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DEUTSCHE NORM März 2020

DIN EN ISO 9167


D
ICS 67.200.20 Ersatz für
DIN EN ISO 9167:2019-09

Rapssamen und Rapsschrot –


Bestimmung des Glucosinolatgehaltes –
Verfahren mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (ISO 9167:2019);
Deutsche Fassung EN ISO 9167:2019
Rapeseed and rapeseed meals –
Determination of glucosinolates content –
Method using high-performance liquid chromatography (ISO 9167:2019);
German version EN ISO 9167:2019
Graines et tourteaux de colza –
Dosage des glucosinolates –
Méthode par chromatographie liquide à haute performance (ISO 9167:2019);
Version allemande EN ISO 9167:2019

Gesamtumfang 39 Seiten

DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)


DIN EN ISO 9167:2020-03

Nationales Vorwort
Dieses Dokument (EN ISO 9167:2019) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 „Food products“
(Sekretariat: AFNOR, Frankreich) in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 307 „Ölsaaten,
tierische und pflanzliche Fette und Öle und deren Nebenprodukte — Probenahme- und Untersuchungs-
verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat von AFNOR (Frankreich) gehalten wird.

Das zuständige nationale Gremium ist der Arbeitsausschuss NA 057-05-05 AA „Gemeinschaftsausschuss von
DIN und DGF für die Analytik von Fetten, Ölen, Fettprodukten, verwandten Stoffen und Rohstoffen (GA Fett)“
im DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtsachaftliche Produkte (NAL).

Für die in diesem Dokument zitierten internationalen Dokumente wird im Folgenden auf die
entsprechenden deutschen Dokumente hingewiesen:

ISO 664 siehe DIN EN ISO 664


ISO 665 siehe DIN EN ISO 665
ISO 3696 siehe DIN ISO 3696
ISO 5725:1986 siehe DIN ISO 5725:1988-04
ISO 5725 (all parts) siehe DIN ISO 5725 (alle Teile)
ISO 21294 siehe DIN EN ISO 21294

Änderungen

Gegenüber DIN EN ISO 9167-1:2013-12 wurden folgende Änderungen vorgenommen:

a) Aufnahme von Rapsschrot in den Anwendungsbereich mit Hinzufügung eines neuen Ringversuchs;

b) normative Verweisungen aktualisiert bzw. ergänzt;

c) Aufnahme des Abschnittes 3 „Begriffe“;

d) Aktualisierung des Abschnittes 5 „Reagenzien“ (z. B. bei „Interner Standard“ und „Mobile Phasen“);

e) in Abschnitt 9.2 70%iges Methanol wegen der geringeren Toxizität durch 50%iges Methanol ersetzt [6];

f) in Abschnitt 9.2 wird anstelle von zwei nur eine Extraktion durchgeführt;

g) ausführliche Aktualisierung des Abschnitts 9.6.2 „Geräteeinstellung“ (ehemals 8.6.1);

h) in Abschnitt 10.2 und Abschnitt E.5.1 den Begriff „relativer Proportionalitätsfaktor“ anstelle von
„Kalibrierfaktor“ verwendet;

i) Anhang A (informativ) „Ergebnisse von Ringversuchen — HPLC-Verfahren mit Gradientenelution“ neu


aufgenommen;

j) Anhang B (normativ) „Überprüfung des Titers der vorbereiteten internen Standardlösung“ neu
aufgenommen;

k) Anhang C (normativ) „Herstellung und Prüfung einer gereinigten Sulfatase-Lösung und Überprüfung des
Desulfatierungsschritts auf Ionenaustauschsäulen“ neu aufgenommen;

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DIN EN ISO 9167:2020-03

l) Anhang D (informativ) „Qualifizierung der Leistungskriterien von HPLC-System und -Säule“ neu
aufgenommen;

m) in Anhang E isokratischen Modus aufgenommen;

n) Norm redaktionell überarbeitet und an die derzeit gültigen Gestaltungsregeln angepasst.

Gegenüber DIN EN ISO 9167:2019-09 wurden folgende Korrekturen vorgenommen:

a) Korrektur der Formel zur Berechnung des Gehalts Cg eines jeden Glucosinolats, angegeben in Mikromol
je Gramm Trockenmasse des Produkts (E.1);

b) die Übersetzung in D.2.3 wurde angepasst.

Frühere Ausgaben

DIN EN ISO 9167-1: 1995-09, 2013-12


DIN EN ISO 9167: 2019-09

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DIN EN ISO 9167:2020-03

Nationaler Anhang NA
(informativ)

Literaturhinweise

DIN EN ISO 664, Ölsamen — Verkleinerung der Laboratoriumsprobe auf die Untersuchungsprobe

DIN EN ISO 665, Ölsamen — Bestimmung des Gehaltes an Feuchtigkeit und flüchtigen Bestandteilen

DIN EN ISO 21294, Ölsamen — Manuelle oder automatische diskontinuierliche Probenahme

DIN ISO 3696, Wasser für analytische Zwecke — Anforderungen und Prüfungen

DIN ISO 5725:1988-04, Präzision von Messverfahren — Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpräzision von
festgelegten Messverfahren durch Ringversuche; Identisch mit ISO 5725, Ausgabe 1986

DIN ISO 5725 (alle Teile), Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Messverfahren und Messergebnissen

4
EUROPÄISCHE NORM EN ISO 9167
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE Juni 2019

ICS 67.200.20 Ersetzt EN ISO 9167-1:1995

Deutsche Fassung

Rapssamen und Rapsschrot —


Bestimmung des Glucosinolatgehaltes —
Verfahren mittels Hochleistungsflüssigchromatographie
(ISO 9167:2019)
Rapeseed and rapeseed meals — Graines et tourteaux de colza —
Determination of glucosinolates content — Dosage des glucosinolates —
Method using high-performance liquid chromatography Méthode par chromatographie liquide à haute
(ISO 9167:2019) performance (ISO 9167:2019)

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 4. Mai 2019 angenommen.

Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter
denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand
befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim CEN-CENELEC-Management-
Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich.

Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen
Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem
Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, Estland, Finnland,
Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen,
Österreich, Polen, Portugal, der Republik Nordmazedonien, Rumänien, Schweden, der Schweiz, Serbien, der Slowakei, Slowenien,
Spanien, der Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.

EUROPÄI SCHE S KO MITEE FÜR NORM UNG


EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMIT É E UROP É E N DE NOR MALI SA TIO N

CEN-CENELEC Management-Zentrum: Rue de la Science 23, B-1040 Brüssel


DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Inhalt
Seite

Europäisches Vorwort ...........................................................................................................................................................4


Vorwort .......................................................................................................................................................................................5
Einleitung ...................................................................................................................................................................................6
1 Anwendungsbereich................................................................................................................................................7
2 Normative Verweisungen ......................................................................................................................................7
3 Begriffe .........................................................................................................................................................................7
4 Kurzbeschreibung ....................................................................................................................................................8
5 Reagenzien ..................................................................................................................................................................8
6 Geräte ......................................................................................................................................................................... 10
7 Probenahme ............................................................................................................................................................ 12
8 Vorbereitung der Untersuchungsprobe ........................................................................................................ 12
9 Durchführung.......................................................................................................................................................... 12
9.1 Einwaage ................................................................................................................................................................... 12
9.2 Extraktion der Glucosinolate ............................................................................................................................ 12
9.3 Blindversuch ........................................................................................................................................................... 13
9.4 Herstellung der Ionenaustauschersäulen .................................................................................................... 13
9.5 Reinigung und Desulfatierung .......................................................................................................................... 13
9.6 Chromatographie mit Gradientenelution ..................................................................................................... 14
10 Angabe der Ergebnisse ........................................................................................................................................ 15
10.1 Berechnung des Gehalts der einzelnen Glucosinolate ............................................................................. 15
10.2 Relative Proportionalitätsfaktoren ................................................................................................................ 16
10.3 Berechnung des Gesamtgehalts an Glucosinolaten .................................................................................. 17
11 Präzision ................................................................................................................................................................... 17
11.1 Ringversuch ............................................................................................................................................................. 17
11.2 Wiederholpräzision .............................................................................................................................................. 17
11.3 Vergleichpräzision ................................................................................................................................................ 17
12 Untersuchungsbericht ......................................................................................................................................... 17
Anhang A (informativ) Ergebnisse von Ringversuchen — HPLC-Verfahren mit
Gradientenelution ................................................................................................................................................. 18
Anhang B (normativ) Überprüfung des Titers der hergestellten internen Standardlösung ................... 20
B.1 Bestimmung der Reinheit................................................................................................................................... 20
B.2 Bestimmung des Titers........................................................................................................................................ 20
B.3 Relative Proportionalitätsfaktoren ................................................................................................................ 20
Anhang C (normativ) Herstellung und Prüfung einer gereinigten Sulfatase-Lösung und
Überprüfung des Desulfatierungsschritts an Ionenaustauschersäulen............................................ 21
C.1 Allgemeines ............................................................................................................................................................. 21
C.2 Kurzbeschreibung ................................................................................................................................................. 21
C.3 Reagenzien und Geräte........................................................................................................................................ 21
C.4 Durchführung.......................................................................................................................................................... 22

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Anhang D (informativ) Qualifizierung der Leistungskriterien von HPLC-System und -Säule ................ 26
D.1 Allgemeines ............................................................................................................................................................. 26
D.2 Durchführung ......................................................................................................................................................... 26
D.3 Eignung des Systems ............................................................................................................................................ 26
Anhang E (informativ) Elution im isokratischen Modus....................................................................................... 28
E.1 Interner Standard.................................................................................................................................................. 28
E.2 Mobile Phasen für die isokratische Elution ................................................................................................. 28
E.3 Säule für die isokratische Elution.................................................................................................................... 28
E.4 Chromatographie mit isokratischer Elution (vereinfachtes Verfahren) .......................................... 29
E.5 Angabe der Ergebnisse ........................................................................................................................................ 31
E.6 Berechnung des Gesamtgehalts an Glucosinolaten .................................................................................. 32
E.7 Präzision ................................................................................................................................................................... 32
E.8 Untersuchungsbericht ......................................................................................................................................... 33
E.9 Ergebnisse des Ringversuchs für das HPLC-Verfahren mit isokratischer Elution ........................ 33
Literaturhinweise................................................................................................................................................................. 35

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Europäisches Vorwort
Dieses Dokument (EN ISO 9167:2019) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 „Food products“ in
Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 307 „Ölsaaten, tierische und pflanzliche Fette und
Öle und deren Nebenprodukte — Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat
von AFNOR gehalten wird.

Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Dezember 2019, und etwaige entgegenstehende
nationale Normen müssen bis Dezember 2019 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.

Dieses Dokument ersetzt EN ISO 9167-1:1995.

Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden


Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, die
Republik Nordmazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien,
Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien,
Schweden, Schweiz, Serbien, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Türkei, Ungarn,
Vereinigtes Königreich und Zypern.

Anerkennungsnotiz

Der Text von ISO 9167:2019 wurde von CEN als EN ISO 9167:2019 ohne irgendeine Abänderung genehmigt.

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Vorwort
ISO (die Internationale Organisation für Normung) ist eine weltweite Vereinigung nationaler
Normungsorganisationen (ISO-Mitgliedsorganisationen). Die Erstellung von Internationalen Normen wird
üblicherweise von Technischen Komitees von ISO durchgeführt. Jede Mitgliedsorganisation, die Interesse an
einem Thema hat, für welches ein Technisches Komitee gegründet wurde, hat das Recht, in diesem Komitee
vertreten zu sein. Internationale staatliche und nichtstaatliche Organisationen, die in engem Kontakt mit ISO
stehen, nehmen ebenfalls an der Arbeit teil. ISO arbeitet bei allen elektrotechnischen Themen eng mit der
Internationalen Elektrotechnischen Kommission (IEC) zusammen.

