Estudios de Comunidades Bacterianas de Un Biofiltro Acoplado A Un Digestor Anaerobio Por DGGE

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES BACTERIANAS DE UN

BIOFILTRO ACOPLADO A UN DIGESTOR ANAEROBIO POR
ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE
DESNATURALIZANTE (DGGE)
ESTANCIA DE TITULACIÓN
PRESENTA:
JOSÉ ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ
ALUMNO DE LA CARRERA:
ING. BIOTECNOLÓGICA
BAJO LA DIRECCIÓN DE:
DRA. ELVIA INÉS GARCÍA PEÑA
JUNIO, 2010
ESTUDIO DE COMUNIDADES BACTERIANAS DE UN BIOFILTRO ACOPLADO A UN DIGESTOR
ANAEROBIO POR ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DESNATURALIZANTE (DGGE)
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................................................. IV
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................................... V
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
2 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................. 7
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 8
3.1 GENERAL ...............................................................................................................................8
3.2 ESPECÍFICOS ...........................................................................................................................8
4 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 9
4.1 EXTRACCIÓN DE ADN DE MUESTRAS DEL BIOFILTRO ......................................................................9
4.2 DISEÑO DE INICIADORES .........................................................................................................10
4.3 ESTANDARIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN POR PCR ............................................10
4.4 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE DGGE..............................................................................11
4.4.1 Preparación de reactivos para formar el porcentaje de agente desnaturalizante
adecuado ..................................................................................................................................11
4.4.2 Formación del gradiente de agente desnaturalizante en el gel de poliacrilamida. .......12
4.5 ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS AMPLIFICADAS POR PCR EN UNA DGGE ..............................................13
5 RESULTADOS Y ANÁLISIS ................................................................................................. 14
5.1 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ..........................................................................................14
5.2 ELECCIÓN DE INICIADORES ......................................................................................................16
5.2.1 Elección del iniciador sentido ........................................................................................16
5.2.2 Elección del iniciador Antisentido .................................................................................17
5.2.3 Análisis de los iniciadores .............................................................................................18
5.3 CONDICIONES PARA AMPLIFICACIÓN POR PCR ............................................................................19
5.3.1 Amplificación de ADN por PCR con el iniciador BAC_FGC ............................................20
5.4 CONDICIONES PARA EVALUAR LAS MUESTRAS EN LA DGGE ...........................................................21
5.4.1 Condiciones de gradiente desnaturalizante en la DGGE ...............................................21
5.4.2 Tiempo idóneo para correr las muestras en la DGGE ...................................................22
5.5 ANÁLISIS DEL PATRÓN DE BANDAS EN EL GEL DE POLIACRILAMIDA...................................................23
5.5.1 Similitud y en las poblaciones microbianas ...................................................................24
5.5.1.1 Similitud de comunidades microbianas en diferentes tiempos de operación del
biofiltro 26
5.5.1.2 Similitud de comunidades microbianas en diferentes niveles del biofiltro...........28
6 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 31
7 REFERENCIAS .................................................................................................................. 32
J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ II

APÉNDICE ............................................................................................................................... 35
BUFFER TAE 50X ...........................................................................................................................35
PERSULFATO DE AMONIO 5% .......................................................................................................35
TINTE DE CARGA EN EL GEL...........................................................................................................35
BUFFER TAE DE CORRIMIENTO 1%................................................................................................36
ACRILAMIDA/BIS 40% (37.5:1)......................................................................................................36
J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ III

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diferentes caminos que se pueden tomar para el seguimiento de comunidades

microbianas (Muyzer y Smalla, 1998; Amann et al., 1995) ................................................................2
Figura 2. PCR usando la cola de GC, se demuestra que con un solo iniciador que tenga la cola de
GC se pueden generar suficientes copias de ADN con la cola de GC,. ................................................4
Figura 3. Biofiltro acoplado a un digestor anaerobio indicando los lugares donde se tomaron las
muestras. ...........................................................................................................................................9
Figura 4. Sistema utilizado para la técnica de DGGE (BIO RAD D-Code System). .............................11
Figura 5. Jeringas con las soluciones para forma el gradiente desnaturalizante en el gel de
poliacrilamida (Bio-Rad Cat. 170-9080). ...........................................................................................13
Figura 6. ADN extraído de las muestras del biofiltro. Pozo 1a-9a ácidos nucleícos de las muestras a
diferentes tiempos de operación del biofiltro. Pozos 9b, 9c y 9d representan ácidos nucleícos en
las diferentes posiciones del biofiltro. Corrido en un gel de agarosa 1%, 120 V, 90 min. ................14
Figura 7. Región más conservada para escoger el iniciador sentido. ...............................................17
Figura 8. Región más conservada para escoger el iniciador antisentido. .........................................18
Figura 9. Ciclo de PCR para la amplificación el ADN extraído de las muestras del biofiltro. ............19
Figura 10. Productos de PCR de ADN extraídas del biofiltro evaluadas en diferentes diluciones. Gel
de agarosa 1%, 90 V, 120 min. .........................................................................................................20
Figura 11. Productos de PCR de ADN extraídas del biofiltro usando los iniciadores BAC_FGC y
BAC_R. Gel de agarosa 1%, 90 V, 60 min. .........................................................................................21
Figura 12. Gel de poliacrilamida al 6%. Gradiente 0-100%, 2h de corrimiento, 200 V, 60 °C. ..........22
Figura 13. Cinética de corrimiento cada 30 min, gel de poliacrilamida al 6% por 6.5 horas, 200 V, 60
o
C. .....................................................................................................................................................23
Figura 14. Patrón de bandas de los productos de PCR de diferentes muestras del biofiltro en un gel
de poliacrilamida al 6%. Gradiente 15-60%, 6 h de corrimiento, 200 V, 60 °C. ................................24
J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ IV

