áèîõèìèß

Биохимия

УДК 616.432-008.931-02
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРИ СТРЕССЕ
А. Н. ВЕРНИГОРА
Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского
Кафедра химии и теории и методики обучения химии
Обнаружено, что глюкокортикоиды, гидроксибутират натрия, верапамил, каптоприл и гуанидиноэтилмеркапто-
янтарная кислота предотвращают повышение активности карбоксипептидаз ��H���
��
и ��
N �������������������������
и ангиотензинпревращающе-
го фермента, вызванное внутрибрюшинной инъекцией физиологического раствора. Обсуждается роль ферментов
обмена нейропептидов в антистрессовом действии вышеуказанных препаратов, а также механизм влияния этих
веществ на активность исследуемых ферментов.
Важная роль в развитии стрессорных реакций при- МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
надлежит стресс-пептидам. Нейропептиды синтезиру- Исследование выполнено на самцах белых беспо-
ются в виде высокомолекулярных предшественников, родных крыс весом 150–180 г. В качестве контрольной
которые активируются при ограниченном расщепле- группы использовали интактных животных (n = 12).
нии протеолитическими ферментами [19]. В конечной Стресс вызывали внутрибрюшинной инъекцией 0,9 %
стадии процессинга участвует карбоксипептидаза H раствора NaCl в дозе 2 мл на кг веса (n = 10–12 для
(КПH, КФ 3.4.17.10) – экзопептидаза секреторных каждого временного интервала). Фармакологические
везикул, отщепляющая остатки аргинина и лизина с препараты вводили внутрибрюшинно в эквивалент-
C-конца пропептидов [1, 5]. В результате её действия ном количестве физраствора в следующих дозах: гид-
образуются зрелые секретируемые формы нейропеп- рокортизон – 100 мг на кг веса (n = 5–6 для каждой
тидов, в частности адренокортикотропин, β-эндорфин, временной группы), дексаметазон – 1 мг на кг веса
пролактин и др. [5]. То есть, КПH контролирует уро- (n = 5–6), гидроксибутират натрия – 100 мг на кг веса
вень активных форм этих пептидов. (n = 5), верапамил – 25 мг на кг веса (n = 5), ГЭМЯК –
Модификация и инактивация нейропептидов 1 мкмоль на кг веса (n = 9–10), каптоприл – 100 мкмоль
осуществляется также путём протеолитического рас- на кг веса (n = 9–10). Животных декапитировали через
щепления [19]. Одним из ферментов, расщепляющих 0,5, 4 и 24 ч после введения. Выделяли гипофиз и со-
вышеуказанные пептиды является ангиотензинпре- бирали кровь. Сыворотку получали стандартным спо-
вращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1) [10]. В об- собом.
мене нейропептидов участвует и карбоксипептидаза N Активность КП����������������������������
H���������������������������
определяли по образованию
(КП���������������������
N��������������������
, КФ 3.4.17.3) [18]. дансил-Phe-Leu из дансил-Phe-Leu-Arg при pH 5,6
Показано, что АПФ, КП����������������������
H���������������������
и КП����������������
N���������������
вовлекаются в флюориметрически [7]. Активность КПN определя-
развитие стрессорных реакций [2]. Известно, что внут- ли по высвобождению аргинина из гиппурил-Arg при
pH 7,6 нингидриновым методом [4]. Активность АПФ
рибрюшинное введение физиологического раствора
определяли по образованию Gly-Arg из карбобензок-
является стрессирующим фактором для крыс [16] и,
си-Gly-Gly-Arg как ингибируемую каптоприлом при
как и другие виды стресса, вызывает повышение ак-
pH 7,6 по нингидриновой реакции [4]. Концентрацию
тивности вышеуказанных ферментов [3].
белка определяли методом Лоури [15]. Активность
Целью данной работы было исследование вли-
ферментов выражали в нмоль продукта, образовавше-
яния гидрокортизона, дексаметазона, верапамила, гося за 1 мин, на 1 мг белка.
гидроксибутирата натрия, каптоприла – высокоспе- Достоверность отличия между средними значения-
цифичного ингибитора АПФ, и гуанидиноэтилмер- ми показателей оценивали по t-критерию Стьюдента.