Die Verfahren, die bei der Entwicklung dieses Dokuments angewendet wurden und die für die weitere Pflege
vorgesehen sind, werden in den ISO/IEC-Direktiven, Teil 1 beschrieben. Es sollten insbesondere die
unterschiedlichen Annahmekriterien für die verschiedenen ISO-Dokumentenarten beachtet werden. Dieses
Dokument wurde in Übereinstimmung mit den Gestaltungsregeln der ISO/IEC-Direktiven, Teil 2 erarbeitet
(siehe www.iso.org/directives).

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. ISO ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.
Details zu allen während der Entwicklung des Dokuments identifizierten Patentrechten finden sich in der
Einleitung und/oder in der ISO-Liste der erhaltenen Patenterklärungen (siehe www.iso.org/patents).

Jeder in diesem Dokument verwendete Handelsname dient nur zur Unterrichtung der Anwender und
bedeutet keine Anerkennung.

Für eine Erläuterung des freiwilligen Charakters von Normen, der Bedeutung ISO-spezifischer Begriffe und
Ausdrücke in Bezug auf Konformitätsbewertungen sowie Informationen darüber, wie ISO die Grundsätze der
Welthandelsorganisation (WTO, en: World Trade Organization) hinsichtlich technischer Handelshemmnisse
(TBT, en: Technical Barriers to Trade) berücksichtigt, siehe www.iso.org/iso/foreword.html.

Dieses Dokument wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34, Food products, Unterkomitee SC 2,
Oleaginous seeds and fruits and oilseed meals erarbeitet.

Diese erste Ausgabe ersetzt ISO 9167-1:1992, die technisch überarbeitet wurde. Sie enthält auch die
Änderung ISO 9167-1:1992/Amd.1:2013. Die wesentlichen Änderungen sind folgende:

Rapsschrot wurde in den Anwendungsbereich mit der Hinzufügung eines neuen Ringversuchs
aufgenommen;

in 9.2 wurde 70%iges Methanol wegen der geringeren Toxizität durch 50%iges Methanol ersetzt [6];

in 9.2 wird nur eine Extraktion durchgeführt anstelle von zwei;

in 10.2 und E.5.1 wurde die Benennung „relativer Proportionalitätsfaktor“ anstelle von „Kalibrierfaktor“
verwendet;

der isokratische Modus wurde in Anhang E aufgenommen.

Rückmeldungen oder Fragen zu diesem Dokument sollten an das jeweilige nationale Normungsinstitut des
Anwenders gerichtet werden. Eine vollständige Auflistung dieser Institute ist unter
www.iso.org/members.html zu finden.

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Einleitung
Die Glucosinolate in Rapssamen können durch chromatographische, enzymatische oder spektroskopische
Verfahren analysiert werden. Dieses Dokument beschreibt ein chromatographisches Verfahren mit zwei
Elutionsbedingungen (Gradienten- und isokratische Elution) zur qualitativen und quantitativen Analyse von
einzelnen Glucosinolaten in Rapssamen und Rapsschrot. Das Verfahren mit Gradientenelution wird als
Referenzverfahren angesehen, während das Verfahren mit isokratischer Elution als vereinfachtes Verfahren
betrachtet wird und in Anhang E zur Information aufgeführt ist.

Dieses Dokument legt ein Verfahren unter Anwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC, en:
high-performance liquid chromatography) mit Gradientenelution als Referenzverfahren fest. Bei dem
isokratischen Modus unterscheiden sich die Wahl des internen Standards, die chromatographischen
Bedingungen und die Ergebnisse der Trennung vom Referenzverfahren. Diese Aspekte werden in Anhang E
behandelt.

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

1 Anwendungsbereich
Dieses Dokument legt ein Verfahren zur Bestimmung der einzelnen Glucosinolate in Rapssamen und
Rapsschrot mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Gradientenelution fest.

Dieses Verfahren wurde an Rapssamen und Rapsschrot (Brassica rapa, Brassica napus und Brassica juncea)
geprüft, ist jedoch auf andere Pflanzenmaterialien unter der Bedingung anwendbar, dass die vorkommenden
Glucosinolate zuvor identifiziert wurden und in diesem Dokument beschrieben sind. Die quantitative
Bestimmung des (der) betreffenden Glucosinolats (Glucosinolate) wird nicht durchgeführt.

ANMERKUNG Glucosinolate, die am Glucosemolekül substituiert sind, werden mit diesem Verfahren nicht erfasst,
sind für handelsübliche Rapssamen und Rapsschrot jedoch auch von untergeordneter Bedeutung.

Anhang A enthält die Ergebnisse der Ringversuche für das HPLC-Verfahren mit Gradientenelution. Anhang B
stellt dar, wie der Titer der hergestellten internen Standardlösung überprüft wird. Anhang C stellt dar, wie
die gereinigte Sulfatase-Lösung hergestellt und geprüft wird und wie der Desulfatierungsschritt an der
Ionenaustauschersäule überprüft wird. Anhang D stellt die Qualifikation der HPLC- und Säulenleistungs-
kriterien dar.

Die Analyse des Glucosinolatgehalts in Rapssamen kann auch unter Anwendung eines isokratischen
Elutionsmodus erfolgen. Das erfordert einige Modifikationen des Verfahrens (interner Standard, HPLC-Säule
und HPLC-Pufferlösungen), wie in Anhang E beschrieben.

2 Normative Verweisungen
Die folgenden Dokumente werden im Text in solcher Weise in Bezug genommen, dass einige Teile davon
oder ihr gesamter Inhalt Anforderungen des vorliegenden Dokuments darstellen. Bei datierten
Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte
Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschließlich aller Änderungen).

ISO 664, Oilseeds — Reduction of laboratory sample to test sample

ISO 665, Oilseeds — Determination of moisture and volatile matter content

ISO 771, Oilseed residues — Determination of moisture and volatile matter content

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 5502, Oilseed residues — Preparation of test samples

3 Begriffe
In diesem Dokument werden keine Begriffe aufgeführt.

ISO und IEC stellen terminologische Datenbanken für die Verwendung in der Normung unter den folgenden
Adressen bereit:

ISO Online Browsing Platform: verfügbar unter http://www.iso.org/obp

IEC Electropedia: verfügbar unter http://www.electropedia.org/

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

4 Kurzbeschreibung

Extraktion der Glucosinolate mit einem Wasser-Ethanol-Gemisch, danach Reinigung sowie enzymatische
Desulfatierung mit Ionenaustauschersäulen. Bestimmung mittels Umkehrphasen-Flüssigkeitschromato-
graphie und Gradientenelution (Referenzverfahren) oder isokratischer Elution (Schnellverfahren) mit
anschließender Detektion mittels UV-Absorptionsmessung.

5 Reagenzien
Soweit nicht anders festgelegt, sind Reagenzien mit anerkanntem Reinheitsgrad „zur Analyse“ zu verwenden
sowie Wasser, das der Qualität 2 nach ISO 3696 entspricht.

5.1 Ethanol, Volumenanteil = 50 %.

5.2 Natriumacetat, c = 0,02 mol/l bei pH 4,0, hergestellt durch Mischen von Natriumacetat,
c = 0,02 mol/l und Essigsäure, c = 0,02 mol/l, um eine Lösung mit pH = 4,0 zu erhalten.

5.3 Sulfatase, Helix pomatia, Typ H1, gereinigt und verdünnt wie in Anhang C beschrieben.

5.4 Imidazolformiat, c = 6 mol/l.

204 g Imidazol werden in einem 500-ml-Becherglas in 113 ml Ameisensäure gelöst. Das Gemisch wird in
einen 500-ml-Messzylinder überführt und mit Wasser auf 500 ml aufgefüllt.

5.5 Interner Standard.

Es wird entweder Sinigrin (Kalium-Allylglucosinolat-Monohydrat, M = 415,5 g/mol) (5.6) oder Gluco-


tropaeolin (Kalium-Benzylglucosinolat, M = 447,5 g/mol oder Tetramethylammonium-Benzylglucosinolat,
M = 482,6 g/mol) (5.7) verwendet. Das Glucotropaeolin darf in hydratisierter Form verwendet werden;
dann müssen die Molmasse und die Reinheit bekannt sein und bei der Herstellung der Lösung berücksichtigt
werden.

Die Wahl des internen Standards wird durch seine perfekte chromatographische Trennung von anderen
Glucosinolaten der Probe abhängig gemacht. Das naturgemäße Nichtvorhandensein des internen Standards
oder von Glucosinolaten, die nicht von letzterem getrennt sind, in der Probe kann mit einem Blindversuch
(siehe 9.3) überprüft werden.

Bei der Gradientenelution an einer Octyl- oder Octadecyl-Phase als stationäre Phase kann Sinigrin oder
Glucotropaeolin verwendet werden. Es ist jedoch manchmal schwierig, Glucotropaeolin von anderen
natürlich vorkommenden Glucosinolaten von geringerer Bedeutung (Minor-Glucosinolaten) zu trennen.

Bei der isokratischen Elution an einer Cyanopropyl-Phase als stationäre Phase (siehe Anhang E) kann
Sinigrin nicht für die Analyse von Rapssamen verwendet werden, weil es nicht von den anderen
Glucosinolaten getrennt wird. Stattdessen muss Glucotropaeolin verwendet werden.

In den häufigsten Fällen (d. h. wenn Rapssamen einen angenommenen Glucosinolatgehalt zwischen jeweils
einschließlich 10 µmol/g und 50 µmol/g haben) wird der interne Standard in Form einer Lösung von
20 mmol/l verwendet. Für Rapssamen mit einem angenommenen Glucosinolatgehalt von weniger als
10 µmol/g oder mehr als 50 µmol/g sind die je Probe verwendeten Konzentrationen der internen
Standardlösungen in Tabelle 1 angegeben.

Der Titer der hergestellten internen Standardlösung wird wie in Anhang B beschrieben überprüft.

8
DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Tabelle 1 — Konzentration der internen Standardlösung zur Verwendung entsprechend dem


angenommenen Glucosinolatgehalt der Probe

Glucosinolatgehalt der Probe Konzentrationen der internen Standardlösungen


mol/g mmol/l
< 10 5
> 10 und < 50 20
> 50 40

5.6 Sinigrin-Lösung.

Die Sinigrin-Lösung mit der erforderlichen Konzentration (siehe Tabelle 1) wird nach Tabelle 2 hergestellt.
Das Sinigrin wird auf 0,5 mg eingewogen und in einem 100-ml-Messkolben in Wasser gelöst. Der
Messkolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Die so hergestellte Lösung darf in einem Kühlschrank
bei etwa 4 °C bis zu einer Woche oder in einem Tiefgefrierschrank bei 18 °C für einen längeren Zeitraum
aufbewahrt werden.

