Colorações

Método de coloração hematoxilina-eosina de

Carazzi
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Método de coloração hematoxilina de Carazzi-eosina é um método simples para histologia.

Núcleos basófilos, bactérias, cálcio e outros são corados pela hematoxilina. O
citoplasma eosinófilo e outros tecidos são corados de vermelho pela eosina.

O corante é adequado à fotografia em preto e branco em determinadas aplicações.

O método de Carrazzi é composto das etapas de deparafinização, coloração, desidratação e

imersão e são mais adequadamente realizadas em temperatura de aproximadamente 24°C.

Os componentes são a solução de hematoxilina de Carazzi, álcool ácido, solução saturada

de carbonato de lítio, soluções de eosinaacidificadas com ácido acético e uma mistura de creosoto-
xileno.

Técnica de Gram
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Staphylococcus aureus: Cocos gram-positivos

A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações histológicas

para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com
base na composição química e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem,
são classificados em gram positivos (roxo) ou gram negativos (vermelho). Tal método se deve ao
médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938). Geralmente as bactérias "gram
negativas" são mais patogénicas, possuindo ainda lipopolissacarídeos na sua membrana exterior,
que agravam a infecção.

Na técnica de Gram, colora-se bactérias com um corante violeta especial. A bactéria que assim
obtiver uma cor roxa, será gram positiva e a que obtiver coloração rósea, gram negativa. A gram
positiva ganha coloração roxa porque sua camada mais externa, a parede celular, formada
por peptidoglicano, absorve a tinta. Já a gram negativa é rósea porque, apesar de também ter
parede celular, esta fica fica abaixo de uma membrana adicional, parecida com a mebrana
plasmática, típica deste grupo de bactérias, logo não ocorrendo absorção.

Índice

[esconder]

• 1 Procedimento

• 2 Preparação para a coloração

• 3 Alguns microorganismos gram-

positivos

• 4 Alguns dos microorganismos

gram-negativos

• 5 Ver também

[editar]Procedimento

1. Confeccionar o esfregaço;

2. Corar com violeta de cristal por 60 segundos;

3. Lavar com esguicho de água destilada;

4. Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;

5. Lavar com esguicho de água destilada;

6. Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;

7. Lavar com esguicho de água destilada;

8. Corar com safranina por 60 segundos

9. Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.

Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa

Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos

As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona
da seguinte forma.

O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactéria assim como o mordente(Soluto de Lugol).

Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar
o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano é maior em bactérias gram positivas,
as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e são coradas pelo vermelho de
safranina.

A lavagem com álcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for
permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa
do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a
lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram
negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas.
Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho.
Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou
menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa
corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar
negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento
celular ou acção de lisozimas).

[editar]Preparação para a coloração

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o
que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e
algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem

à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.
A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura
bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzênicos que se encontram
ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo
que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os
tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes
ácidos (são negativos, formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos, formando
sais com ânions). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa, existe afinidade entre os
corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria, permitindo que esta fique corada. Para
reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste, as estruturas celulares utilizam-se
de mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor
e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias, sendo geralmente hidro-
alcoólicos-fenicados porque, além da substância corante, possuem água para permitir a dissociação
iônica do corante; álcool para conservar e ácido fênico, que atua como mordente e como
bacteriostático, evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante,
aplica-se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido
sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já
previamente coradas e são usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações
policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo
calor), aplica-se:

1. O primeiro corante
2. O mordente

3. O diferenciador

4. Água (vai parar a diferenciação)

5. Segundo corante (vai ser contrastante)

[editar]Alguns microorganismos gram-positivos

 Staphylococcus aureus

 Lactobacillus sp.

 Streptococcus pyogenes

[editar]Alguns dos microorganismos gram-negativos

 Pseudomonas aeruginosa

 Haemophilus influenzae

 Escherichia coli

 Helicobacter pylori
Técnica de Ziehl-Neelsen
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Bacilo da Lepra corado com Técnica de Ziehl-Neelsen

A Técnica de Ziehl-Neelsen é uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que atécnica
de Gram. Ela é usada em bactérias que coram mal com o Gram, como os bacilos da Lepra e
da tuberculose, entre outros.

Índice

[esconder]

• 1 Técnica de Ziehl-

Neelsen

• 2 Preparação para a

Coloração

• 3 Aplicações em

diagnóstico

• 4 Referências

• 5 Ligações externas

[editar]Técnica de Ziehl-Neelsen
Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à
descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem esta
propriedade dizemos que são ácido-álcool resistentes (géneros Mycobacterium eNocardia). Esta
característica é devida ao elevado teor de lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede
celular destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos
mordentes e diferenciadores de corantes aquosos. A técnica de Ziehl-Neelsen evidencia esta ácido-
álcool resistência. Segue o seguinte protocolo:
 1. Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança;

2. Cobrir a lâmina com fucsina fenicada (o mordente é o ácido fénico);

3. Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver);

4. Aguardar 5 a 8 minutos;

5. Lavar com água corrente;

6. Cobrir a lâmina com álcool-ácido 3% até descorar totalmente o esfregaço;

7. Lavar com água corrente;

8. Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 minuto;

9. Lavar com água corrente;

10. Secar;

11. Observar.

A fucsinaaa fenicada, atuando a quente, vai corar todas as células bacterianas e outras estruturas
presentes no esfregaço de vermelho (o calor vai derreter os lípidos de membrana, tornando-a
permeável). O ácido diluído em álcool aplicados vão descorar todas as bactérias exceto as ácido-
álcool resistentes, que permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas
após coloração e contraste, com azul de metileno, encontraremos as bactérias:

 Ácido-álcool resistentes: coradas de vermelho.

 Não ácido-álcool resistentes: coradas de azul.

[editar]Preparação para a Coloração

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o
que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e
algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem

à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura

bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzénicos que se encontram
ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo
que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os
tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes; os corantes
ácidos (são negativos formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos formando
sais com ânions). Como as bactérias possuem carga elétrica negativa existe afinidade entre os
corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria permitindo que esta fique corada. Para
reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste às estruturas celulares utilizam-se
mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fénico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e
os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias sendo geralmente hidro-
alcoólicos-fenicados porque além da substância corante possuem água para permitir a dissociação
iônica do corante, álcool para conservar e ácido fénico que atua como mordente e como
bacteriostático evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante aplica-
se um diferenciador que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido
sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já
previamente coradas e são usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações
policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo
calor), aplica-se:

1. O primeiro corante
2. O mordente

3. O diferenciador

4. Água (vai parar a diferenciação)

5. O segundo corante (vai ser contrastante)

[editar]Aplicações em diagnóstico
As técnicas de coloração ácido-resistente, desenvolvidas inicialmente por Paul Ehrlich se baseiam
na presença de ácidos micólicos, como as voltadas para a identificação do Mycobacterium
tuberculosis[1] pela coloração de Ziehl Neilsen[2] e Kinyoun.[3]