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28.04.

2019

Versuch 5: Direktisolieren und Bestimmen fluoreszierender


Pseudomonaden
Tischassistent: Jens Behnen
Gruppen-Nr.: 33
Experimentatoren: Emma Schröder & Julia Seyfarth
Protokollant: Julia Seyfarth

Zusammenfassung
Aus einer Bodenprobe wurden durch wiederholte Drei-Strich-Ausstriche
fluoreszierende Einzelkolonien gewonnen.
Anhand des KOH-Tests und des LAAP-Tests wurde das Gram-Verhalten bestimmt. Es
handelte sich um ein Gram-negatives Bakterium.
Der Oxidase-Test zeigte eindeutig die Zugehörigkeit zur Gruppe der Pseudomonaden.
Mithilfe des API20NE® Test wurde die Art der Reinkultur bestimmt. Mit 99,6 %
Wahrscheinlichkeit gehört diese zur Art der Pseusomonas fluorescens.

Einführung
Pseudomonaden werden in die Hauptgattungen Burkholeria, Comamonas,
Pseudomonas, Zymomonas und Xanthomonas eingeteilt. Sie sind
chemoorganoprototroph und fakultativ aerob. (Steinbüchel et al., 2013)
P. kommen in großer Zellzahl im Wasser, Tieren und Pflanzen, sowie in der Rhizoshäre
vor. P. sind gerade oder leicht gekrümmte stäbchenförmige Bakterien. Sie sind 0,5-
1,1 µm breit und 1,5-4 µm lang und sind durch mehrere polar angeordnete Geißeln
beweglich. (Bast, 2001)
Die Gram-negativen Proteobakterien besitzen die Fähigkeit zur Denitrifikation,
Mn(IV)- und Fe(III)-Reduktion. Zucker werden immer über den Enter-Doudoroff-Weg
(KDPG-Weg) abbauen. (Ottow, 2011)
Die Oxidase- und Katalase-positiven P. scheiden extrazelluläre wasserlösliche Pigmente
aus, so genannte Siderophoren. Pyoverdine16 ist ein Eisenchelatbildner mit einer sehr
hohen Affinität zu Fe3+-Ionen. Die freigegebenen Pyovedine bilden Eisenpyoverdin-
Komplexe aus, welche in die Zellen transportiert werden und dort Eisen-Ionen
freigeben. (Fuchs, 2014)

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Chinolin ist als Chromophor an die Peptidketten gebunden und damit für die grüne
Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 366 nm verantwortlich. (Steinbüchel et al.,
2013)
P. haben einfache Nährstoffansprüche, daher sind die verwendeten Nährboden nicht
sehr selektiv. (Madigan et al., 2013)

Bei der Gram-Färbung werden die morphologisch unterschiedlichen Zellwandstrukturen


von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien genutzt, um diese zu unterscheiden.
Die hitzefixierten Zellen werden mit dem basischen Farbstoff Kristallviolett und
Lugolscher-Lösung dunkelblau gefärbt. Bei der anschließenden Differenzierung wird
der Farbkomplex mit Ethanol ausgewaschen. Gram-negative Bakterien werden dabei
entfärbt, gram-positive behalten teilweise die Farbstoffe. Gram-negative Bakterien
werden mit Safranin rot gegengefärbt. (Fritsche, 2016)
In den Zellen bilden sich tiefblauviolette Farbstoff-Iod-Komplexe bei denen das kleine
Chlorid-Anion durch das größere Iodid-Anion ausgetauscht wurde. Der Komplex ist
dadurch wasserunlösslich und fällt aus. Ethanol löst den Farbstoff-Iod-Komplex wieder
auf. Bei Gram-positiven Zellen verhindert das durch en Alkohol dehydrierte dicke
Mureinnetz, dass Teile des Farbstoffes die Zellwand passieren.
Der Alkohol bewirkt bei den Gram-negativen Zellen, dass sich die äußere Membran von
der Zelloberfläche ablöst. Durch die Löcher der dünnen einschichtigen Mureinschicht
können die gelösten Farbstoff-Iod-Komplexe die Zelle verlassen und die Bakterien
entfärben. Durch das Safranin erschienen Gram-negative Zellen rot. (Bast, 2001)