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Comparación de diferentes técnicas usadas para identificar comunidades microbianas. ....5
Tabla 2. Diferentes índices para de similitud y de diversidad más usados. ........................................6
Tabla 3. Reactivos y cantidades que se usaron para la PCR .............................................................10
Tabla 4. Concentraciones de los reactivos que se usaron para formar el porcentaje de agente
desnaturalizante en el gel de poliacrilamida. ...................................................................................12
Tabla 5. Análisis por espectrofotometría del ADN extraído. ...........................................................15
Tabla 6. Análisis de los iniciadores diseñados. .................................................................................19
Tabla 7. Matriz de presencia y ausencia de bandas en cada uno de los pozos. ...............................25
Tabla 8. Bandas iguales comparando las diferentes muestras de ADN del biofiltro tomadas a
diferentes tiempos de operación. ....................................................................................................26
Tabla 9. Matriz de similitud analizada con el índice de Jaccard de las poblaciones bacterianas de las
diferentes muestras tomadas a un determinado tiempo de operación del biofiltro. ......................27
Tabla 10. Matriz de similitud analizada con el índice de Sorensen-DIce de las poblaciones
bacterianas de las diferentes muestras tomadas a un determinado tiempo de operación del
biofiltro. ...........................................................................................................................................28
Tabla 11. Bandas iguales comparando las diferentes muestras de ADN del biofiltro tomadas en
diferentes sitios del biofiltro. ...........................................................................................................29
Tabla 12. Matriz de similitud de las muestras tomadas en diferentes alturas del biofiltro,
analizadas con el índice de Jaccard y de Sorensen-Dice. ..................................................................30
J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ V

1 INTRODUCCIÓN
La biofiltración es una tecnología usada para el tratamiento de emisiones gaseosas, como ácido
sulfhídrico (H2S) y ácidos grasos volátiles (AGVs) (Ácido acético, propiónico, butírico), producidos
en diferentes procesos como sistemas de digestión anaerobia (Ramírez-Sáenz et al., 2009). La
presencia de estos ácidos alteran el pH en el biorreactor e inhiben el crecimiento de
microorganismos que son usados en estos procesos (Barnes, S., 2003; Colon, G., 2001). Este tipo
de sistemas es complejo por la presencia de un consorcio microbiano que es necesario caracterizar
para conocer la interacción que tienen cada una de las poblaciones microbianas que llevan a cabo
el proceso de limpiar el gas que pasa a través del biofiltro, y para mejorar el desempeño y
operación de estos sistemas. Se tienen reportados algunas cepas de Thiobacillus que remueven el
H2S (Barbosa, VL, 2006), también se han reportado especies de Rhodococcus para remover AGVs
(Ramírez-Sáenz et al., 2009).
Por mucho tiempo se buscaron técnicas para la caracterización de un consorcio microbiano, la

microscopia y el cultivo en agar no habían sido muy útiles debido a la similitud en la morfología
que tienen diversos microorganismos y a las condiciones específicas de cultivo que son necesarias
para el crecimiento de éstos (Ferris et al., 1996), además de que existen muchos microorganismos
que hasta ahora no son cultivables.
Una alternativa para conocer la composición poblacional de un consorcio microbiano es el uso de

técnicas de biología molecular que proveen un análisis de los microorganismos sin la necesidad de
cultivarlos. El uso de estas técnicas involucra el análisis de la regiones variables del gen 16S rDNA
de las comunidades procariontas (Moyer et al., 1994).
El desarrollo de las técnicas de la biología molecular ha facilitado la identificación de

microorganismos de un consorcio microbiano, por lo que se pueden seguir diferentes caminos (fig.
1). Las genotecas por ejemplo son creadas amplificando por PCR las regiones o fragmentos del gen
16S rDNA y conservándolas en E. coli. Se secuencian estos fragmentos clonados y se comparan en
bancos de datos genómicos para la identificación de los microorganismos.
J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ 1

MUESTRA
aislamiento
CULTIVOS
Extracción de ácidos nucleicos

Análisis de hibridación
Adaptación del cultivo

ADN ARN
PCR RT-PCR
PRODUCTOS DE PCR
DGGE, TGGE, T-FLP clonación

PCR
MARCADORES GENÉTICOS LIBRERÍA EN CLONAS

Análisis de hibridación
Secuenciación de Secuenciación de
bandas individuales clonas
COMPARACIÓN EN BASE DE DATOS
PRUEBAS DE ÁCIDOS ÁRBOL

NUCLEICOS FILOGENÉTICO
Figura 1. Diferentes caminos que se pueden tomar para el seguimiento de comunidades microbianas (Muyzer y Smalla,
1998; Amann et al., 1995)
La Hibridación in situ con Fluorescencia (FISH) es una técnica que consiste en hibridar una sonda
de ADN con su secuencia complementaria. La sonda es etiquetada incorporando nucleótidos

fluorescentes. Finalmente las sondas unidas con sus objetivos (secuencias de ADN del
microorganismo de interés) son visualizadas in situ por microscopia (Volpi y Bridger, 2008).
El análisis por Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (T-RFLP) de las comunidades

microbianas usa productos de PCR donde uno de los iniciadores utilizados esta marcado con
fluorescencia. Después de la amplificación, el producto de PCR es digerido con una o varias
enzimas de restricción y se visualizan en un gel de electroforesis y se analiza la abundancia con las
intensidades de las bandas terminales que tienen fluorescencia, para que después éstas puedan
ser secuenciadas (Moeseneder et al., 1999).
El Análisis de Restricción del ADN ribosomal Amplificado (ARDRA), esta técnica se basa en
amplificar por PCR el ADN ribosomal y después tratar el producto de PCR con enzimas de
restricción, se separan los fragmentos resultantes en un gel de alta densidad de agarosa o en geles
de poliacrilamida. El patrón de bandas obtenido es característico de cada especie por lo que es
posible la identificación de los microorganismos (Sklarz et al., 2009).
Durante la Electroforesis en Gel con Gradiente de Temperatura (TGGE) se amplifican por PCR
muestras de ADN con iniciadores universales, seguido de un análisis en un gel de acrilamida
usando un gradiente de temperatura para desnaturalizar el ADN y encontrar el número de
poblaciones presentes en un consorcio microbiano (Muyzer y Smalla, 1997)
La Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante (DGGE) ofrece numerosas ventajas entre
ellas están las de poder analizar comunidades bacterianas presentes en un biofiltro que
constituyen una población mayor al 1% del total (Muyzer et al., 1993), cuenta con la sensibilidad
de separar las bandas de ADN con solo un cambio en la base de la secuencia de ésta (Lu et al.,
2007). En un solo gel se pueden comparar el comportamiento de las comunidades microbianas.
Sin embargo es necesario estandarizar las condiciones de la DGGE para este tipo de muestras.
El fundamento de la DGGE es la separación de productos de PCR amplificados en la región 16S

rDNA (Muyzer et al., 1993), las bandas de ADN se logran separar por un gradiente de agente
desnaturalizante que se crea en el gel de poliacrilamida, entonces los fragmentos de ADN que
tengan menor cantidad de enlaces G-C son las muestras que se desnaturalizarán más rápidamente
y se detendrán parcialmente en el gel y se observarán en la parte superior, las que contengan
mayor cantidad de uniones G-C en la estructura del ADN son las que recorrerán una distancia

mayo en el gel. Pero para que las bandas de ADN no se desnaturalicen en su totalidad es necesario
agregar una cola de GC al amplificar por PCR las muestras de ADN con esto se evita la total
desnaturalización del ADN y se pueden observar mejor las bandas en el gel (fig. 2) (Muyzer et al.,
1993).
Cola de GC
Primer ciclo
Segundo ciclo
Tercer ciclo
Cuarto ciclo
Figura 2. PCR usando la cola de GC, se demuestra que con un solo iniciador que tenga la cola de GC se pueden generar
suficientes copias de ADN con la cola de GC,.