Tabelle 2 — Masse von Sinigrin in 100 ml Wasser zur Herstellung von Lösungen mit 5 mmol/l,
20 mmol/l und 40 mmol/l

Molekülmasse Masse von Sinigrin


Form von Sinigrin g/mol g
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Kalium-Monohydrat 415,5 0,207 7 0,831 0 1,662 0

5.7 Glucotropaeolin-Lösung.

Die Glucotropaeolin-Lösung mit der erforderlichen Konzentration (siehe Tabelle 1) wird nach Tabelle 3
hergestellt. Das Glucotropaeolin wird auf 0,5 mg eingewogen und in einem 100-ml-Messkolben in Wasser
gelöst. Der Messkolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Die so hergestellte Lösung darf in einem
Kühlschrank bei etwa 4 °C bis zu einer Woche oder in einem Tiefgefrierschrank bei 18 °C für einen
längeren Zeitraum aufbewahrt werden.

Tabelle 3 — Masse von Glucotropaeolin in 100 ml Wasser zur Herstellung von Lösungen mit
5 mmol/l, 20 mmol/l und 40 mmol/l

Molekülmasse Masse von Glucotropaeolin


Form von Glucotropaeolin g/mol g
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Kalium 447,5 0,223 7 0,895 0 1,790 1
Tetramethylammonium 482,6 0,241 3 0,965 2 1,930 3

5.8 Elutionsmittel A: Wasser, gereinigt durch Filtrieren über eine Aktivkohle-Kartusche oder Wasser
entsprechender Reinheit.

ANMERKUNG Die Verwendung von unzureichend gereinigtem Wasser kann bei der Analyse zu Geisterpeaks
aufgrund von Verunreinigungen führen, die eluiert werden, wenn sich der Anteil an Acetonitril im Elutionsmittel erhöht.

9
DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

5.9 Elutionsmittel B: Acetonitril, für HPLC mit Gradientenelution geeignet, Lösung in gereinigtem
Wasser, Volumenanteil = 20 %. Die Konzentration darf je nach der verwendeten Säule modifiziert werden.

5.10 Lösemittel zum Spülen: Acetonitril, HPLC-Qualität, Lösung in Wasser, Volumenanteil = 70 %.

5.11 Ionenaustauscherharz: DEAE Sephadex A25 1, auf folgende Weise angesetzte Suspension.

10 g DEAE Sephadex A25-Harz (oder ein gleichwertiges Harz) mit einem Überschuss Essigsäure-Lösung von
2 mol/l mischen. Absetzen lassen. Essigsäure von 2 mol/l hinzufügen, bis das Gesamtvolumen dem
doppelten Volumen des abgesetzten Materials entspricht.

6 Geräte
Übliche Laborgeräte und im Besonderen die folgenden.

6.1 HPLC-Gerät mit Gradienten- oder isokratischer Elution, Regelung der Säulentemperatur bei 30 °C und
Detektion durch UV-Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 229 nm und, falls möglich, bei einer
Wellenlänge 275 nm.

Wenn die Umgebungstemperatur mehr als 25 °C beträgt, kann eine wirksame Regelung der Säulen-
temperatur bei 30 °C unmöglich sein. In diesem Fall wird ein Ofen mit einer Kühl- und Heizeinrichtung
empfohlen.

6.2 HPLC-Säulen für Gradientenelution.

HPLC-Säulen, die als stationäre Phase eine Octyl-(C8-) oder Octadecyl-(C18-)Phase, gebunden an eine
Siliciumdioxid-Säulenpackung, mit einer Teilchengröße von weniger als oder gleich 5 m enthalten.

Die Trennleistung der Säule sollte regelmäßig überprüft werden, vorzugsweise mit einer Referenzprobe aus
Rapssamen. Insbesondere darf die Säule vor allem Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin, ein wichtiges, aber
relativ instabiles Desulfoglucosinolat, nicht zersetzen. In Bild 1 ist ein Beispiel für die Trennung von
Glucosinolaten unter Anwendung des HPLC-Gradientenmodus dargestellt. Neue Säulen müssen vor der
Analyse nach den Anweisungen des Herstellers vorkonditioniert werden, so dass reproduzierbare
Ergebnisse erzielt werden können.

6.3 pH-Messgerät.

6.4 Mikromühle, z. B. eine Kaffeemühle.

6.5 Zentrifuge, geeignet für die Anwendung mit Zentrifugenröhrchen (6.6) und in der Lage, eine
Zentrifugalbeschleunigung von 5 000 g zu erreichen.

6.6 Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, Nennvolumen 6 ml.

6.7 Wasserbad oder eine andere Heizvorrichtung, einstellbar auf eine Temperatur von 75 °C ± 3 °C.

6.8 Pasteurpipetten, ausgestattet mit Glaswolle, 150 mm lang, sowie ein geeignetes Gestell oder eine
andere geeignete Vorrichtung.

1 DEAE-Sephadex A25 ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur
Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch
ISO.

10
DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Legende
1 Desulfoglucoiberin 9 Desulfogluconapin
2 Desulfoprogoitrin 10 Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin
3 Desulfoepiprogoitrin 11 Desulfoglucobrassicanapin
4 Desulfosinigrin 12 Desulfoglucotropaeolin
5 Desulfoglucoraphanin 13 Desulfoglucobrassicin
6 Desulfogluconapoleiferin 14 Desulfogluconasturtiin
7 Desulfoglucoalyssin 15 Desulfo-4-methoxyglucobrassicin
8 Desulfosinalbin 16 Desulfoneoglucobrassicin

Bild 1 — Beispiel für ein typisches Chromatogramm von Rapssamen unter Anwendung der
Gradientenelution

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7 Probenahme

Es ist wichtig, dass das Laboratorium eine Probe erhält, die tatsächlich repräsentativ ist und die während des
Transports oder der Lagerung nicht beschädigt oder verändert worden ist.

Die Probenahme ist nicht Bestandteil des in diesem Dokument festgelegten Verfahrens. Ein empfohlenes
Probenahmeverfahren ist für Ölsamen in ISO 21294 [4] und für Ölsamenschrot in ISO 5500 [1] angegeben.

Wenn große, nicht ölhaltige Fremdkörper vor der Verkleinerung der Laboratoriumsprobe ausgelesen
wurden, muss dies bei der Berechnung berücksichtigt werden.

8 Vorbereitung der Untersuchungsprobe


Die Laboratoriumsprobe wird bei Ölsamen nach ISO 664 und bei Ölsamenschrot nach ISO 5502 verkleinert.

Falls die Samen einen Feuchtegehalt und einen Gehalt an flüchtigen Bestandteilen von w = 10 % aufweisen,
sind sie vorher bei 45 °C ± 5 °C in einem Luftstrom zu trocknen.

Der Anteil an Verunreinigungen beträgt im Allgemeinen 2 % (Massenanteil). Wird Sinigrin in der Probe
festgestellt (mit der Blindprobe), sind die Verunreinigungen getrennt zu analysieren, da Sinigrin aus Samen
von zufälligen Cruciferae (Kreuzblütlern) stammen kann, die Verunreinigungen in Rapssamen sind.

Wurden die Samen einer Vorbehandlung unterzogen, sind sie mit Dichlormethan zu waschen und in einem
Luftstrom bei Umgebungstemperatur zu trocknen.

Die Probe wird auf zwei Teilproben von jeweils 20 g verkleinert.

Der Feuchtegehalt und der Gehalt an flüchtigen Bestandteilen einer Teilprobe ist für Ölsamen nach ISO 665
und für Ölsamenschrot nach ISO 771 oder einem entsprechenden Verfahren zu bestimmen.

Die Samen der anderen Teilprobe sind in der Mikromühle (6.4) 20 s zu mahlen. Alles mischen, dann erneut
5 s mahlen. Die hergestellte Probe wird sofort gewogen (siehe 9.1), um eine Veränderung des Feuchtegehalts
und des Gehalts an flüchtigen Bestandteilen zu vermeiden.

9 Durchführung

9.1 Einwaage

Zwei Zentrifugenröhrchen (6.6) werden als A und B bezeichnet und in jedes Röhrchen werden 200 mg der
vorbereiteten Untersuchungsprobe (siehe Abschnitt 8) bei Ölsamen und 100 mg bei Ölsamenschrot, jeweils
auf 0,5 mg eingewogen, überführt. Röhrchen A wird für die Untersuchungsprobe verwendet und Röhrchen B
wird als Blindprobe verwendet, falls notwendig.

9.2 Extraktion der Glucosinolate

Die Zentrifugenröhrchen sind in dem auf 75 °C temperierten Wasserbad oder in eine andere Heizvorrich-
tung (6.7) zu stellen und 1 min zu erhitzen. Danach sind (in jedes Zentrifugenröhrchen) 3 ml siedende
Ethanol-Lösung (5.1) hinzuzufügen und unmittelbar darauf folgt die Zugabe von 200 l auf 3 l der internen
Standardlösung, hergestellt in Übereinstimmung mit dem HPLC-Elutionsmodus und dem angenommenen
Glucosinolatgehalt der Probe (5.5), in Röhrchen A.

Die Temperatur der Ethanol-Lösung muss möglichst nahe am Siedepunkt liegen, um eine schnelle Denaturie-
rung des Enzyms Myrosinase sicherzustellen, das im Allgemeinen in der Einwaage vorkommt.

ANMERKUNG Nicht denaturierte Myrosinase kann die Glucosinolate innerhalb weniger Minuten abbauen.

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Die Zentrifugenröhrchen sind weitere 10 min bei 75 °C zu erhitzen und dabei in regelmäßigen Abständen zu
schütteln. Das Volumen der Zentrifugenröhrchen A und B ist mit Wasser auf etwa 4 ml aufzufüllen, der Inhalt
ist zu mischen und anschließend 3 min bei einer Beschleunigung von 5 000 g zu zentrifugieren.

Die überstehende Flüssigkeit ist jeweils in zwei andere, mit A und B gekennzeichnete Zentrifugenröhr-
chen (6.6) zu überführen. s Volumen in jedem Röhrchen A und B ist mit Wasser auf etwa 5 ml aufzufüllen
und zu durchmischen.

Diese Extrakte dürfen zwei Wochen im Dunkeln bei 18 °C in einem Tiefgefrierschrank aufbewahrt werden.

ANMERKUNG Bei der Verwendung von 50%igem Ethanol als Lösemittel hat sich eine einstufige Extraktion als
hinreichend wirksam herausgestellt [6].

9.3 Blindversuch

Falls notwendig (5.5), ist ein Blindversuch unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise (siehe 9.2) an
einer aus derselben Untersuchungsprobe entnommenen Einwaage durchzuführen, jedoch ohne der internen
Standardlösung (Sinigrin oder Glucotropaeolin) und ihrer Ersetzung mit 200 l Wasser, um in der Einwaage
vorhandenes Sinigrin oder Glucotropaeolin (oder eine coeluierende Verbindung) nachzuweisen und
quantitativ zu bestimmen.

9.4 Herstellung der Ionenaustauschersäulen

Pasteurpipetten mit Glaswolle (6.8) in der erforderlichen Anzahl, d. h. für jeden vereinigten Extrakt eine
Pipette, sind so abzuschneiden, dass oberhalb des Halses ein Volumen von 1,2 ml verbleibt. Die Pipetten sind
senkrecht in ein Gestell zu stellen.

Es sind 0,5 ml der gut durchmischten Suspension des Ionenaustauscherharzes (5.11) in jede Pipette zu
überführen und absetzen zu lassen.

Die Pipetten sind mit 2 ml des Imidazolformiats (5.4) und anschließend zweimal mit jeweils 1 ml Wasser zu
spülen.

