INFORME DE LABORATORIO

UNIVERSIDAD CIENTIFICA DEL SUR

FACULTAD DE: CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA: MEDICINA HUMANA

LABORATORIO DE BIOLOGÍA
CURSO: BIOLOGÍA CELULAR
DOCENTE: OMAR CÁCERES

INFORME DE PRÁCTICAS
PRÁCTICA N° 9-10-11
TITULO: EXTRACCIÓN DE ADN /FUNDAMENTOS DE LA REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA/FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS
INTEGRANTES: - PONCE RAMOS, JENIFER GERALDINE
- ROA VARGAS, DAYANA
- RIVERA CAMACHO, XIOMARA JASMIN

HORARIO DE PRÁCTICA
FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 28 DE OCTUBRE / 04 DE
NOVIEMBRE/11 DE NOVIEMBRE
FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 18 DE NOVIEMBRE
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CONCLUSIONES:
A partir de este experimento se puede concluir que el ADN aislado y purificado
se manifiesta como una solución densa e incolora, y que gracias a este
proceso se procederá a hacer PCR o técnicas de biopsia líquida. El ADN del
citocromo C es de gran tamaño puesto que marco una alta cantidad de bp, el
C- monitorea o analiza la contaminación en el sistema, manifestando
contaminación en el PCR debido a amplicones; Se concluye que la técnica de
amplificación con PCR, dio resultados tergiversados producto de dicha
contaminación. Para el caso de diagnóstico por amplificación, si amplifica va de
acuerdo con el C+ del ADN del patógeno, pero al tener la muestra de C-
también amplificada, el resultado final seria un falso positivo.
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RESULTADOS:
1. EXTRACCION DE ADN DE SANGRE TOTAL:
Al obtener la muestra de sangre, teniendo una composición heterogénea, se
agregó compuestos catalizadores, así como también homogeneizadores, se
consiguió ADN precipitado, esto se día gracias a la intervención de etanol
frío.

2. PROCESO DE PURIFICACION:
Luego de que la muestra paso por un proceso de centrifugación, lavado y
filtración; se obtuvo residuos en las columnas, siendo estos descartados;
dando como resultado final al ADN como solución viscosa e incolora.

3. CUANTIFICACION DE ADN:
a) Para este experimento utilizaremos las muestras finales que se
obtuvieron en la práctica n°9; luego de haber agregado 2µL de ADN
a los pedestales en el espectrofotómetro, se obtuvieron los siguientes
resultados:
 Absorbancia: 0.052
 Concentración: 52.23 ng/ µL

µ g 103 ng 1 mL
52.23 x x =52.23ng / µL
ml 1 µ g 103 µL
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b) Después de haber calculado la absorbancia y la concentración, se

calculó el valor que hemos colocado de ADN en la muestra del tubo
ependorf que contenía PCR y ADN.
 Valor(g) colocado de ADN = Concentración x
Volumen agregado de ADN al tubo de PCR
Valor (g) de ADN = 52.23 ng/ µL x 5.1 µL
= 266.373 ng
c) Tras haber cuantificado la concentración de ADN, a partir de 2 µL , se
estableció que esta era de 52.23 ng/ µL; se procedió a calcular la
concentración para la muestra total:

 Concentración total de ADN = Concentración x

cantidad total de ADN
Concentración total de ADN = 52.23 ng/ µL x 150 µL
= 7,879.5
Luego de haber hecho la cuantificación de ADN, se procedió a hacer el PCR en
el termociclador, concluyendo con electroforesis.
4) ELECTROFORESIS:
tras haber colocado las muestras de ADN en los pocillos y encender las
fuentes de poder, se procedió a observar los resultados luego de haber puesto
el gel en el transiluminador para el revelado.

Muestra Muestra de
de ADN PCR
C-
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 Para el pocillo que contenía ADN del citocromo C, tras

