GUIA DE LABORATORIO No.

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO

FERMENTADORES

Objetivos

o Conocer los principales géneros y especies de Bacilos gramnegativos no fermentadores

o Determinar las pruebas bioquímicas utilizadas en la identificación de bacilos gramnegativos no
fermentadores
o Utilizar y tener en cuenta los fundamentos de las pruebas específicas para determinar especie.

Introducción

Los bacilos gramnegativos no fermentadores (BGNNF) son un grupo de microorganismos aerobios

estrictos, no esporulados, que no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía o los
degradan a través de vías metabólicas diferentes a la fermentación. Se encuentran ampliamente
distribuidos en la naturaleza: suelo, agua, mucosas y tracto digestivo del hombre y animales.

En el grupo de los BGNNF existen diversas especies de importancia clínica, pertenecientes a los
géneros, Acinetobacter spp, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia spp, Chryseobacterium
spp y Pseudomonas spp, que es el género principal de este grupo.

Actualmente la clasificación para los miembros del género Pseudomonas spp, está basada en la
homología de secuencias de ARN, donde el género Pseudomonas spp se ubica taxonómicamente
en el reino Procariota, orden Pseudomonadales, familia Pseudomonadaceae constituido por las
varias especies, algunas de estas son: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P.
veronii, P. monteilii, P. mallei, P. pseudomallei, P. cepacia, P. diminuta, P. alcaligenes.

Las Pseudomonas son bacilos gramnegativos rectos o ligeramente curvos, oxidasa positivo. No
fermentan carbohidratos, más bien catabolizan este mediante oxidación. Producen pigmentos
difusibles como las piocianinas. Crecen en Agar Sangre, McConkey en aerobiosis con rapidez y
producen colonias planas de borde progresivo y olor dulzón.

P. aeruginosa spp es la especie patógena aislada con mayor frecuencia en muestras humanas. Es
un bacilo aeróbico obligado que mide aproximadamente de 0,5 a 1 µm de ancho por 3 a 4 µm de
largo, posee un solo flagelo, pero en forma ocasional algunos pueden tener dos o tres. Producen
dos pigmentos de importancia clínica: piocianina, que puede colorear de azul verdoso el pus de
una herida, y pioverdina (fluoresceína), pigmento amarillo verdoso que fluoresce bajo la luz
ultravioleta. A diferencia de otras especies de Pseudomonas spp, P. aeruginosa crece a 42ºC en
24 horas y produce fluorescencia en Medio King A y King B (actualmente remplazado por el agar
Cetrimide), (medio selectivo utilizado para el aislamiento de P. aeruginosa) en el que las colonias
típicas son pequeñas, generalmente de color verdoso y con fluorescencia verdosa a la luz
ultravioleta. Esta especie puede infectar heridas, vías urinarias, quemaduras y el tracto respiratorio
inferior, especialmente en individuos inmunosuprimidos, es considerada además un patógeno
oportunista, causante principal de mortalidad en pacientes con fibrosis quística, enfermedades
neoplásicas y quemaduras severas. En los ambientes hospitalarios tiene la capacidad de sobrevivir
y multiplicarse en medios húmedos, con el mínimo de materia orgánica, condiciones favorables
para convertirse en un gran patógeno nosocomial.
Las especies P. fluorescens y P. putida son recuperadas con menor frecuencia en muestras
humanas. P. fluorescens crece a 37ºC en 24 horas y produce fluorescencia en Medio King B. Sin
embargo, P. fluorescens es considerado igualmente como típico oportunista para el hombre,
asociado a septicemia ocasionada por diversas causas, como heridas, transfusiones sanguíneas,
infección post-operatoria y enfermedades inflamatorias de la pelvis. Por su parte, P. putida ha sido
asociada igualmente a septicemias, transfusiones de sangre, además de bacteriuria y bacteriemia
asociada con contaminación intravascular.

Las especies de Acinetobacter spp son bacilos o cocobacilos gramnegativos. No fermentan la

glucosa y son aerobios estrictos, inmóviles, catalasa positivos y oxidasa negativos. Crecen bien en
todos los medios de cultivo de rutina, Agar Sangre, McConkey entre otros, siendo su temperatura
óptima de crecimiento de 33 a 35º C, además de ser muy resistentes a antibióticos en especial a la
penicilina y cloranfenicol.

Entre la clasificación de Acinetobacter spp encontramos: A. calcoaceticus, A. junnii, A.johnsonii, A.

lwoffii, A. haemolyticus, A. baumannii, siendo esta ultima la mas prevalente en muestras clínicas, y
es la bacteria mas frecuentemente responsable de las infecciones adquiridas en el hospital. Ha
sido implicada en una variedad de infecciones nosocomiales, que incluyen bacteremia, infecciones
del tracto urinario y meningitis secundaria, pero su papel fundamental es el agente de neumonías
nosocomiales

Estas bacterias son las responsables de causar una serie de infecciones a los humanos incluidas
las neumonías, (relacionadas con mayor frecuencia en tubos endotraqueales) endocarditis,
meningitis, infecciones de piel y heridas, peritonitis (en pacientes sometidos a diálisis peritoneal), e
infecciones del tracto urinario.

Antiguamente clasificada dentro de los géneros Pseudomonas (1961) y Xanthomonas (1983), en

1993, Palleroni y Bradbury proponen el nuevo género Stenotrophomonas constituido por dos
especies: S. maltophilia y S. africana recientemente aislada de LCR de un paciente infectado por
VIH con meningoencefalitis. S. maltophilia es un bacilo gramnegativo pequeño, fino, con flagelo
polar multítrico, aerobia, poco exigente, que se desarrolla en forma rápida en los medios de cultivo
utilizados de rutina. Las colonias son rugosas de 3 a 5 mm de diámetro, color amarillo en
MacConkey y café verdoso en agar sangre, generalmente no hemolítica y de olor característico a
amoníaco. Prueba de oxidasa negativa y ADNasa positiva (debe incubarse hasta 72 horas para
evitar los falsos negativos). Otras pruebas adicionales incluyen la oxidación de la glucosa y maltosa
en medio OF, decarboxilación de la lisina, licuefacción de la gelatina y producción de H 2S.

