UABC

Facultad de Ciencias Marinas

Oceanologia

LABORATORIO
de
BIOQUIMICA

Práctica 1
Espectrofotometría y ley de Beer-Lambert

Realizada: 24 de Febrero del 2017

Entrega: 28 de Febrero del 2017
Autor: Alejandro Ramírez Sánchez

RESUMEN

La ley de Lambert Beer consiste en la relación que tiene una concentración de una
solución estándar con respecto a su absorbancia a una definida longitud de onda; utilizando
la espectrofotometría se realiza un barrido de 400 a 600nm para encontrar la longitud
óptima para cuantificar la albumina (549.82nm), con base a la longitud optima se generara
una curva de calibración a diferentes concentraciones de la solución estándar y por medio
de la ley de Lambert Beer se calcula la concentración de una solución problema utilizando
la regresión lineal de nuestras absorbancias vs concentración.
INTRODUCCION
 Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las
sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se
puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino
también en ultravioleta (Longitudes de onda más larga) e infrarrojo (longitudes de onda
más corta). Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación,
y a las mediciones a una determinada longitud de onda.

Figura 1: Espectro electromagnético.

La transmitancia T de una solución es la fracción de la radiación incidente que a

determinada longitud de onda es transmitida hacia la solución, dicha relación esta
expresada por la ecuación:
Intensidad de la radiancia transmitida
Transmitancia=
Intensidad de laradiancia incidente

La absorbancia es el proceso que remueve energía radiante de un campo

electromagnético y lo transfiere a otras formas de energía, esta relación está dada por la
ecuación:
I
( )
log 10 0 = Absorbancia
I
Donde I 0 es la intensidad de la luz incidente, y I intensidad de la luz transmitida.

La transmitancia y la absorbancia de una solución se mide a través del

espectrofotómetro, que utiliza las propiedades de la luz así como su interacción con otras
sustancias para determinar la identidad y propiedades de las mismas. La luz de una lámpara
es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa la luz de una determinada
longitud de onda y la hace pasar por un analito encapsulado en una celda. La intensidad de
la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz incidente y
finalmente calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la
concentración de la sustancia.
 La ley de Lambert y Beer describe la relación lineal entre la absorbancia y la
concentración de una muestra descrita por la siguiente formula:
I
( )
log 10 0 = A=εCl
I
I
( )
Donde log 10 0 es definido como la absorbancia A y ε es una constante conocida
I
como coeficiente de extinción molar. El valor de ε dependerá de la naturaleza de la
solución absorvente y de la longitud de onda de la radiación incidente. La absorbancia por
lo tanto es vista como directamente proporcional tanto para la concentración de la solución
absorbente como el grosor del medio absorbente. (Fifield, et al. 2000).

OBJETIVO

Encontrar la longitud de onda óptima para cuantificación de una proteína, elaborar

curva de calibración con diferentes diluciones y por medio de la ley de Beer-Lambert
encontrar la cantidad de proteína soluble de una sustancia problema.

METODO

Materiales Reactivos

 Tubos de ensayo  Solución estándar de albumina

 Pipetas graduadas de 5mL (clara de huevo), 1mL en 100mL
 Pipetero de H2O
 Vaso de precipitado  Reactivo Biuret (3.75 g
 Termómetro CuSO4.5H2O + 1.51 g
 Celdas para espectrofotómetro NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g
 Gradilla NaOH en 250mL de agua
 Piseta destilada)
 Solución Problema

Proceso

1. Diluir albumina de un huevo (1mL en 100mL de H2O) en vaso de precipitado, esta

será la solución estándar.
2. Poner 1mL de solución estándar en un tubo de ensayo.
3. Colocar 4.5mL de biuret en el mismo tubo.
4. Poner en gradilla y marcar como tubo 1.
5. De la solución estándar, tomar 2mL y agregar a un vaso de precipitado con 8mL de
H2O (la llamaremos solución estándar 2).
6. Hacer 4 soluciones más en tubos de ensayo con la nueva solución (Todas deben
tener un total de volumen igual a 5.5ml).
7. Tubo 2: 2mL de solución estándar 2 y 3.5mL de biuret.
8. Tubo 3: 1.5mL de solución estándar 2 y 4mL de biuret.
9. Tubo 4: 1mL de solución estándar 2 y 4.5mL de biuret.
 10. Tubo 5: 0.5mL de solución estándar 2 y 5mL de biuret.
11. Mesclar todos los tubos.
12. Calentar las soluciones en agua a 37C’durante 10 min.
13. Hacer blanco (3mL de biuret y 3mL de H2O).
14. Tomar el tubo 1 y extraer solución en celda.
15. Hacer un barrido de 400 a 600nm (Puede ser diferente dependiendo la
concentración).
16. Determinar longitud de onda óptima (549.82nm).
17. Medir absorbancias de las demás diluciones en la longitud de onda óptima.
18. Medir absorbancia de solución problema.

