Práctica Cinetica de la Enzima Ureasa

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Índice

1. Resumen …...…………………………………………………………………….3
2. Introducción ...…………………………………………………………………...4
3. Marco teórico……………………………………………………………………. 5
4. Objetivos…………………………………………….…………………………... 6
5. Materiales………………………………………………….…………………..... 6
6. Metodología……………………………………………………..……………….8
7. Resultados…………………………………………………...…………….…... 8
8. Discusión …………………………………………………………...………….. 12
9. Conclusion……………………………………………………….……………...13
10. Recomendaciones y sugerencias …………………………..………………. 13
11. Referencias…………………………………………………………..………… 13

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~RESUMEN~

En la siguiente práctica nos dimos a la tarea de determinar los diversos factores que
influyen en la actividad enzimática y que técnicas podemos usar en el laboratorio para
llevarlo a cabo, así como el uso adecuado del material de laboratorio.
Para poder identificar los numerosos factores que influyen se dividieron las
problemáticas por cada equipo, especializándose cada uno en factores de cambio
como son: determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato
sobre la velocidad de reacción, determinación del efecto de la variación en la
concentración de enzima sobre la velocidad de reacción de la misma, determinación
del efecto por variación de temperatura y por variación del pH.
Para poder medir uno de los factores que afectan la actividad enzimática como es la
temperatura que nos tocó a nuestro equipo usamos la misma cantidad de urea y
amortiguador solo modificando la temperatura y obteniendo al final el efecto de la
variación de la temperatura sobre la velocidad de reacción de la ureasa obteniendo una
temperatura optima entre los 50°c donde la cinética de la enzima alcanza su punto
máximo de la velocidad de reacción, ya que si se llegase a pasar de esta habría una
desnaturalización por la temperatura y si no alcanza no llegaría a su punto óptimo.
Para el pH se agregaron fosfatos de pH de menor a mayor mililitros con la misma
temperatura para todos, cada enzima tiene un pH óptimo al cual tiene máxima
actividad, por debajo y encima de este pH pierde su actividad óptima
En los otros trabajos la variación fue la concentración tanto de enzima como de
sustrato sobre la velocidad de reacción de la misma, bajo condiciones saturantes de
sustrato, la velocidad de reacción, es directamente proporcional a la enzima.
.

Introducción

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacción enzimáticas y los factores

que la afectan, esta puede ser determinada midiendo la cantidad de sustrato

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consumido o la cantidad de producto formado en una unidad de tiempo bajo
condiciones adecuadas de T° y Ph .
Numerosos factores influyen en la velocidad de las enzimas entre ellas están:
Temperatura, pH, concentración de enzima, tiempo de incubación, inhibidores,
electrolitos y fuerza iónica, sustancias químicas y concentración de sustrato.
El tipo de inhibición en la práctica es irreversible ya que al retirar del medio el inhibidor,
la enzima no recupera su actividad enzimática. Entonces el inhibidor ha destruido algún
grupo función necesario para la actividad catalítica de la enzima.
La importancia de conocer la inhibición y sus diferentes tipos radica en que pueden ser
encontrados en la naturaleza, pero también son diseñados y producidos como parte de
la farmacología y la bioquímica .Los venenos naturales son a menudo inhibidores
enzimáticos que han evolucionado para defender a una planta o animal contra sus
depredadores. Estas toxinas naturales incluyen algunos de los compuestos más
venenosos conocidos hasta hoy.
Los inhibidores enzimáticos son utilizados principalmente como fármacos en el
tratamiento de diversas enfermedades. Muchos de estos inhibidores son capaces de
actuar sobre enzimas humanas y así corregir determinadas patologías. Sin embargo,
no todos los fármacos son inhibidores enzimáticos.
El estudio de los inhibidores es importante porque proporciona información sobre:
mecanismo de catálisis enzimática, especificidad de la enzima, la naturaleza de los
grupos funcionales del sitio activo, no solo tiene aplicaciones en la veterinaria si no en
otras ramas como: Agricultura produciendo herbicidas, insecticidas etc, Medicina
humana con antiinflamatorios, antibióticos etc, así como en la industria alimentaria y la
biotecnología.

