INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA

INOCUIDAD ALIMENTARIA

PRÁCTICA 5

ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES Y FECALES

1. OBJETIVOS

a) El alumno conocerá la normatividad e importancia de la determinación

de organismos coliformes totales y fecales

b) El alumno aplicará la metodología para la determinación de organismos

coliformes totales y fecales

c) El alumno determinará organismos coliformes totales y fecales en

muestras de alimentos y aguas.

d) El alumno aplicará las tablas del NMP para reportar los resultados de la
determinación de organismos coliformes.

2. INTRODUCCIÓN

Los organismos coliformes se definen como bacilos Gram negativos, aerobios o

anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas dentro de 48 h de incubación a 35°C.

Este definición pretende involucrar bacterias de hábitat típicamente intestinal

(Escherichia coli), si bien existen microorganismos que satisfacen la definición y
que frecuentemente se localizan en ambientes extraintestinales (Enterobacter
aerogenes). De hecho, el grupo no se configura a base de géneros microbianos,
sino de cepas que en el desarrollo de la prueba cumplen con la definición.
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Más aún, algunas cepas de Salmonella, por ejemplo, se comportan como

coniformes por el hecho de fermentar la lactosa, en tanto que cepas de E. coli
lentas fermentadoras de la lactosa (patógenas), quedan fuera de la definición.

Las bacterias más prominentes del grupo pertenecen a géneros de las familias
Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa: Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter y Klebsiella.

La E. coli es el típico coliforme en el sentido de que se trata de una bacteria cuyo

hábitat natural es el contenido intestinal de los animales de sangre caliente. Por
tal razón, su hallazgo en un alimento o en el agua es más significativo desde un
punto de vista sanitario, que el de cualquier otro coliforme.

En la materia fecal los coliformes alcanzan cifras de 10 6 a 109 UFC/g. Debido a

su capacidad de sobrevivencia y gran potencial para desarrollar en la materia
orgánica, pueden recuperarse de una diversidad de substratos extraintestinales:
piel humana y de animales, vegetales, insectos, aguas superficiales, tierra y
cualquier material que entre en contacto con ellos.

La presencia de coliformes en los alimentos resulta de su exposición al medio

ambiente y a las posibilidades de desarrollo que encuentren en tales substratos.
Es evidente que su hallazgo en un alimento no involucra necesariamente a la
materia fecal.

En los alimentos los coliformes adquieren un significado distinto al que reciben

en el agua. Los factores más determinantes de esta diferencia radican en su
capacidad para multiplicarse en los alimentos, en la operación de fuentes no
fecales de contaminación y a la presencia de coliformes residuales en el equipo
y utensilios en plantas y servicios de alimentos.

El recuento de los coliformes puede efectuarse por la técnica del número más
probable o por la técnica de vaciado en placa.

Los coliformes fecales se refieren a aquellos coliformes que tienen capacidad

para fermentar la lactosa con producción de gas a temperaturas de 44-45°C.
Excepto esto, los coliformes fecales se identifican del resto de los coliformes en
lo que se refiere a su resistencia al medio ambiente, agentes químicos y factores
que favorecen o impiden su desarrollo.

La técnica para su recuento es el número más probable (NMP), con caldo lauril
triptosa como medio presuntivo incubado a 35°C por 48 h y caldo EC que
contiene sales biliares que le dan selectividad como confirmativo, incubado a
44.5  0.2 °C. El NMP se computa en las tablas correspondientes en la forma
indicada para los coliformes totales.

PRACTICA 5 24
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3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR

a) ¿Cuáles son los microorganismos considerados como coliformes?

b) ¿Qué microorganismo conforma principalmente a los coliformes

fecales?

c) ¿Qué ventajas y desventajas presentan los métodos de vaciado en

placa y el número más probable para determinar coliformes?

d) ¿Qué otro nombre recibe la técnica del número más probable?

e) ¿Cuál es el fundamento de la técnica del número más probable?

f) ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa para

coliformes totales?

4. MATERIALES Y REACTIVOS

Autoclave o Horno a 180°C

Balanza digital
Cuenta colonias
Potenciómetro
Refrigerador
Incubadora a 35°±2°C
4 cajas Petri
1 pipetero metálico
1 cilindro metálico para cajas Petri
4 pipetas de 2 mL
4 pipetas de 10 mL
1 probeta de 250 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
1 espátula
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL
4 frascos de dilución
1 mechero
1 soporte, 1 varilla
Benzal
Agua destilada
4 frascos con 90 mL de agua peptonada al 0.1%
1 matraz con 100 mL de agar bilis rojo violeta
9 tubos con 10 mL de caldo lactosado con campana de Durham
9 tubos con 10 mL de caldo bilis verde brillante al 2% con campana de Durham
Muestras de alimentos

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A) COLIFORMES TOTALES EN PLACA

5. DESARROLLO EXPERIMENTAL

5.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-

110-SSA1-1994 preparación y dilución de muestras de alimentos para su
análisis microbiológico (ANEXO 2).

5.2. PROCEDIMIENTO

a) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a la
inoculación.

b) Colocar 1 mL de las diluciones de las muestras preparadas según la

NOM-110-SSA1-1994, en una caja Petri. Realizar por duplicado.

c) Agregar de 15 a 20 mL de agar rojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA), fundido y

mantenido a 45  1°C. En el caso de cajas Petri de plástico de 10-15 ml
de medio.

d) Mezclar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido

de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante,
sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la
cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

e) Dejar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.

f) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora

al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las
cajas, no debe exceder de 20 min.

g) Después de que está el medio completamente solidificado en la caja,

verter aproximadamente 4 mL de medio RVBA a 45  1°C en la superficie
del medio inoculado. Dejar que solidifique.

h) Incubar las cajas en posición invertida a 35°C  1°C, durante 24  2 h.

i) Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las

colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran
rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es
de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes
biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2 mm.