Todas estas técnicas permiten el análisis de comunidades microbianas en un sistema de

biofiltración (Tabla 1).
Tabla 1. Comparación de diferentes técnicas usadas para identificar comunidades microbianas.

Método Ventajas Desventajas Referencia
Análisis de muchas clonas
Alta resolución
Genotecas del para identificación de varias Purkhold et al,
filogenética de distintos
16S rDNA especies; no da información 2000
entornos
cuantitativa
Es relativamente sencillo y Es necesario la combinación
Volpi y Bridger,
FISH específico así como muy con otras técnicas para una
2008
flexible mayor resolución
Se puede cuantificar la
abundancia de las Alto costo en la secuenciación Moeseneder et
T-RFLP
comunidades; alta automática al., 1999
resolución
Parcialmente exitoso para
Diferencía géneros
identificar especies de Sklarz et al.,
ARDRA basándose en la
microorganismos del mismo 2009
fermentación in-silico
género
Mucho tiempo para la
Fragmentos de la misma migración de fragmentos
Muyzer y Smalla,
TGGE longitud pueden ser grandes de ADN ; Dificultad al
1998
separados controlar un gradiente de
temperatura
Fragmentos de la misma
longitud pueden ser Mucho tiempo para la
Muyzer y Smalla,
DGGE separados; Fácil de migración de fragmentos
1998
realizar el gradiente grandes de ADN
desnaturalizante

La finalidad de la DGGE es analizar el comportamiento de las comunidades bacterianas en un

sistema en tiempos determinados para conocer su evolución.
Los cambios en las comunidades bacterianas de un sistema pueden describirse con relaciones
matemáticas indicando la diversidad describiendo la heterogenecidad de un sistema, también se
puede describir la abundancia por el aumento o disminución de algunas comunidades bacterianas.
El análisis de un consorcio microbiano se realiza tomando en cuenta las intensidades relativas de

las bandas de un DGGE, se usa el índice de diversidad de Shannon-Weaver (H’) para conocer la
diversidad estructural (Ledder et al., 2007) y para estudiar la dominancia de las especies se
emplea el índice de Simpson (S) (Omar y Ampe, 2000) (Tabla 2).
Para comparar comunidades microbianas entre dos muestras se analiza la ausencia o presencia de
bandas en un DGGE, usando un sistema binario y asignando el valor de 0 a la ausencia y 1 a la
presencia de una banda. Las dos relaciones más usadas son el índice de Jaccard (J) y el índice de
Sorensen-Dice (SD) (Schloss y Handelsman) (Tabla 2).
Tabla 2. Diferentes índices para de similitud y de diversidad más usados.

Índice Expresión matemática
𝑛
Shannon-Weaver
′
𝐻 =− 𝑃𝑖 ∙ 𝑙𝑜𝑔2 𝑃𝑖
𝑖=1
𝑃𝑖 = 𝑛𝑖/𝑁
𝑛
Simpson
𝑆= 𝑃𝑖 2
𝑖=1
Jaccard 𝑛𝐴𝐵
𝐽=
𝑛𝐴 + 𝑛𝐵 − 𝑛𝐴𝐵
Sorensen-Dice 2𝑛𝐴𝐵
𝑆𝐷 =
𝑛𝐴 + 𝑛𝐵
Donde ni es intensidad relativa de una banda, N es la intensidad

de la suma de todas las bandas en un carril, n AB es el número de
bandas comunes entre A y B, n A es el número de bandas en A, n B
es el número de bandas en B.

2 JUSTIFICACIÓN
Debido a que la digestión anaerobia es usada para la generación de biocombustibles (usado como
una fuente de energía alterna) a partir de residuos sólidos orgánicos y el biogás generado está
contaminado con otros componentes (AGVs y H2S principalmente). Este tiene que ser tratado
biológicamente con un biofiltro y resulta de interés el estudio de la evolución de las comunidades
bacterianas en el sistema para tratar de explicar la posible interacción que hay entre las
comunidades bacterianas en la degradación de los contaminantes. De esta forma se puede
planear y diseñar sistemas más eficientes. Por otra parte debido a que no todos los sistemas son
iguales es necesario estandarizar de la técnica de DGGE para su estudio.

3 OBJETIVOS
3.1 General
- Analizar las poblaciones microbianas de un sistema de biofiltración usado para tratar
el biogás generado en un digestor anaerobio por DGGE.
3.2 Específicos
- Diseñar iniciadores para las regiones variable del 16S rDNA.
- Obtener fragmentos de 800pb aproximadamente por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) del ADN extraído de muestras del biofiltro.
- Evaluar los diferentes gradientes de desnaturalización de los productos amplificados
por PCR.
- Analizar la variación de las comunidades microbianas del biofiltro por Índices de
similitud.

4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Extracción de ADN de muestras del biofiltro
El ADN se extrajo a partir de 0.5 g de muestra de tezontle de diferentes partes del biofiltro, donde
las muestras se les asignaron claves de letras, la letra “a” corresponde a la muestra tomada en la
parte superior, la letra “b” es la muestra que corresponde a la altura de 2/3 del biofiltro, la
siguiente muestra se tomó a la altura de 1/3 del biofiltro que se le asignó la letra “c”, y la última
muestra que se tomó fue la de la parte inferior del biofiltro que le corresponde la letra “d” (fig. 3).
También las muestras se tomaron (de la parte superior) en diferentes tiempos de operación. Las
muestras de tezontle se trituraron en un mortero y se resuspendieron en 0.5 mL de agua
desionizada estéril, se trataron con 1 volumen de fenol:cloroformo en relación 1:1, se
homogenizaron en vortex y se centrifugaron 5 min a 12000 x g, se recuperó el sobrenadante de
cada muestra en un tubo de polipropileno estéril y se adicionaron 2 volúmenes de etanol absoluto
y se centrifugaron a 12000 x g 20 min, se eliminó el sobrenadante de cada tubo y se lavó la pastilla
de ácidos nucleicos con 1 volumen de etanol al 70%, se centrifugaron a 12000 x g por 5 min, se
eliminó el etanol y se dejaron secar a temperatura ambiente para resuspender en 50 µL de TE pH
8.0 (Sambrook and Russel, 2001).
b
Lugar de la toma
de muestra
Figura 3. Biofiltro acoplado a un digestor anaerobio

indicando los lugares donde se tomaron las muestras.

