Universidad Autónoma de Campeche

Facultad de Ciencias Químico-Biológicas

Licenciatura en Biología

Trabajo en cumplimiento a la materia de

Biología Molecular

Impartida por

Dr. Marco A Popoca Cuaya

Elaborado por

Martha Alejandra Durán Canché

Alumna del

Cuarto semestre grupo A

20 de abril de 2020

 Reacción en Cadena de la Polimerasa

PCR Técnica utilizada para amplificar, o

hacer muchas copias de, una región
de ADN blanco en específico.

Existen distintos métodos para extraer el RNA de una célula.

Obtención, aislamiento y Obtención del RNA Entre ellos mencionamos los siguientes:

- Extracción de RNA total con Trizol

purificación del mRNA - Extracción de RNA total con CTAB

- Extracción de dsRNA con fenol:cloroformo/Sephadex

- SV Total RNA Isolation System (Promega)

Frecuentemente, durante el proceso de extracción de

Eliminación de DNA genómico RNA, también se extrae DNA genómico (gDNA). Esto
supone un problema, porque el gDNA es susceptible de
amplificarse durante la PCR posterior, pudiendo falsear
así nuestros resultados.

Para ello, se comercializan kits que se aprovechan de la

diferente composición en nucleótidos que tienen las
moléculas de DNA y de RNA (Timina, en vez de Uracilo).

Diseño de Primers Son moléculas cortas de una sola hebra de DNA (15-40
Retrotranscripción bp). Son manufacturados comercialmente y pueden
diseñarse para complementarse con cualquier secuencia
de DNA.

Un buen primer debe tener:

Los primers son secuencias específicas y se ligarán a una
- temperatura de fusión (Tm) en el secuencia deseada del DNA. La DNA polimerasa requiere
rango de 52ºC a 65ºC.
de primera para iniciar la replicación.

- Que no tienda a formar dineros

- Que no forme horquillas >3bp

Existen tres tipos de primers para la reacción RT:

- Que no se ligue a sitios secundarios

- Primer oligo(dT): Este cebador se une a la cola de poliA
- Baja afinidad específica en 3’ característica del mRNA, de manera que la
retrotranscripción se inicia siempre por el extremo 3 ́ del
mRNA.

- Primers específicos (SSPs, Sample Specific Primers):

se unen de manera específica al mRNA en aquella zona
de su secuencia donde esté el gen que queremos
estudiar.

- Random primers: Es un cocktail de oligonucleótidos

(generalmente, de 6 nt) de secuencia variada que se unen
de manera aleatoria a lo largo de la secuencia de RNA.

Proceso por el que una hebra de RNA se retrotranscribe en

Síntesis de cDNA
una cadena complementaria, que llamamos cDNA. Para ello
se necesita un enzima retrotranscriptasa, dNTPs (mezcla de
nucleótidos), un buffer de trabajo y un cebador, un
oligonucleótido complementario a la secuencia de RNA, que
se une a esta molécula y que sirve para que el enzima
empiece su acción retrotranscriptora.

 Amplificación del
Desnaturalización
cDNA 


(96ºC) La reacción se calienta bastante

para separar, o desnaturalizar, las
cadenas de ADN. Esto proporciona los
moldes de cadena sencilla para el
siguiente paso.

Templado

(55-65ºC) La reacción se enfría para

que los cebadores puedan unirse a sus
secuencias complementarias en el
molde de ADN de cadena sencilla.

Extensión

(72ºC) La temperatura de la reacción

se eleva para que la Taq polimerasa
extienda los cebadores y sintetice así
nuevas cadenas de ADN.

Visualización de la PCR Visualización de PCR por
electroforesis en gel
Los fragmentos de ADN de la misma
longitud forman una "banda" en el gel que
se puede identificar a simple vista si el gel
Es una técnica en la que una corriente eléctrica
impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz
de gel y los fragmentos de ADN se separan según
su tamaño. Típicamente se incluye un estándar, o
marcador de peso molecular, para que pueda
determinarse el tamaño de los fragmentos en la
muestra de PCR.

se tiñe con un pigmento que se una al

ADN.

Una banda de ADN contiene muchas,

muchas copias de la región blanco de
ADN, no solo una o unas cuantas copias.
Dado que el ADN es microscópico, deben
existir muchas copias de este para poder
verlo a simple vista. Esto es una parte
importante de por qué la PCR es una
herramienta importante: produce
suficientes copias de una secuencia de
ADN para poder ver o manipular esa
región de ADN.
BIBLIOGRSFÍA
Khan Academy. (s. f.). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (artículo). Recuperado 19 de
abril de 2020, de https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

Hernandez Guzmán, A. (2012). Manual de Biología Molecular (1.a ed., Vol. 1). Recuperado de
http://bdigital.unal.edu.co/10593/7/598500.20122.pdf

Universidad Complutense. (s. f.). DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS DE DATOS EN LA

TÉCNICA DE LA qRT- PCR (quantitive Real Time-Polymerasa Chain Reaction). (1.a ed., Vol.
1). Madrid, España: Universidad Complutense.