Ebenso wurde zur Überprüfung ein Kaliumhydroxyd-Test und ein L-Alanyl-


Aminopeptidase-Test durchgeführt.
Beim KOH-Test werden die Zellwände der Gram-negativen Zellen durch die verdünnte
Alkalilösung zerstört und DNA in Form von langen Fäden tritt aus. Diese weisen
zusammen mit der Suspension eine schleimig viskose Konsistenz auf und zieht Fäden.
Der LAAP-Test prüft das Vorhandensein von LAAP, einem Enzym, dass in Gram-
negativen Zellen in der Zellwand lokalisiert ist. (Bast, 2001)
Auf dem Bactident®-Teststreifen wird das farblose L-Alanyl-Nitroanilid in
Anwesenheit von LAAP in das gelbe Nitroanilin und L-Alinin aufgespalten.
Das Bactident®-Oxidase-Teststäbchen ist mit N-N-Dimethyl-1,4-
phenylendiammoniaumchlorid und α-Nephthanol getränkt. Wenn Bakterienmaterial mit

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dem in der Atmungskette vorhandenem Cytochrom c darauf gelangt, oxidiert das
farblose Dimethyl-1,4-phenylendiammoniaumchlorid und es kommt zu einer
Blaufärbung. Cyctochrom c kommt in Pseudomonaden, jedoch nicht in Enterobakterien
vor. (Merck KGaA, 2019)

Zur Bestimmung der Art wurde eine biochemische Testreihe (API20NE®)


durchgeführt. Dieser ist für Gram-negative, fakultativ aerobe, Oxidase-positive
Reinkulturen geeignet. Der bebrütete Teststreifen gibt Aufschluss über die Verwendung
unterschiedlicher Kohlenstoffquellen, der Präsenz von Enzymen und dem Verhältnis
zum Sauerstoff. Er ist aufgeteilt in die so genannte bunte Reihe und das
Substratspektrum.
Die bunte Reihe zeigt durch (Farb)-Reaktionen die Ergebnisse an, da die Röhrchen mit
pH-Indikatoren, farbgebenden Substraten und Nachweisreagenzien von enzymatischen
Reaktionsprodukten gefüllt sind.
Die Röhrchen des Substratspektrums sind durch Wachstum getrübt und damit positiv.
(Steinbüchel et al., 2013)

Das Ziel des Versuchs war es fluoreszierende Pseudomonaden aus einer Bodenprobe zu
isolieren und zu bestimmen.

Material & Methode


Detaillierte Durchführung siehe Skript „Mikrobiologie I/II“ (Februar/März 2019) S. 12
Änderungen
Am vierten Versuchstag wurde bei der Kontrolle nach Fluoreszenz keine Kolonie
gefunden. Daher wurde Koloniematerial der Gruppe 32 verwendet.

Ergebnisse
In Tabelle 1 werden die Ergebnisse der durchgeführten Tests aufgeführten. Am sechsten
Versuchstag wurde ein mikroskopisches Präparat angefertigt. Im Phasenkontrast
konnten viele große polar begeißelte Stäbchen beobachtet werden.
Bei der Gram-Färbung wurden keine Zellen im Hellfeld des Mikroskops gefunden.
Deutliche Fäden konnten beim KOH-Test zwischen Impföse und Suspension beobachtet

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werden. Der LAAP-Test war gelblich verfärbt. Diese Tests weisen beide auf ein Gram-
negatives Bakterium hin.
Der Oxidase-Test wies eine bläuliche Verfärbung auf und zeigte somit, dass es sich um
Pseudomonaden handelt.
Test/Ergebnis Positiv Negativ
Gram-Färbung
KOH-Test X
LAAP-Test X
Oxidase-Test X

Die bunte Reihe wurde mithilfe der Ablesetabelle (Steinbüchel et al., 2013)
ausgewertet. Das erste Röhrchen blieb farblos nach der Zugabe von NIT 1 und NIT 2.
Nach der Zugabe von Zink wurde die Lösung rosa (siehe Abb 1). Das in diesem Fall
negative Ergebnis wurde in den Protokollzettel (siehe Abb. 1) eingetragen.
Beim zweiten Röhrchen wurde James-Reagenz hinzugegeben und die Lösung wurde
Tabelle 1: Übersicht der Tests zur Vorbestimmung mit Ergebnissen

blassgelb und somit auch negativ.


