Producción de Biocombustibles – Teoría n°4 (31/08/2016)

Evolución de los biocombustibles (1974 – 2017) -Materia prima que viene de lo biológico-
A partir de ciertos periodos hay un crecimiento exponencial del aporte al conocimiento de los biocombustibles.
El inicio de los biocombustibles puede tener una implicación en que coincide con una de las crisis del petróleo a
principios de los 70’. En Brasil durante esa crisis se comenzó con un programa pro-alcohol desde la caña de azúcar y
esto llevo a que hoy en día sea uno de los principales países productores de bioetanol y muchos de sus vehículos en
Brasil funcionan exclusivamente con bioetanol.
En ciertos periodos, pareciera existir un desinterés (por algunas mesetas que existen en la gráfica) y un
alergatamiento en la investigación científica.
Hay toda una variedad de combustibles de origen microbiano, entre ellos: hidrocarburos, biodiesel, hidrógeno,
butanol, etanol, metanol y metano. En la columna de la derecha se encuentra la escala de aplicación de esos
resultados de investigación, los hidrocarburos de origen microbiano están todavía a una escala de laboratorio,
fundamentalmente lo que es la mejora de cepas (a escala piloto). A nivel de biodiesel microbiano está en la misma
escala y algo similar ocurre con el hidrógeno y butanol (el butanol fue, hasta fines de los 80’, de producción industrial
en conjunto con la acetona, luego se volvió un proceso menos económico que su obtención a partir del petróleo). El
etanol tiene una producción industrial y sigue existiendo desarrollo en escala de laboratorio, mejoramiento de cepas
y de procesos, lo mismo ocurre con el metano(es común que las plantas industriales recuperen a partir de desechos
el biogás generado y este sea reutilizado como energía u otros). El metanol está en una escala de laboratorio, puede
utilizarse como combustible o como sustrato para la producción de biodiesel.

Biocombustible Escala de resultados

Hidrocarburos Laboratorio
Biodiesel Laboratorio
Hidrógeno Laboratorio
Butanol (Laboratorio)
Etanol Industrial
Metanol Laboratorio
Metano Industrial

Hidrocarburos microbianos

Se ha visto desde ya hace un tiempo, que existen muchos microorganismos que son capaces de sintetizar y
acumular hidrocarburos (alcanos o alquenos). En la tabla se encuentra el porcentaje de hidrocarburos que
son capaces de sintetizar en base de masa seca. El perfil de hidrocarburos, normalmente son lineales. La
cantidad de átomos de carbonos que tienen y cuáles son las fracciones mayoritarias.

Entre estos microorganismos se encuentran las cianobacterias, bacterias fototróficas anaeróbicas,

bacterias sulfatoreductoras gram (-), bacterias anaeróbicas facultativas gram (-) y bacterias anaeróbicas
gram (+) como el Clostridium. Se resalta una bacteria anaeróbica facultativa gram (-), donde se incluye
E.coli que naturalmente tiene la capacidad de producir y además es una plataforma para producir un
montón de moléculas recombinantes, fundamentalmente proteínas, pero estas proteínas pueden ser las
enzimas que se encuentran en los pasos de síntesis de hidrocarburos E. coli podría ser de esta forma una
plataforma adecuada para la producción de hidrocarburos. Pero hay una bacteria de especial interés que
es Vibrio fumissii, que es capaz de acumular hasta 60% de hidrocarburos en masa seca, eso lo hace de
forma natural (no deben hacerse modificaciones moleculares) y además tiene la capacidad de resistir los
hidrocarburos sin que resulte tóxico para la biomasa. La desventaja de esta bacteria es que su crecimiento
es más lento y menos estudiado que el de E. coli.

Las microalgas es un grupo que no tiene un taxón estrictamente, pero es un grupo de microorganismos de
agua dulce o salada. Muchos de ellos tienen la capacidad de hacer fotosíntesis. Algunos autores incluyen
dentro de las microalgas a algunos protistas y células eucariotas de vida libre que no son fotosintéticos. La
microalga de particular interés acá es Botryococcus braunii que acumulan hasta un 75%. Son de agua dulce.

Microorganismo % de la Biomasa seca Perfil de Hidrocarburos

hidrocarburos mayoritarios
Cianobacterias 0,025 – 0,12 n-C15 – C18 n-C17
Bacterias fototróficas 0,0055 n-C15 – C20 n-C17
anaeróbicas
Bacterias sulfato 0,8 – 2,25 n-C11 – C35 n-C25 –C35
reductoras (Gram -)
Bacterias 0,0035 (E.coli) – 60 n-C15 – C24 n-C17 , C24
anaeróbicas (Vibrio fumissii)
facultativas (Gram -)
Bacterias ND n-C11 – C35 n-C17 –C35
anaeróbicas (Gram +)
(Clostridium sp.)
Bacterias aeróbicas 0,33 n-C14 – C34 n-C17 – C29
(Gram +) Bacillus sp
Mycobacterium sp. 2,69 n-C17 – C31 n-C25 – C29
Levaduras 0,06 – 10,2 n-C10 – C31 n-C13 – C30
(Saccharomyces
oviformis, S. ludwigii)
Filamentosos 0,06 – 0,12 n-C7 – C39 n-C13 – C22
Microalgas 75 n-C34 – C37 C36
(Botrycoccus braunii)

¿Por qué las células microbianas son capaces de sintetizar hidrocarburos?

Hay distintas hipótesis, pero todavía no hay ninguna que dé una respuesta satisfactoria. Pero algunas explicaciones
geológicas sobre el origen del petróleo, pueden tener que ver con este tipo de metabolismo. El petróleo formado a
expensas de microorganismos prehistóricos que han sintetizado hidrocarburos, además de otras relacionadas con la
descomposición de la materia orgánica a altas presiones en periodos prolongados.