RESULTADOS Y DISCUSION

Barrido de absorbancia (Albumina)

0.2
0.18
0.17
0.16
0.14
Absorbancia

0.12 0.12
0.1
0.08
0.06
0.04 0.04
0.02
0
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
Longitud de onda (nm)

Figura 2: Grafica de barrido.

En la figura 2 la gráfica es resultante de los datos de absorbancia del barrido en el

espectrofotómetro del “tubo 1” que era 1mL de solución estándar y 4.5 de biuret. Podemos
observar cómo muestra un pico de absorbancia a la frecuencia de onda de 549nm dejando
como el óptimo este valor de longitud de onda para cuantificar las proteínas de la solución,
mientras que a las otras longitudes del barrido disminuye la absorbancia a excepción de las
longitudes de onda menores de 440nm donde vuelve a absorber más luz. Pienso que este
comportamiento en la gráfica puede deberse a la estructura molecular de la albumina que
absorbe a diferentes longitudes de onda que otro tipo de proteínas. [1]
 TUBO 2 3 4 5
Solución 2mL 1.5mL 0.5mL 1mL
estándar 2
Biuret 3.5mL 4mL 5mL 4.5mL
Concentración 0.73 0.55 0.18 0.36
mg
( )
ml
Absorbancia 0.066 0.036 0.013 0.022
Tabla 1: Tabla de absorbancia y concentración

En la tabla 1 se muestra las cantidades de solución estándar 2 y biuret que se

pusieron en cada tubo, junto su concentración y absorbancia.

Curva de calibracion
0.07 0.07
Absorbancia a (549.82 nm)

0.06
f(x) = 0.09 x − 0.01
0.05 R² = 0.93
0.04
0.04
0.03
0.02 0.02
0.01
0.01
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Concentraciones (mg/ml)

Absorbancias Linear (Absorbancias)

Figura 3: Grafica de absorbancias a diferentes concentraciones.

En la figura 3 se puede observar un comportamiento exponencial en los datos de la

absorbancia en función con la concentración de albumina, definiendo el comportamiento en
la ecuación que define la relación entre la absorbancia de luz y la concentración de una
determinada muestra, se encuentra dada por y=0.0939 x−0.0085 donde la absorbancia es
la variable independiente y la concentración es la variable dependiente.

La absorbancia de la solución problema a 549.89nm fue de 0.385, al aplicar la

ecuación y despejar para calcular la concentración se obtiene un valor de 4.19mg/ml.
(|+0.0085|)
C= =4.19 mg/ml
0.0939
CONCLUSION

Por medio de la Ley de Lambert y Beer se comprobó la relación entre la

absorbancia de luz y la concentración de una proteína. En este caso, se determinaron dos
cosas; la longitud de onda óptima para la albumina que presenta una mayor absorbancia, y
la curva de calibración para cuantificar la concentración de una solución desconocida. La
ley de Lambert-Beer es una buena herramienta para cuantificar la cantidad de proteína de
una solución, aunque debe de utilizarse en concentraciones diluidas para que sea válida la
relación de absorbancia y concentración.

Referencias

 Introducción a la Espectroscopia de Absorción Molecular Ultravioleta, Visible e

Infrarrojo Cercano, pag. 1-2 (PDF) por Ing. Carlos Brunatti y Lic. Ana María Martín.
 Fifield, F.W., y Kealey D. 2000. Principles and practice of analytical chemistry.
Blackwell Science Ltd. Quinta Edición. Reino Unido.
 The Beer-Lambert Law. (web)
http://www.chemguide.co.uk/analysis/uvvisible/beerlambert.html
 [1] Métodos físico-químicos en biotecnología (ESPECTROFLUORIMETRIA),
Universidad Autónoma de México-Instituto de biotecnología, María Teresa
Martínez Estrada y Claudia L. Moctezuma González (PDF), pp. 37
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrofluorimetria.pdf

Figuras
 Figura 1. “EFICIENCIA ENERGÉTICA EN EL ALUMBRADO PÚBLICO DEL CENTRO
HISTÓRICO DE CUENCA: TELEGESTIÓN Y SUSTITUCIÓN DE LUMINARIAS” pag. 25
(Tesis) por Luis Leonardo Chabla Auqui & Danny Fernando Córdova Erráez
(Universidad de Cuenca, Facultad de ingeniería).