-repór-
teres. Novamente, aqui, seqüências de locos enzimáticos
(como o da lacZ bacteriana e outros), cuja detecção pode ser
colorimétrica ou histoquímica, podem ser utilizadas para
construir e detectar transgenes. Também tem sido bastante
freqüente o uso de um loco enzimático bacteriano capaz de
promover a expressão de luciferase, detectável por ensaios
de bioluminescência. As plantas transformadas, em que os
transgenes são acoplados ao loco da luciferase bacteriana,
simplesmente “brilham” no escuro, da mesma forma que o
fazem as bactérias de cujo genoma provém esse gene, reve-
lando o sucesso da transformação.
OUTROS MÉTODOS
Além dos métodos já tradicionalmente utilizados, nos
últimos anos foram aperfeiçoadas novas metolodologias ba-
seadas no seqüenciamento dos genomas e na bioinformática
(chips e microarranjos de DNA), o que propiciará, a curto
prazo, o acesso ao elenco de genes especificamente expres-
sos em cada momento do desenvolvimento, mesmo que ainda
desconhecidos. Por exemplo, pelo método de microarranjos
de DNA, os mRNAs são isolados por fragmentos 3’ poly A
copiados em DNA complementar. Os cDNAs, que corres-
pondem aos pedaços processados dos genes individuais, po-
dem ser clonados em plasmídeos e replicados várias vezes,
favorecendo a construção de bancos de dados. Por meio de
seqüenciamento automatizado, será possível escolher os clo-
nes de cDNA dos plasmídeos do banco que contêm os meno-
res fragmentos de um gene (ESTs ou Expressed Sequence
Tags), que serão amplificados por PCR, e decifrada a sua
função no tecido ou no estágio do desenvolvimento de interes-
se. Com essa estratégia, sítios contendo cDNA, ESTs ou oli-
gonucleotídeos presentes em uma amostra podem ser monito-
rados por hibridação com a seqüência complementar previa-
mente imobilizada em uma placa, a análise é feita base por
base e a sua identificação é possível porque o DNA da amostra
foi previamente marcado com substâncias fluorescentes.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BERG, P.; SINGER, M. (1992). Dealing with genes: The language
of heredity. Mill Valley: Blackwell Scientific publications.
BONORINO, C.B.C.; COUTO SILVA, T.; ABDELHAY, E.;
VALENTE, V.L.S. (1993). Heat shock genes in the willistoni
group of Drosophila: induced puffs and proteins. Cytobios,
v.73, p. 49-64.
BROWDER, L.; ERICKSON, C.A.; JEFFERY, W.R. (1991). Deve-
lopmental biology. 3thed. Philadelphia: Saunders College
Publishing.
DRAPER, J.; SCOTT, R. (1991). Gene transfer to plants. In: Grierson,
D. (ed.) Plant genetic engineering. New York: Blackie Chapman
& Hall. v.1.
GILBERT, S.F. (2000). Developmental biology. 4thed. Massachusetts:
Sinauer Associates Inc. Publishers.
GOLDHAMER, D.J.; BRUNK, B.P.; FAERMAN, A. et al. (1995).
Embryonic activation of the myoD gene is regulated by a
highly conserved distal control element. Development, v.121,
n.3, p. 637-649.
GRIFFIN, H.G.; GRIFFIN, A.M. (1993). DNA sequencing.
Appl. Biochem. and Biotechnology, v.38, p. 147-159.
MARKERT, C.L.; URSPRUNG, H. (1962). The ontogeny of
isozyme patterns of lactate dehydrogenase in the mouse.
Develop. Biol., v.5, p. 363-381.
MARKERT, C.L.; URSPRUNG, H. (1971). Developmental gene-
tics. New York: Prentice-Hall. Englewood Cliffs.
O’FARRELL, P.H. (1975). High resolution two-dimensional elec-
trophoresis of proteins. J. Biol. Chem., v.250, p. 4009-4201.
SOUTHERN, E.M. (1975). Detection of specific sequences among
DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol.,
v.98, p. 503-517.
SULSTON, I.A.; ANDERSON, K.V. (1996). Embryonic patterns
mutants in Tribolium castaneum. Development, v.122, n.3,
p. 805-814.
WALSH, D.; Li, K.; CROWTHER, C.; MARSH, D.; EDWARDS,
M. (1991). Thermotolerance and heat shock response during early
development of the mammalian embryo. In: HIGHTOWER, L.;
NOVER, L. (eds.) Heat shock and development. Berlin: Springer-
Verlag, New York: Heidelberg.
WOLPERT, L.; BEDDINGTON, R.; BROCKES, J.; JESSELL, T.;
LAWRENCE, P.; MEYEROWITZ, E. (1998). Principles of
development. Oxford: Current Biology.