4.2 Diseño de iniciadores
El diseño de los iniciadores se realizó con el programa Vector NTI 6.0 con una base de datos de
secuencias de la región 16S rDNA de bacterias de la página web de NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), el iniciador sentido diseñado fue el BAC_F (5’ CTCCT ACGGG
AGGCA GCAG 3’) y el antisentido fue BAC_R (5’ GGGTT GCGCT CGTTG CGGGA 3’); al iniciador
sentido se le adicionó una cola de 40 nucleótidos de guanina (G) y citocina (C), BAC_FGC (5’ CGCCC
GCCGC GCCCC GCGCC CGGCC CGCCG CCCCC GCCCC CTCCT ACGGG AGGCA GCAG 3’), en la parte
inicial para llevar a cabo la técnica de DGGE (Muyzer et al., 1993).
4.3 Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR
Se amplificó una región 16S rDNA con los iniciadores diseñados por el grupo de trabajo (BAC_FGC
y BAC_R), las condiciones que se evaluaron y fueron: las concentraciones de ADN (haciendo
diferentes diluciones) en la reacción de PCR. Las condiciones de ciclo de PCR que se evaluaron
fueron: gradientes de temperatura y tiempos de elongación. Se usaron reactivos de la marca
Fermentas cat. EP0281 (Tabla 3).
Tabla 3. Reactivos y cantidades que se usaron para la PCR

Reactivo Cantidad (µL)
10X Taq buffer con(NH4)2SO4) 2.5
MgCl2, 25 mM 5
dNTPs mix, 2 mM cada uno 2
Taq DNA polimerasa (5 u/µL) 0.2
ADN (diferentes diluciones) 2
Iniciadores 1µM (BAC_FGC o BAC_F y BAC_R) 1 cada uno
dH2O Ajustando a 50

4.4 Estandarización de la técnica de DGGE
El perfil de los fragmentos amplificados de las muestras de biofiltro por PCR se obtuvieron por
DGGE en el sistema D-Code system (Bio-Rad Cat. 170-9080) (fig. 4) controlando la temperatura
(60 °C) y un gradiente desnaturalizante de urea y formamida. Se evaluaron gradientes
desnaturalizantes entre valores de 0 a 100%, así como el tiempo de corrimiento para obtener un
perfil adecuado.
Figura 4. Sistema utilizado para la técnica de DGGE (BIO RAD D-Code System).
4.4.1 Preparación de reactivos para formar el porcentaje de agente desnaturalizante

adecuado
Para formar el gradiente de los geles se prepararon 15 mL de una mezcla de reactivos para ajustar
al porcentaje de agente desnaturalizante correspondiente (Tabla 4). El porcentaje de Acrilamida y
N,N’-metileno-bis-acrilamida (37.5:1) usado para formar los geles es de 6 % porque los poros que
se forman permiten un adecuado desplazamiento de las cadenas de ADN que se encuentren en el
rango de 300-1000 pb (Bio-Rad Cat. 170-9080), y ya que nuestro producto de PCR es de 800 pb
aproximadamente, es adecuada esta concentración.

Tabla 4. Concentraciones de los reactivos que se usaron para formar el porcentaje de agente desnaturalizante en el gel
de poliacrilamida.
Porcentaje de agente desnaturalizante
Reactivo 0% 15 % 60 % 100 %
40% Acrilamida- Bis

2.25 mL 2.25 mL 2.25 mL 2.25 mL
Acrilamida
Buffer TAE 50X 0.3 mL 0.3 mL 0.3 mL 0.3 mL
Formamida 0 mL 0.9 mL 3.6 mL 6 mL
Urea 7 M* 0 mL 2.25 mL 9.0 mL 6.3 g
dH2O Ajustar a 15 mL Ajustar a 15 mL Ajustar a 15 mL Ajustar a 15 mL
Volumen total 15 mL 15 mL 15 mL 15 mL
* En el caso de la concentración de 100% de agente desnaturalizante se usó urea sólida.
4.4.2 Formación del gradiente de agente desnaturalizante en el gel de poliacrilamida.
Para que polimericen las mezclas de reactivos preparados anteriormente es necesario agregarles
250 μL de persulfato de amonio al 5% y 25 μL de N,N,N’,N’-Tetrametiletilendiamina (TEMED) a
cada uno de los preparados. Inmediatamente se debe llenar una jeringa con los 15 mL de la mezcla
y anclarlo al formador de gradiente (Fig. 5). El formador de gradiente deposita entre los vidrios (de
16 x 10 cm con un espacio de separación de 1.50 mm) la solución de agente desnaturalizante para
formar el gel de poliacrilamida. La rueda se gira poco a poco para ir agregando cada una de las
mezclas preparadas con distinto porcentaje desnaturalizante hasta formar el gradiente
desnaturalizante requerido (de 0% a 100% o de 15% a 60%). Se deja aproximadamente 30 min
para que polimerice la acrilamida, para finalmente meterlo a la cámara de corrimiento con 7 L de
buffer TAE 1X. Se ajusta la temperatura a 60 °C y se cargan las muestras para correrlas a 200 V por
un determinado tiempo.
Al finalizar de correr las muestras, el gel se tiñe en una charola con 200 mL de buffer TAE 1X y con
5 μL del colorante “Red Texas”, de deja la solución con el gel durante 20 min. Pasando este tiempo
se enjuaga el gel con 200 mL de agua destilada por 10 min, se descarta el agua y se le agrega
nuevamente 200 mL de agua y finalmente se observa el gel a la luz UV.

Figura 5. Jeringas con las soluciones para forma el gradiente desnaturalizante en el gel de poliacrilamida (Bio-Rad
Cat. 170-9080).
4.5 Análisis de las muestras amplificadas por PCR en una DGGE
Después de estandarizar la técnica de DGGE se evaluaron los diferentes productos de PCR para
analizar el patrón de bandas en el gel de poliacrilamida y encontrar la similitud entre esas
muestras del biofiltro usando los índices de Jaccard y de Sorensen-Dice.