каптоянтарной кислоты (ГЭМЯК) – высокоспеци-
фичного ингибитора КП��������������������������
H�������������������������
и КПN, на активность ан- РЕЗУЛЬТАТЫ
гиотензинпревращающего фермента, карбоксипепти- Внутрибрюшинная инъекция физиологическо-
даз H и N при стрессе, вызванном внутрибрюшинной го раствора вызывала повышение активности КП���� H���
и
инъекцией физраствора. Активность КП��������H�������
и АПФ АПФ через 0,5, 4 и 24 ч, КПN через 4 и 24 ч после вве-
исследовали в гипофизе – отделе, синтезирующем дения (рис.).
стресс-пептиды и отличающемся очень высокой по Введение гидрокортизона приводило к снижению
сравнению с остальными отделами мозга активнос- по сравнению с введением физраствора активности
тью этих ферментов [1, 5, 10], КПN – в сыворотке КПH через 4 и 24 ч, АПФ – через 0,5 ч, КПN – через
крови – единственном месте локализации карбокси- 4 и 24 ч после инъекции. Таким образом, введение гид-
пептидазы N в организме [18]. рокортизона снижало повышение активности КП���� H���
и

55
 ÈÇÂÅÑÒÈß ÏÃÏÓ Åñòåñòâåííûå íàóêè ¹ 5 (9) 2007 ã.

56

КП������������������������������������������������
N�����������������������������������������������
, вызванное стрессом введения, причём в случае
КПH активность была ниже, чем у контрольных жи-
вотных.
При введении дексаметазона активность КПH
была ниже активности у стрессированных животных
в случае всех исследованных промежутков времени,
АПФ через 0,5 ч, а КПN через 4 и 24 ч после введе-
ния была ниже, чем при стрессе. При этом активность
КПH снижалась ниже уровня контроля, АПФ остава-
лась повышенной, а КП������������������������������
N�����������������������������
не отличалась от активности
у контрольной группы животных.
В случае воздействия гидроксибутирата натрия
активность КПH была ниже, чем при введении физрас-
твора и ниже контроля; АПФ – ниже, чем при стрессе,
но через 0,5 и 4 ч не отличалась от контроля, а через
24 ч была повышенной по сравнению с контролем.
Активность КПN через 4 ч после введения была выше
контроля и не отличалась от активности при стрессе,
через 24 ч – промежуточной между активностью у кон-
трольной и стрессированной групп.
При введении верапамила активность КПH была
ниже, чем при инъекции физраствора. В случае всех
исследованных интервалов времени она не отлича-
лась от активности у контрольных крыс. Активность
АПФ через 0,5 и 24 ч была ниже активности у стрес-
сированных животных и не отличалась от активности
Влияние фармакологических препаратов на активность ферментов обмена нейропептидов in vitro
(в % к контролю (100%), концентрации препаратов равны дозам, вводимым in vivo)
Препарат КПН
Контроль
Гидрокортизон
Дексаметазон
Гидроксибутират натрия
Верапамил
ГЭМЯК
Каптоприл
При введении каптоприла наблюдалось сни-
жение активности КПH через 4 ч после инъекции,
через 0,5 и 24 ч после введения каптоприл на актив-
ность фермента не влиял. Активность АПФ в случае
введения каптоприла была существенно ниже, чем
при инъекции физраствора, и через 0,5 и 4 ч ниже,
чем у контрольной группы. Активность КПN через
4 и 24 ч после воздействия была промежуточной меж-
ду активностью у стрессированных и интактных жи-
вотных. Таким образом, высокоспецифичный ингиби-
тор АПФ при введении in vivo подавлял не только его
активность, но и активность КПH и КПN, на которые
in vitro не влиял (табл.).
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, все исследованные фармакологи-
ческие препараты, вне зависимости от механизма их
действия, в той или иной мере предотвращают повы-
áèîõèìèß
у контрольной группы, через 4 ч – выше контроля и
не отличалась от активности при стрессе. Активность
КПN через 4 и 24 ч после введения верапамила была
промежуточной между активностью у контрольной и
стрессированной групп.