Los hidrocarburos de origen microbiano tienen una ubicación que puede ser: endocelular o exocelular. Es decir, en el
caso de ser exocelular muchas veces puede ser como una cápsula o bien puede almacenarse como vacuolas en el
interior citoplasmático. Si constituyen una cápsula, su producción de hidrocarburos tiene que ver con la patogenia o
mecanismos de defensa. También algunos le atribuyen que pueden intervenir en la comunicación entre las células.
Pero muchos autores no le atribuyen una función energética para el microorganismo.

Los hidrocarburos se sintetizan siguiendo la ruta de los ácidos grasos. La cadena de ácido graso unido a la proteína
transportadora de ácidos grasos (ACP) a través de una enzima del tipo de las reductasas usando NADPH como
cofactor se remueve la ACP y se forma el aldehído graso, y una segunda enzima involucrada es una aldehído
decarboxilasa, que remueve CO y genera alcanos o alquenos. El aspecto negativo de la síntesis es que la reacción
libera CO. El CO no es un gas ambientalmente amigable, sin embargo los microorganismos son capaces de
capturarlo.
 Schirmer 2010 – Microbial biosynthesis of
alkanes

Biodiesel

Wiki: El biodiésel (biocombustible) es un líquido que se obtiene a partir de lípidos naturales

como aceites vegetales o grasas animales, con o sin uso previo,1 mediante procesos industriales
de esterificación y transesterificación, y que se aplica en la preparación de sustitutos totales o parciales
del petrodiésel o gasóleo obtenido del petróleo. El biodiésel se describe químicamente como compuestos
orgánicos de ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de cadena larga y corta. Biodiesel is a monoalkyl
ester of fatty acids from vegetable oil and is presently produced by catalytical transesterification with
petrochemically derived methanol, also called alcoholysis (e.g. rape seed oil methyl ester, RME; Ma and
Hanna 1999).

El biodiesel es un combustible, cuya materia prima en Argentina es la soja. Por esto, tiene una connotación
negativa que es recurrir al uso de la tierra para usar materia prima que puede ser alimenticia. Se trabaja en
la búsqueda de vegetales que no sean comestibles y que puedan ser cultivados en terrenos que no sean
utilizados para cultivo de alimentos, pero que por supuesto estos cultivos acumulen una gran cantidad de
aceite para luego ser usados para la obtención del biodiesel. Además, esas plantas deben tener ciertas
particularidades como tener un perfil de ácidos grasos que sea el adecuado
para la obtención de biodiesel. No puede utilizarse ácidos grasos con
cadenas de carbono muy largas (no sirven para el momento de la
combustión o se oxidan demasiado al tener mayor cantidad de dobles
enlaces).
A nivel clásico, la producción de biodiesel es partir de un vegetal oleaginoso,
de la cosecha se obtiene la semilla y un residuo lignocelulósico (el rastrojo
que queda en el campo). La semilla después en la aceitera se va a procesar,
moler y extraer con solventes (hexano), para obtener el aceite y un residuo
pellet de la soja.
El aceite puede someterse a distintos procesos de transformación de los
triglicéridos en biodiesel, uno de los más usados es la transesterificación. Se parte de un triglicérido genérico
en presencia de metanol y NaOH, se genera metóxido y se puede hacer la remoción del glicerol de la
molécula del triglicérido y cada una de las moléculas de ácido graso termina siendo esterificado por el
etanol. Las grasas de animales y plantas están hechas típicamente de triglicéridos, que son ésteres de ácidos
grasos libres con glicerol. En el proceso, el alcohol es deprotonado (removido de un catión hidrógeno de
una molécula) con una base para formar un nucleófilo (anión con un par de electrones libres) más fuerte.
Comúnmente son usados etanol y metanol. Como se ve en el diagrama, la reacción no tiene
otros reactivos más que el triglicérido y el alcohol.
En condiciones ambientales normales, la reacción puede no ocurrir o hacerlo de manera muy lenta. Se usa el
calor para acelerar la reacción, además de un ácido o una base. Es importante notar que el ácido o la base no
son consumidos durante la reacción, es decir, son catalizadores. Casi todo el biodiésel es producido a partir de
aceites vegetales vírgenes usando una base como catalizador debido a que es el método más económico,
requiriendo bajas temperaturas y presiones y obteniendo una conversión del 98%. Sin embargo, hay otros
métodos que usan ácidos como catalizadores que son más lentos.
Un ejemplo de la transesterificación mostrado en fórmula
esquelética.

Durante el proceso de esterificación,

el triglicérido reacciona con un alcohol en presencia de
un catalizador, generalmente hidróxidos
fuertes (NaOH o KOH). El propósito de hacer
una valoración ácido-base es para saber
cuánta base es necesaria para neutralizar todos
los ácidos grasos libres y, entonces, completar lareacción.

Los esteres metílicos son los que constituyen el biodiesel, el éster metílico de un determinado ácido graso,
normalmente de una semilla se obtiene una variedad de esteres metílicos en función del ácido graso de
partida y como subproducto queda el glicerol. A veces en el proceso de producción del aceite quedan
ácidos grasos libres, no esterificados en el glicerol, entonces si hay mucha acidez en el aceite hay que
estudiar algunas otras alternativas para intensificar el rendimiento de biodiesel, no se recurre a una tasa de
esterificación única, sino que se hacen otros procedimientos.
El subproducto Glicerol (se le puede sacar valor agregado, tiene distintas aplicaciones). El aspecto negativo
en la obtención es el metanol, que la mayoría de las veces tiene origen petroquímico, sin embargo puede
ser generado por síntesis microbiana y de esta forma lograr un proceso completamente verde (casi
completamente verde ya que la transesterificación debe realizarse usando NaOH).
También pueden generarse esteres etílicos, usando etanol en lugar de metanol. El etanol es más caro a
nivel de las propiedades de las aplicaciones tecnológicas del éster etílico.