9.5 Reinigung und Desulfatierung

9.5.1 Für jeden Extrakt sind die Arbeitsgänge in 9.5.2 bis 9.5.5 auszuführen.

9.5.2 1 ml oder 0,5 ml des Extrakts (siehe 9.2), in Abhängigkeit vom angenommenen Glucosinolatgehalt
der Probe (siehe Tabelle 4), ist/sind, ohne die Harzoberfläche zu beschädigen, auf die vorbereitete Säule
(siehe 9.4) zu geben und ablaufen zu lassen. Es ist zweimal 1 ml 0,02 M-Natriumacetat-Puffer (5.2) mit
einem pH-Wert von 4,0 hinzuzufügen und nach jeder Zugabe ablaufen zu lassen.

Tabelle 4 — Volumen des Extrakts, das entsprechend dem erwarteten Glucosinolatgehalt der Probe
auf die Ionenaustauschersäule überführt wird

Glucosinolatgehalt der Probe Volumen des Extrakts


µmol/g ml
< 50 1,0
> 50 0,5

9.5.3 Auf die Säule sind 75 l der verdünnten, gereinigten Sulfatase-Lösung (siehe C.4.4) zu geben. Diese ist
etwa 15 h bei Umgebungstemperatur einwirken zu lassen.

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9.5.4 Ein Röhrchen (6.6) wird unter der Säule angeordnet, um das Eluat zu sammeln. Die erhaltenen
Desulfoglucosinolate sind zweimal mit je 1 ml Wasser zu eluieren, wobei nach jeder Zugabe das Abfließen
des Wassers zu ermöglichen ist.

ANMERKUNG Die vollständige Elution der Desulfoglucosinolate von der Ionenaustauschersäule kann überprüft
werden, indem eine zusätzliche Portion Wasser (1 ml) für die Elution verwendet wird. Die Chromatographie dieser
zusätzlichen Portion ergibt keine signifikanten Mengen beliebiger Desulfoglucosinolate.

9.5.5 Das Eluat ist gut zu mischen. Sofern das Eluat nicht sofort zur Chromatographie verwendet wird, darf
es im Dunkeln im Tiefgefrierschrank bei 18 °C maximal eine Woche aufbewahrt werden.

9.6 Chromatographie mit Gradientenelution

9.6.1 Allgemeines

Beim Referenzverfahren wird eine Gradientenelution mit einer Säule mit einer Octyl- oder Octadecyl-Phase
als stationäre Phase (6.2) und Elutionsmitteln (5.8, 5.9 und 5.10) angewendet.

9.6.2 Geräteeinstellung

9.6.2.1 Allgemeines

Die Säulentemperatur wird auf 30 °C und die Detektor-Wellenlänge auf 229 nm eingestellt. Das HPLC-
Gerät (6.1) wird so programmiert, dass die Säule gespült wird, indem Elutionsmittel B mit einer Durchfluss-
geschwindigkeit von etwa 1 ml/min hindurchgeleitet wird. Wenn die Basislinie stabil ist, werden die
Anfangsbedingungen des Elutionsgradienten (Elutionsmittel A) angenommen und dem System wird
während 5 min eine Gleichgewichtseinstellung ermöglicht.

Wenn die Basislinie nach dem 20-minütigen Hindurchleiten von Elutionsmittel B instabil bleibt, wird das
Elutionsmittel zum Spülen (70%iges Acetonitril) verwendet, um die Säule zu reinigen. Anschließend wird
erneut 5 min Elutionsmittel B verwendet und die Anfangsbedingungen (Elutionsmittel A) werden ange-
nommen.

Wenn sich das System mit Elutionsmittel A im Gleichgewicht befindet, muss die Probe ohne Verzögerung
injiziert werden. Wenn nicht, können im Wasser vorkommende Spuren von organischen Verbindungen auf
der Säule konzentriert und während der Gradientenelution freigesetzt werden. Dann kann eine Coelution
mit Desulfoglucosinolaten auftreten.

9.6.2.2 Untersuchung

Es werden höchstens 50 µl der nach 9.5.5 erhaltenen Desulfoglucosinolat-Lösung in den Chromatographen


injiziert und die Konzentration von Acetonitril in der mobilen Phase wird einem linearen Gradienten
entsprechend verändert (von 0 % auf 25 % innerhalb von etwa 20 min).

Ein der eingesetzten Trennsäule entsprechender Elutionsgradient ist anzuwenden.

Die folgenden Elutionsgradienten sind als Beispiele angegeben und dürfen so verändert werden, dass in
Abhängigkeit von den verwendeten Säulen optimale Trennungen erreicht werden (siehe Anhang D).

BEISPIEL 1 RP18-Säule, 5 µm (150 mm × 4,6 mm): Für 1 min 100 % Elutionsmittel A (5.8) hindurchleiten. Im
Verlauf von 20 min einen linearen Elutionsgradienten anwenden, bis 0 % Elutionsmittel A und 100 % Elutionsmittel B
erhalten werden. Im Verlauf von 5 min einen linearen Elutionsgradienten anwenden, bis 100 % Elutionsmittel A und
0 % Elutionsmittel B erhalten werden. Für 5 min 100 % Elutionsmittel A zur Gleichgewichtseinstellung hindurchleiten.

BEISPIEL 2 RP8-Säule, 5 µm (125 mm × 4 mm): Für 2 min 30 s 100 % Elutionsmittel A hindurchleiten. Im Verlauf
von 18 min einen linearen Elutionsgradienten anwenden, bis 0 % Elutionsmittel A und 100 % Elutionsmittel B erhalten
werden. Für 5 min 100 % Elutionsmittel B hindurchleiten. Im Verlauf von 2 min einen linearen Elutionsgradienten
anwenden, bis 100 % Elutionsmittel A und 0 % Elutionsmittel B erhalten werden. Für 5 min 100 % Elutionsmittel A zur
Gleichgewichtseinstellung hindurchleiten.

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9.6.2.3 Untersuchung der Chromatogramme

9.6.2.3.1 Peakidentifizierung

Unter Anwendung dieses chromatographischen Verfahrens können die desulfatierten Derivate von
Raps-Glucosinolaten verhältnismäßig leicht getrennt werden und die Elutionsreihenfolge entspricht im
Allgemeinen der Darstellung in Bild 1. Jedoch können bei der Trennung der folgenden Desulfoglucosinolate
einige Probleme auftreten, die durch eine leichte Veränderung des Elutionsgradienten oder den Wechsel der
Säulenart behoben werden können:

Desulfoepiprogoitrin und Desulfoglucosinigrin;

Desulfogluconapoleiferin und Desulfoglucoalyssin;

Desulfoglucobrassicanapin und Desulfoglucotropaeolin;

Desulfogluconasturtiin und Desulfo-4-methoxyglucobrassicin.

Die Identifizierung der Peaks darf durch Vergleich mit einem sich aus einer Standardprobe ergebenden
Chromatogramm (6.2) oder durch UV-Detektion bei einer bestimmten Wellenlänge (275 nm für indolische
Glucosinolate) erfolgen.

9.6.2.3.2 Quantitative Bestimmung

Es werden lediglich Peaks berücksichtigt, die Desulfoglucosinolaten entsprechen und bei denen die Fläche
mehr als 1 % der Summe aller Peakflächen beträgt.

Es ist sicherzustellen, dass das Gerät zur Integrationsmessung bei schlecht getrennten Peaks und bei Peaks
mit hoher Intensität auf geeignete Weise funktioniert. Falls notwendig, wird die Desulfoglucosinolat-Lösung
(siehe 9.5.5) nach dem Verdünnen mit Wasser erneut injiziert.

ANMERKUNG Ungeachtet der Wahl von zwei internen Standards kann das Chromatogramm des Blindversuchs
(Röhrchen B, siehe 9.2) einen Peak mit der gleichen Retentionszeit wie der in Röhrchen A verwendete interne Standard
(siehe 9.2) aufweisen. Dennoch kann die Berechnung des Glucosinolatgehalts möglich sein, indem der Einfluss des
coeluierenden Peaks auf die Peakfläche des internen Standards beseitigt wird. Wenn die Fläche des coeluierenden Peaks
geringer ist als die Hälfte der Fläche des internen Standards, kann erstere von letzterer mit einer Korrektur im Vergleich
zu Flächen von anderen Hauptpeaks, die in beiden Chromatogrammen vorliegen, subtrahiert werden. Im Unter-
suchungsbericht wird dieser Berechnungsmodus angegeben.

10 Angabe der Ergebnisse

10.1 Berechnung des Gehalts der einzelnen Glucosinolate

Der Gehalt Cg eines jeden Glucosinolats, angegeben in Mikromol je Gramm Trockenmasse des Produkts, ist
nach Gleichung (1) zu berechnen:

00
= × × × (1)
( 00 )

Dabei ist

Ag der Zahlenwert der Peakfläche, die dem Desulfoglucosinolat entspricht, in Integratoreinheiten;

As der Zahlenwert der Peakfläche, die dem als interner Standard verwendeten Desulfoglucosinolat
entspricht, in Integratoreinheiten;

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Kg der Zahlenwert des relativen Proportionalitätsfaktors des Desulfoglucosinolats;

Ks der Zahlenwert des relativen Proportionalitätsfaktors des als interner Standard verwendeten
Desulfoglucosinolats;

m der Zahlenwert der Masse der Einwaage, in Gramm;

n der Zahlenwert der Menge des dem Zentrifugenröhrchen in 9.2 zugesetzten internen Standards, in
Mikromol;

w der Zahlenwert des Feuchtegehalts und des Gehalts an flüchtigen Bestandteilen in der Unter-
suchungsprobe, angegeben als Massenanteil in Prozent.

Falls gewünscht wird, das Ergebnis auf einen bestimmten Feuchtegehalt und Gehalt an flüchtigen Bestand-
teilen ws, (z. B. ws = 9 %), zu beziehen, wird das für die Trockenmasse (siehe oben) erhaltene Ergebnis C g
mit Gleichung (2) multipliziert:

00
(2)
00

10.2 Relative Proportionalitätsfaktoren

Die in Tabelle 5 angegebenen relativen Proportionalitätsfaktoren (Ki) müssen angewendet werden.

ANMERKUNG Diese relativen Proportionalitätsfaktoren sind in Versuchen ermittelt und zwischen den verschie-
denen an der Prüfung beteiligten Laboratorien nach Absprache festgelegt worden; ihre spätere Überarbeitung kann
notwendig werden.

Tabelle 5 — Anzuwendende relative Proportionalitätsfaktoren (Ki)

Desulfoglucosinolat Ki
1 Desulfoglucoiberin 1,07
2 Desulfoprogoitrin 1,09
3 Desulfoepiprogoitrin 1,09
4 Desulfosinigrin 1,00
5 Desulfoglucoraphanin 1,07
6 Desulfogluconapoleiferin 1,00
7 Desulfoglucoalyssin 1,07
8 Desulfosinalbin 0,50
9 Desulfogluconapin 1,11
10 Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin 0,28
11 Desulfoglucobrassicanapin 1,15
12 Desulfoglucotropaeolin 0,95
13 Desulfoglucobrassicin 0,29
14 Desulfogluconasturtiin 0,95
15 Desulfo-4-methoxyglucobrassicin 0,25
16 Desulfoneoglucobrassicin 0,20
17 Sonstige Desulfoglucosinolate 1,00

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10.3 Berechnung des Gesamtgehalts an Glucosinolaten

Der Gesamtgehalt an Glucosinolaten, angegeben in Mikromol je Gramm Trockenmasse des Produkts, ist
gleich der Summe aller einzelnen Glucosinolatgehalte (deren jeweilige Peakfläche größer als 1 % der Summe
aller Peakflächen ist).