В случае введения ГЭМЯК активность КПH через
0,5 и 4 ч была ниже, чем при введении физраствора, че-
рез 24 ч не отличалась от неё. Через все исследованные
промежутки времени активность фермента не отли-
чалась от активности у контрольных животных. Ак-
тивность АПФ была ниже активности при инъекции
физиологического раствора и во всех случаях, кроме
4 ч после введения, ниже активности у контрольных
животных. Активность КПN через 0,5 ч после введения
была выше, чем при инъекции физраствора и у интак-
тных животных, через 4 ч не отличалась от активности
у стрессированных и была выше активности у конт-
рольных крыс, через 24 ч была промежуточной между
активностью у этих групп животных. Таким образом,
высокоспецифичный ингибитор КПH ГЭМЯК, не вли-
яющий на активность АПФ in vitro (табл.), in vivo по-
давлял активность не только КПH, но и АПФ. ГЭМЯК,
которая in vitro ингибирует и КПN, хотя и в значитель-
но меньшей степени, чем КПH (табл.), через короткий
промежуток времени после введения повышала актив-
ность КПN, а при более длительных – подавляла.
Таблица.
КПN АПФ
100 100 100
94 103 90
84 110 91
90 111 88
96 113 113
0 41 102
99 106 0
шение активности КПH, КПN и АПФ, вызванное инъ-
екцией физраствора. Однако, динамика влияния этих
веществ зависит как от используемого препарата, так и
от исследуемого фермента. Внутрибрюшинная инъек-
ция физиологического раствора является стрессирую-
щим фактором для крыс [16] и, как и многие другие
виды стресса, приводит к возрастанию активности ис-
следуемых ферментов [3]. Дексаметазон и гидрокорти-
зон подавляют секрецию стресс-пептидов по механиз-
му обратной связи [17]. Таким образом, одним из воз-
можных механизмов воздействия глюкокортикоидов
на уровень стресс-пептидов является снижение актив-
ности КПH – фермента, участвующего в образовании
активных форм этих пептидов [5]. Вместе с тем, при
уменьшении секреции стресс-пептидов предотвраща-
ется повышение их уровня и, следовательно, исчезает
необходимость в повышении активности АПФ и КПN,
которые участвуют в их деградации.
57
 ÈÇÂÅÑÒÈß ÏÃÏÓ Åñòåñòâåííûå íàóêè
Гидроксибутират натрия и верапамил обладают
антистрессорным действием и вызывают снижение
активности исследуемых ферментов по сравнению с
крысами, подвергнувшихся воздействию только физ-
раствора. То есть, одним из возможных механизмов
антистрессорного действия этих веществ является их
влияние на активность ферментов обмена стресс-пеп-
тидов.
Ингибиторы АПФ – каптоприл и карбокси-
пептидазы H – ГЭМЯК также, в основном, вызыва-
ют снижение активности исследуемых ферментов
(исключая КПN через 0,5 ч после введения). Известно,
что ингибиторы АПФ подавляют синтез и секрецию
адренокортикотропина [21]. Поэтому представляет-
ся интересным изучение антистрессорного действия
ингибиторов ферментов обмена стресс-пептидов с це-
лью получения направленных средств воздействия на
стресс-систему.
Необходимо отметить, что в ряде случаев, особен-
но при использовании ингибиторов, активность фер-
ментов снижалась значительно ниже уровня нормы.
То есть, данные вещества не являются специфичными
стресс-протективными препаратами, нормализирую-
щими функционирование системы стресс-пептидов,
а просто подавляют выработку стресс-пептидов, как,
возможно, и других нейропептидов, путём ингибиро-
вания ферментов их обмена, обеспечивая таким спо-
собом антистрессовое действие. Следовательно, адап-
тогенное действие этих препаратов представляется
весьма проблематичным.
Вызывает интерес вопрос о механизмах влияния
исследуемых фармакологических препаратов на ак-
тивность изучаемых ферментов. Не вызывает сом-
нения, что влияние гидрокортизона, дексаметазона,
гидроксибутирата натрия и верапамила на активность
всех исследованных ферментов, ГЭМЯК на актив-
ность АПФ и каптоприла на активность КПH и КПN
не связано с прямым влиянием указанных веществ на
ферменты, так как in vitro они не влияют на их актив-
ность (табл.).