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5.3. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Considerar las placas con 15 a 150 colonias como las adecuadas para el
informe. Multiplicar por el inverso de la dilución. Para la expresión de resultados,
consultar el ANEXO 3 (cálculo de los valores de la cuenta en placa) y los
criterios establecidos.

5.3.1 PLACAS QUE CONTIENEN MENOS DE 15 COLONIAS

Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el

número obtenido seguido de la dilución correspondiente.

5.3.2 PLACAS CON COLONIAS NO CARACTERÍSTICAS

Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como:

menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.

6. INFORME DE RESULTADOS

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL), en placa de

agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24  2 h.

En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando

como referencia la dilución más baja utilizada.

En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: “no

desarrollo de coliformes por mL”.

En un cuadro presentar los resultados obtenidos de las muestras analizadas

contemplando las especificaciones de acuerdo a la normatividad.

Interpretar los resultados obtenidos considerando las causas posibles que

pudieran dar origen a dichos valores.

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B) BACTERIAS COLIFORMES TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

5.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-

110-SSA1-1994 preparación y dilución de muestras de alimentos para su
análisis microbiológico (ANEXO 2).

5.2 PROCEDIMIENTO PARA AGUA POTABLE Y HIELO

Para el análisis de agua potable, agua purificada y hielo, se emplea la serie de 5

tubos inoculados, 5 tubos con 10 mL, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0.1 mL
(cuadro 4 del ANEXO 4).

5.2.1 PRUEBA PRESUNTIVA

a) Agitar la muestra. Transferir volúmenes de 10 mL de muestra a cada

uno de 5 tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concentración
y 1 mL y 0.1 mL de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5
respectivamente con 10 mL de caldo lactosado de concentración
sencilla o caldo lauril sulfato triptosa con púrpura de bromocresol (ver
preparación en el ANEXO 1).

b) Incubar los tubos a 35°C. examinar a las 24  2 h y observar si hay

formación de gas, si la formación de gas no se observa en ese tiempo,
incubar por 48  2 h.

5.2.2 PRUEBA CONFIRMATIVA

a) De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y

sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación,
caldo lactosa lauril bilis verde brillante.

b) Incubar a 35  0.5°C por 24  2 h o si la formación de gas no se

observa en este tiempo, incubar por 48  2 h.

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5.3 PROCEDIMIENTO PARA ALIMENTOS

Preparar suficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos
correspondientes a la última dilución rindan un resultado negativo.

5.3.1 PRUEBA PRESUNTIVA

a) Inoculación. Tomar 3 tubos de medio de enriquecimiento de mayor

concentración. Usar una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL
de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilución primaria inicial, en el
caso de otros productos.

b) Tomar 3 tubos de concentración sencilla del medio selectivo de

enriquecimiento. Usar una pipeta estéril para transferir a cada uno de
estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL de la dilución primaria
en el caso de otros productos.

c) Para diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párrafo

anterior, usando una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar
suavemente el inóculo en el medio.

d) Incubar los tubos a 35 0.5°C por 24  2 h y observar si hay formación de

gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48  2 h.

5.3.2 PRUEBA CONFIRMATIVA

a) De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar
en un número igual de tubos con medio de confirmación.

b) Incubar a 35  0.5°C por 24  2 h o si la formación de gas no se observa

en este tiempo, prolongar la incubación por 48  2 h.

c) Se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie.

Para algunos productos y siempre y cuando que se requiera una mayor
precisión en los resultados, será necesario inocular una serie de cinco o
diez tubos.

5.4. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas

después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros
correspondientes.

El cuadro 3 del ANEXO 4muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.

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Ejemplo1. Cuando sólo una dilución muestra 3 tubos positivos, elegir ésta y las
diluciones mayores posteriores.

Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra 3 tubos positivos y la última da

menos de tres, elegir esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.

Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay 3 tubos positivos y éstos se

encuentran en más de tres diluciones. Seleccionar las dos diluciones mayores
positivas y la siguiente.

Ejemplo 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin

diluir (1 mL o 1 g) y en la primera dilución (1 mL o 10 -1 g), seleccionar las tres
primeras diluciones para el cálculo del número más probable.

En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en los

cuadros 4 al 7 del ANEXO 4, según corresponda. En la columna que indica el
número de tubos positivos se busca el índice del NMP.

Los límites de confianza están representados en los cuadros 4 al 7.

7. BIBLIOGRAFÍA

a) Banwart, G.J. 1989. Basic food microbiology. 2nd Ed. Chapman & Hall.
New York, USA. Pág. 371-392.

b) Fernández, E.E. 2000. Microbiología e inocuidad de los alimentos.

Universidad Autónoma de Querétaro. México. Pág. 51-54.

c) Jay, J.M. 1992. Modern food microbiology. 4 th Ed. Chapman & Hall. New
York, USA. Pág. 416-421.

d) NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para cuenta de

bacterias aerobias en placa. Secretaría de Salud. México.

e) NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparación y dilución de

muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaría de
Salud. México.

f) NOM-112-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Determinación de bacterias

coliformes: Técnica del Número Más Probable. Secretaría de Salud.
México.

g) NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para la cuenta de

microorganismos coliformes totales en placa. Secretaría de Salud.
México.

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INOCUIDAD ALIMENTARIA

h) PROY-NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimientos para la

toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico. Secretaría de Salud. México.

i) Roberts, D; Hooper, W. y Greenwood, M. 2000. Microbiología Práctica de

los Alimentos. Métodos para el examen de microorganismos de los
alimentos de interés para la salud pública. Acribia. S. A. Zaragoza,
España. Pág. 116-122.

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