5 RESULTADOS Y ANÁLISIS
5.1 Extracción de ácidos nucleicos
La extracción de ADN es crítico para sus posteriores estudios, una buena cantidad así como una
alta pureza son necesarios. Para el sistema de biofiltración es complicado una extracción libre de
trazas de contaminantes por el tipo de muestra que se maneja.
El método de extracción de ácidos nucleicos de fenol-cloroformo es de los métodos más baratos,

por lo que se decidió realizarlo por este método. Aunque una de sus desventajas es que al finalizar
la extracción quedan siempre trazas de éstos solventes por lo que se recomienda realizarse
cuidadosamente.
Aún así el ADN es extraído con el método de fenol-cloroformo (fig. 6), y es analizado por
espectrofotometría para determina la cantidad y pureza del ADN extraído (tabla 5). La solución de
ADN se debe medir a una absorbancia de 260 nm para estimar la cantidad de ácidos nucleicos, un
valor unitario de absorbancia significa que hay aproximadamente 50 μg/mL de ADN en la solución
(Sambrook and Russel, 2001).
1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 9b 9c 9d
Posible ARN
Figura 6. ADN extraído de las muestras del biofiltro. Pozo 1a-9a

ácidos nucleícos de las muestras a diferentes tiempos de operación
del biofiltro. Pozos 9b, 9c y 9d representan ácidos nucleícos en las
diferentes posiciones del biofiltro. Corrido en un gel de agarosa 1%,
120 V, 90 min.

Para conocer la pureza del ADN extraído es necesario medir la absorbancia a 280 nm, y la relación
de las absorbancias, OD260:OD280, debe estar entre 1.8 (60% de proteínas y 40% de ácidos nucleicos
aproximadamente) y 2.0 (0% de proteínas y 100% de ácidos nucleicos) para que la pureza sea
aceptable, si esta relación es menor puede estar contaminado con fenol y/o proteínas (Sambrook
and Russel, 2001).
Como se observa en la tabla 5, solo las soluciones de ADN de las muestras 1a, 2a, 5a, y 9c, tienen
valores aceptables al relacionar las absorbancias de 260 nm y 280 nm. Solamente la muestra 1a
presenta un valor arriba de 1.9 lo que significa que es la muestra más pura de ADN que se extrajo
del biofiltro. Las muestras más contaminada son la 8a que tiene la valor (OD260:OD280) de 1.35 y la
4a con 1.40.
Solo la mitad de las muestras (1a, 3a, 6a, 9b, 9c y 9d) presentan valores altos, arriba de 1000 ng de
ADN en 1 μL de solución.
De acuerdo a muchos autores solo se necesita de 1 ng para que la PCR sea exitosa con ADN
bacteriano (Sambrook and Russel, 2001), por lo que la extracción de ADN del biofiltro fue exitosa y
es factible usarla para amplificar por PCR la región 16S rDNA.
Tabla 5. Análisis por espectrofotometría del ADN extraído.

Muestra Concentración de ADN (ng/μL) Relación (OD260/OD280)
1a 1548 1.93
2a 923 1.82
3a 1745 1.71
4a 150 1.40
5a 908 1.84
6a 1665 1.51
7a 188 1.67
8a 280 1.35
9a 113 1.41

9b 1015 1.77
9c 1313 1.83
9d 1488 1.77
5.2 Elección de iniciadores
Los iniciadores deben ser diseñados de tal manera que se empalmen con cualquier ADN de
bacterias en la región 16S rDNA para el análisis en la DGGE. Con ayuda del programa Vector NTI
6.0 y la base de datos de NCBI se lograron diseñar los iniciadores.
Se analizaron 27 secuencias del gen que codifica para la región 16S ribosomal de diferentes
bacterias, entre ellas la más conocida E. coli, hasta las que son incultivables como la clona R1-FM2,
y otras que han sido reportadas en sistemas de biofiltración para emoción de de AGVs y H 2S como
Rodococcus y Thiobacillus respectivamente (Ramírez-Sáenz et al., 2009).
5.2.1 Elección del iniciador sentido
El iniciador sentido BAC_F que se escogió es 5’ CTCCT ACGGG AGGCA GCAG 3’ y se encuentra
entre las posiciones de 452 pb y 471 pb (fig. 7), se escogió porque es la región más conservada que
se encontró al inicio del alineamiento.
Aunque no es un alineamiento al 100% con todas las bacterias como la clona G-Dunc y la T0-C10
que no se empalman por una sola base, se deduce que no tendría muchos problemas para
alinearse porque este cambio de base se da al inicio y al final del iniciador, y las bases de la
secuencia de BAC_F que si se parece se empalmaría perfectamente con el ADN aunque causaría
una mutación puntual, pero cumpliría el propósito de amplificar.
Una vez teniendo el iniciador BAC_F se le agrega a este la cola de GC quedando entonces la
siguiente el siguiente iniciador BAC_FGC (5’ CGCCC GCCGC GCCCC GCGCC CGGCC CGCCG CCCCC
GCCCC CTCCT ACGGG AGGCA GCAG 3’).

Figura 7. Región más conservada para escoger el iniciador sentido.
5.2.2 Elección del iniciador Antisentido
El iniciador antisentido se eligió tomando en cuenta la región más conservada al final del
alineamiento que se encuentra en la región de 1278 pb y 1298 pb (fig. 8), éste iniciador difiere en
una sola base con las secuencias de las bacterias incultivables clona G-Dunc y la clona R1-FM2.
Pero no debería existir problema alguno al alinearse con el ADN porque este cambio se encuentra
al principio de la secuencia de 5’ TCCCG CAACG AGCGC AACCC 3’.
Pero el iniciador que debe usarse como antisentido es el complementario de la secuencia que se
encontró (5’ TCCCG CAACG AGCGC AACCC 3’) quedando entonces el iniciador BAC_R 5’ GGGTT
GCGCT CGTTG CGGGA 3’.

Figura 8. Región más conservada para escoger el iniciador antisentido.
5.2.3 Análisis de los iniciadores
Los iniciadores que se diseñaron se analizaron en el mismo programa (Vector NTI 6.0) para
conocer la temperatura a la cual se alinean con el ADN (Tm) para que pueda transcribir la
polimerasa, así como para conocer los dímeros y las horquillas (Hairpin loops) que pudieran
formarse entre los iniciadores (tabla 6).
El iniciador BAC_FGC necesita una Tm de 100 °C lo cual se explica por el alto contenido de bases C
y G. Esto podría traer problemas al realizar una PCR por lo que fue necesario estandarizar las
condiciones para la amplificación por PCR.