Auch die Röhrchen GLU, ADH, URE, ESC und PNPG zeigten negative Ergebnisse.
Der Test GEL ist positiv ausgefallen.
Das Substratspektrum zeigte keine Trübung bei den Röhrchen MAL, ADI und PAC und
somit kein Wachstum, also ein negatives Ergebnis. Die restlichen Röhrchen des
Substratspektrums waren getrübt und somit positiv.
Mithilfe des Protokollzettel des API20NE® Tests wurden die Codenummern und somit
die 7stellige Schlüsselzahl 0057555 ermittelt. Laut des APILAB-Rechnerprogramms
codiert diese Schlüsselzahl mit einer Wahrscheinlichkeit von 99,7 % die Art P.
flourescens.
Abb. 1: oben: API20NE® Teststreifen nach 24 h Bebrütung; unten: Protokollzettel mit
Schlüsselzahl 0057555

Diskussion
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Durch den Flächenausstrich einer Bodenprobe auf dem eisenarmen komplexen Medium
King-Agar wurden alle Bakterien mit einem Weg der effizienten Eisenaufnahme
vermehrt.
Durch Betrachtung der bewachsenen Platten unter einer UV-Lampe bei einer
Wellenlänge von 366 nm konnten, durch die fluoreszierenden Pyoverdine,
Einzelkolonien durch Drei-Strich-Ausstriche gewonnen werden. Am
vierten Versuchstag konnte keine fluoreszierenden Kolonien festgestellt werden.
Wahrscheinlich wurde am Tag zuvor nicht das richtige Koloniematerial entnommen.
Für den weiteren Versuch wurde daher Koloniematerial der Gruppe 32 verwendet.
Dieses wurde weiter zu einer fluoreszierenden Reinkultur gezüchtet.
Bei der Gram-Färbung waren keine Zellen zu sehen, da wahrscheinlich die Suspension
nicht vollständig getrocknet war, bevor damit weiter gearbeitet wurde. Auch können die
Zellen bei der Hitzefixierung zu heiß geworden sein und daher denaturierten.
Die Ergebnisse der Test zur Vorbestimmung zeigten, dass die Zellhülle der
vorliegenden Art eine dünne Mureinschicht und zwei Membranen aufweist, also Gram-
negativ ist. Durch den positiven Oxidase-Test ist klar, dass Cyctochrom c in der
Atmungskette vorliegt und es sich daher um die Gattung Pseudomonaden handeln
könnte.
Durch die abschließende biochemische Testreihe konnte die Bestimmung der P.
fluorescens abgeschlossen werden.

Somit konnte die Direktisolierung und Bestimmung von P. fluorescens aus einer
Bodenprobe ohne große Komplikationen gelingen.

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Literatur/Quellen
(1) Bast E (2001) Mikrobiologische Methoden. Eine Einführung in grundlegende
Arbeitstechniken. 2. Aufl., Spektrum Akademischer Verlag, Berlin Heidelberg
(2) Fritsche O (2016) Mikrobiologie (Kompaktwissen Biologie). 1. Aufl., Springer
Spektrum, Berlin Heidelberg
(3) Fuchs G (2017) Allgemeine Mikrobiologie. 10. Aufl., Thiemen Verlag,
Stuttgard New York
(4) Madigan MT, Martiko JM, Stahl DA, Clark DP (2013) Brock Mikrobiologie.
13. Aufl., Pearson Studium, Hallbergmoos
(5) Merck KGaA (2019), Bactident® Aminopeptidase, Damstadt,
http://www.merckmillipore.com/DE/de/product/Bactident-
Aminopeptidase,MDA_CHEM-113301#anchor_PI
Abgerufen am 28.04.19 m 11.23 Uhr
(6) Merck KGaA (2019), Bactident® Oxidase, Damstadt,
http://www.merckmillipore.com/DE/de/product/Bactident-
Oxidase,MDA_CHEM-113300#documentation
Abgerufen am 28.04.19 um 11.14 Uhr
(7) Ottow JDG (2011) Mikrobiologie von Böden. Biodiversität, Ökophysiologie
und Metagenomik. 1. Aufl., Springer, Berlin Heidelberg
(8) Steinbüchel A, Oppermann-Sanio FB, Ewering C, & Pötter M. (2013).
Mikrobiolorisches Praktikum. Versuche und Theorie. 2. Aufl., Springer, Berlin
Heidelberg

Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich das vorliegende Protokoll selbstständig verfasst habe,
dass ich keine andere Quellen und Hilfsmittel als die angegebenen benutzt habe und
dass ich die Stellen der Arbeit, die ich anderen Werken – auch elektronischen Medien –
dem Wortlaut oder Sinn nach entnommen habe, auf jeden Fall unter Angabe der Quelle
als Entlehnung kenntlich gemacht habe.

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Datum, Unterschrift
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