EXTRACCIÓN MANUAL DE ADN A PARTIR DE SANGRE TOTAL EN EDTA

UTILIZANDO EL KIT DE PURIFICACIÓN DE GENTRA

1. Abreviaturas utilizadas.

• ADN: ácido desoxiribonucleido.

• EDTA: ácido etilendiaminotetraacético.

• PBS (Na+K+): Phosphate Buffered Saline (sodio/potasio).

• g: medida de fuerza de centrifugación.

• ml: mililitro.

• min: minutos.

• s: segundos.

• nm: nanómetros.

• Pellet: cúmulo compacto de células y/o restos celulares que se producen en el

fondo de un tubo después de una centrifugación o decantación.

• T.A: temperatura ambiente (18-25°C)

2. Materiales.

• DNA purification systemn PuregenTM, de Gentra Systems (Minneapolis, MN),

compuesto de los siguientes reactivos:
- RBC Lysis Solution.
- Cell Lysis Solution.
- Protein Precipitation Solution.
- DNA Hydratation Solution.

• Isopropanol (2-propanol) al 100%.

• Etanol al 70%.

• Tubos cónicos de 50 ml, tipo Falcon.

• Tubos de 5 ml y 10 ml transparentes, con tapón.

• Puntas de micropipeta de 200 ul.

• Pipetas serológicas de 10 ml, para pipeteador eléctrico.

3. Desarrollo.

3.1. Lisis celular.

Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno, s/n. 37007 Salamanca.
Tlf.: 923 294 833 Fax: 923 294 795 e-mail: bancoadn@usal.es
 • Añadir 8-10 ml de sangre a un tubo Falcon de 50 ml que contenga 30 ml de
RBC Lysis Solution. Invertir el tubo para mezclar e incubar a T.A. durante 5
min ó el tiempo que sea necesario para que se rompan los glóbulos rojos.
Estos estarán lisados cuando el color de la mezcla sea muy oscura; invertir al
menos una vez más durante la incubación.

• Centrifugar a 3000g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante mediante

aspiración por vacio o por decantación, dejando el pellet de leucocitos y 200-
400ul de líquido residual.

• Agitar en vórtex vigorosamente para resuspender las células en el líquido

residual 20s; esto facilita enormemente la posterior lisis de células.

• Añadir 10 ml de Cell Lysis Solution para resuspender las células.

Nota: En este paso se puede parar, almacenar las muestras en oscuridad a T.A. y
continuar en días posteriores. Las muestras son estables en Cell Lysis Solution durante al
menos 2 años.

3.2. Precipitación de proteínas.

• Añadir 3 ml de Protein Precipitacion Solution a las células lisadas.

• Agitar con vórtex vigorosamente a alta velocidad durante 20s para mezclar
uniformemente la Protein Precipitacion Solution con las células lisadas.

• Centrifugar a 2000g durante 6 min. El precipitado de proteínas tendrá forma

de pellet compacto de color marrón oscuro. Si el pellet de proteínas no es
compacto, agitar de nuevo, incubar otros 5 min y centrifugar.

3.3. Precipitación de ADN.

• Decantar el sobrenadante (contiene la suspensión de ADN), dejando dentro el

pellet de precipitación de proteínas hacia un tubo Falcon estéril de 50 m que
contenga 10 ml de Isopropanol al 100%.

• Mezclar la muestra invirtiéndola suavemente unas 50 veces.

• En este paso aparecerá, perfectamente visible, la nube de ADN

resuspendido. La nube tiene color blanco y textura filiforme
(figura 1). Sí en este paso no se observa ADN a simple vista la
muestra se debe desechar.

• Centrifugar a 2000g durante 3 min. El ADN se observará como

un pellet blanco.
Figura 1

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 • Eliminar el sobrenadante con el sistema de aspiración por vacio o por
decantación y poner el tubo invertido sobre el papel absorbente limpio para
secarlo durante unos minutos.

• Añadir 10 ml de Etanol al 70% e invertir el tubo varias veces para lavar el

pellet de ADN.

• Centrifugar a 2000g durante 2 min. Decantar con precaución el etanol

observando que el pellet no se desprenda del fondo del tubo.

• Invertir y secar el tubo en papel absorbente.

• Dar al tubo un pulso de centrífuga durante 10-15s y eliminar el resto de etanol

con una micropipeta de 200ul.

3.4. Hidratación del ADN.

• Añadir 4 ml de DNA Hydration Solution.

Nota: Cuando la nube de ADN obtenido sea pequeña y el pellet de ADN ocupe menos de
la cuarta parte del fondo del Falcon, resuspender el pellet en 2-3 ml de ADN Hydratation
Solution, para evitar que el ADN resuspendido quede diluido en exceso.

• Incubar agitando en el baño a 65ºC durante 1-2 horas y toda la noche a

temperatura ambiente para que el ADN se disuelva totalmente.

• Comprobar la disolución total del ADN mediante pipeteo, comprobando que no

existen grumos ni restos viscosos. Si el ADN no estuviese totalmente disuelto
se puede calentar en el baño a 37ºC agitándolo de forma suave
periódicamente hasta que se disuelva. También se le puede añadir entre 0,5 y
1 ml adicionales de DNA Hydratation Solution.

3.5. Cuantificación de ADN.

• Medir en el espectrofotómetro a longitudes de onda de 260, 280 y 320 nm.

• Para calcular la concentración y pureza del preparado:

- Concentración de ADN: (A260-A320)/0,02

- Relación 260/280: (A260-A320)/(A280-A320)

Nota: Se considera que la pureza del ADN es buena cuando la relación 260/280 se halla
entre 1,7 y 2. Lecturas de absorbancia a 260 nm fuera del rango 0,1-0,9 aconsejan
realizar una dilución diferente para la medida.

4. Referencias.

• Instruction of Genomic DNA Purification Kit. www.gentra.com

Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno, s/n. 37007 Salamanca.
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