Desde hace unos125 años se viene determinando la concentración de una disolución

por el simple artificio de comparar su color con el de otras disoluciones de

concentración conocidas de la misma sustancia. El método Nessler para la
determinación de NH3 fue descrito en 1852 y en la misma época se usó el
sulfocianuro para la colorimetría de hierro. La determinación de Cu (II) con NH3 data
de 1830. Estos primeros ensayos demostraron la validez de estas técnicas para
determinar, de una forma sencilla pequeñas cantidades de impurezas en muchas
sustancias (1).
El fundamento de la colorimetría visual no puede ser más simple: cuando dos
disoluciones coloreadas de una sustancia en el mismo disolvente observadas por
transmisión en condiciones adecuadas, tienen igual color, los espesores de disolución
atravesados por la radiación blanca están en razón inversa de las cantidades de
sustancia disueltas por unidad de volumen, en cada una de las disoluciones. Llamando
I1 y I2 a los espesores y C1 y C2 a las concentraciones, tenemos la siguiente proporción
I1 C2
( = ). Esta expresión se educe igualando las absorbancias A1 y A2 de las dos
l2 C 1
disoluciones, que tienen igual absortividad molar porque se trata de la misma
sustancia en el mismo disolvente; A1=Ɛ I1 C1=A2 = Ɛ I2 , I1 C1=I2 = I2 C2 (1)
El ojo humano no pude medir directamente intensidades luminosas ni es capaz de
apreciar con exactitud la diferencia de intensidad de dos disoluciones. La precisión que
puede alcanzarse se deduce del hecho de que, en condiciones óptimas, el observador
promedio puede percibir, justamente, una diferencia de intensidad del color del 6%,
entre dos disoluciones coloreadas que observa simultáneamente. Por este motivo, el
error en la determinación de concentraciones es de +_ 1.3%, pero como hay otros
factores, esta cifra se eleva 3-5%, que es lo que consigue en la práctica (1).

Una de las principales dificultades en colorimetría es la existencia de varios solutos

