PRACTICA N° 03: ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS:

SEGUIMIENTO DEL CRECIMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I. Objetivos

 Determinar la curva de crecimiento en microorganismos como levaduras

cultivados en aerobiosis utilizando diferentes fuentes de carbono.
 Determinar la velocidad de fermentación utilizando un medio definido con
diferentes fuentes de carbono.
 Comparar las tasas de crecimiento específico durante la fermentación de
Saccharomyces cerevisiae con diferentes fuentes de carbono.
 Controlar la fermentación por producción de CO2 y decrecimiento en peso del
medio de cultivo.

II. Marco teórico

2.1. Metabolismo de azúcares por levaduras

Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaeróbicas, la fosforilación a

nivel del substrato en la glucólisis es la única fuente de ATP en Saccharomyces
cerevisiae y posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molécula de glucosa
convertida en dos moléculas de piruvato. La disimilación de glucosa a piruvato vía
la glucólisis está unida a la reducción de NAD+ en la reacción catalizada por la
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilación
es logrado por descarboxilación de piruvato a acetaldehído, el cuál (NAD+)
subsecuentemente actúa como un aceptor de electrones para la reoxidación de
NADH2.1
El NADH2 y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metabólica de
Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vías
asimilatorias. La glucólisis juega un rol esencial en la disimilación de azúcar, pero
también genera bloques constituyentes para la biosíntesis. Además, aunque
muchas reacciones biosintéticas usan NADPH como un reductor, algunas
reducciones unidas a NADH ocurren en la conversión de metabolitos centrales
(piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a monómeros celulares, por ejemplo en la
biosíntesis de aminoácidos. Durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae
sobre azúcar, la preferencia del NADH en reducciones disimilatorias (en la
reducción de acetaldehído a etanol y la reducción del pool de quinona de la cadena
respiratoria) es muy fuerte.

En Saccharomyces cerevisiae, el mantenimiento de las condiciones de cultivo

aeróbico no es suficiente para lograr metabolismo respiratorio de azúcar. Incluso
cultivos totalmente aeróbicos exhiben un metabolismo mixto respiro-fermentativo, a
menos que ellos sean desarrollados con un suplemento limitado de azúcar a tasas
bajas de crecimiento específico.2, 3 Este fenómeno de fermentación aeróbica
(frecuentemente referido como efecto de la “glucosa” o “Crabtree”) es parcialmente
 debido a la represión de la síntesis de enzimas respiratorias por exceso de
glucosa.4, 5
Durante el crecimiento respiratorio sobre azúcares, la reoxidación del NADH2
formado en la glucólisis puede ocurrir vía respiración mitocondrial, de esta manera
rinde ATP adicional vía fosforilación oxidativa. Además por otra parte, la reoxidación
respiratoria de NADH2 glucolítico implica que el piruvato no tiene que ser convertido
en acetaldehído (aceptor de electrones), pero puede ser posteriormente oxidado.
La oxidación de piruvato a acetil coenzima-A, ocurre predominantemente vía el
complejo mitocondrial piruvato-deshidrogenasa, y subsecuentemente el acetil-CoA
es oxidado a CO2 y H2O por las enzimas del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA).6
Los análisis cuantitativos de culturas respiratorias, han concluido que la eficiencia
in vivo de este proceso en Saccharomyces cerevisiae es menor que en muchos
otros microorganismos, esta baja estequiometría de fosforilación oxidativa está
relacionado con la ausencia de un protón de translocación NADH deshidrogenasa
en Saccharomyces cerevisiae, la disimilación respiratoria completa de glucosa rinde
aproximadamente 16 ATP por molécula de glucosa (cuatro ATP desde la
fosforilación a nivel del substrato y cerca de 12 a partir de la fosforilación oxidativa).

Gay-Lussac fué el primero en mostrar que la fermentación de la glucosa rinde

aproximadamente pesos iguales de etanol y CO2 (45 partes de glucosa rinden 23
partes de alcohol y 22 partes de CO2). Pasteur encontró que 100 partes de sucrosa
rinden 105.4 partes de azúcar invertida, el cual fué fermentada a 51.1 partes de
etanol, 49.4 partes de CO2, 3.2 partes de glicerol y 1.7 partes de ácido succínico.
El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor teórico, el
cual debe ser 51.1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se
debe a la formación de sub-productos durante la fermentación alcohólica y a la
asimilación de azúcar por la levadura, además de esto el rendimiento es afectado
por diversas variables incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inóculo y
presencia ó ausencia de O2, en la práctica 47.0 – 47.5 gramos de etanol son
usualmente obtenidos por cada 100 gramos de azúcar fermentado.

III. Culturas, reactivos y materiales

Levadura Saccharomyces 10 g Bagetas 02

cerevisiae
Glucosa, sucrosa 20g c/u Pinzas 01
Extracto de levadura 5.0 g/L Chapitas 30
KH2PO4 4 g/L Espectrofotómetro 01
MgSO4.7H2O 2 g/L Balanza analítica 01
(NH4)2SO4 5 g/L Potenciómetro 01
Agua destilada 5L Algodón 01 rollo
HCl al 10% 50ml Cinta mazkin 01
Matraces Erlenmeyer de 1L 02 Rotulador 01
Matraces Erlenmeyer de 06 Papel aluminio 01 rollo
250ml
 Pipetas de 10 ml 02 Tijera 01
Vasos de precipitación de 04 Pabilo 01 rollo
200ml
Espátulas 02
Pizeta 01
Pipetas 5ml, 10ml 02 c/u

IV. Metodología

Preparación de inóculo: Preparar 100 ml de una solución que contenga: Glucosa ó

sacarosa 2 g, extracto de levadura 0.1 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.04 g,
ajustar el pH a 3.8. Luego de esterilizarlo a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2,
inocular asépticamente con la levadura Saccharomyces cerevisiae usando una asa
de siembra y cultivar por 24 horas en agitación a 28ºC.