Tabla 6. Análisis de los iniciadores diseñados.

BAC_F BAC_R BAC_FGC
Tamaño 19 20 59
% GC 68.4 70 89.8
Tm (°C) 54.7 66.7 100
Dímeros 4 3 98
Horquillas 2 1 43
5.3 Condiciones para amplificación por PCR
El ciclo para amplificar el fragmento 16S rDNA se tomó del estándar aunque con una pequeña
variación en el tiempo de elongación de 2 min (fig. 9). EL ciclo comienza con la iniciación de 4 min
para activar la ADN polimerasa, después entra el ciclo con 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y por
último 72 °C por 2 min. La terminación se da con una temperatura de 4 °C por 10 min. Después se
debe confirmar el fragmento amplificado en un gel de agarosa.
Figura 9. Ciclo de PCR para la amplificación el ADN extraído de las

muestras del biofiltro.
Se amplificaron las muestras de ADN (con los iniciadores BAC_F y BAC_R) sin dilución, con una
dilución de 1:10 y de 1:100 (fig. 10). Las muestras de ADN que se usaron directamente no
amplificaron del todo bien, esto posiblemente a las trazas de contaminantes de fenol, cloroformo

o por una cantidad de ADN excesiva que pudiera saturar la reacción. En las diluciones de 1:10
amplifican la mayoría de las muestras por la dilución de los contaminantes y esto propicia una
mejor condición para que se lleve a cavo la PCR. Aunque en la dilución de 1:100 amplifican todas
las muestras debido a que la cantidad de contaminantes se reduce significativamente, y/o que la
cantidad de ADN es adecuada para la reacción.
Sin dilución 1:10 1:100
Figura 10. Productos de PCR de ADN extraídas del biofiltro evaluadas en diferentes diluciones. Gel de agarosa 1%, 90 V,
120 min.
5.3.1 Amplificación de ADN por PCR con el iniciador BAC_FGC
Después de encontrar las condiciones optimas para la amplificación de ADN por PCR con los
iniciadores BAC_F y BAC_R, se amplificaron después con los iniciadores BAC_FGC y BAC_R, en las
mismas condiciones. Los resultados mostraron que también es posible amplificar en las mismas
condiciones cuando se usa el iniciador sentido BAC_F y cuando se usa el BAC_FGC.
Se aprecia que el producto de PCR se encuentra alrededor de 800 pb (fig. 11). En el gel se observa
un barrido alrededor del amplificado de interés posiblemente se deba a la degradación del ADN.

MPM 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 9b 9c 9d MPM
800 pb
600 pb
Figura 11. Productos de PCR de ADN extraídas del biofiltro usando los iniciadores
BAC_FGC y BAC_R. Gel de agarosa 1%, 90 V, 60 min.
5.4 Condiciones para evaluar las muestras en la DGGE
Es necesario encontrar las condiciones a las cuales se deben correr los productos de PCR en una
DGGE, ya que las muestras que se estudian son de un consorcio microbiano desconocido.
5.4.1 Condiciones de gradiente desnaturalizante en la DGGE
Los productos de PCR que se evaluaron en la DGGE con gradiente desnaturalizante de 0% a 100%
fueron una mezcla de todas las muestras de los productos de PCR, esto para tener el total de
bandas que pudieran aparecer en todas las muestras y así encontrar el gradiente más adecuado
para correr las muestras individualmente. En un inicio se observó que los productos amplificados

de bacterias provenientes del biofiltro se desnaturalizaron, en el gel de poliacrilamida corrido en

paralelo, en un gradiente comprendido entre 0% y 50% (fig. 12). Aunque si se hubiera dejado más
tiempo de corrimiento tal vez se hubiera apreciado una mayor resolución de las bandas. Pero este
resultados nos da una idea de cuánto debe ser el gradiente para apreciar mejor las bandas en un
DGGE para este tipo de muestras.
0%
100%
Figura 12. Gel de poliacrilamida al 6%. Gradiente 0-100%, 2h de corrimiento, 200 V, 60 °C.
5.4.2 Tiempo idóneo para correr las muestras en la DGGE
Después de determinar el gradiente sobre el cual se correría el gel, se siguió con el análisis
corriendo el gel por 6.5 h en intervalos de 0.5 h para establecer el tiempo en el cual el producto de
PCR de las bacterias mostraría la mejor resolución (tiempo en el cual se vieron separadas y bien
definidas la mayor cantidad de bandas posibles). Como se logra observar el la figura 13, en el
tiempo 0.5 h se logró observar una banda que avanza rápido sobre el gel, al tiempo de 1 h esta
banda se separa en dos nuevas bandas y se sigue observando a las 1.5 h para posteriormente ver
que a las 2 h ya no se logra percibir, esto puede deberse a los iniciadores que se pudieron
amplificar pero que no afectan al final los resultados con las bandas de interés ya que se sale

completamente del gel. Entre más tiempo pasa la muestra, corriendo en el gel, más se desplazan
las bandas de la concentración de 0% lo cual sugiere que el gradiente de menor concentración
debe subir hacia uno de 15% (como el menor), aunque la mejor resolución con la mayor cantidad
de bandas se obtuvo a las 5.5 h (fig. 13). Pero para el análisis del patrón de bandas se escoge que
sea el gradiente de 15% hasta 60% de agente desnaturalizante y con un tiempo de 6 h.
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5

0%
55%
o
Figura 13. Cinética de corrimiento cada 30 min, gel de poliacrilamida al 6% por 6.5 horas, 200 V, 60 C.
5.5 Análisis del patrón de bandas en el gel de poliacrilamida
Después de encontrar el tiempo y el porcentaje de agente desnaturalizante para correr los

productos de PCR en el gel, se corrieron las diferentes muestras individualmente para encontrar el
patrón de bandas (fig. 14). Se observa que el pozo que corresponde a la banda 9d es la que menos
se parece a las demás en el patrón de bandas esto es debido posiblemente a que como el flujo de
gas se alimenta por la parte superior del biofiltro entonces al llegar a la parte de abajo la cantidad

de nutrientes ya es menor y además que ahí hay acumulación de lodos con escasa cantidad de
nutrientes.
1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 9b 9c 9d
15 %
60 %
Figura 14. Patrón de bandas de los productos de PCR de diferentes muestras del biofiltro en un gel de
poliacrilamida al 6%. Gradiente 15-60%, 6 h de corrimiento, 200 V, 60 °C.
5.5.1 Similitud y en las poblaciones microbianas
Teniendo el patrón del gel se realiza una matriz para visualizar y poder comparar un carril con otro.
El “1” significa presencia de una banda y el “’0” es la ausencia de esa banda en determinado carril.
Se considera la misma banda cuando esta aparece a la misma altura en otro carril, pero si la altura
no es igual se considera otra banda. Se analizaron todas las bandas que aparecieron en el gel, y se
les asigno una letra a cada banda, la primera banda que aparece en el gel se le asigno la letra “A” y
así sucesivamente hasta llegar a la última banda que es la “S”. Siendo un total de 19 bandas
diferentes las que se encontraron.