11 Präzision

11.1 Ringversuch

Einzelheiten eines Ringversuchs zur Präzision des Verfahrens sind in Anhang A zusammengefasst. Die aus
diesem Ringversuch abgeleiteten Werte sind möglicherweise nicht auf andere Konzentrationsbereiche und
Matrices als die angegebenen anwendbar.

11.2 Wiederholpräzision

Die absolute Differenz zwischen zwei unabhängigen einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter
Anwendung desselben Verfahrens an identischen Untersuchungsmaterialien in demselben Laboratorium
von demselben Bearbeiter unter Verwendung derselben Geräte innerhalb eines kurzen Zeitabstandes
erhalten wurde, sollte nicht größer sein als 2 µmol/g für Glucosinolatgehalte unter 20 µmol/g und 4 µmol/g
für Glucosinolatgehalte im Bereich von 20 µmol/g bis 35 µmol/g.

11.3 Vergleichpräzision

Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter Anwendung desselben
Verfahrens an identischem Untersuchungsmaterial unter Verwendung unterschiedlicher Geräte erhalten
wurde, sollte nicht größer sein als 4 µmol/g für Glucosinolatgehalte unter 20 µmol/g und 8 µmol/g für
Glucosinolatgehalte im Bereich von 20 µmol/g bis 35 µmol/g.

12 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht ist Folgendes anzugeben:

alle für die vollständige Identifizierung der Probe erforderlichen Angaben;

das angewendete Probenahmeverfahren, falls bekannt;

das angewendete Untersuchungsverfahren mit Verweisung auf das vorliegende Dokument, d. h.


ISO 9167;

alle Einzelheiten zu Arbeitsschritten, die nicht in diesem Dokument festgelegt sind oder als optional zu
betrachten sind, zusammen mit sämtlichen Vorkommnissen, die das (die) Untersuchungsergebnis(se)
beeinflusst haben können;

das (die) erhaltene(n) Untersuchungsergebnis(se);

wenn die Wiederholpräzision geprüft wurde, das ermittelte Endergebnis.

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Anhang A
(informativ)

Ergebnisse von Ringversuchen — HPLC-Verfahren mit Gradientenelution

Ein im Jahr 1988 mit 11 Laboratorien durchgeführter internationaler Ringversuch, bei dem jedes
Laboratorium an jeder Probe A, B, C und D zwei Bestimmungen ausführte, ergab die in Tabelle A.1
angegebenen statistischen Ergebnisse (ausgewertet nach ISO 5725:1986 [2]). Das Verfahren der
Gradientenelution wurde angewendet.

Tabelle A.1 — Statistische Ergebnisse des Ringversuchs 1988 — Gradientenelution

Rapssamen Rapssamen Rapssamen Rapssamen


Probe
A B C D
Anzahl der Laboratorien, die nach
Eliminierung von Ausreißern 11 11 11 11
verblieben sind
Mittlerer Glucosinolatgehalta 20,6 14,1 4,9 25,6
Standardabweichung der
Wiederholpräzision sra 1,7 0,6 0,3 0,8

Variationskoeffizient der
8,5 4,4 6,7 3,3
Wiederholpräzision (%)
Wiederholgrenze r (2,83 × sr)a 4,8 1,7 0,8 2,2
Standardabweichung der
Vergleichpräzision sRa 3,4 2,5 1,5 2,4

Variationskoeffizient der
17 18 31 9,4
Vergleichpräzision (%)
Vergleichgrenze R (2,83 × sR)a 9,5 7,0 4,2 6,7
a Angegeben in µmol/g Trockenmasse.

Ein im Jahr 2014 mit 18 Laboratorien durchgeführter internationaler Ringversuch, bei dem jedes
Laboratorium an jeder Probe A bis F zwei Bestimmungen ausführte, ergab die in Tabelle A.2 angegebenen
statistischen Ergebnisse (ausgewertet nach ISO 5725:1986 [2]). Das Verfahren der Gradientenelution wurde
angewendet.

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Tabelle A.2 — Statistische Ergebnisse des Ringversuchs 2014

Probe A B C D E F
Brassica Brassica Brassica Brassica Brassica Brassica
napus, napus, juncea, juncea, napus napus
Probenart
Schrot Samen Schrot Samen (Canola), (Canola),
Samen Schrot
Anzahl der teilnehmenden
18 18 15 18 18 18
Laboratorien
Anzahl der Laboratorien, die nach
Eliminierung von Ausreißern 16 18 13 17 18 16
verblieben sind
Mittlerer Glucosinolatgehalta 7,83 14,58 156,97 15,07 10,14 1,70
Standardabweichung der
Wiederholpräzision, sra 0,15 0,18 1,99 0,36 0,52 0,10

Variationskoeffizient der
1,9 1,2 1,3 2,4 5,2 6,1
Wiederholpräzision (%)
Wiederholgrenze, r (2,83 × sr)a 0,43 0,51 5,57 1,02 1,47 0,29
Standardabweichung der
Vergleichpräzision, sRa 1,33 1,34 30,14 1,91 1,27 0,36

Variationskoeffizient der
17,0 9,2 19,2 12,7 12,5 21,0
Vergleichpräzision (%)
Vergleichgrenze, R (2,83 × sR)a 3,72 3,75 84,4 5,34 3,56 1,00
a Angegeben in µmol/g Trockenmasse.

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Anhang B
(normativ)

Überprüfung des Titers der hergestellten internen Standardlösung

B.1 Bestimmung der Reinheit


Es ist sicherzustellen, dass die Lösung außer dem internen Standard keine Glucosinolate enthält, indem die
Lösung nach 9.5 bis Abschnitt 11 analysiert wird.

B.2 Bestimmung des Titers


B.2.1 Kurzbeschreibung

Der Titer wird entweder durch ein unabhängiges Verfahren zur Messung von Glucosinolaten (freigesetzte
Glucose) oder durch Kalibrierung unter Anwendung des vorliegenden Verfahrens und eines Referenz-
materials bestimmt.

B.2.2 Verfahren mit Glucosefreisetzung

Der Titer der Lösung wird durch Messung der stöchiometrischen Menge der nach der vollständigen
Hydrolyse mit Myrosinase (Thioglucosid-Glucohydrolase, EC 3.2.3.1) freigesetzten Glucose bestimmt. Die
Hydrolyse erfolgt an Ionenaustauschersäulen [5] und die Ausbeute der Hydrolyse wird unter Anwendung
verschiedener Dauern wie bei der Überprüfung der Aktivität von Sulfatase (siehe C.4.5) überprüft.

B.2.3 Kalibrierung durch ein Referenzmaterial

Die interne Standardlösung, wobei der tatsächliche Titer zu bestimmen ist, wird mit einem theoretischen
Titer zur Analyse einer Probe von Raps mit einem zertifizierten Glucosinolatgehalt verwendet. Es wird das
gleiche Elutionsverfahren (Gradienten- oder isokratische Elution) wie bei der erwarteten Verwendung der
internen Standardlösung angewendet und es werden mehrere Wiederholungen durchgeführt, um die
Präzision der Kalibrierung zu bewerten. Der tatsächliche Titer der internen Standardlösung wird wie in
Gleichung (B.1) angegeben berechnet:

= × (B.1)

Dabei ist

ISr der Zahlenwert des tatsächlichen Titers des internen Standards;

ISth der Zahlenwert des theoretischen Titers des internen Standards;

cc der Zahlenwert des zertifizierten Glucosinolatgehalts des Referenzmaterials;

cth der Zahlenwert des Glucosinolatgehalts des Referenzmaterials, bestimmt mit ISth.

B.3 Relative Proportionalitätsfaktoren


Es ist zu verifizieren, dass der relative Proportionalitätsfaktor von Glucotropaeolin, im Vergleich zu Sinigrin,
dem in 10.2 angegebenen Faktor mit einer zulässigen Abweichung von 10 % entspricht.

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Anhang C
(normativ)

Herstellung und Prüfung einer gereinigten Sulfatase-Lösung und


Überprüfung des Desulfatierungsschritts an Ionenaustauschersäulen

C.1 Allgemeines
Die Sulfatase-Lösung kann nach zwei Verfahren gereinigt werden, die auf unterschiedlichen Prinzipien
beruhen. Verfahren A ist effizienter, jedoch weniger einfach als Verfahren B. Die Aktivität der gereinigten
Sulfatase wird gemessen, um gebrauchsfertige Lösungen herzustellen. Die Aktivität der Sulfatase-Lösung
wird unter Analysebedingungen (an Ionenaustauschersäulen) überprüft.

C.2 Kurzbeschreibung
C.2.1 Reinigung

Verfahren A: Die Sulfatase wird durch Ionenaustausch und Ultrafiltration gereinigt.

Verfahren B: Die Sulfatase wird durch fraktionierte Ausfällung gereinigt.

C.2.2 Messung der Aktivität

Die Aktivität wird aus der Anfangsgeschwindigkeit der Desulfatierung von Sinigrin berechnet. Die Abnahme
der Absorption der Sinigrin-Lösung bei 229 nm wird mit einem Spektrometer gemessen.

C.2.3 Überprüfung der Aktivität an Ionenaustauschersäulen

Die Desulfatierungsaktivität wird mittels Durchführung einer kinetischen Untersuchung der Reaktion an
Glucosinolaten, die an eine Ionenaustauschersäule gebunden sind, überprüft.

C.3 Reagenzien und Geräte


C.3.1 Sulfatase, Helix pomatia, Typ H1 (EC 3.1.6.1).

C.3.2 DEAE-Sepharose-6B-CL-Suspension 2, gebrauchsfertige, im Handel erhältliche Suspension oder ein


gleichwertiges Produkt.

C.3.3 Ionenaustauschersäulen für die Reinigung nach Verfahren A.

Fünf Pasteurpipetten (6.8) sind 7 cm oberhalb des Halses abzuschneiden und in den Hals ist ein Glas-
wollstopfen zu stecken. Die Pipetten sind senkrecht in eine Halterung zu stellen, und in jede Pipette ist eine
ausreichende Menge des Ionenaustauscherharzes (C.3.2) so einzufüllen, dass nach dem Ablaufen des
Wassers ein Volumen von etwa 0,5 ml Harz zurückbleibt.

1 ml der Imidazolformiat-Lösung (5.4) ist in jede Pipette einzufüllen, dann sind diese mit jeweils 1 ml
Wasser zweimal zu waschen.

2 DEAE-Sepharose ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur
Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch
ISO.

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C.3.4 Natriumacetat, Lösung 0,2 mol/l.

C.3.5 Sinigrin-Lösung, 0,15 mmol/l, gepuffert auf pH 5,8 zur Messung der Aktivität.

Es sind nacheinander die folgenden drei Lösungen anzusetzen:

a) 1 ml Eisessig ist in einen 500-ml-Messkolben zu überführen und dieser ist mit Wasser bis zur Marke
aufzufüllen;

b) 1 ml Ethylendiamin ist in einen 500-ml-Messkolben zu überführen und dieser ist mit Wasser bis zur
Marke aufzufüllen;

c) 73 ml der Lösung a) sind mit 40 ml der Lösung b) zu mischen, und der pH-Wert dieser Lösung ist unter
Verwendung der Lösung a) oder b) auf pH 5,8 einzustellen.

3 ml der 5-mmol/l-Sinigrin-Lösung (5.6) sind in einen 100-ml-Messkolben zu überführen und dieser ist mit
Lösung c) bis zur Marke aufzufüllen.