coloreados en las disoluciones que van a ser comparadas con patrones. En la
determinación de la acidez de una disolución de CuSO4 con naranja de metilo, no se
puede emplear patrones que solo contienen el indicador y la mezcla tampón. Las
técnicas colorimétricas se clasifican en tres grupos: método por variación de espesor,
método por dilución, método por comparación con una serie patrón (2).
Todas las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas de una
frecuencia o de un intervalo de frecuencias característico de cada molécula, la unidad
de absorción de la radiación electromagnética en química analítica se basa en esta
capacidad y en la relación que existe entre el número de moléculas capaces de
absolver y la cantidad de energía absorbida por ellas.
En electroscopía de absorción molecular se puede emplear cualquier longitud de onda
del espectro electromagnético, pero las que se utilizan con más frecuencia en el
laboratorio clínico son las de regiones visibles y ultravioleta (3).
La le de Beer – Lambert-Bouguer es la ley fundamental que relaciona la concentración
de una molécula en disolución con su capacidad de absorción, es el resultado de la
combinación de la ley de Lambert-Bouger y la ley de Beer (3).
La ley de Lambert-Bouger predice el efecto del recorrido de la radiación a través de un
sistema sobre la fracción de la radiación que es absorbida. Fue formulada primro por
Bouguer en 1729 y confirmada por Lambert en 1768. Utilizando radiaciones paralelas
y monocromáticas (de una única frecuencia) y medios absorbentes de diferente
grosor, Lambert llego a la conclusión de que cada capa de igual grosor absorbe una
fracción idéntica de la radiación que atraviesa. Cuando un haz paralelo de radiación
monocromática de potencia radiante P a traviesa un medio absorbente, la disminución
(dP) que sufre dicha potencia en cada capa (dI) de puede calcularse matemáticamente
−dP
mediante la siguiente ecuación: =K I∗P ; donde KI es una constante de
dI
proporcionalidad; el signo negativo se debe a que se produce siempre una disminución
de la potencia radiante.(4)
La ley de Beer predice el efecto de la concentración de un sistema sobre la fracción de
radiación que este absorbe. Beer, en 1852, utilizo radiaciones monocromáticas y
paralelas, así como disoluciones de diferentes concentraciones de una determinada
molécula, pero mantuvo constante se recorrido de la radiación. Observo que un
aumento lineal de concentración se refleja en la disminución exponencial de la
transmitancia. Esto se pude expresar mediante una ecuación similar a la de la ley de
P t −K ∗C
Lambert =e 2
; siendo K2 una constante de proporcionalidad y C la
Po
concentración de sustancia o de masa del soluto absorbente.(4)
Las limitaciones a la aplicabilidad de la ley de Beer –Lambert-Bouger son: que la
radiación sea monocromática y paralela, que el medio sea isotrópico y homogéneo,
que el recorrido de la radiación sea uniforme, que el único tipo de interacción entre la
radiación la disolución sea la absorción, y que el o los solutos se comporten de
manera independiente entre sí, sean cuales sean su número y tipo. Por otro lado, esta
ley se cumple solo si la disolución no es muy concentrada. (5)
El termino espectrofotometría suele aplicarse cuando la radiación utilizada se extiende
a las regiones ultravioleta e infrarroja, y además, se utilizan monocromadores sin lugar
de filtros así como sistemas de detección más sensible, con tubos fotomultiplicadores.
Es cuanto a la región ultravioleta, hay que indicar que la zona de mayor interés en la
práctica analítica ordinaria es la denominada como ultravioleta próximo (longitud de
onda entre 200 y 400 nm), pues el ultravioleta lejano o ultravioleta vacío (de 10 a 200
nm) presenta el inconveniente de que oxigeno atmosférico absorbe n esa región
siendo necesario eliminarlo del instrumento de medida. Debido a ello la
espectrofometría en esa región no se ha desarrollado suficientemente. (6)
Las fluctuaciones producidas en la corriente eléctrica, la inestabilidad de algunas
fuentes de radiación o a respuesta no lineal del detector pueden originar el
funcionamiento incorrecto de un determinado aparato. Además de estos, pueden
considerarse tres factores de tipo instrumental para causar desviaciones en las leyes
de Lamber y Beer. Uso de radiación no monocromática, presencia de radiación
parasitaria, errores de lectura. Factores de tipo químico para causar desviaciones en
las leyes de Lamber y Beer; influencia del equilibrio: cuando la sustancia problema
interviene o forma parte de un sistema en equilibrio con otras especies, el
desplazamiento del equilibrio implica una modificación en la concentración y, en
consecuencia, en la absorbancia (ejemplos: dimerización, acido-base, complejos).
Influencia del disolvente, influencia de la temperatura, presencia de impurezas en los
reactivos, interacción entre especies absorbentes, interacción soluto-radiación
electromagnética. (7)
Los factores de tipo personal para causar desviaciones en las leyes de Lamber y Beer
son: por uso inadecuado de las cubiertas de absorción, y que no se tienen en uenta
las siguientes recomendaciones:
Es necesario asegurarse de que las cubiertas estén perfectamente limpias, no rayadas
y exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que se ha de pasar la
radiación, la cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con ácido nítrico con agua
regia al frio, pero no con mezcla cromática; una vez limpias las cubiertas deben
enjuagarse con agua destilada y con varias porciones de la disolución medir; no
deben secarse interiormente, mientras que el exterior debe secarse con papel suave,
comprobando, además, que una vez llena con la disolución problema no contiene
burbujas de aire y aunque se debe trabajar con cubetas idénticas para la muestra y
referencia (blanco), es buena práctica utilizar siempre la misma disolución en cada una
de ellas.(7)
La albúmina presente en la clara de huevo puede ser separada, ya que la albúmina
precipita únicamente si la solución en la que se encuentra es saturada con sulfato de
amonio (8).
La caseína está compuesta de proteínas fosfatadas y contiene también calcio con el
cual forman un complejo calcio-caseína. La caseína es l componente principal de la
leche y presenta cerca del 80% de la proteína total, además de participar en muchos
procesos tecnológicos, por ejemplo, la producción de quesos. La caseína es única en
su naturaleza y no existe ninguna sustancia parecida en la sangre ni en los tejidos del
animal (9).
La caseína obtenida comercialmente tiene un color blanco amarillento y forma regular,
pero la obtenida en forma pura es blanca, inodora e insípida; el color blanco contribuye
al color de la leche. La caseína se encuentra en la leche en forma de pequeñas
partículas o micelas de caseína en suspensión y carece de homogeneidad ya que
consta de varias fracciones (10).
Proteínas de la clara del huevo:
Ovoalbumina (54%),Ovotrasnferrina o conalbumina (13%), Ovomucoide (11%),
Ovoglubolinas (7%), Ovomucina (1,6%), Flavoproteinas (0,8%),ovoinhividor (0,5%),
avidina (0,05%) (11).
La desnaturalización de proteínas está influida por varios factores, entre ellos se
encuentran los cambios de temperatura, pH, y detergentes, así como a la radiación,
los cambios en el tipo de solvente, los agentes oxidantes, y reductores que pueden
alterar las uniones s-s. Cuando el pH desciende y se acerca al punto isoeléctrico de
las proteínas, las fuerzas de repulsión son mínimas y por consiguiente las proteínas
tienden a agregarse y a precipitarse, siendo entonces cuando pierden sus propiedades
funcionales (12).
El método Biuret es la técnica más simple para la determinación de proteínas solubles.
Las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo
purpura-violeta con sales de cobre (II) alcalinas. Es posible que el color se desarrolle
por la formación de un ion coordinado, tetracúprico con dos grupos amida adyacentes.
(13)
El desarrollo de color es diferente para cada proteína y su intensidad se puede
determinar espectroscópicamente a 540 nm. La cuantificación de la proteína se lleva a
cabo con una curva patrón utilizando el principio establecido por la ley de Beer. Un
ámbito adecuado para la determinación de la masa de proteínas por este método
oscila entre 20 y 40 mg de proteína. (13)
Existen pocas interferencias en esta determinación; entre ellas la presencia del ion
Amonio altera el desarrollo del color, algunos pigmentos absorben la misma longitud
de onda, algunos lípidos y carbohidratos son capaces de formar complejos con el ion
coordinado.(13)

Bibliografía
(1) Pino F, Pérez D. Análisis de elementos – traza por espectrofotometría de
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(5) Walton H, Reyes J. Análisis químico e instrumental moderno. 1 Ed. Barcelona.
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acuicultura. 1 Ed. Ciudad de México, Limusa: 2002.
(13) Herrera C, Bolaños N, Lutz G. Quimica de alimentos. Manual de
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