Enzimas: cinética enzimática, e inhibición. Coila Añasco Pedro Ubaldo. FMVZ

~MARCO TEORICO~

La Cinética Química estudia los cambios en la concentración de reactivos y productos,

que se dan durante el desarrollo de las reacciones químicas y su relación con el
tiempo. También se ocupa de estudiar la ruta o mecanismo a través del cual se lleva a
cabo la reacción, y el efecto de los factores que la pueden modificar. La velocidad de

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una reacción química se define como el cambio en la concentración de productos o
reactivos en un tiempo determinado.
La temperatura es una medida de la energía cinética molecular promedio de un
sistema. En la mayoría de las reacciones químicas la velocidad aumenta con la
temperatura porque las moléculas se mueven con más velocidad. A mayor velocidad,
aumenta la distancia recorrida por unidad de tiempo y con ella, aumenta la probabilidad
de encuentros. Además, mayor velocidad significa que la energía de los choques
también es mayor, y es más probable que sea suficiente para provocar la reacción.
Las enzimas son proteínas o ácidos nucleicos, más grandes que los substratos o
grupos funcionales. La mayoría de las enzimas son específicas de los substratos que
usan y/o las reacciones que catalizan. Las enzimas son activas en condiciones de pH y
temperatura.
La cinética enzimática estudia el mecanismo, velocidad y los factores que modifican las
reacciones catalizadas por enzimas. Los factores que estudiaremos son la
concentración de sustrato, temperatura, pH y concentración de enzima.
La concentración del substrato tiene un efecto importante en la velocidad de las
reacciones enzimáticas. El análisis del efecto del cambio de concentración de
substrato, proporciona información respecto del mecanismo de reacción, especificidad
y propiedades cinéticas de las enzimas.
Para valores pequeños de la cantidad del substrato limita la velocidad; mientras que
con valores grandes el límite es la cantidad de enzima.
Igual que ocurre en las reacciones químicas, al aumentar la temperatura aumenta la
velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se debe a que un mayor
número de moléculas alcanzan la energía cinética necesaria para superar la energía de
activación de la reacción. Sin embargo, el aumento de temperatura también disminuye
la estabilidad de la estructura de las proteínas y las enzimas comienzan a
desnaturalizarse, de modo que a medida que aumente la temperatura la actividad
enzimática tiende a bajar. Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento
de temperatura, existe una temperatura óptima en la cual la actividad enzimática tiene
un máximo. Es de suponer que a la temperatura normal de los organismos las enzimas
sean estables, y por lo tanto estén por debajo de su temperatura óptima.
El pH del medio afecta la actividad de las enzimas, porque muchos de los aminoácidos
tiene restos ionizables. Los cambios de pH modifican el grado de ionización de todos o
alguno de estos grupos, lo que repercute en la ionización total de la molécula de
enzima modificando su actividad al menos por tres mecanismos.
1. Los pH extremos, por debajo de 4.0, o por arriba de 10.0, cambian el grado de
ionización de casi todos los restos de aminoácidos de la enzima, de forma que puede
alterarse su estructura tridimensional. Si este cambio es suficientemente grande, se
desnaturaliza la enzima y se pierde su actividad de forma irreversible. Incluso, la
disminución del pH, que se presenta en las muestras de fluidos corporales o de tejidos
por daño o muerte celular, puede ocasionar la desnaturalización de las enzimas.

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2. Las variaciones de pH más pequeñas, entre 4 y 10, afectan a un número menor de
grupos ionizables, pero si éstos están presentes en el sitio activo, la actividad
enzimática cambia en forma importante. Sin embargo, este cambio normalmente es
reversible.
3. La variación del pH también puede alterar la ionización del substrato, y modificar la
unión enzima sustrato.
Para muchas enzimas, el efecto del pH tiene forma de campana con un valor de pH
óptimo bien definido.

~OBJETIVOS~
● Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas y la
manera en la que pueden ser observados y medidos en el laboratorio, tomando
como ejemplo la ureasa producida por el frijol de soya.
● Determinara la influencia del inhibidor Bicloruro de Mercurio (HgCl2), en la
reacción catalizada por la ureasa.

~MATERIALES~

Material y equipo:

● 5 Tubos de ensaye grandes

● 3 Pipetas (1,5,10 mL)
● 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
● 1 Bureta de 25 o 50 mL
● 1 Soporte universal
● 1 Pinzas de bureta
● 1 Propipeta
● Gradilla para tubos de ensaye Vortex
● 1 Piseta
● Baño Maria
● Termometro

Reactivos y soluciones:
● Urea 0.25 M.
● Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH 7.2
● Amortiguador de fosfatos de pH diferentes
● Bicloruro de mercurio al 1%
● Acido Clorhidrico 0.1 N
● Rojo de metilo al 0.04%
Muestra biologica
● Extracto de ureasa proveniente de frijol de soya

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Material que deberá traer cada equipo
● Guantes de latex
● Plumon indeleble
● Toallas de papel
● Detergente