C.3.6 Ultrafiltrationseinheit (Eintauchfilter oder Membranfilter) für eine maximale nominale Molmasse
von 10 kg/mol3.

C.3.7 Zentrifugenröhrchen, Nennvolumen 10 ml.

C.3.8 Zweistrahlspektrometer, das im ultravioletten Bereich des Spektrums bei einer geregelten
Temperatur von 30 °C arbeitet und das mit Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm und nach
Möglichkeit mit einer Registriereinrichtung ausgestattet ist.

C.4 Durchführung
C.4.1 Reinigung nach Verfahren A

25 mg Sulfatase Helix pomatia Typ H1 (C.3.1) sind auf 1 mg einzuwägen, in 2,5 ml Wasser zu lösen, und
jeweils 0,5 ml dieser Lösung sind auf jede der in C.3.3 vorbereiteten Säulen zu geben. Jede Säule ist mit
1,5 ml Wasser zu waschen, wobei das Waschwasser zu verwerfen ist. Folgend sind 1,5 ml Natriumacetat-
Lösung (C.3.4) zuzugeben, und die Eluate der fünf Säulen sind in einem Reagenzglas zu sammeln und zu
vereinigen.

Mit Hilfe einer Ultrafiltrationseinheit (C.3.6) sind die Eluate zu konzentrieren, bis etwa 100 µl Flüssigkeit
verbleibt (Sulfatase mit einer Molmasse über 5 000 wird nicht entfernt). 2,5 ml Wasser sind hinzufügen und
erneut durch Filtration zu konzentrieren, bis etwa 0,1 ml Flüssigkeit verbleibt. Mit Wasser ist auf 2,5 ml zu
verdünnen und bei 18 °C aufzubewahren, wenn die Aktivität nicht am selben Tag überprüft wird. Es wird
empfohlen, die Sulfatase-Lösung in mehreren Chargen zu konditionieren, um ein wiederholtes Einfrieren
und Auftauen zu vermeiden, da empfohlen wird, die unbenutzte Lösung bei 18 °C aufzubewahren.

3 Das Tauchfilter Millipore PLGC 11K25 oder die Filtrationseinheit Millipore Ultra free-CL sind Beispiele für geeignete
handelsübliche Produkte. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet
keine Anerkennung der genannten Produkte durch ISO.

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C.4.2 Reinigung nach Verfahren B

75 mg Sulfatase Helix pomatia Typ H1 (C.3.1) sind auf 1 mg in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen (C.3.7)
einzuwägen. Sie wird in 3 ml Wasser und 2 ml Ethanol unter Mischen mit einem Vortex-Mischer für 3 min
gelöst. Es erfolgt eine Zentrifugation für 1 min bei 5 000 min 1 und der Niederschlag wird verworfen. Zum
Überstand werden 8 ml Ethanol hinzugefügt und alles wird 3 min mit dem Vortex-Mischer gemischt. Nach
dem Dekantieren für 45 min wird für 10 min bei 5 000 min 1 zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen
und der Niederschlag wird in 5 ml Wasser gelöst und bei 18 °C aufbewahrt, wenn die Aktivität nicht am
selben Tag überprüft wird. Es wird empfohlen, die Sulfatase-Lösung in mehreren Chargen zu konditionieren,
um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

C.4.3 Messung der Aktivität der gereinigten Sulfatase

C.4.3.1 In die Referenz- und Messküvette des Spektrometers (C.3.8), dessen Wellenlänge auf 229 nm
eingestellt ist und das eine Küvettentemperatur von 30 °C aufweist, sind mit einer Pipette je 2 ml der
gepufferten Sinigrin-Lösung (C.3.5) zu geben. Zum Zeitpunkt t = 0 sind 50 µl der gereinigten Sulfatase
(siehe C.4.1 oder C.4.2) in die Messküvette zu geben, und es ist unverzüglich der Schreiber einzuschalten. Die
Registrierung durch den Schreiber ist zu beenden, wenn sich die Absorption (Ae) nicht mehr verändert; es ist
die Tangente im Punkt t = 0 anzulegen und ihre Steigung A/ t zu bestimmen.

ANMERKUNG Wenn kein Schreiber zum graphischen Darstellen der Absorption zur Verfügung steht, können die
Daten auf der Anzeige des Spektrometers abgelesen und manuell in einer Kurve eingetragen werden. Der Beginn der
Reaktion wird genau vermerkt, um die Tangente im Punkt t = 0 anzulegen.

C.4.3.2 Die Aktivität der Sulfatase-Lösung stellt die Anzahl von Mikromol von desulfatiertem Sinigrin je
Minute bei 30 °C je Milliliter dieser Lösung dar. Die Aktivität wird nach der vereinfachten Gleichung (C.1)
bestimmt:

×
= (C.1)
×

Dabei ist

a der Zahlenwert der Aktivität, in Aktivitätseinheiten je Milliliter (ua/ml);

✁A/✁t der Zahlenwert der Steigung der Tangente im Punkt t = 0, in Absorptionseinheiten je Minute;
Ae der Zahlenwert der Differenz zwischen der Absorption des desulfatierten Sinigrins im Gleich-
gewichtszustand und der Absorption zum Zeitpunkt t = 0.

C.4.3.3 Die Berechnung der Aktivität darf wie in C.4.3.4 bis C.4.3.5 beschrieben detailliert erfolgen.

C.4.3.4 Nach der Definition der Aktivität, wie in Gleichung (C.2) dargestellt:

× 0 × 0
= = (C.2)
× × 0 ×

Dabei ist

✁◆ die Anzahl der Mole des desulfatierten Sinigrins während ✁t;

v der Zahlenwert des in das Reaktionsmedium eingebrachten Volumens der Sulfatase-Lösung


(d. h. 50 × 10 6 l), in Liter;

106 der Zahlenwert des Faktors zur Umrechnung von Mol in Mikromol;

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103 der Zahlenwert des Faktors zur Umrechnung von Liter in Milliliter;

◆= c V

Dabei ist

V der Zahlenwert des Volumens des Reaktionsmediums (d. h. 2,05 × 10 3), in Liter;

✁c der Zahlenwert der Konzentrationsänderung von Sinigrin während ✁t, in Mol je Liter.

C.4.3.5 Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz, wie in Gleichung (C.3) dargestellt:

= (C.3)
×

Dabei ist

✁A der Zahlenwert der Differenz der Absorption zwischen ✁t zu Beginn der Reaktion;

✁✂ der Zahlenwert der Differenz (im Bereich von 1 500 l mol 1 cm 1) des molaren Extinktions-
koeffizienten von Sinigrin und von Desulfosinigrin bei 229 nm;

1 der Zahlenwert der Schichtdicke, in cm.

✂ darf mit Hilfe von Ae und ce nach Gleichung (C.4) angegeben werden:

= (C.4)
×

Dabei ist

Ae der Zahlenwert der Differenz zwischen der Absorption des desulfatierten Sinigrins im Gleich-
gewichtszustand und der Absorption zum Zeitpunkt t = 0;

ce der Zahlenwert der Konzentration des Desulfosinigrins im Gleichgewichtszustand, in Mol je Liter,


d. h.

4
= × × = × 0

cd der Zahlenwert der Konzentration der ursprünglichen Sinigrin-Lösung (0,15 × 10 3 mol/l);

r der Zahlenwert der Ausbeute bei der Desulfatierung des Sinigrins im Gleichgewichtszustand (0,95).

Die Ableitung erfolgt von den Ausdrücken ✂, c, ◆ und a:


× e × × e × × e
= = = × 103
e e × e×

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C.4.4 Herstellung gebrauchsfertiger Lösungen

Die gereinigte Sulfatase wird so mit Wasser verdünnt, dass in Abhängigkeit von der in C.4.3 gemessenen
Aktivität eine Lösung erhalten wird, die 0,25 ua/ml enthält.

BEISPIEL Wenn die Messung der Aktivität einer Lösung von gereinigter Sulfatase mit einem Volumen von 1,5 ml
0,75 ua/ml ergibt, wird diese Lösung mit 3 ml Wasser verdünnt, so dass 4,5 ml Lösung mit einer Aktivität von
0,25 ua/ml erhalten werden.

Da der Verdünnungsfaktor nachträglich auf der Grundlage der Ergebnisse der Überprüfung der Desulfatie-
rung (siehe C.4.5) geändert werden kann, wird empfohlen, einen Vorrat an unverdünnter gereinigter
Sulfatase (siehe C.4.1 oder C.4.2) aufzubewahren.

C.4.5 Überprüfung der Aktivität der Sulfatase an Ionenaustauschersäulen

Da Glucosinolate mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten desulfatiert werden, ist es für das Erzielen von
quantitativ genauen Ergebnissen notwendig sicherzustellen, dass die auf den Ionenaustauscher überführten
Glucosinolate am Ende des für die Desulfatierung gewählten Zeitraums (15 h) vollständig desulfatiert sind.

Zu diesem Zweck wird die Kinetik der Desulfatierung unter wahren Betriebsbedingungen auf folgende Weise
untersucht.

Herstellen eines Volumens des Extrakts von etwa 8 ml mittels Durchführung von zum Beispiel
vier Extraktionen nach dem üblichen Verfahren (siehe 9.2), mit Zugabe des internen Standards, einer
Kontrollprobe und durch Sammeln des je Extraktion erzeugten 2-ml-Extrakts.

Überführen von 1 ml Extrakt in jede der sechs Ionenaustauschersäulen und Durchführung der
Desulfatierung nach dem üblichen, in 9.5 beschriebenen Verfahren, jedoch mit entsprechenden
Desulfatierungszeiten von 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h und 32 h (gleichzeitiges Überführen der Extrakte und
der Sulfatase und Elution jeder Säule nach 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h bzw. 32 h). Die sechs Eluate werden
durch HPLC nach dem üblichen, in 9.6 beschriebenen Verfahren analysiert und die Flächen der
Hauptpeaks für die sechs Analysen werden aufgezeichnet.

Anschließend werden die Kurven (Peakfläche von Desulfoglucosinolat) = f (Desulfatierungsdauer) für


die wichtigsten Glucosinolate und den internen Standard erstellt. Die Ebene jeder Kurve entspricht der
vollständigen Desulfatierung der Glucosinolate.

Der Beginn der Ebene des am langsamsten desulfatierten Glucosinolats muss an einem Zeitpunkt wesentlich
unter 15 h (z. B. 8 h) liegen.

Andererseits sollte der Verdünnungsfaktor der gereinigten Sulfatase verringert werden, um die Aktivität der
auf die Säule überführten Sulfatase-Lösung zu erhöhen (eine Erhöhung des auf die Säulen überführten
Volumens an Sulfatase erhöht nicht die Ausbeute der Desulfatierung).

Der Wert der Peakfläche des internen Standards auf dieser Stufe kann als eine Grundlage der Verifizierung
für die tägliche Analyse verwendet werden, da die Bedingungen für das Einbringen des internen Standards
unverändert geblieben sind.

Die Überprüfung der Desulfatierung ist notwendig, wenn die Betriebsbedingungen wesentlich schwanken
(Art der Ionenaustauschersäule, verwendete Konzentration der Sulfatase, Umgebungstemperatur).

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Anhang D
(informativ)

Qualifizierung der Leistungskriterien von HPLC-System und -Säule

D.1 Allgemeines
Dieses Verfahren kann angewendet werden, um die Eignung jeder/s HPLC-Säule oder -Systems zu
bestimmen, die/das zuvor nicht für das vorliegende Dokument genutzt wurde.

