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HEMATOLOGIA

CLASE TEORICO-PRACTICA

PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO


HEMOSTÁTICO

Bioq. Mariana Raviola


Cátedra de Hematología-Servicio de Hematología.
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
2018
HEMOSTASIA

Comprende el proceso que


previene el sangrado cuando un
vaso sanguíneo es dañado y al
mismo tiempo mantiene la sangre
en estado fluido dentro del árbol
vascular.
HEMOSTASIA
FASES:
• -Respuesta vascular: Vasoconstricción
localizada a nivel del área afectada
• -Hemostasia Primaria: Formación de
un agregado o trombo de plaquetas
sobre la superficie de vascular
lesionada.
• -Coagulación: Formación de fibrina
que refuerza el trombo plaquetario.
• -Fibrinolisis: Eliminación de los depósitos
de fibrina.
INDICACIONES PARA EL PACIENTE

Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas tratando


de realizar el menor esfuerzo físico posible
FICHA DE ANTECEDENTES DEL
PACIENTE
• - Motivo de consulta
• -Trombosis actual o anterior
• -Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis
• -Sangrado post extraccion dentaria
• -Hemorragia post parto o post cirugia
• -Menstruacion abundante
• -Petequias
• -Antecedentes familiares de trombosis o sangrado.
• -Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos,
heparina, etc
HEMOSTASIA PRIMARIA

RECUENTO DE PLAQUETAS

-Anticoagulante: EDTA
-Material adecuado: tubos de polipropileno,
vidrio siliconado
-Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de
tejido
HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS

Método manual
sangre venosa anticoagulada con EDTA
Dil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn:
150-400 x 103/mm3

Contadores hematológicos
HEMOSTASIA PRIMARIA

RECUENTO DE PLAQUETAS

Es conveniente observar un frotis de


sangre periférica donde se
controlará el número, forma y
tamaño plaqueterio
HEMOSTASIA PRIMARIA
Tiempo de sangría
Prueba global de la hemostasia primaria. Evalúa
interacción: Plaquetas-Pared vascular “in vivo”
Depende de:
▪cantidad y calidad funcional de las plaquetas
▪cantidad y calidad funcional de vWF
▪calidad del colágeno.
Duke VN < 4 min
Ivy VN < 5 min
Simplate VN < 9 min
Cohibir cuando tpo > 2 VN
Tiempo de sangría

TS:
▪  sensibilidad -  especificidad - 
reproducibilidad
▪Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad,
presión del corte, dirección de la incisión,
“barrido” excesivo
HEMOSTASIA PRIMARIA

Retracción del Coagulo

Se produce a través de la interacción de la GPIIb-


IIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP
como fuente de energía, depende de varios
factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de
fibrinógeno, hematocrito, es poco sensible, y muy
influenciada por la limpieza del material
HEMOSTASIA PRIMARIA
Retracción del Coagulo

Se coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de


vidrio bien limpio, se mantiene a 37°c, a la hora
se observa la magnitud de la retracción.
El resultado se expresa en cruces. Cuando el
coagulo se ha despegado por completo de la pared
del tubo se considera retracción total (+++),
cuando no hay retracción es a retractil, y cuando
queda un sedimento de hematíes es
fibrinocruorico.
RETRACCION DEL COAGULO
HEMOSTASIA PRIMARIA

PRUEBA DEL LAZO

Evalúa fragilidad capilar aplicando una presión


positiva que aumenta la presión sanguínea por
obstrucción del recorrido venoso , depende de
calidad y cantidad de plaquetas, calidad del vaso
y los tejidos adyacentes, el gradiente de presión
que tiende a generar la extravasación
HEMOSTASIA PRIMARIA

PRUEBA DEL LAZO

Se coloca el esfigmomanómetro en el antebrazo y


se deja 5 min. a una presión media entre la
máxima y la mínima, se quita la presión y se
observa la aparición de petequias
VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de
diámetro. Se informa la positividad en cruces
HEMOSTASIA PRIMARIA
ADHESIVIDAD