Desde la microbiología, se podría tomar la alternativa para prescindir de los vegetales oleaginosos, es
recurrir al uso de microorganismos oleaginosos, es decir utilizar microorganismos que pueden sintetizar
más del 20% en biomasa seca de aceite (define el corte que dan los autores para definir organismos
oleaginosos). El aceite que se acumula y que se obtiene de organismos microbianos se denomina aceite
unicelular (simple cell oil). Así como la oleaginosa crecía en tierra, en defensa del sol, agua, CO2, hay
microorganismos oleaginosos que tienen la propiedad de poder crecer a expensas de la luz solar y del CO 2
porque son polisintéticos. Con la ventaja sustantiva de que si se tiene que recurrir a la soja (la cual tiene
sus momentos de siembra, crecimiento y cosecha, y depende de las condiciones ambientales y costos de
mercado). Cuando se lleva la producción a un bio-reactor, se independiza un poco más de esas cuestiones,
además no se requiere de grandes áreas. Una de las formas es cultivar microalgas o microorganismos
fotosintéticos. Luego de un tiempo, se puede hacer la cosecha y la extracción del aceite unicelular. El
producto de interés se encontrará en la biomasa, se forman cuerpos lipídicos en la célula. Para ello, se
obtiene la biomasa, se aplica algún procedimiento extractivo (muchas veces hay un pre-tratamiento) con
ácidos y enzimáticos o una molienda y puede haber un secado de la
biomasa para favorecer la llegada de solventes apolares, para poder
remover el aceite. Se conserva la fase orgánica que contiene los aceites.
Evaporo y reciclo el solvente. Proceso el aceite para biodiesel-
Usos que se le puede dar a la biomasa es la alimentación animal o para bioenmienda de suelos. A veces,
contiene otras moléculas en baja cantidad, pero como es una gran cantidad de biomasa de ahí se puede
extraer moléculas de interés como enzimas, oxidantes, vitaminas, pigmentos (da más valor agregado y
mejora la economía del bioproceso). Las microalgas también pueden cultivarse en bolsas (son bolsas que
se airean y están iluminadas para que se pueda realizar la fotosíntesis) o en biofermentadores planos
(consisten en dos placas de vidrio o plástico, en su interior poseen un entramado para permitir la
circulación. Se pueden operar como tipo airlift, en esas placas que tienen mucha superficie se pueden
hacer de manera más eficiente la fotosíntesis. Las placas no son profundas para evitar la sombra. Y por
supuesto tienen que tener una orientación tal que la luz solar incida de forma adecuada). Recordar que
demasiada iluminación genera foto inhibición, para cada microorganismo existen curvas que dependerán
del medio de cultivo, del sistema de producción). La curva es similar al de cinética de Monod, pero a partir
de cierta radiación comienza a disminuir parámetros específicos como la velocidad especifica de
crecimiento (µ) y rendimientos.
La circulación puede ser de tipo airlift o con circulación
hidráulica, para reactores tipo tubos.

Hay algunos parámetros tabulados en algunas publicaciones, y

el contenido de aceite reportado en las distintas citas
bibliográficas siempre dependerá de la cepa utilizada y las
condiciones de cultivo. Muchos de los microorganismos
mencionados en la tabla producen aceite pero su perfil es más
alimenticio que para la generación de biodiesel.
Algunos autores hacen una propuesta superadora en cuando al concepto de biorrefineria. Se quiere
generar una refinería biológica, donde uno quiere hacer el mayor aprovechamiento de todo lo útil
proveniente de la biomasa.
Esta propuesta en particular, se basa en el uso de microalgas para el tratamiento de los efluentes
(municipales e industriales) y como el producto es de aplicación industrial y no está destinado al consumo
humano ni terapéutico es mucho menos problemático partir de la materia prima sucia. Al crecer la
biomasa van a bajar los niveles de nitrógeno, de fósforo y la carga de materia orgánica que tiene el
efluente. Si bien la microalga crece a expensas de la luz, cuando uno le ofrece junto con la luz una fuente
de carbono orgánica se da un fenómeno denominado crecimiento mixotrófico, que consiste en “comer
mezclado”. Usa tanto la fuente de carbono orgánica, la luz solar y el CO2 para hacer la fotosíntesis. Algunos
trabajos se han hecho comparativamente crecimiento fotosintético y con crecimiento mixotrófico y se vio
que los rendimientos de crecimiento mixotrófico fueron superadores en el contenido de aceite, e inclusive
cuando se hizo crecimiento heterotrófico de microalga (una microalga que tiene la capacidad de consumir
glucosa, hacer fotosíntesis) y se hizo también un ensayo autotrófico (fotosintético), heterotrófico (o a
oscuras) y mixotrófico (donde hay luz, CO2 y glucosa). El crecimiento mixotrófico para algunos casos
particulares supero a los otros dos. En segundo lugar se ubicó el heterotrófico y por último el autotrófico.

Zhu 2014 . Biodiesel production from algae cultivated in Winter with artificial wastewater though pH regulation by acetic acid.