~METODOLOGIA~

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~RESULTADOS~

Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre la

velocidad de reacción de la ureasa

Tubo mL de μM de urea inicial en cada mL gastados μM de urea

urea tubo (x) hidrolizada (y)

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 1 0.5 12.5 μM 0.3 mL 15 μM

2 1 25 μM 0.4 mL 20 μM

3 2 50 μM 0.5 mL 25 μM

4 5 125 μM 0.5 mL 25 μM

5 7.5 187.5 μM 0.5 mL 25 μM

Determinación del efecto de la variación en la concentración de enzima (ureasa) sobre

la velocidad de reacción de la misma

Tubo μM de enzima inicial en mL gastados μM de urea

cada tubo (x) hidrolizada (y)

1 0.1 μM 1 mL 50 μM

2 0.3 μM 1.2 mL 60 μM

3 0.5 μM 1.6 mL 80 μM

4 0.7 μM 1.7 mL 85 μM

5 0.9 μM 1.8 mL 90 μM

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Determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la velocidad de
reacción de la ureasa

Tubo Temperatura (x) mL gastados μM de urea

hidrolizada (y)

1 0 °C 0.7 mL 35 μM

2 20 °C 0.9 mL 45 μM

3 50 °C 0.8 mL 40 μM

4 80 °C 0.8 mL 30 μM

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Determinación del efecto de la variación del pH del medio sobre la velocidad de
reacción de la ureasa

Tubo pH del medio (x) mL gastados μM de urea

hidrolizada (y)

1 4.5 0 mL 0 μM

2 6 0 mL 0 μM

3 7.2 2 mL 100 μM

4 8.5 2.4 mL 120 μM

5 10 2.3 mL 115 μM

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~DISCUSIÓN~
Durante el análisis de la primera parte de la práctica, en la determinación del efecto de
la variación en la concentración de la urea sobre la velocidad de reacción de la ureasa,
logramos resaltar que aunque exista mayor concentración de sustrato, existen puntos
en los cuales la enzima se satura y ya no puede procesar todo el sustrato.
En la segunda parte del experimento logramos destacar que si existe un mayor
concentración de ureasa con respecto a la urea, la urea hidrolizada es mayor que en el
procedimiento anterior y no se encuentra estática en ningún punto.
En la tercera parte del experimento donde la temperatura fue la variable, logramos
destacar que si la temperatura aumenta ligeramente, la urea hidrolizada también lo
hace, pero si se eleva excesivamente, la urea hidrolizada disminuye a mayor
temperatura, con esto podemos demostrar los daños que se puede producir si la
temperatura se eleva en el organismo.
Durante la cuarta y última parte del experimento. Donde la variable es el pH del medio,
como en el caso anterior, si el ph se eleva ligeramente, también lo hace la urea
hidrolizada, pero si el pH se eleva excesivamente, la urea hidrolizada comienza a
disminuir, esto también nos demuestra que si en un organismo se producen
alteraciones en el pH, se afecta la actividad enzimática.

~CONCLUSION~

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Los objetivos se cumplieron, se determinaron los factores que influyen en la velocidad
en la que la enzima puede llevar a cabo su reacción, los cuales son: concentración de
sustrato, concentración de enzima, variación de temperatura y variación del pH.
Debido a los alteraciones que pueden causar las variaciones de los factores
anteriormente mencionados, no es bueno someter al organismo a cambios bruscos de
temperatura, a variaciones de pH, o a distintas concentraciones tanto de enzimas como
de sustratos porque estas variaciones pueden provocar diversas enfermedades
metabolicas.
También identificamos que la velocidad de reacción de una enzima puede determinarse
midiendo la disminución en la concentración de sustrato en un cierto tiempo, midiendo
el aumento en la concentración de producto final en una unidad de tiempo determinada
o midiendo los cambios de concentración en una coenzima en un determinado tiempo.
Se colocaron 4 gotas de Bicloruro de Mercurio (HgCl2) en la reacción catalizada por la
ureasa para evitar que las proteínas se desnaturalizan ya que esta sustancia funciona
como inhibidor enzimático.

~RECOMENDACIONES Y SUGERENCIAS~
Como equipo consideramos que para un mejor desarrollo de la práctica que se mejore
la organización con los aparatos que modifican la temperatura de los tubos.
~REFERENCIAS~

Curtis, H., y Barnes, N. (2001). Biología. (6ª. ed.). Buenos Aires: Editorial Médica
Panamericana.

Solomon, E., Berg, L. y Martin, D. (2001). Biología. (5ª. ed.). México: McGraw-Hill
Interamericana.

Chang, Raymond Química, 6ª ed McGraw-Hill, México, 1999.

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