PLAQUETA vW SUPERFICIE

•In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157)


•In Vitro : Hellem II (superficie de vidrio)
Scand J Haemat 1970, 7: 37
HEMOSTASIA PRIMARIA

ADHESIVIDAD

In Vivo : Borchgrevink
Adhesividad (%)= 100 *( RT0 – RT2 / RT0 )
RT0 : recuento de pq. De muestra de sangre
venosa extraída con EDTA
RT2 : recuento de pq. Luego de 2 min de TS.
VN: 30-70%
ADHESIVIDAD: método de Hellen II
•Sangre entera
•Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de
vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna.
•Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.

columna cp
EDTA 2%
bomba
sp
%Adh = 100 SP- CP
EDTA 2% VN = 27- 70% SP
HEMOSTASIA PRIMARIA

AGREGACIÓN

La agregación plaquetaria es el resultado final de un


complejo proceso metabólico.

Cuando el endotelio se daña, se expone una serie de


agonistas capaces de activar a las plaquetas, estos
son el colageno, la adrenalina, y el ADP.

La agregación plaquetaria in vitro se define como la


interacción Pq-Pq medida sobre PRP.
Agregación plaquetaria in vitro

Método óptico (Born, 1980)


Método potenciométrico
(Challen, 1982) IIHEMA-ANM
Agregación plaquetaria in vitro
Condiciones del ensayo:
-Sangre obtenida por punción sobre citrato de sodio 3,8%
(1:9)
-Tubos de polipropileno
-Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a
150-200 rpm
-Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a
altas rpm.
-Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – 300 109/m3
-Tapar tubos para evitar cambios de pH
- Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs
posteriores a la extracción.
AGREGACION
Agonistas panel de rutina:
ADR: 10 uM ( adrenérgicos)
Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa)
AA: 0.5 mM (receptor de Tx)
ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12)
Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II)

Agonistas especiales
TRAP6 : PAR1, PAR4
U46619: análogo de TX
Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza
Ionóforos (A23187): movilización de Calcio
AGREGACION
COAGULACIÓN

HMWK VII
XII
PK
XI
MI IX ME
VIII
X
V
II
I TC
TOMA DE MUESTRA
• Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 %

• No se aconseja utilizar sangre capilar.

• La sangre venosa debe ser obtenida por punción rápida


y precisa, evitando la formación de espuma, el éxtasis
venoso y la contaminación con tromboplastina tisular,
( torniquete menos de un minuto)
TOMA DE MUESTRA
• La sangre arterial debe ser obtenida por punción
directa no traumática.

• Evitar la extracción por catéter, de ser indispensable,


realizar la extracción con doble jeringa y descartar los
primeros 5 a 10ml de sangre.
TOMA DE MUESTRA

• No se aconseja la extracción con tubos de vacío,


aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar la
sangre una vez abiertos.

• Relación ac / sgre, 1+9


TOMA DE MUESTRA

• La relación Anticoagulante / Sangre varía cuando el Hto. se


encuentra fuera del rango de 25 – 50%. Para calcular el
citrato a utilizar se usa la siguiente fórmula:

Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55


1 – Hto en (v/v)
TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Cualquiera sea la distancia se remitirán las


muestras congeladas, con hielo seco, y en
un recipiente adecuado para su
conservación, acompañadas de controles
normales procesados de igual forma.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

• Descartar los tubos que no mantengan


adecuada relación ac/ sgre , y aquellos que
muestren hemólisis visible.

• Centrifugar las muestras y separar los plasmas


con pipetas de plástico lo mas rápido posible.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
a-Plasma citratado rico en plaquetas (prp)
centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el
plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs

b-Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp)


Menos de 5000/mm3
centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las 4 hs .

c-Plasma citratado libre de plaquetas (PPP)