El CO2 también puede

provenir de los gases 3.4. Production by algae
The autotrophic production of glycerol using the green alga species Dunaliella tertiolecta and
de combustión de una Dunaliella bardawil is an attractive possibility as CO2 and light can be used as carbón and
usina, de una planta energy sources. In these algae, glycerol is accumulated intracellularly in response to increases
termoeléctrica que se in NaCl concentration (Ben-Amotz and Avron, 1981; Ben-Amotz, 1983). Extracellular
glycerol concentrations up to 5 g/L have been reached in the hypersaline (4 M NaCl) medium
ha instalado donde se of D. tertiolecta immobilized in calcium alginate (Grizeau and Navarro, 1986). The application
quema gas o fuel oil y of algae to glycerol production has apparently received no further attention. Wang, 2001.
se produce calor y
vapor que mueve una turbina y los gases de combustión se aprovechan para otra turbina. Hay una
biorremediación ambiental de un efluente líquido y un efluente gaseoso. Se obtiene la biomasa de
microalgas y se realiza la extracción y quedan residuos que pueden ser sometidos a una fermentación
anaeróbica para obtener biogás y fertilizantes (parte sólida). Otras moléculas integran la química fina de
los microorganismos como: pigmentos, proteínas (con un valor nutritivo adecuado para sepáralas),
enzimas y también si se produce biogás se genera CO 2 que se va a reciclar a la parte inicial de la
biorrefineria donde se está produciendo el crecimiento mixotrófico de las microalgas. O parte de los
sólidos se pueden destinar a la producción de más microalgas (alimento).
Hay bacterias, levaduras y órganos filamentosos que no fotosintetizan pero que generan aceites.

GLICEROL.
El glicerol es un subproducto. Puede ser un sustrato del biodiesel para producir más biomasa de un
microorganismo de forma mixotrófica o heterotróficamente (levaduras, hongos filamentosos, bacterias).
Pero también el glicerol puede ser utilizado en la formulación de medios de cultivo para la producción de
distintos insumos que son necesarias para las biorrefinerias como ser enzimas del tipo de las lipasas. Hay
muchos trabajos de investigación, pero pocas aplicaciones industriales donde en lugar de hacer la
transesterificación utilizando NaOH, se hacen mediante lipasas que remueven el glicerol y esterificar con
metilo o con etanol. Las lipasas se pueden obtener de cultivos de microorganismos nativos o
recombinantes e introducirlos en el proceso de producción de biodiesel. También se pueden hacer cultivos
de microorganismos que introduzcan otro tipo de enzimas vinculadas al proceso como por ej. la celulasa,
para tratar los residuos de las aceiteras y residuos a campo y remover algunos ingredientes lignocelulósicos
que pueden ser útiles. Los microorganismos productores nativos de enzimas por excelencia son:
Trichoderma spp. , Aspergullus spp. y Penicillium spp.
El glicerol, además de estos usos potenciales a escala de laboratorio ya vistos, siempre fue un insumo de
interés con otros usos con valor comercial. Existía una
fermentación glicérica para la obtención de glicerol. Esta
tecnología existió hasta estos momentos donde la oferta de
glicerol brindada por la producción de biodiesel desplaza
cualquier proceso fermentativo de glicerol exclusivo. El proceso
es un buen ejemplo de la ingeniería bioquímica. La
fermentación glicérica se realizaba en levaduras (en microalgas
marinas también puede realizarse y para el microorganismo
tiene una función osmoprotectora frente a las sales presentes
en el agua). En el caso de las levaduras, se recurría a un
metabolismo de tipo fermentativo anaeróbico con producción
de etanol. En la figura se ven algunos pasos de la glicolisis
donde intervienen en el proceso, esencialmente el paso de la
glucosa a pirúvico con formación del acetaldehído y el etanol y
hay un reciclado de NAD+. Esto garantiza que funcione si hay
presente sustrato y que no existan productos intermediarios
que estén interfiriendo. En determinados momentos, se
agregaba sulfito ácido de sodio (NaHSO3) en exceso al
fermentador (es importante la presencia de septos para
introducir el aditivo). El sulfito se asocia y forma complejos con
el acetaldehído que es el precursor de la síntesis del etanol.
Este precursor con el paso del etanol permitía el reciclado del
NAD+. Entonces se genera un desbalance redox y comienza a
haber acumulación de NAD+, siempre que exista oferta de
glucosa. Se recurre a una vía accesoria,de salvataje, para poder
reciclar el NAD+, se transforma (con enzimas necesarias
presentes) al gliceraldehido 3-fosfato a glicerol y utiliza una
ruta accesoria para reciclar el NAD+ (ruta glicérica).

En la curva se puede ver una evolución de la producción del glicerol crudo, ha crecido de manera exponencial. En
Argentina hubo una fuerte inversión de la producción y luego variaron los precios y las condiciones y se frenó. En
celeste se puede ver como es la producción de biodiesel, donde el glicerol es siempre un porcentaje (10% p/p) y
como cae por la oferta incrementada de glicerol el precio del glicerol puro.

El glicerol es un subproducto de la obtención de biodiesel, así se lo obtenga con enzimas. Existen distintos usos
microbianos:

- Biomasa: es una fuente de carbono y energía. Hay microorganismos que son capaces de metabolizarlo y de sacar
de él precursores carbonados para la síntesis de material plástico.

- Dihidroxiacetona (DHA): Es una molécula que se sintetiza a partir del glicerol. Hay dos bacterias que son capaces de
producirla, también se puede obtener por oxidación química del glicerol. Una de las bacterias son las del ácido
acético: Gluconobacter oxydans. Y las otras son enterobacterias como E.coli. La manera en que producen DHA varía.
Para el caso de las bacterias del ácido acético, se usa un cofactor que está ligado a membrana (PQQ) y partiendo del
glicerol con O2 es capaz de oxidarlo para producir DHA y H2O. La enzima responsable de esta biotransformación es la
gliceroldeshidrogenasa y para el caso particular del Gluconobacter está asociada a la membrana plasmática.

Glicerol +1/2O2 DHA + H2O

Gliceroldeshidrogenasa

En el caso del otro grupo de bacterias que también eran capaces de generar DHA (Enterobacterias). Tienen una
gliceroldeshidorgenasa citoplasmática, soluble en el interior celular, utiliza como cofactor al NAD+ (se debe asociar el
cofactor a otro sistema que lo recicle).