Известно, что глюкокортикоиды регулируют ак-
тивность многих ферментов путём изменения экс-
прессии их генов. Однако, исследования на культуре
AtT20 клеток показали, что глюкокортикоиды, изме-
няя уровень мРНК проопиомеланокортина, не влия-
ют на уровень мРНК КПH [20]. Более того, участков
связывания стероидных гормонов в структуре гена
КПH не обнаружено [12]. Вопрос о возможности вли-
яния глюкокортикоидов на уровень экспрессии КПN и
АПФ остаётся пока открытым.
Что касается влияния каптоприла на активность
АПФ и ГЭМЯК на активность КПH, то здесь оно осу-
ществляется путём прямого ингибирования активнос-
ти ферментов. Однако, при действии каптоприла на
активность КПH и КПN, а также ГЭМЯК на актив-
ность АПФ прямое ингибирование исключено. Извес-
тно, что и КПH и АПФ ингибируются многими биоло-
гически активными пептидами, в обмене которых они
и участвуют [9, 13]. Поэтому изменение концентрации
нейропептидов в результате ингибирования КПH при
58
¹ 5 (9) 2007 ã.
введении ГЭМЯК может приводить к изменению ак-
тивности АПФ и наоборот. Однако, если АПФ, яв-
ляющийся мембраносвязанным эктопротеином [10],
доступен для действия веществ пептидной природы,
то КПH локализована внутри секреторных везикул
[1, 5], и не доступна для действия пептидов, находя-
щихся вне везикул. Вместе с тем, многие нейропеп-
тиды влияют на экспрессию генов, в том числе генов
АПФ [8] и КПH [6, 14]. Таким образом, изменение
уровня нейропептидов вследствие ингибирования ак-
тивности одного из ферментов его специфичным ин-
гибитором может приводить к изменению активности
и другого фермента, посредством влияния этих нейро-
пептидов на уровень экспрессии мРНК фермента. Бо-
лее того, вследствие эффекта обратной связи, по этому
механизму может изменяться и активность фермента,
подавляемого специфичным ингибитором. Этим, ве-
роятно, объясняется длительный и фазный характер
влияния данных ингибиторов, несмотря на то. Сход-
ным образом на активность данных ферментов могут
влиять и другие исследуемые вещества, в особеннос-
ти глюкокортикоиды, которые, влияют на уровень не
только стресс-пептидов, но и многих других нейро-
пептидов, в частности энкефалинов [11]. Последние
вовлекаются в регуляцию уровня стресс-пептидов
[17]. Таким образом, представляется вероятным, что
влияние исследуемых фармакологических препара-
тов на активность ферментов обмена стресс-пептидов
опосредуется различными нейромедиаторными, в том
числе и пептидергическими системами.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вернигора А. Н., Генгин М. Т. Механизмы регуляции
активности и биологическая роль карбоксипептида-
зы H – фермента процессинга нейропептидов // Био-
химия. 1995. Т. 60. № 12. С. 1953–1963.
2. Вернигора А. Н., Генгин М. Т., Никишин Н. Н. Об учас-
тии некоторых ферментов обмена нейропептидов в ме-
ханизмах эмоционального стресса // Физиол. ж. 1995.
Т. 81. № 5. С. 103–112.
3. Вернигора А. Н., Никишин Н. Н., Генгин М. Т. Влия-
ние внутрибрюшинного введения физиологического
раствора на поведение крыс в тесте «открытое поле» и
активность ферментов, участвующих в обмене нейро-
пептидов // Физиол. ж. 1995. Т. 81. № 12. С. 121–125.
4. ����������
Генгин М.� �����������������������������������������
�����������������������������������������
Т., Вернигора А.�������������������������
 ������������������������
Н., Никишин Н.����������
 ���������
Н., Щети-
нина Н.�������������������������������������������
 ������������������������������������������
В. Активность карбоксипептидазы N и ангио-
тензинпревращающего фермента в сыворотке крови
крыс в норме и при эмоциональном стрессе // Укр.
биохим. журн. 1994.
������ ����������������������
�����������������������
. 66. № 2. С����������
�����������
. 116–119.