Menos de 1000/mm3
centrifugar la muestra de sangre 10 minutos a 3000 rpm,
trasvasar el PPP a tubo de plástico de polipropileno (PP) con
pipeta plástica y volver a centrifugar a altas revoluciones para
eliminar la mayor cantidad de plaquetas posibles. 1 mes a -20ºC
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TPR
• -Tiempo de plasma recalcificado
• -Se basa en reiniciar la cadena de activación del
sistema de la coagulación al agregar un exceso de iones
calcio al plasma citratado y se mide el tiempo que tarda
en coagular.
• -Evalúa numero y función de plaquetas
• Muestra: prp
• Reactivo: cloruro de calcio 0,025 M
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TPR
• Procedimiento: incubar unos segundos a 37°C 200 ul
de prp y disparar el cronometro al agregar 200 ul de
cloruro de calcio 0,025 M, medir en intervalos de 30
seg el tiempo que tarda en coagular
• Se realiza por duplicado y se informa el promedio
• VN: 1-3 min.
• Prolongado: Déficit de factores de la vía intrínseca y
del numero y función de las plaquetas.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
• -Tiempo de protombina
• -Mide el tiempo de coagulación de un plasma
citratado en presencia de tromboplastina (FT) e iones
calcio
• -Evalúa la vía extrínseca y tronco comun.
• -Se usa para monitorear la terapia con ACO
• -Refleja cambios en los niveles de los factores
II,VII,X,V
• -En cuanto al fibrinógeno solo una disminución por
debajo de 50 mg lo afectan.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN

TP
Tromboplastina
Apoproteina + Fosfolipidos

• Fuentes: plantas, cerebro de conejo, ratón o mono,


recombinarte (humana) a la que se le agregan
fosfolipidos naturales o artificiales
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN

TP
• Muestra: plasma citratado ppp
• Reactivo: tomboplastina calcica
• Procedimiento: incubar 100 ul de ppp 1 min a 37°C,
disparar el cronometro al agregar 200 ul de reactivo a
37°C, medir el tiempo de coagulación.
• Los resultados se informan:
-En segundos informando entre paréntesis el valor del
testigo( 11 recombinante, 12-14 de conejo)
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
-En % de actividad o tasa de trombina:
Se preparan diluciones de un pool de plasmas
normales y se determina el TP por duplicado, con
los datos se grafica una curva, en papel doble log, de
TP vs % de actividad, asignando al pool de normales
el 100% de actividad.
Teniendo el TP del paciente se busca en la curva el %
o tasa que le corresponde.
VN: 70-100%
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TP
• Valores prolongados se observan en:
-Deficiencia congénita o adquirida de uno o varios de
los siguientes factores: II,V,VII,X
-Hipofibrinogenemia
-Enfermedad hepática
-Deficiencia de vitamina K
-Tratamiento con ACO
-Presencia de inhibidores de alguno de los factores
involucrados
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
• -Tiempo de tromboplastina parcial activado
• -Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma
citratado ppp en presencia de tromboplastina parcial,
un activador, e iones calcio.
• -Evalúa la vía intrínseca y tronco común.
• -Se utiliza para controlar la terapia de anticoagulación
con heparina
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN

APTT
• Tromboplastina parcial: fosfolipidos de la
tromboplastina que se obtienen de tejido animal o de
fuentes vegetales (cefalina)
• Activador :- particulado, caolín, celite, sílica
micronizada.
-no particulado, ac. Elagico
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
• Muestra: plasma citratado ppp
• Reactivos: -cefalina - caolin
-cloruro de calcio 0.025 M
• Procedimiento: incubar100 ul de ppp con 100 ul de
rvo a 37°C durante 3 min, disparar el cronometro al
agregar 100 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir el
tiempo que tarda en coagular.
• VN: 30- 40 seg.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
APTT
• Valores prologados se observan en:
-Déficit congénito o adquirido de factores II, V, VIII,
IX, X, XI, y XII
-Tratamiento con heparina
-Presencia de inhibidores
-Tratamiento ACO instaurado
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TT
Evalúa la etapa de fibrinoformación midiendo el tiempo
que tarda en coagular el plasma citratado en presencia
de trombina, independientemente de las alteraciones
que podrían afectar el MI o el ME
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TT
Muestra: ppp
Reactivo: solución de trombina comercial (liofilizada) o
preparada a partir de plasmas de dadores, se ajusta la
dilución de manera tal que el testigo sea
aproximadamente 15 seg
Procedimiento: incubar 100ul de muestra 1 min a 37° C
agregar 100 ul de trombina diluida y tomar el tiempo
que tarda en coagular.
PRUEBAS PARA EVALUAR LA
COAGULACIÓN
TT
Se considera prolongado cuando el plasma del paciente
difiere en mas de 4 segundos con el normal.
Valores prolongados se observan en :
-Niveles bajos de Fibrinógeno o Disfibrinogenemia
-Tratamiento con heparina no fraccionada
-Presencia de inhibidores adquiridos
PRUEBAS ALTERADAS
Déficit de factores
o presencia de inhibidores?