Glicerol DHA

Gliceroldeshidrogenasa

Dadas estas dos posibilidades de transformar el glicerol en DHA, algunos autores observan lo siguiente, que en el
caso de las bacterias del ácido acético, al tener la gliceroldeshidrogenasa asociada a la membrana plasmática (con
actividad catalítica hacia la cara externa de la célula) no requiere que el glicerol sea introducido al citoplasma para
ser transformado a DHA. En E.coli si lo requiere, y el glicerol al ser una molécula hidrosoluble requiere algún tipo de
permeasa en el caso de E. coli, de sarcoporinas para ingresar (son de alguna manera etapas limitantes de la
biotransformación). En el caso del Gluconobacter oxydans que trabaja externamente no debe incorporar el glicerol a
la célula y la reacción enzimática se da en el sobrenadante de cultivo. En las enterobacterias, la DHA queda
acumulado en el interior citoplasmático y puede ser tóxico y tendrá que evacuarlo dando lugar a mecanismos que
consuman ATP. Muchos se inclinan por el uso tecnológico de las bacterias del ácido acético.
La DHA es un precursor químico de un montón de moléculas, algunas muy complejas de uso medicinal, como agente
de pigmentación artificial de la piel, mediante la reacción del grupo ceto de las DHA con los grupos aldehídos
presentes en las proteínas de la piel, que genera un polímero del tipo de las melaninas de color oscuro.

- 1,3-propanodiol (1,3-PD): sustrato que se utiliza para hacer fibras textiles (Dupont). Los microorganismos
que son capaces de transformarlo pertenecen al grupo de enterobacterias, entre ellas se destacan: Klebsiella
spp. (para algunos procesos puede estar contraindicada por ser un microorganismo emparentado con
especies patógenas para el humano); Citrobacter spp. También pueden ser fuentes de genes para
transformar bacterias inocuas y producir de manera recombinante el propanodiol a expensas del glicerol.
 Se produce en dos pasos metabólicos, que involucra dos enzimas: gliceroldeshidratasa y 1,3-PD
deshidrogenasa. La primera remueve el –OH del C2 (β) y oxida uno de los –OH de los extremos dando lugar a
3HPA (3-hidroxipropionaldehido) y H2O. La segunda enzima forma 1,3-PD (1,3-propanodiol).
Glicerol 3HPA 1,3-PD

Gliceroldeshidratasa 1,3-PD deshidrogenasa

Si uno combina la imagen anterior para la producción de DHA, esa deshidrogenasa en el sentido que trabaja
está reduciendo al NAD+ y en el sentido que trabaja la deshidrogenasa para la producción de 1,3-PD está
oxidando al NADH2+, entonces el acople de estas dos reacciones permite el reciclado del cofactor que de otra
manera sería costoso. Da un cierre económico al proceso.

Producción de biodiesel recombinante: Microdiesel

Es una propuesta superadora, se produce un éster etílico o metílico directamente en una célula y no producir la
enzima que se usa para trabajar con aceites.
Uno de los trabajos pioneros, es de hace unos 10 años, donde un grupo alemán hizo una expresión heteróloga en E.
coli de tres genes diferentes, dos de Zymomonas mobilis y uno de Acinetobacter baylyi. La ingeniería utilizada para la
generación de la cepa triplemente recombinante que codifica 3 enzimas. La propuesta es, a expensas de glucosa
mejorar a través de ingeniería metabólica ciertos pasos que están presentes en E. coli (puede producir etanol de
manera natural en muy poca cantidad, es poco redituable). Por lo tanto, se utilizan genes de Zymomonas mobilis:
Piruvato decarboxilasa y la aldehído deshidrogenasa. Esa cepa hasta ahí, podría ser un buen productor de bioetanol
(siempre que sus rendimientos superen los obtenidos por los microorganismos naturalmente. Para los autores que
desean obtener biodiesel, el etanol sería la molécula que se va a usar para formar el éster etílico del biodiesel. La
otra molécula es el ácido oleico, uno de los ácidos grasos producidos naturalmente por la E. coli. Entonces el etanol
está presente en bajos porcentajes de forma natural en E. coli y los ácidos grasos también, pero no poseen la
capacidad de transformarlos como esteres etílicos. De ahí la importancia del tercer gen, que puede unir y formar el
éster. El ácido graso por ejemplo unido al acetil-CoA el sustrato junto con el etanol y la enzima van a producir el éter
etílico.
El inconveniente, es el bajo rendimiento de los esteres etílicos que
son muy pocos para ser competitivos en los procesos biológicos de
obtención del biodiesel o de los métodos tradicionales de
obtención de aceites, incluso aceites microbianos. El rendimiento
obtenido fue bueno para el trabajo, aun alimentando con ácidos
con aceites. Tal vez, la propuesta superadora sea mejorar las rutas
de síntesis de aceites en E. coli en una bacteria oleaginosa o llevar
toda esta plataforma a un microorganismo oleaginoso, donde
existen menos conocimientos y herramientas moleculares para
transformarlas, por este motivo siempre se recurre a E. coli.
Esto es un buen modelo de inicio, pero no para escalarlo a plantas industriales.

Producción de hidrógeno microbiano

Hay 2 maneras de producir hidrógeno en los microorganismos:

-Cultivos de microorganismos anaeróbicos. Como es el caso de los Clostridium (fermentación butírica, acetofilica)
-Cultivos de microalgas y cianobacterias: A partir de lo que sería la fotosíntesis, producción de moléculas de azucares
a partir de H2O y CO2, fotosíntesis oxigénica. El hidrógeno de los microorganismos puede producirse por dos caminos.
Uno de ellos es la descomposición del agua por descomposición directa (Biofotólisis directa). El otro es valiéndose de
los azucares previamente sintetizados, fermentarlos para obtener el H 2 (Biofotólisis indirecta). Se presenta el
proceso global. Tiene un bajo rendimiento. Y si se lo compara con la producción con Clostridium, se queda con los
Clostridium como productores de H2. De todas maneras, las microalgas tienen la ventaja de crecer de manera
fotosintética, que el Clostridium no (aunque Clostridium puede crecer en una amplia variedad sustratos con bajo
nivel como residuos lignocelulósicos).