Siendo un microorganismo de baja patogenicidad, cuyo hábitat natural es el ambiente acuático, su

importancia radica en la patología nosocomial, debido fundamentalmente a su alta resistencia a los
antimicrobianos, lo que favorece su selección. Los aislados clínicos representan la mayoría de las
veces colonización; sin embargo, se describen cuadros graves, tales como neumonía en pacientes
de UCI con ventilación mecánica y bacteriemias asociadas a catéter venoso central. También
puede producir en forma inhabitual meningitis, endocarditis, endoftalmitis y un amplio rango de
infecciones cutáneas como celulitis y ectima gangrenoso. Se considera un patógeno emergente en
pacientes con factores de riesgo como: uso prolongado de diversos antimicrobianos, neutropenia,
edad avanzada y procedimientos invasores en pacientes de UCI.

MATERIALES:

 Asa de argolla y recta

 Colorantes (coloración de Gram)
 Cultivos bacterianos de Pseudomonas, Acinetobacter y Stenotrophomonas.
 Agar: McConkey, Sangre, Cetrimide.
 Medios para identificación bioquímica.
 Agar Mueller hinton
 Trimetroprim sulfa
Esquema de identificación Pseudomonas spp.

Agar McConkey
Colonias redondas, incoloras por no fermentación de la lactosa

GRAM: Bacilos Gram

negativos

Oxidasa
Positivo Negativo

Acinetobacter spp
Catalasa +
Stenotrophomonas
Bioquímicas 37ºC – 24h
maltophilia
CITRATO (+)
Pseudomonas spp MOVILIDAD (+)
NITRATOS (+)
HIDRÓLISIS DE GELATINA (+)
OF GLUCOSA (+)
LIA (K/K)
TSI (K/K)

Crecimiento a 42ºC

Nitrito a Gas

Fluorescencia en agar Cetrimide

+ -

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens

 Esquema de identificación Acinetobacter spp.

MUESTRAS BIOLÓGICAS (SECRECIONES

REPIRATORIAS ESPECTORADAS-ESPUTO)

FROTIS DIRECTO COLORACION DE IDENTIFICACION DE BACILO O COCOBACILO

GRAM MORFOLOGÍA GRAM NEGATIVO

CRECIMIENTO DE CULTIVO EN AGAR

103 UFC/ mL 24-48 HORAS 33-35 ºC McCONKEY

GLUCOSA
NO FERMENTAN

MOVILIDAD
PRUEBAS NEGATIVA MICROROGANISMO
BIOQUIMICAS AEROBIO ESTRICTO

CATALASA
POSITIVA
FUENTE: López Fernández FJ.
OXIDASA Acinetobacter spp
Guía de Higiene y Prevención de la Infección Hospitalaria. Ed. NEGATIVA
Diaz de Santos SA. Madrid 1998

Principales características diferenciales del género Pseudomonas spp y

Stenotrophomonas maltophilia.

Especie Nitrat Pigm

Nitrit Hidrólisi Crecimient
oa Crecimient Maltos Oxidas DNAs Amari
oa s de La o en NaCl a
Nitrito o a 42ºC a a l
Gas Gelatina 6.5%
Pseudomonas + + + V - V + V -
aeruginosa
Pseudomonas V - - + - - + - -
fluorescens
Pseudomonas - - - - V V + - -
putida
Pseudomonas + + V - + + + - -
stutzeri
Stenotrophomon V - V + V + - + +
as maltophilia
Principales características diferenciales del género Acinetobacter spp.

Especie Hidrólisis Oxidació Beta Crecimiento Malonato Citrato

De La n de la Hemólisis a 42ºC
Gelatina Glucosa
Acinetobacter - + - + + +
baumannii
Acinetobacter - + - V + +
calcoaceticus
Acinetobacter + V + - - +
haemolyticus
Acinetobacter - - V V - V
junii
Acinetobacter - - - - V V
johnsonii
Acinetobacter - - - V - V
iwoffii

PROCEDIMIENTO:

A partir del cultivo asignado, realizar la descripción macroscópica de las colonias y una coloración
de Gram. Posteriormente, llevar a cabo los procedimientos necesarios para la identificación de la
cepa bacteriana.

ACTIVIDADES:

PRELABORATORIO
1. Cuáles son los fundamentos y como se realiza cada una de las siguientes pruebas: hidrólisis de
la gelatina y crecimiento en agar Cetrimide. Plantee dos ejemplos de resultados negativos y
positivos para cada una de las pruebas
2. Que antibióticos no se deben utilizan para Pseudomona aeruginosa en un estudio de
sensibilidad para un urocultivo por la técnica de difusión en disco.
3. Que mecanismos de resistencia son comunes en Pseudomona aeruginosa Acinetobacter
baumanii.

BIBLIOGRAFIA

1. Sánchez, M.P y Guzmán, M. Manual de procedimientos en Bacteriología clínica. Quinta edición. Bogota,
1998.
2. MacFaddin, Jean F; Rondinone, S y Giovaniella, O.A. Pruebas bioquímicas para la identificación de
Bacterias de importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana. Bogotá. 2003.
3. Koneman, W.E, Allen, D.S; Janda, M.W, Diagnostico Microbiologico. Editorial Panamericana. Bogotá,
Caracas, Buenos Aires. 2003