Pruebas de corrección - Mezcla (1+1)

corrige no corrige

cuantificación de detección de
factores inhibidores
PRUEBAS DE CORRECCIÓN

Para orientarnos sobre las causas que provocan la


alteración de las pruebas podemos realizar
correcciones mezclando partes iguales del plasma en
estudio con:
- Plasma normal
- Plasma adsorbido: aporta los factores
I,V,VIII,XI,yXII.
- Suero: aporta los factores VII,IX,X,XI, yXII
- Plasma envejecido: carece de factor V
PRUEBAS DE CORRECCIÓN

Preparación de pool de plasmas normales


Se extrae sangre a como mínimo 10 sujetos
normales con básico de coagulación normal , y
se prepara ppp se fracciona y se conserva
a -80° C hasta 6 meses o solo 1 mes si se
guarda a -20 ° C
PRUEBAS DE CORRECCIÓN
Preparación de plasma adsorbido
Es plasma desprovisto de los factores vitamina K
dependientes, factores II ,VII, IX y X, que quedan
adsorbidos en sulfato de bario.
A partir de sangre extraída con oxalato de sodio en
relación 1+9, se prepara ppp y se mezcla con sulfato
de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba a 37°C 15
min. ,se centrifuga dos veces y se recoge el
sobrenadante, que debe tener un TP mayor de 60 seg.
El plasma adsorbido posee los factores:
I,V,VIII,XI,XII
PRUEBAS DE CORRECCIÓN

Preparación de suero
Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI Y XII.
Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo de
vidrio por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min. a
3000 rpm .Se puede mantener a 4°C por 24 horas o
fraccionar y congelar
PRUEBAS DE CORRECCIÓN

Preparación de plasma envejecido


Deficitario en factor V, se extrae sangre con oxalato
de sodio 1 M en proporción 9+1, se obtiene ppp, y
se coloca en un enlenmeyer a 37°c.
Se contola decaimiento de la actividad del factor V
mediante el TP hasta un valor de 60 seg. Alicuotar y
guardar a -20°c.
DOSAJE DE FACTORES DE
LA VIA EXTRINSECA
II,V,VII,X
TP
seg
• plasma
» patrón/pool de
plasma normal(curva seg
de calibración) pac
» paciente diluido
• plasma deficiente en el % pac
factor a medir % factor

• tromboplastina - calcio
DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA INTRINSECA
VIII,IX,XI,XII

• plasma
» patrón/pool de plasma
normal (curva de seg
calibración) pac
» paciente diluido
• plasma deficiente en el
% pac
factor a medir % factor
• cefalina - kaolín
• Cl2Ca
DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA
FINAL :FIBRINOGENO (método
gravimétrico)

trombina

fibrinógeno fibrina

-Se recoge el coagulo con varilla de vidrio


-Se lava con agua destilada
-Se deshidrata con alcohol, y se deja secar a 80° C
-Se pesa la fibrina en balanza de precisión, la masa final
de fibrina es directamente proporcional a la
concentración de fibrinógeno
DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA FINAL :FIBRINOGENO
(método de Claus)

método básico = TT seg

• plasma
» patrón mg/dl (curva de seg
calibración) pac
» paciente
• trombina mg/dl pac
mg/dl
SANGRADO SIN ALTERACION DE LA
PRUEBAS GLOBALES