Medio de fermentación: Preparar 250 ml de una solución que contenga: Glucosa ó

sacarosa 5 g, extracto de levadura 0.25 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KH2PO4 1.0 g,
MgSO4.7H2O 0.1 g.

V. Procedimiento

En cada uno de 3 matraces Erlenmeyer de 400 ml se adicionan 250 ml de medio

de fermentación de composición citada anteriormente, el pH se ajusta a 3.8 con HCl
al 10%. Luego se esteriliza a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente
se deja enfriar hasta alcanzar los 28 ºC (temperatura de cultivo con Saccharomyces
ncerevisiae). Luego asépticamente se inocula con el 5% del inóculo cultivado
anteriormente. El inóculo a utilizar debe centrifugarse previamente a 3 000 rpm x
10min., y enjuagado con agua destilada antes de inocular al medio de fermentación.

Tratamiento del inóculo:

 Agitación 24 horas
150rpm, 24h, 28ºC

100 ml de medio estéril Inocular con levadura

glucosa ó sacarosa Pipetear 5% del volumen de
fermentación

Centri- Centri-
fugaci Enjuagar con H2Od fugaci
ón ón

Inoculo 3000 rpm x 10min

enjuagado y
centrifugado

Proceso de cultivo: 250 ml de medio de cultivo estéril – glucosa ó sucrosa

DO

Inóculo tratado

Espectrofotometría
μglucosa ó sacarosa

Tiempo (h)
mg biomasa seca/ml

Agitación 150 rpm

μglucosa ó sacarosa

Inóculo tratado
Tiempo (h)

28ºC, tiempo: a criterio

Medición: Biomasa total (biomasa seca/L)
Etanol: picnometría
Agitación 150 rpm

Inóculo tratado

28ºC, tiempo: a criterio

Medición: Biomasa total (biomasa seca/L)
Etanol: picnometría
Anaerobiosis Control de la fermentación: Pesado

VI. Mediciones:
 Para determinar la curva de crecimiento en el cultivo aerobio se realizará por dos
métodos indirectos:

1º. Determinación del crecimiento por gravimetría: Con una pipeta se extrae
asépticamente 2 – 3 ml de medio cada 4 horas, se centrifuga y las células se vierten
en una placa metálica previamente tarada. Seguidamente la biomasa centrifugada
se coloca en la estufa para secarlo durante 1hora a 100 ºC. Con los datos
obtenidos: peso seco de las células y el intervalo de tiempo en el que se tomo la
muestra se construye una gráfica tiempo – peso seco de biomasa (mg de biomasa
seca/ml). Luego se determinará la tasa de crecimiento específico al inicio de la fase
logarítmica con la siguiente formula:

Ln X1 – Ln Xo
μ = ----------------------
t1 – to

2º. Determinación del crecimiento por densidad óptica: Se tomará muestras del
medio de fermentación (2ml aprox.) cada 4 horas para medir la densidad óptica del
medio a 620nm. Con estos datos se construye una curva de crecimiento de la
levadura ploteando densidad óptica y tiempo de toma de muestras.

Para controlar el tiempo de fermentación (en anaerobiosis), se toma el peso inicial

del medio de cultivo correspondiente a 250ml (no olvidar descontar el peso del
matraz y el tapón) y cada 4 horas se vuelve a pesar el matraz para determinar la
velocidad de fermentación, se anota el intervalo en que se toma cada medida y el
peso neto del medio de cultivo en ese instante, y se construye una grafica tiempo
– peso.

Se determinará el etanol producido al final de la fermentación por picnometría, con

los datos obtenidos se calculará la eficiencia de cada fermentación

VII. Cuestionario

Cuál es la importancia de controlar el desprendimiento de CO2 en una

fermentación?
Cómo esta caracterizada la fase exponencial de crecimiento microbiano?
Qué es la fase lag y que factores influye en su duración?
Qué rendimientos en etanol ha encontrado utilizando diferentes azúcares?
Realice una discusión respecto a los valores encontrados de producción de etanol
y biomasa bajo condiciones aerobias y anaerobias

VIII. Referencia bibliográfica

 Bisson, L. F. Metabolismo de azúcares por levaduras, en la microbiología y
biotecnología del vino. Chur, Suiza: Ed. Harwood Academic Publishers,
1993, p. 55-75.
 De Deken, R. H. El efecto Crabtree: Un sistema regulatorio en levaduras.,
1966. Revista: Gen. Microbiol. Vol. 44, p. 149-156.
 Estela, W. D. Evaluación del comportamiento fisiológico de levaduras
Saccharomyces y no-Saccharomyces bajo diferentes condiciones de
crecimiento. Reporte anual, VSCHT, Praga – República Checa, 2001.