Producción de Butanol

La síntesis de butanol históricamente estuvo La fermentación ABE fue la bioindustria mayor escala cada vez
asociada a la síntesis de acetona. El proceso se ejecuta en segundo lugar a la fermentación del etanol. Por
conoce como fermentación acetobutirica o 1927, butanol se utiliza cada vez más para la producción de
acetona-butanol, y en las primeras cepas utilizadas, acetato de butilo el disolvente de laca y para la industria del
además de CO2 y H2 se producía etanol, por ello la caucho sintético.
fermentación también se conoce como
fermentación ABE.
Las primeras cepas se pueden encontrar: ATCC 824, se usaban para la obtención de acetona, butanol y etanol, en
relación de rendimientos 3:6:1. Posteriormente, se fueron haciendo mutaciones y surgen nuevas cepas donde ya el
etanol no interesa (se produce muy bien microbiológicamente por la fermentación alcohólica) y el C va a unir a
productos como acetona y butanol que son productos de mayor interés. Entonces se mejoró la relación llevándola a
acetona, butanol 4:9. Luego en una cepa hiperalmidolítica (puede crecer y desdoblar el almidón), el butanol se
produce tres veces más que la acetona. La acetona sería un subproducto. Antes cuando se la producía naturalmente,
a la acetona se la llamaba solvente. La acetona se usaba para la síntesis de explosivos. Hoy en día tanto la acetona
como el butanol se producen mayoritariamente en la industria de la petroquímica. El butanol se usaba por ejemplo
para la síntesis de pinturas.

Los Clostridium que tienen importancia acá tienen importancia médica y biotecnológica. El Clostridium tetani
se utiliza para la producción de vacunas. El Clostridium botulinum para la producción del Botox.

En el caso de la producción de acetona y butanol, particularmente interesa el butanol. Se parte de la

glicólisis tradicional, partiendo de Glucosa que da 2 piruvatos que pasa a 2 acetil-CoA. Se está formando
NADH y de alguna forma los microorganismos deben encontrar la forma de reciclarlo. Una posibilidad (se
encuentra en línea de puntos) es que el Clostridium regenere el NADH a NAD+ a través de la producción de
ácido láctico, pero la vía no es demasiado importante para que forme el subproducto y pueda sobrevivir y
obtener energía adecuadamente por el proceso fermentativo. Está marcada la síntesis a partir de la glucosa-
6-fosfato de un polisacárido llamado granulosa que en el caso de Clostridium es una equivalencia a nuestro
glucógeno, es decir que es una molécula de reserva de carbono y energía. Las moléculas de interés hasta
ahora son NADH y la acetil-CoA y la emisión de CO2 (subproducto del metabolismo).
Se puede partir de glucosa, pentosas y tienen la capacidad de sintetizar enzimas exocelulares que desdoblan
polisacáridos.
Una de las cosas importantes en este metabolismo es pasar acetil-CoA a acetato (se evidencia por la
aparición de acetato en el sobrenadante del medio de cultivo). Se transforma y se obtiene ATP y energía.
Si se grafica la reacción y el tiempo de cultivo, el pH del sobrenadante (mediante una sonda con
monitorización online) se ve que el pH arranca en un pH cercano a la neutralidad y conforme se comienza a
sintetizar ácidos el pH comienza a bajar, excepto que se neutralice o que la capacidad buffer del medio no
permita evidenciarlo. En principio el pH descendería. Pero más importante que la producción de acetato, es
la condensación de dos moléculas de acetilo para producir el acetoacetil-CoA. Se recicla la CoA de una de las
moléculas de acetilo. El acetoacetil-CoA tiene la función de reciclar el NADH a NAD+, formando el 3-
hidroxibutiril-CoA. Hay una deshidratación de la molécula formando un doble enlace y dando lugar a
crotonil-CoA (saca uno de los átomos de O que contienen los 4 átomos de C). El crotonil-CoA puede ser
reducido a expensas del NADH (por lo que se vuelve a reciclar el Nad+) para producir butiril-CoA y que puede
sintetizar ATP, formando butirato. El butirato se exporta al sobrenadante y va a colaborar con la bajada de
pH que se observa macroscópicamente en el
fermentador. Si se grafica además la concentración
de acetato/butirato “copia” el fenómeno y explica
por qué esa bajada de pH.
En paralelo con esto, cómo se produce hidrógeno en
Clostridium: el Clostridium tiene hidrogenasas que
permiten reciclar el NADH usando el H que contiene
para la síntesis de H2, y para lo cual esa
deshidrogenasa requiere además de un polipéptido
de 100 aa que se denomina ferrodoxina, que tiene
comportamiento rédox (se pasan los H+ entre NADH,
ferrodoxina, deshidrogenasa, para la síntesis de H2).
Si el NAD+ se recupera con producción de H2, esta
ruta compite con la síntesis de butirato. Si hay
producción de H2 y no se busca obtener H2 sino
butanol, conviene inhibir la ruta metabólica. Otro
ejemplo de ingeniería bioquímica fue burbujear en
los fermentadores CO, de esta forma se inhibe la
hidrogenasa presente durante el trascurso
metabólico, y al no ser funcional no hay producción
de H2 (se saca una de las rutas que distrae de la
síntesis de butirato) Fase acidogenica.