D.2 Durchführung
D.2.1 Peakformen von Sinigrin und Glucotropaeolin

Die Standards werden nach den Festlegungen in 5.5 hergestellt. Unter Verwendung der Arbeitslösung des
internen Standards werden höchstens 50 µl auf die HPLC-Säule injiziert. Die Form des (der) Peaks wird
sorgfältig untersucht. Sie sollte symmetrisch sein und keine vorauslaufende Schulter bzw. kein stuhl-
ähnliches Erscheinungsbild aufweisen. Eine vorauslaufende Schulter oder ein stuhlähnliches Erscheinungs-
bild weisen auf ein übermäßiges Injektionsvolumen hin. Es ist sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen
50 µl nicht überschreitet. Wenn eine Injektion mit vollständiger Schleifenfüllung genutzt wurde, könnte das
Problem durch ein übermäßiges Totvolumen an der Stelle, an der die Schleife am Injektor angebracht ist,
verursacht worden sein. Um das Problem zu beheben, ist die Schleife auszutauschen. Auch eine Säule mit
größerem Durchmesser (4,6 mm im Vergleich zu 3 mm) kann das Problem beheben.

D.2.2 Auflösung von internen Standards

Die Peaks für Sinigrin und Glucotropaeolin werden am gleichen Chromatogramm untersucht. Die Reten-
tionszeit für beide interne Standards wird bestimmt. Beide sollten bis zur Basislinie voneinander getrennt
sein. In Bild 1 sind Beispiele für gute Chromatogramme dargestellt.

D.2.3 Kritische Auflösung

Ein Rapssamen-Extrakt ist wie in der Norm beschrieben herzustellen und zu analysieren. Es ist sicherzu-
stellen, dass die Peaks für a) Desulfoglucoiberin (Peak 1) und Desulfoprogoitrin (Peak 2), b) Desulfo-
glucobrassicanapin (Peak 11) und Desulfoglucotropaeolin (Peak 12) sowie c) Desulfogluconasturtiin
(Peak 14) und Desulfo-4-methoxyglucobrassicin (Peak 15) vollständig voneinander abgesetzt sind (siehe
Chromatogramm in Bild 1). Einige HPLC-Säulen sind nicht in der Lage, diese Peaks aufzulösen und sind
somit nicht für dieses Verfahren geeignet. Einige HPLC-Säulen könnten die Elutionsreihenfolge der Peaks
ändern. Diese Säulen können bei diesem Verfahren angewendet werden, vorausgesetzt, die Peaks werden
korrekt identifiziert und sind vollständig voneinander abgesetzt. Eine Ursache von mangelhafter Auflösung
könnte ein unzureichendes Vermischen der Lösemittel A und B im HPLC-System sein, was in Form von zu
breiten Peaks und von Lauf zu Lauf schwankenden Retentionzeiten dieser Peaks ersichtlich ist. Das kann
durch Hinzufügen eines Rührwerks behoben werden.

D.3 Eignung des Systems


D.3.1 Allgemeines

Ein Schritt zur Bestimmung der Eignung des Systems muss durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass
das HPLC-System ordnungsgemäß arbeitet. Vor dem Durchlauf beliebiger Prüflösungen werden die
Wiederholpräzision und das Fehlen von Verschleppung beim HPLC-System nachgewiesen, wie in D.3.2 bis
D.3.3 beschrieben.

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D.3.2 Artefakte des Systems

Die ersten beiden Injektionen am Tag, ein Leerwert-Standard zweimal hintereinander, dürfen zu keinen
Artefakten führen. In beiden Durchläufen vorhandene Artefakte weisen auf Verunreinigungen im System hin
und werden in jedem Durchlauf vorhanden sein. Artefakte, die im ersten Chromatogramm vorhanden sind
und im zweiten fehlen, weisen auf eine Ansammlung von Verunreinigungen im System hin. In diesem Fall
muss die erste Probe bei jeder analytischen Prüfung eine Leerwertlösung sein.

D.3.3 Verschleppung — Präzision des Systems

Fünf Wiederholungsanalysen der internen Standardlösung werden analysiert. Die Konzentration jedes
Analyten wird berechnet und Mittelwert, Standardabweichung und relative Standardabweichung (RSD) der
Ergebnisse werden berechnet. Die RSD für alle Peaks sollte im Idealfall < 0,2 % sein. Ist die RSD > 0,5 %, ist
das System nicht für die Analyse geeignet und die Ursache für das Problem sollte gefunden und muss
behoben werden.

ANMERKUNG Umkehrphasen-HPLC-Säule: alle C8- und C18-Umkehrphasen-(RP-)Säulen, die die Anforderungen der
Leistungskriterien erfüllen, sind geeignet. Allerdings unterscheiden sich viele C8- und C18-RP-Säulen identischer
Teilchengröße nach ihrer Porengröße, Oberfläche, Kohlenstoffgehalt und Reinheit des Siliciumdioxids. Einige Säulen
sind auch mit Endkappen versehen, um den Effekt der nicht reagierten Silanolgruppen zu minimieren. Diese Merkmale
geben den verschiedenen C18- und C8-Säulen unterschiedliche Polaritäts- und hydrophobe Eigenschaften, weshalb
nicht alle C8- und C18-Säulen für diese Analyse geeignet sind und die Wahl der Säule ein kritischer Punkt bezüglich des
Erreichens der gewünschten Auflösung ist.

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Anhang E
(informativ)

Elution im isokratischen Modus

E.1 Interner Standard


Bei der isokratischen Elution an einer Cyanopropyl-Phase als stationäre Phase kann Sinigrin nicht für die
Analyse von Rapssamen verwendet werden, weil es nicht von den anderen Glucosinolaten getrennt wird. Es
muss stattdessen Glucotropaeolin (Kalium-Benzylglucosinolat, M = 447,5 g/mol oder Tetramethyl-
ammonium-Benzylglucosinolat, M = 482,6 g/mol) (5.7) verwendet werden. Das Glucotropaeolin darf in
hydratisierter Form verwendet werden; dann müssen die Molmasse und die Reinheit bekannt sein und bei
der Herstellung der Lösung berücksichtigt werden.

Zur Bestimmung der Konzentration der internen Standardlösung zur Verwendung entsprechend dem
angenommenen Glucosinolatgehalt der Probe siehe Tabelle 1 und zur Bestimmung der Masse von
Glucotropaeolin zur Herstellung von 100 ml wässriger Lösung siehe Tabelle 2.

E.2 Mobile Phasen für die isokratische Elution


E.2.1 Elutionsmittel.

Mischung von Wasser und Acetonitril, filtriert durch ein 0,22-µm-Filter. Der Anteil von Acetonitril hängt von
der HPLC-Säule ab. Er kann zum Beispiel betragen:

bei Lichrospher CN: von 0 % bis 5 % und

bei Nucleosil CN und Hypersil CN: etwa 10 %.

ANMERKUNG Acetonitril kann ohne Nachteil durch Methanol ersetzt werden (mit verdoppeltem Anteil in Wasser).
Die Verwendung von Methanol kann die Selektivität der Trennung im Vergleich zu Acetonitril leicht verändern.

E.2.2 Lösemittel zum Spülen, Acetonitril, HPLC-Qualität, 25%ige (Volumenanteil) Lösung in Wasser.

E.3 Säule für die isokratische Elution


HPLC-Säule mit den Maßen 250 mm × 4 mm oder 250 mm × 4,6 mm, die als stationäre Phase eine
Cyanopropyl-Phase, gebunden an eine Siliciumdioxid-Säulenpackung, mit einer Teilchengröße von weniger
als oder gleich 5 µm enthält.

Die Kennwerte der Selektivität und Retention der gewählten Säule müssen eine Trennung der Desulfo-
glucosinolate ermöglichen, wie in Bild E.1 dargestellt.

Neue Säulen müssen vor der Analyse nach den Anweisungen des Herstellers vorbereitend konditioniert
werden, so dass reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden können. Insbesondere muss die Säule vor dem
ersten Gebrauch mit reinem Ethanol gespült werden, um das zur Lagerung verwendete Lösemittel zu
entfernen, das im Allgemeinen nicht mit Wasser mischbar ist.

Die Trennleistung der Säule sollte regelmäßig überprüft werden, vorzugsweise mit einer Referenzprobe aus
Rapssamen-Desulfoglucosinolaten. Insbesondere darf die Säule vor allem Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin,
ein wichtiges, aber relativ instabiles Desulfoglucosinolat, nicht zersetzen. Die Peaks sollten symmetrisch sein
und keine vorauslaufende Schulter bzw. kein stuhlähnliches Erscheinungsbild aufweisen. Der interne
Standard sollte gut von den anderen Peaks getrennt sein.

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Die Qualifizierung der Leistungskriterien von HPLC-System und -Säule (Peakform und Eignung des Systems)
sollte mit Modifikationen (Sinigrin wird nicht als interner Standard verwendet) nach den in 9.6.2.1
beschriebenen Verfahrensweisen erfolgen.

ANMERKUNG Die folgenden Säulen wurden mit diesem Dokument geprüft und arbeiten einwandfrei: Lichrospher
CN-Säule, 5 m (250 mm × 4,0 mm); Nucleosil CN-Säule, 5 m (250 mm × 4,6 mm) oder Hypersil CN-Säule, 5 m
(250 mm × 4,6 mm)4.

E.4 Chromatographie mit isokratischer Elution (vereinfachtes Verfahren)


E.4.1 Geräteeinstellung und Elutionsmittel

Die Säulentemperatur wird auf 30 °C und die Detektor-Wellenlänge auf 229 nm eingestellt. Die Säule wird
mit dem Elutionsmittel zum Spülen (5.9) bei 1 ml/min gespült. Wenn die Basislinie stabil ist, werden die
Anfangsbedingungen der isokratischen Elution bei 1 ml/min entsprechend der gewählten HPLC-Säule
angenommen und dem System wird während mindestens 15 min eine Gleichgewichtseinstellung ermöglicht.
Wenn die Basislinie stabil ist, ist das Gerät bereit für die Injektion.

ANMERKUNG Wenn ein stabiler Gleichgewichtszustand mit dem Elutionsmittel für die Analyse (5.8) erreicht ist,
kann das Abwasser von der Säule ohne Nachteile in den Kolben mit dem Elutionsmittel zurückgeführt werden.
Andererseits werden die Stabilität der Analysebedingungen (Retentionszeit) und die Lebensdauer der Säule verbessert.
Nach vielen Injektionen kann eine leichte Drift der Basislinie auftreten, die durch die Nullpunkteinstellung des
Detektors einfach korrigiert werden kann.

Nach vielen Injektionen und einer langen Dauer der Durchführung einer isokratischen Elution können eine
merkliche Drift der Basislinie oder Geisterpeaks auftreten. Die Säule muss bis zur Stabilisierung der
Basislinie mit dem Elutionsmittel zum Spülen (5.9) gespült werden. Während dieses Vorgangs darf das
Abwasser von der Säule nicht in den Kolben mit dem Elutionsmittel zurückgeführt werden.

E.4.2 Untersuchung

Es werden höchstens 50 µl der nach 9.5.5 erhaltenen Desulfoglucosinolat-Lösung in den Chromatographen


injiziert. Bei Bedarf wird der Anteil von Acetonitril im Elutionsmittel angepasst, um das geeignete
Elutionsprofil (siehe Bild E.1) und ähnliche Retentionszeiten zu erreichen.