Determinación de factor XIII


-Solubilidad del coagulo en urea 5 M
La fibrina formada en ausencia de factor XIII se
disuelve en urea 5 M.
Procedimiento: Se hace coagular 200ul de ppp con
200ul de cloruro de calcio 0.025 M, y 100 ul de
trombina, incubar 30 min a 37°C agregar solución de
urea 5 M, desprender el coagulo de las paredes y
dejar a temperatura ambiente 24 horas. Observar a los
30min, 1,2,4,y 24 horas la disolución del coagulo
SANGRADO SIN ALTERACION DE LA
PRUEBAS GLOBALES

Valor normal: no disolución a las 24 horas.


Poco valor diagnostico solo se modifica cuando la cc
del factor es muy baja

-Metodos Funcionales:
Espectofotometricos
Fluoromericos
-Determinacion Inmunologica de factor XIII
FUNCIONES DEL SISTEMA
FIBRINOLITICO

• ELIMINACIÓN DE LA FIBRINA QUE QUEDA


ADHERIDA A LAS PAREDES DE LOS VASOS
DESPUÉS DE LA COAGULACION (intravascular)

• INTERVIENE EN LAS REPARACIONES


HÍSTICAS

• INTERVIENE EN LA ACTIVACION DE LOS


MACROFAGOS (extravascular)
SISTEMA FIBRINOLÍTICO

Está compuesto por una


enzima clave: plasmina (Plm),
cuyo precursor inactivo es el
plasminógeno ( Plg ).
Esta activación puede
producirse por :
Activador tisular del
plasminógeno: t-PA
Activador tipo uroquinasa: u-
PA
Factor XIIa y calicreína
SISTEMA FIBRINOLÍTICO
La plasmina produce clivaje tanto del fibrinógeno como de la fibrina.

Degradación del fibrinógeno.(Fibrinogenolisis)


fragmentos X, Y, D, E ( PDF)
Fisiológicamente esto no ocurre ya que las pequeñas cantidades de
plasmina que se generan son inhibidas por la antiplasmina.

Degradación de fibrina. (Fibrinolisis)


fragmentos de distinto PM , en su mayoría fragmento D entrecruzado
( D-Dímero)
El hallazgo de Dímero D aumentado implica que hubo formación de
fibrina entrecruzada y posterior lisis de la misma.
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
PRUEBAS GLOBALES

TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO.

TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE


ENTERA DILUIDA.

TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS


EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS
La dilución y acidificación del plasma provoca la
precipitación de las euglogulinas( fracción proteica
que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los
activadores del plasminógeno y la plasmina), luego se
resuspende en buffer alcalino, se coagula y se incuba
.
a 37°C, para registrar el tiempo de lisis del coágulo,
este procedimiento elimina los inhibidores de la
fibrinolisis.
El tiempo de lisis del coagulo es inversamente
proporcional a la actividad fibrinolítica del plasma
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
Procedimiento: en tubo de vidrio se agregan 4ml de
agua destilada,70ul de acido acético, y 250ul de ppp,
se mezcla y deja 30 min a 4° C, se centrifuga 5 min a
bajas rpm, en el sobrenadante quedan los inhibidores
que se descartan, se deja escurrir y se resuspende con
solución de borato de sodio en baño a 37°C hasta
disolución y se coagula agregando cloruro de calcio
Se registra el tiempo desde la coagulación hasta la
disolución total del coagulo.
EVALUACION DEL MECANISMO
FIBRINOLÍTICO
VN: el coagulo se lisa entre 1h 30 min y 4 hs.
Tiempos de lisis inferiores demuestran un aumento de la
fifrinolisis a expensas del aumento de los activadores
del plasminógeno, pudiéndose asociar con
hemorragias.
Tiempos de lisis superiores reflejan disminución de la
actividad fibrinolítica y pueden asociarse a perdidas
embriofetales.
La prueba se ve afectada por los niveles de fibrinógeno
y de plasminógeno.

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