Tabla 7. Matriz de presencia y ausencia de bandas en cada uno de los pozos.

Banda/Pozo 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 2b 2c 2d
A 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
C 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0
D 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
E 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0
F 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
H 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0
J 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0
K 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0
L 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0
M 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
N 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1
O 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1
P 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1
Q 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1
R 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1
S 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
Total 13 13 16 10 13 15 15 13 10 10 12 10

5.5.1.1 Similitud de comunidades microbianas en diferentes tiempos de operación del biofiltro
Como se mencionó en la metodología se tomaron muestras a diferentes tiempos los cuales son
comparados por índices de similitud de Jaccard (J) y de Sorensen-Dice (SD), estas ecuaciones
comparan dos poblaciones microbianas para lo cual se deben tener datos como el número de
bandas presentes en la muestra de PCR de la comunidad 1 y el número de bandas presentes en la
muestra de PCR de la comunidad 2, al igual que es necesario conocer el número de bandas que
aparecen en las dos comunidades (tabla 8).
Tabla 8. Bandas iguales comparando las diferentes muestras de ADN del

biofiltro tomadas a diferentes tiempos de operación.
2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a
1a 10 12 8 10 10 10 10 8
2a ---- 11 10 10 11 12 12 10
3a ---- ---- 9 13 14 14 12 10
4a ---- ---- ---- 7 8 9 10 9
5a ---- ---- ---- ---- 13 12 10 8
6a ---- ---- ---- ---- ---- 14 11 9
7a ---- ---- ---- ---- ---- ---- 11 10
8a ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 10
Una vez teniendo el número de bandas que son iguales ente dos muestras de ADN, se hace el
análisis con los índices de similitud de Jaccar (tabla 9) y de Sorensen-Dice (tabla 10).
La mayor similitud que se encontró fue entre las poblaciones de las muestras 6a y 7a con un índice
de Sorensen-Dice de 0.933 y con un índice de Jaccard de 0.875.

La menor similitud que se encontró fue comparando las poblaciones de la muestra 4a con la de la
muestra 5a, con un índice de Jaccard de 0.438 y con un índice de Sorensen-Dice de 0.609.
Aunque en general las poblaciones no varían tanto y siempre existe una mayoría de las bandas
que se parecen entre las diferentes poblaciones de las muestras.
Tabla 9. Matriz de similitud analizada con el índice de Jaccard de las poblaciones

bacterianas de las diferentes muestras tomadas a un determinado tiempo de operación
del biofiltro.
2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a
1a 0.625 0.706 0.533 0.625 0.556 0.556 0.625 0.533
2a ---- 0.611 0.769 0.625 0.647 0.750 0.857 0.769
3a ---- ---- 0.529 0.813 0.824 0.824 0.706 0.625
4a ---- ---- ---- 0.438 0.471 0.563 0.769 0.818
5a ---- ---- ---- ---- 0.867 0.750 0.625 0.533
6a ---- ---- ---- ---- ---- 0.875 0.647 0.563
7a ---- ---- ---- ---- ---- ---- 0.647 0.667
8a ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 0.769

Tabla 10. Matriz de similitud analizada con el índice de Sorensen-DIce de las poblaciones
bacterianas de las diferentes muestras tomadas a un determinado tiempo de operación
del biofiltro.
2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a
1a 0.769 0.828 0.696 0.769 0.714 0.714 0.769 0.696
2a ---- 0.759 0.870 0.769 0.786 0.857 0.923 0.870
3a ---- ---- 0.692 0.897 0.903 0.903 0.828 0.769
4a ---- ---- ---- 0.609 0.640 0.720 0.870 0.900
5a ---- ---- ---- ---- 0.929 0.857 0.769 0.696
6a ---- ---- ---- ---- ---- 0.933 0.786 0.720
7a ---- ---- ---- ---- ---- ---- 0.786 0.800
8a ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 0.870
5.5.1.2 Similitud de comunidades microbianas en diferentes niveles del biofiltro.
Las comunidades bacterianas de los diferentes sitios del biofiltro también se analizaron,
comparando las distintas muestras se observa que las muestras 9a, 9b y 9c comparadas con la 9d
comparten pocas bandas (comunidades bacterianas), lo que nos indica que la población
microbiana de la parte de abajo del biofiltro es diferente con las de las partes superiores del
biofiltro (tabla 11).

Tabla 11. Bandas iguales comparando las

diferentes muestras de ADN del biofiltro tomadas
en diferentes sitios del biofiltro.
2b 2c 2d
2a 10 11 6
2b ---- 10 5
2c ---- ---- 6
Después de encontrar las bandas que son comunes en las diferentes muestras, se analiza ahora la
similitud de las diferentes poblaciones con los índices de Jaccard y Sorensen-Dice (Tabla 12).
Con estos índices se comprueba lo que se dijo en un principio cuando se compararon las bandas
que compartían todas las muestras comparándolas con la muestra 9d, donde se observa que es la
que menos similitud tiene con respecto a las poblaciones microbianas de las demás muestras. Esto
se debe posiblemente a que en la parte inferior del biofiltro es donde se acumulan los metabolitos
o toxinas de las bacterias, pudiendo de esta manera cambiar el ambiente inferior y entonces la
similitud en la población microbiana es ligeramente diferente.
La mayor similitud de comunidades bacterianas están presentes en las muestras 9b con la 9c, que
representan la parte media del biofiltro, con una índice de Jaccard de 0.833 y un índice de
Sorensen-Dice de 0.909.
La menor similitud en la población microbiana esta en las muestras 9b y 9d, la parte media baja y
la parte de hasta abajo del biofiltro, con un índice de Jaccard de 0.333 y un índice de Sorensen-
Dice de 0.500.