E.4.3 Untersuchung der Chromatogramme

E.4.3.1 Peakidentifizierung

Bei diesem Verfahren werden einige desulfatierte Derivate der Raps-Glucosinolate nicht gut getrennt, aber
die Genauigkeit der quantitativen Bestimmung der Glucosinolate insgesamt wird durch die perfekte
Trennung des Peaks des internen Standards (Nr. 5, Bild E.1) von den benachbarten Peaks (Nr. 4 und Nr. 6)
und durch die perfekte Trennung der Peaks Nr. 6, Nr. 7 und Nr. 8, die sehr unterschiedliche relative
Proportionalitätskoeffizienten haben, unterstellt.

Die Elutionsreihenfolge ist in Bild E.1 dargestellt:

1) Desulfoglucoiberin, Desulfoprogoitrin, Desulfoepiprogoitrin, Desulfoglucoraphanin, Desulfogluco-


napoleiferin und Desulfoglucosinigrin;
2) Desulfoglucoalyssin, Desulfogluconapin;
3) Desulfosinalbin;

4 Diese Produkte sind Beispiele für geeignete handelsübliche Produkte. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der
Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung der genannten Produkte durch ISO.

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4) Desulfoglucobrassicanapin;
5) Desulfoglucotropaeolin;
6) Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin;
7) Desulfogluconasturtiin;
8) Desulfoglucobrassicin;
9) Desulfo-4-methoxyglucobrassicin;
10) Desulfoneoglucobrassicin.

Die Identifizierung der Peaks darf durch Vergleich mit einem sich aus einer Standardprobe ergebenden
Chromatogramm oder durch UV-Detektion bei einer bestimmten Wellenlänge (275 nm für indolische
Desulfoglucosinolate, Nr. 6, Nr. 8, Nr. 9 und Nr. 10) erfolgen.

Legende
1 Desulfoprogoitrin 6 Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin
2 Desulfoglucoalyssin, Desulfogluconapin 7 Desulfogluconasturtiin
3 Desulfosinalbin 8 Desulfoglucobrassicin
4 Desulfoglucobrassicanapin 9 Desulfo-4-methoxyglucobrassicin
5 Desulfoglucotropaeolin 10 Desulfoneoglucobrassicin

Bild E.1 — Beispiel für ein typisches Chromatogramm von Rapssamen unter Anwendung
der isokratischen Elution

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E.4.3.2 Quantitative Bestimmung

Es werden lediglich Peaks berücksichtigt, die Desulfoglucosinolaten entsprechen und wenn die Fläche mehr
als 1 % der Summe aller Peakflächen beträgt.

Es ist sicherzustellen, dass das Gerät zur Integrationsmessung bei schlecht getrennten Peaks und bei Peaks
mit hoher Intensität auf geeignete Weise funktioniert. Falls notwendig, wird die Desulfoglucosinolat-Lösung
(siehe 9.5.5) nach dem Verdünnen mit Wasser erneut injiziert.

E.5 Angabe der Ergebnisse


E.5.1 Berechnung des Gehalts der einzelnen Glucosinolate

Der Gehalt Cg eines jeden Glucosinolats, angegeben in Mikromol je Gramm Trockenmasse des Produkts, ist
nach Gleichung (E.1) zu berechnen:

× × × 100
= (E.1)
× × × 100 )

Dabei ist

Ag der Zahlenwert der Peakfläche, die dem Desulfoglucosinolat entspricht, in Integratoreinheiten;

As der Zahlenwert der Peakfläche, die dem als interner Standard verwendeten Desulfoglucosinolat
entspricht, in Integratoreinheiten;

Kg der Zahlenwert des relativen Proportionalitätsfaktors des Desulfoglucosinolats;

Ks der Zahlenwert des relativen Proportionalitätsfaktors des als interner Standard verwendeten
Desulfoglucosinolats;

m der Zahlenwert der Masse der Einwaage, in Gramm;

n der Zahlenwert der Menge des dem Zentrifugenröhrchen in 9.2 zugesetzten internen Standards, in
Mikromol;

w der Zahlenwert des Feuchtegehalts und des Gehalts an flüchtigen Bestandteilen in der Unter-
suchungsprobe, angegeben als Massenanteil in Prozent.

Falls das Ergebnis auf einen bestimmten Feuchtegehalt und einen Gehalt an flüchtigen Bestandteilen ws
(z. B., ws = 9 %) bezogen werden soll, wird das für die Trockenmasse (siehe oben) erhaltene Ergebnis Cg
multipliziert mit:

100
100

E.5.2 Relative Proportionalitätsfaktoren

Es müssen die in Tabelle E.1 angegebenen relativen Proportionalitätsfaktoren (Ki) angewendet werden.

ANMERKUNG Diese relativen Proportionalitätsfaktoren sind in Versuchen ermittelt und zwischen den
verschiedenen an der Prüfung beteiligten Laboratorien nach Absprache festgelegt worden; ihre spätere Überarbeitung
kann notwendig werden.

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Tabelle E.1 — Anzuwendende relative Proportionalitätsfaktoren (Ki)

Desulfoglucosinolat Ki

1 Desulfoglucoiberin 1,07
2 Desulfoprogoitrin 1,09
3 Desulfoepiprogoitrin 1,09
4 Desulfosinigrin 1,00
5 Desulfoglucoraphanin 1,07
6 Desulfogluconapoleiferin 1,00
7 Desulfosinalbin 0,50
8 Desulfogluconapin und Desulfoglucoalyssin 1,11
9 Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin 0,28
10 Desulfoglucobrassicanapin 1,15
11 Desulfoglucotropaeolin 0,95
12 Desulfoglucobrassicin 0,29
13 Desulfogluconasturtiin 0,95
14 Desulfo-4-methoxyglucobrassicin 0,25
15 Desulfoneoglucobrassicin 0,20
16 Sonstige Desulfoglucosinolate 1,00

E.6 Berechnung des Gesamtgehalts an Glucosinolaten


Der Gesamtgehalt an Glucosinolaten, angegeben in Mikromol je Gramm Trockenmasse des Produkts, ist
gleich der Summe aller einzelnen Glucosinolatgehalte (deren jeweilige Peakfläche größer als 1 % der Summe
aller Peakflächen ist).

E.7 Präzision

E.7.1 Ringversuch

Einzelheiten eines Ringversuchs zur Präzision des Verfahrens sind nachstehend angeführt. Die aus diesem
Ringversuch abgeleiteten Werte sind möglicherweise nicht auf andere Konzentrationsbereiche und Matrices
als die angegebenen anwendbar.

E.7.2 Wiederholpräzision

Die absolute Differenz zwischen zwei unabhängigen einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter
Anwendung desselben Verfahrens an identischen Untersuchungsmaterialien in demselben Laboratorium
von demselben Bearbeiter unter Verwendung derselben Geräte innerhalb eines kurzen Zeitabstandes
erhalten wurde, sollte nicht größer sein als 2 µmol/g für Glucosinolatgehalte unter 20 µmol/g und 4 µmol/g
für Glucosinolatgehalte im Bereich von 20 µmol/g bis 35 µmol/g.

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E.7.3 Vergleichpräzision

Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter Anwendung desselben
Verfahrens an identischen Untersuchungsmaterialien unter Verwendung unterschiedlicher Geräte erhalten
wurde, sollte nicht größer sein als 4 µmol/g für Glucosinolatgehalte unter 20 µmol/g und 8 µmol/g für
Glucosinolatgehalte im Bereich von 20 µmol/g bis 35 µmol/g.

E.8 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht ist Folgendes anzugeben:

alle für die vollständige Identifizierung der Probe erforderlichen Angaben;

das angewendete Probenahmeverfahren, falls bekannt;

das angewendete Untersuchungsverfahren mit Verweisung auf das vorliegende Dokument;

alle Einzelheiten zu Arbeitsschritten, die nicht in diesem Dokument festgelegt sind oder als optional zu
betrachten sind, zusammen mit sämtlichen Vorkommnissen, die das (die) Untersuchungsergebnis(se)
beeinflusst haben können;

das (die) erhaltene(n) Untersuchungsergebnis(se);

wenn die Wiederholpräzision geprüft wurde, das ermittelte Endergebnis.

E.9 Ergebnisse des Ringversuchs für das HPLC-Verfahren mit isokratischer Elution
1988 wurde in Frankreich und Belgien ein Ringversuch [7] durchgeführt, an dem sechs Laboratorien teil-
nahmen, wobei jedes Laboratorium unter Anwendung des isokratischen Elutionsverfahrens drei Bestim-
mungen an jeder Probe A , B und C ausführte. e statistischen Ergebnisse (ausgewertet nach
ISO 5725:1986 [2]) sind in Tabelle E.2 angeführt.

Tabelle E.2 — Statistische Ergebnisse des Ringversuchs 1998 — Isokratische Elution

Rapssamen Rapssamen Rapssamen


Probe
A B C
Anzahl der Laboratorien, die nach Eliminierung von
5 5 4
Ausreißern verblieben sind
Mittlerer Glucosinolatgehalta 11,2 21,3 53,0
Standardabweichung der Wiederholpräzision sra 0,32 0,41 1,4
Variationskoeffizient der Wiederholpräzision CV,r (%) 2,8 1,9 2,6
Wiederholgrenze r (2,83 × sr)a 0,90 1,1 3,9
Standardabweichung der Vergleichpräzision sRa 1,3 1,9 8,5
Variationskoeffizient der Vergleichpräzision CV,R (%) 11 8,7 16
Vergleichgrenze R (2,83 × sR)a 3,6 5,3 23,8
a Angegeben in µmol/g Trockenmasse.

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2014 wurde ein internationaler Ringversuch durchgeführt, an dem sechs Laboratorien teilnahmen, wobei
jedes Laboratorium unter Anwendung des isokratischen Elutionsverfahrens zwei Bestimmungen an jeder
Probe A bis F ausführte. Die statistischen Ergebnisse (ausgewertet nach ISO 5725:1986 [2]) sind in
Tabelle E.3 angeführt.

Tabelle E.3 — Statistische Ergebnisse des Ringversuchs 2014

Probe A B C D E F
Probenart Brassica Brassica Brassica Brassica Brassica Brassica
napus, napus, juncea, juncea, napus napus
Schrot Samen Schrot Samen (Canola), (Canola),
Samen Schrot
Anzahl der teilnehmenden
6 6 5 6 6 6
Laboratorien
Anzahl der Laboratorien, die nach
Eliminierung von Ausreißern 6 6 6 6 6 5
verblieben sind
Mittlerer Glucosinolatgehalta 8,64 14,37 167,75 14,59 9,55 2,39
Standardabweichung der
Wiederholpräzision sra 0,21 0,20 1,12 0,41 0,65 0,13

Variationskoeffizient der
Wiederholpräzision CV,r (%) 2,4 1,4 0,7 2,8 6,8 5,5

Wiederholgrenze r (2,83 × sr)a 0,58 0,57 3,13 1,14 1,82 0,37


Standardabweichung der
Vergleichpräzision sRa 2,37 1,87 20,10 1,89 2,24 1,41

Variationskoeffizient der
Vergleichpräzision CV,R (%) 27,4 13,0 12,0 12,9 23,4 59,1

Vergleichgrenze R (2,83 × sR)a 6,63 5,24 56,28 5,29 6,26 3,96


a Angegeben in µmol/g Trockenmasse.

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DIN EN ISO 9167:2020-03
EN ISO 9167:2019 (D)

Literaturhinweise

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[2] ISO 5725:1986 5, Precision of test methods — Determination of repeatability and reproducibility for a
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