la electroforesis, la muestra en el gel marcó 1200bp.
 Para el pocillo que contenía ADN con PCR, luego de la
electroforesis, la muestra en gel marcó 1100bp.
 Para el C- (control negativo) que contenía agua
destilada más agregados de PCR, la muestra en gel
marcó 1100bp.
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ANÁLISIS Y DISCUSIONES:
La sangre está formada por una parte líquida, el plasma, y una sólida: glóbulos
rojos, glóbulos blancos y plaquetas; los glóbulos blancos son los que contienen
el ADN, así como también proteínas, lípidos, u otro tipo de sustancias; para
poder obtener el ADN precipitado, hubo intervención de las proteinasas K que
son enzimas que permiten la liberación de ácidos nucleicos nucleares y
degradación de todo tipo de proteínas mediante el proceso de hidrólisis,
permitiendo así que se mantenga el ARN y ADN; para la eliminación del ARN
interviene la nucleasa ARNasa, que cumple la función de degradar al ARN que
se encuentra en la solución; la muestra resultante utilizará el buffer lisis
compuesto principalmente por TRIS, EDTA, SBS(detergente); siendo el TRIS
un tampón biológico que cumple la función de regular el pH de la solución; el
EDTA un agente quelante, se emplean para proteger el ADN de la acción de
enzimas nucleasas, ellos capturan los iones magnesio y no permiten que
actúen como cofactores de las nucleasas; el SDS (sodio dedecil sulfato), que
solubiliza proteínas, tejidos y membranas, evitando que una cantidad
significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos celulares; la
intervención de estos reactivos permite que se aísle el ADN para luego al
mezclarse con etanol frío y se precipite, esto se debe a que El ADN es una
molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja temperatura hace que
se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado justo entre
la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El ADN es el único
componente de la solución que no es soluble en el etanol, se precipita
mediante un proceso de solvatación.
La columna de extracción posee en la base un anillo blanco formado por
sílice(SiO2), un compuesto metálico que tiene afinidad por los ácidos nucleicos,
ya que el sílice posee carga positiva debido a su carácter metálico, mientras
que los ácidos nucleicos, producto del grupo fosfato, poseen carga negativa
formándose entre los dos una interacción electrostática que con la intervención
de un agente caotrópico, siendo este el Tiocianato de Guanidina (GITC) un
compuesto químico utilizado como desnaturalizante de proteínas en general,
fortaleciendo así la unión entre el sílice y el ácido nucleico, la unión se hace tan
fuerte que se asimila a la de un enlace covalente, sin embargo, es iónico; los
lípidos y proteínas no son afines a la membrana y se eliminan con ayuda de la
solución de lavado y un ciclo de centrifugación, mientras que el material
genético permanece unido a la matriz de sílice. El buffer de elución o buffer de
baja fuerza iónica es un buffer de baja salinidad que compite con el ADN por la
unión con la matriz de sílice de tal manera que llega a romper la unión positiva-
negativa de la columna, liberándose de esta manera el ADN, quedando ADN
genómico purificado, manifestándose como una solución densa e incolora,
siendo su estado natural y cumpliéndose el proceso de elución.
Para la cuantificación y PCR solo se procedió a hacer cálculos.
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Las muestras de ADN usadas para el proceso de electroforesis tenían

agregados de buffer de carga que está compuesto por TRIS pH8, siendo
ligeramente alcalino, para evitar que el ADN que es un ácido, se hidrolice y
degrade con el tiempo; Azul de bromofenol y xileno-cianol que son colorantes,
funcionan como marcadores del frente de avance de la electroforesis, su color
es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos; asimismo
contenía glicerol, que le brindaba la densidad y peso para que no se disuelva
en el pocillo y se precipite en el fondo; esta muestra estaba contenida en un gel
de agarosa, quien poseía un color rosado debido al fluoroforo, con una
concentración al 1% p/v , el gel de agarosa forma poros cuyo tamaño depende
la concentración de esta, siendo ambos inversamente proporcional, de esta
manera a una mayor concentración de agarosa formará poros de menor
tamaño, ocasionando que la migración del ADN a través de este gel demore,
esto se debe al gran tamaño del ADN, así cuando la agarosa este menos
concentrada formará poros de mayor tamaño, y esto favorecerá el pase de
ADN de gran tamaño; este gel de agarosa se encuentra sumergido en buffer
de corrida, que puede ser TAE o TBE, en este caso se uso TAE, compuesto
por TRIS, ácido acético, y EDTA; el TRIS funciona regulador del pH; EDTA que
protege al ADN de las enzimas nucleasas, y por último el ACIDO ACETICO
que por acción del ion acetato permite la migración de electrones dándose el
paso de la corriente eléctrica, el Ácido Acético al poder disolverse en agua, se
disocia liberando iones H+ junto con Sulfato y Acetato respectivamente. Lo cual
favorece la conductividad eléctrica. Al brindarle corriente eléctrica a la muestra
sumergida en buffer de corrida, esta procederá a migrar hacia el electrodo
positivo puesto que el ADN, debido al grupo fosfato, posee carga negativa
siendo atraído por tal electrodo, los electrones viajan a través del buffer de
corrida y a través de la agarosa, empujando al ADN atravesando el gel debido
a su porosidad, mientras más grande sea el tamaño del ADN más lento será la
migración de esta.
Luego de haber colocado las muestras en el transiluminador para el revelado,
se observa que la muestra de ADN del Citocromo C marco hasta los 1200bp,
demostrando que el ADN de dicha muestra es de gran tamaño, es por eso que
no puede atravesar con rapidez los poros del gel de agarosa, y si lo atravesara
requeriría más tiempo; al compararlo con el C-, esta muestra tiene mayor
amplificación que tal control, manifestándose un caso de contaminación de
dicho control, puesto que estaba compuesto por agregados de PCR y agua
destilada, y sin la presencia de ADN la muestra no debía de amplificar; sin
embargo, los resultados fueron distintos marcando 1100bp , una de las causas
pudo haber sido la contaminación de algunos de los componentes del PCR
pudiendo tener amplicones que determinen dicho resultado; la muestra de PCR
amplifico tanto como el C-, siendo este resultado considerado como un falso
positivo, puesto que lo que se ha amplificado ha sido la contaminación.