Clostridium fue uno de los que su genoma que se conocieron hace 20 años por su importancia industrial. Por
lo tanto otra posibilidad es recurrir a la ingeniería genética y de alguna manera inhibir la expresión del gen
que codifica para la hidrogenasa o alguna de sus subunidades.
Los intermediarios que sintetizo previamente y que aportó al sobrenadante como producto intermedio de la
fermentación, puede reaprovecharlos en caso de agotamiento de algún nutriente o algún exceso del acetato
y del butirato que se fueron acumulando en el sobrenadante. Se reincorporan a la célula y se metabolizan. El
 acetato puede volver a transformarse a acetil-CoA, el butirato a butiril-CoA (no por las reacciones inversas)
sino por uso de enzimas que usan acetoacetil-CoA y que va a transformarse en acetoacetato como producto
y que a través de la decarboxilasa va a formar acetona. El CO2 es un subproducto. El butirato es
intermediario al ser re-transformado a butiril-CoA puede ser reducido a expensas de NADH a butirilaldehido
y con NADPH a butanol. El butanol se exporta al sobrenadante. La concentración del acetato/butirato
comienza a disminuir y el pH se recupera, a expensas de la aparición en el sobrenadante de la acetona,
butanol y etanol. Fase solventogénica, genera lo que antes se conocían como solventes. Esto es como algo
particular, luego cada cepa tendrá su particularidad, es como algo didáctico para la representación. La curva
en el laboratorio no da fases tan definidas.

Una época en la que tenía importancia hacer acetona/butanol, en la facultad se hizo la experiencia, para no
burbujear CO2 que puede ser costoso, se cultivaba primero un Bacillus aeróbico que consumía O2 y
enriquecía el medio con vitaminas. Cuando se lograba la anaerobiosis del fermentador, se inoculaba con el
Clostridium para el desarrollo de la fermentación aceto-butirica.

Algo acnedótico de esta producción, puede existir contaminación con lactobacilos, ya que comparten el
ambiente anaeróbico. Se desarrollaron las primeras infecciones industriales con bacteriófagos, tiene gran
importancia en procesos de producción de starters para los productos lácteos. Los bacteriófagos también se
utilizaron en la producción de acetona y butanol, ya que eran procesos descuidados.

Hay alternativas moleculares para la producción de acetona y butanol. En este caso se hizo un trabajo con E.
coli. Se parte de glucosa o de alguna pentosa, se produce NADH. Se fueron inhibiendo genes que codifican
enzimas, evitando que los intermediarios de la glicolisis formen etanol u otro producto que la cepa tiene la
capacidad de producir a expensas de la introducción de genes que no están naturalmente presentes en
E.coli, se recicle NADH permitiendo que la célula sobreviva a la fermentación artificial a la que se la somete
por métodos moleculares. Por ahora los rendimientos son bajos.

Uno de los problemas que existen es la toxicidad del butanol hacia E.coli que es una cepa que naturalmente no está
preparada para resistir la deshidratación que puede darse por altas concentraciones de alcohol. Algunas cepas de
Clostridium tienen el metabolismo conocido como ruta de Wood–Ljungdah, que a expensas de dos moléculas de
CO2, con el ciclo del tetrahidrofolato puede sintetizar acetil-CoA. Hay enzimas que utilizan al Co como cofactor,
donde el CO o CO2 es reducido para conjugarlo se usa CoA. En la biorrefineria no se podría incluir esta etapa que
realiza Clostridium para el tratamiento de esos gases cuestionables.

Etanol
Se produce industrialmente. Hay muchos microorganismos que están descriptos para la producción de etanol. Vimos
el caso de E. coli y Clostridium, pero se destaca especialmente en la bibliografía la levadura Saccharomyces cerevisiae
(se utilizan distintas cepas, que se enfrentan a distintos sustratos)
La Saccharomyces que se utiliza para la producción de etanol comparte plataforma industrial con una bacteria,
Zymomonas mobilis, de dónde se extrajo el gen que formaba el éster metílico.
El etanol se utiliza como alco-nafta, se puede utilizar en cortes con combustibles derivados del petróleo tradicional.
Como es higroscópico, es deshidratante y puede ocasionar inconvenientes, por lo que habrá que hacerle alguna
adaptación al motor. En países como Brasil se utiliza 100% etanol como combustible.
El proceso fermentativo ha progresado en el tiempo y no fue desplazado como si lo fue la fermentación butírica, por
dereivados de petróleo. El aporte de la fermentación alcohólica es del 80% del etanol que se comercializa, el resto se
obtiene por métodos químicos de la oxidación del etileno.

¿Qué diferencia hay entre los dos microorganismos mayoritarios en la producción de etanol?
Saccharomyces cerevisiae produce etanol por la glicolisis (Ruta EMP). Donde produce etanol, CO2, NAD+, 2 ATP.

Glucosa = 2 Piruvato + 2 H+ +2 NADH + 2 ATP

2 (Piruvato- + NADH + H+ = etanol + NAD+ + CO2)

-El nivel de tolerancia etílica es de 210 g/L

-La temperatura óptima es de aproximadamente 30°C
-Es una especie considerada GRAS

Zymomonas mobilis sigue la ruta de ED, que produce CO2, etanol, y una sola molécula de ATP. La menor producción
de ATP, para algunos autores tiene una trascendencia tecnológica fundamental porque al haber menor producción
de ATP, hay una menor producción de biomasa. De esta forma se evita la generación de un exceso de biomasa, para
disminuir los pasos de downstream entre otros. (por ejemplo qué hacer con la disposición de biomasa)

Glucosa = 2 piruvato- + 2H+ + 2 NADH + 2 ATP

2 ( piruvato- + NADH + H+ = etanol + NAD+ + CO2)

-El nivel de tolerancia etílica es de 120 g/L

-La temperatura óptima es de aproximadamente 37°C
-La productividad específica es 2,5 veces mayor a la de S. cerevisiae y presenta mayor osmotolerancia
-Las enzimas se expresan constitutivamente y comprenden un 50% de las proteínas totales celulares.
-Es una especie considerada GRAS

GRAS: generalmente reconocido como seguro. Esta dado por la FDA, status son compatibles con las aplicaciones de
sus productos para trabajarlo más tanquilo.