5. Fricker L. D. Peptide processing exopeptidases: amino- and
carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis //
Peptide biosynthesis and processing (Fricker L. D. ed.).
Florida: CRC Press, Boca Raton, 1991. P. 199–230.
6. Fricker L. D., Rigual R. J., Diliberto E. J. Jr., Viveros O. H.
Reflex splanchnic nerve stimulation increases levels of
carboxypeptidase E mRNA and enzymatic activity in the
rat adrenal medulla // J. Neurochem. 1990. Vol. 55. ����� №����
2.
P. 461–467.
7. Fricker L. D., Supattapone S., Snyder S. H. Enkephalin
convertase: a specific enkephalin synthesizing carboxy-

peptidase in adrenal chromaffin granules, brain and
pituitary gland // Life Sci. 1982. Vol. 31. P. 1841–1844.
8. Goraya T. Y., Kessler S. P., Kumar R. S., Douglas J.,
Sen G. C. Identification of positive and negative transcrip-
tional regulatory elements of the rabbit angiotensin-con-
verting enzyme gene // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22.
№����
7. �������������
P. 1194–1201.
9. Hook V. Y. H., LaGamma E. F. Product inhibition of car-
boxypeptidase H // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. ������
№�����
26.
P. 12583–12588.
10. Hooper N. M. Angiotensin converting enzyme: implica-
tions from molecular biology for its physiological func-
tions // Int. J. Biochem. 1991. Vol. 23. №������
�������
7/8. P.
�����������
641–647.
11. Inturrisi C., Franklin S., Shapiro J., Calvano S., Yoburn B.
Adrenal enkephalin biosynthesis regulated by glucocorti-
coid // NIDA Res. Monogr. 1988. Vol. 81. P. 129–135.
12. Jung Y. K., Kunczt C. J., Pearson R. K., Dixon J. E., Frick-
er L. D. Structural characterization of the rat carboxy-
peptidase E gene. // Mol. Endocrinol. 1991. Vol. 5. №����
�����
9.
P. 1257–1268.
13. Kariya K., Okamoto H., Kaktmoto M., Tsuda Y., Okada Y.
Inhibition of angiotensin converting enzyme of rat brain
with the bradykinin and its fragments // Biochim. Biophys.
Res. Commun. 1981. Vol. 100. P. 31–35.
14. Laslop A., Tschernitz C. Effects of nerve growth factor on
the biosynthesis of chromogranin A and B, secretogranin
II and carboxypeptidase H in rat PC12 cells // Neurosci.
1992. Vol. 49. №����
�����
2. �����������
P. 443–450.
áèîõèìèß
15. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J.
Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol.
Chem. 1951. Vol. 193. №����
�����
 1. P.
�����������
265–275.
16. Rosen A., Brodin K., Eneroth P., Brodin E. Short-term
restraint stress and sc saline injection alter the tissue-levels
of substance P and cholecystokinin in the peri-aqueductal
gray and limbic regions of rat brain // Acta Physiol. Scand.
1992. Vol. 146. №����
�����
3. P.
�����������
341–348.
17. Shipston M. J. Mechanisms(s) of early glucocorticoid
inhibition of adrenocorticotropin secretion from anterior-
pituitary corticotropes // Trends Endocrin. Met. 1995.
Vol. 6. № 8. P. 261–266.
18. Skidgel R. A. Human carboxypeptidase N: lysine
carboxypeptidase // Methods Enzymol. 1995. Vol. 248.
P. 653–663.
19. Steiner D. F. The biosynthesis of biologically active
peptides: a perspective // Peptide Biosynthesis and
Processing (Fricker L. D., ed.). Florida: CRC Press, Boca
Raton, 1991. P. 1–16.
20. Thiele E. A., Eipper B. A. Effect of secretagogues on
components of the secretory system in AtT-20 cells //
Endocrinology. 1990. Vol. 126. № 2. P. 809–817.
21. Zacharieva S., Matrozov P., Stoeva I., Andonova K.
The effect of angiotensin-converting enzyme inhibition
on ACTH response to corticotropin-releasing hormone
(CRH) in normal men // Horm. Metab. Res. 1991. Vol. 23.
№ 5. P. 245–246.
59