Tabla 12. Matriz de similitud de las muestras tomadas en diferentes alturas del biofiltro,
analizadas con el índice de Jaccard y de Sorensen-Dice.
Índice J SD
Muestra 9b 9c 9d 9b 9c 9d
9a 0.769 0.786 0.353 0.870 0.880 0.522
9b ---- 0.833 0.333 ---- 0.909 0.500
9c ---- ---- 0.375 ---- ---- 0.545

6 CONCLUSIONES
Las condiciones idóneas para amplificar la región variable del gen 16S ribosomal por PCR fueron: 4
minutos a 95 °C, y el ciclo comienza con la desnaturalización a 95 °C por 30 s, luego el
alineamiento se da a 55 °C por 30 s, y finalmente la elongación a 72 °C por 2 min, este ciclo se
repite 30 veces.
La concentración de ADN extraído para realiza la PCR debe diluirse 100 veces para que puedan
amplificar la región 16S rDNA. Ya que si se utiliza una mayor concentración las PCR se inhibe en
algunos casos.
La estandarización de la DGGE para las muestras del biofiltro demuestra que se obtiene una buena
resolución de las bandas con un porcentaje de agente desnaturalizante de 15% a 60%, corriendo el
gel en un buffer de TAE 1%, 200 V, por 6 horas.
El patrón de bandas de las muestras del biofiltro tomadas en diferentes tiempos, analizadas con
los índices de similitud, demuestran que no existe gran diferencia entre las poblaciones
microbianas.
La mayor diferencia comparando el patrón de bandas de las poblaciones presentes en diferentes

posiciones (alturas) del biofiltro se dio con la población de la parte inferior del biofiltro, debido
posiblemente a que ahí es donde se acumulan productos del metabolismo de las bacterias en todo
el biofiltro, o que la cantidad de nutrientes es menor comparado con las partes superiores del
biofiltro, tomando en cuenta que el biogás es alimentado por la parte superior.

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APÉNDICE
BUFFER TAE 50X
Reactivo Cantidad Concentración final
Tris Base 242.0 g 2M
Ácido acético glacial 57.1 mL 1M
EDTA 0.5 M, pH 8.0 100.0 mL 50 mM
dH2O Llevar a 1000 mL
PERSULFATO DE AMONIO 5%
Reactivo Cantidad
Persulfato de amonio 0.05 g
dH2O 0.95 mL
TINTE DE CARGA EN EL GEL
Reactivo Cantidad Concentración final
Azul de bromofenol al 2% 0.25 mL 0.05 %
Xileno cianol al 2% 0.25 mL 0.05 %
Glicerol al 100% 7.0 mL 70 %
dH2O 2.5 mL
Volumen total 10 mL

BUFFER TAE DE CORRIMIENTO 1%
Reactivo Cantidad
Buffer TAE 50X 140 mL
dH2O 6,860 mL
Volumen total 7,000 mL
ACRILAMIDA/BIS 40% (37.5:1)
Reactivo Cantidad
Acrilamida 38.93 g
Bis-acrilamida 1.07 g
dH2O Llevar a 100 mL

Estudios de Comunidades Bacterianas de Un Biofiltro Acoplado A Un Digestor Anaerobio Por DGGE

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES BACTERIANAS DE UN

JOSÉ ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ

BAJO LA DIRECCIÓN DE:

DRA. ELVIA INÉS GARCÍA PEÑA

J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ II

J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ III

Figura 1. Diferentes caminos que se pueden tomar para el seguimiento de comunidades

J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ IV

J. ALBERTO NAKAUMA GONZÁLEZ V

Por mucho tiempo se buscaron técnicas para la caracterización de un consorcio microbiano, la

Una alternativa para conocer la composición poblacional de un consorcio microbiano es el uso de

El desarrollo de las técnicas de la biología molecular ha facilitado la identificación de

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Extracción de ácidos nucleicos

Adaptación del cultivo

DGGE, TGGE, T-FLP clonación

MARCADORES GENÉTICOS LIBRERÍA EN CLONAS

COMPARACIÓN EN BASE DE DATOS

PRUEBAS DE ÁCIDOS ÁRBOL

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El análisis por Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (T-RFLP) de las comunidades

El fundamento de la DGGE es la separación de productos de PCR amplificados en la región 16S

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Todas estas técnicas permiten el análisis de comunidades microbianas en un sistema de

Tabla 1. Comparación de diferentes técnicas usadas para identificar comunidades microbianas.

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La finalidad de la DGGE es analizar el comportamiento de las comunidades bacterianas en un

El análisis de un consorcio microbiano se realiza tomando en cuenta las intensidades relativas de

Tabla 2. Diferentes índices para de similitud y de diversidad más usados.

Donde ni es intensidad relativa de una banda, N es la intensidad

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4.1 Extracción de ADN de muestras del biofiltro

Figura 3. Biofiltro acoplado a un digestor anaerobio

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4.2 Diseño de iniciadores

4.3 Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR

Tabla 3. Reactivos y cantidades que se usaron para la PCR

10X Taq buffer con(NH4)2SO4) 2.5

dNTPs mix, 2 mM cada uno 2

Taq DNA polimerasa (5 u/µL) 0.2

ADN (diferentes diluciones) 2

Iniciadores 1µM (BAC_FGC o BAC_F y BAC_R) 1 cada uno

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4.4 Estandarización de la técnica de DGGE

4.4.1 Preparación de reactivos para formar el porcentaje de agente desnaturalizante

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40% Acrilamida- Bis

Buffer TAE 50X 0.3 mL 0.3 mL 0.3 mL 0.3 mL

Formamida 0 mL 0.9 mL 3.6 mL 6 mL

Urea 7 M* 0 mL 2.25 mL 9.0 mL 6.3 g

dH2O Ajustar a 15 mL Ajustar a 15 mL Ajustar a 15 mL Ajustar a 15 mL

* En el caso de la concentración de 100% de agente desnaturalizante se usó urea sólida.

4.4.2 Formación del gradiente de agente desnaturalizante en el gel de poliacrilamida.

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4.5 Análisis de las muestras amplificadas por PCR en una DGGE

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5.1 Extracción de ácidos nucleicos

El método de extracción de ácidos nucleicos de fenol-cloroformo es de los métodos más baratos,

Figura 6. ADN extraído de las muestras del biofiltro. Pozo 1a-9a