Dependiendo del sustrato que se tenga se obtendrá:

-Etanol de primera generación: aquellos que provienen de sustratos alimenticios (almidón del maíz, caña de azúcar,
remolacha azucarera). En el caso del azúcar, se da de forma directa, la levadura hidroliza el disacárido, se fermenta
glucosa y fructuosa. En el caso del almidón previamente debe hidrolizarse ya que ninguna de las dos cepas produce
amilasas (excepto que se utilicen cepas recombinantes con esa capacidad y no recurrir a un procesamiento
enzimático primero).
-Etanol de segunda generación: Se produce desde sustratos que no son alimenticios y provienen de subproductos:
materiales lignocelulósicos fundamentalmente (por ej. celulosa). Como no es la celulosa una fuente de carbono y
energía para el ser humano se lo subprecia y es etanol de segunda generación, siendo una característica importante.
Hay ejemplos a nivel mundial de producción de etanol de segunda generación. El proceso consiste en: el material
lignocelulósico (aserrín, bagazo en la aceitera o del campo). Hay un pre-tratamiento que muchas veces tiene que ver
con la molienda de las partículas, para que en el proceso de hidrólisis sea más fácilmente accesible al agente de
hidrólisis. Hay un proceso de hidrólisis enzimático, se genera un mosto y si se trabaja con celulosas se va a obtener
glucosa. Los azucares se llevan a una fermentación alcohólica tradicional con la levadura a expensas de la celulosa.
Hay una separación de los sólidos que pueden ser quemados para producir energía eléctrica o vapor, para después a
través de la destilación recuperar el etanol. Los azúcares se llevan a una fermentación alcohólica tradicional con la
levadura se obtiene posteriormente el etanol con el grado de deshidratación necesario para el uso que se le quiera
dar: puro 95% (usado en farmacia), absoluto 100% (combustible)

Iogen.ccl
Novozymes.com

Hay otros trabajos interesantes, que a través del modelado se que estiman la emisión de gases de efecto
invernadero (GHG) en función del combustible que se utiliza.
Ballat 2011

Los procesos de producción de etanol son batch, fed-batch y continuos. En el diagrama de flujo se muestra eso, se
usa en Brasil para la obtención del etanol a partir de la caña de azúcar. Se tiene una centrifuga continua que permite
separar las levaduras del sobrenadante. La levadura se recicla y del sobrenadante se extrae el etanol. El tema de
reciclar la biomasa, evitando la amplificación del inóculo es algo deseable para ahorrar tiempo e incrementar
rendimiento volumétrico.

Chematur - biostil
Producción microbiana de metano (biogás)
Se da en plantas de tratamiento anaeróbicas.
La síntesis transcurre por lo que se denomina consorcios microbianos, integrado por bacterias quioheterotróficas no
metanogénicas (clostridios, estreptococos, algunas enterobacterias, etc.) y arqueas metanogénicas
(Methanosarcina, Methanosaeta, Methanoculleus, Methanothermobacter, etc.). A veces es muy difícil hacer el
relevamiento biológico, ya que son microorganismos que no se los pueden recuperar en una caja de Petri, cultivar la
colonia e identificar. Entonces hoy en día se recurre mucho a técnicas moleculares para identificar como es la
dinámica de poblaciones en los tratamientos de efluentes.

Hay tres fases que intervienen en la producción de metano:

-Hidrolisis y acidogenesis
-Acetogenesis
-Metanogenesis

Si se parte de efluentes, puede haber gran cantidad de carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos. Las
bacterias hidrolíticas tienen la capacidad de depolimerizar esas sustancias más complejas y llevarlo a sustancias más
asimilables, generando: azúcares, aminoácidos, glicerol, ácidos grasos, bases nitrogenadas). Estos últimos son
sustratos de las bacterias acidogenicas que van a producir butirato y propionato. Luego se entra a la fase de
acetogenesis, donde las bacterias acetogenicas van a simplificar la estructura del butirato y propionato, para
producir acetato y CO2 + H2.
El acetato, CO2 y H2 pueden ser sustrato del resto de los grupos de arqueas para producir el metano (CH 4) y CO2, que
son los constituyentes del biogás. Hay metanógenos acetoclásticos que son capaces de “romper” el acetato para
producir mediante reacción redox: CH4 (forma reducida) y CO2 (forma oxidada). O también el CO2 y H2 soluble,que
quedaron de la etapa de acetogénesis, pueden ser utilizados por otros géneros de arquea (metanógenos
hidrogenotróficos), consumen el H2 para reducir el CO2 y producir CH4; otra posibilidad de fermentación que
coexiste.
Estas dos formas de fermentación coexisten en las plantas de tratamiento de efluentes.

El CH4 es un gas de efecto invernadero y por ello se debe evitar que se liberen al aire.

Producción microbiana de metanol

Se puede dar por dos métodos:
- Uno de ellos es sencillo, a través de microorganismos que tienen la capacidad de codificar
metanomonooxigenasas , el metano es el sustrato y debe solubilizarse en el proceso. Es un proceso
aeróbico. Ocurre una oxidación del CH4 a expensas del NADH, y pasa a CH3OH (metanol). En el fermentador
el CH4 deberá burbujearse (tiene muy baja solubilidad) y por lo tanto es un proceso que requiere mucho
trabajo de ingeniería para que pueda ser satisfactorio.

-
 - Otra alternativa es recurrir a residuos ricos en pectina (pulpa de la remolacha azucarera). La pectinas son
polisacáridos, cuyos azúcares contienen grupos –OH que serán esterificados dando metanol. Hay
microorganismos como Erwinia chrysanthemi (es un fitopatogeno, contiene una enzima Pectin metil
esterasa que hidroliza el éster metílico de la pectina liberando metanol hacia el sobrenadante).

El metanol es un alcohol que se lo puede quemar y usar como combustible. Pero también puede ser un sustrato para
la producción del biodiesel, aunque hoy en día no tiene importancia industrial.