PCR MULTIPLEX

Técnicas de Biología Molecular II (20-I)

Introducción
La PCR multiplex es una técnica generalizada de biología molecular que se utiliza para la
amplificación de múltiples objetivos en un solo experimento de PCR. En un ensayo de en donde se
pueden amplificar más de una secuencia objetivo utilizando múltiples pares de primers en una mezcla
de reacción. Como una extensión al uso práctico de la PCR, esta técnica tiene el potencial de
producir ahorros considerables en tiempo y esfuerzo dentro del laboratorio sin comprometer la
utilidad del experimento.

Tipos de PCR Multiplex

Las reacciones de PCR multiplex pueden dividirse en dos categorías:

1. Reacción de PCR con un ADN plantilla. Esta técnica utiliza una plantilla única que puede ser un
ADN genómico junto con varios pares de primers directos para amplificar regiones específicas dentro
de un ADN.

2. Reacción de PCR con múltiples ADN plantilla. Utiliza múltiples plantillas y varios juegos de primers
en el mismo tubo de reacción. La presencia de múltiples primers puede conducir a una hibridación
cruzada entre sí y a la posibilidad de hidridar mal con otras plantillas.

Diseño de Primers
Los ensayos de PCR multiplex implican el diseño de un gran número de primers, por lo tanto, el
diseño en conjunto de los primers específicos para cada fragmento a amplificar, es esencial para
tener una reacción múltiple exitosa. Las consideraciones importantes para su diseño son clave para la
amplificación específica con un alto rendimiento.
Longitud de los primers. Se requiere que los primers sean cortos, en el rango de 18 a 22 bases.

Temperatura de fusión. Se usan primers con Tm similares, preferiblemente entre 55 y 60° C. Para
secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan primers con una Tm más alta

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(preferiblemente 75° C - 80° C). Una variación de Tm entre 3 y 5° C es aceptable para los primers
utilizados en una misma reacción.

Especificidad. Es importante tener en cuenta la especificidad de los primers con las secuencias a
amplificar, ya que puede haber competencia cuando las múltiples secuencias objetivo se encuentran
en una sola reacción.

Evitar la formación de dímeros. Se debe verificar la probabilidad de formación de dímeros entre los
primers presentes en la mezcla de reacción ya que la dimerización conduce a una amplificación
inespecífica.

Condiciones de Reacción
La PCR multiplex es una reacción muy sensible por lo que cada experimento necesita diferentes
configuraciones y requisitos de reactivos. Sin embargo, algunas ADN simples pueden amplificarse
usando la misma configuración de reacción de PCR estándar, por ejemplo, para estudiar 6 microdele-
ciones del cromosoma Y por PCR multiplex, se utiliza la reacción y las condiciones de la reacción de
PCR convencional.

Para templados complejos, como el gen DMD (el gen más largo del humano), se necesita una
configuración de reacción y condiciones de PCR más compleja, como DNA Polimerasas de mayor
fidelidad y capaz de amplificar fragmentos largos y por lo tanto mayores tiempos de elongación, o la
adición de aditivos en la mezcla de reacción.

Otro factor crucial es el número de ciclos de PCR. Muchos ciclos de PCR pueden causar falla de
reacción o amplificación truncada ya que hay menos reactivos disponibles a medida que avanza la
reacción. Pero, si se establecen pocos ciclos de PCR, la amplificación se termina prematuramente y
no todas las regiones se amplifican adecuadamente. El número de ciclos recomendados es de 25 a
30.

Para obtener resultados precisos es recomendable tener conocimiento previo de las cantidades
relativas de las secuencias a amplificar. Si una secuencia objetivo es mucho más abundante que otra
objetivo, entonces la amplificación de la más abundante puede agotar los dNTP y comprometer la
amplificación de la secuencia de menor abundancia. Este problema se puede mejorar disminuyendo
la concentración de los primers de la secuencia de mayor abundancia, para favorecer su consumo
rápidamente y que los reactivos de reacción restantes se utilicen para la amplificación de la secuen-
cia de baja abundancia. En una muestra con abundancias desconocidas, puede ser necesario optimi-
zar protocolos probando concentraciones limitantes de primers para cada objetivo.

Aunque la PCR multiplex implica optimización y validación, esta inversión de tiempo y reactivos, se ve
recompensada por la capacidad de analizar más de un objetivo en un solo pozo o tubo y la mayor
precisión del análisis comparativo y la cuantificación en investigación, análisis forense y diagnóstico.

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Ventajas
Es un método preciso y rápido ya que se amplifican diferentes plantillas al mismo tiempo.

Se necesita menos mano de obra y menos tiempo para obtener diversos resultados, por lo que es
rentable.

Cada amplicón funciona como un "control interno" para otros amplicones, por lo tanto, la posibilidad
de resultados falsos positivos es menor.

Al comparar diferentes amplicones de una sola plantilla, podemos determinar la calidad de la plantilla.

Podemos obtener más información utilizando poca concentración de ADN.

En términos de ventajas técnicas, aquí los errores de pipeteo son menores y se requieren menos
consumibles y reactivos para realizar un experimento.

Limitaciones
No se pueden amplificar múltiples fragmentos largos. Por lo general, los amplicones deben de tener
como máximo 1000 pb.

Es común obtener resultados no significativos o fracasar en la reacción.

Aplicaciones
Identificación de patógenos.

Genotipado de polimorfismos.

Detección de OMG.

Estudios forenses.

Análisis de alimentos.

Análisis de mutaciones y polimorfismos.

Análisis de eliminación de genes.

Detección de ARN.

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TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y PCR
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Referencias

Bruns DE, Ashwood ER y Burtis CA (2007) Fundamentals of Molecular Diagnostics. Saunders Elsevier. EUA.
Degnath M, Prasad GBKS y Bisen PS (2010) Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities. Springer. EUA.
Sudbery P (2004) Genética Molecular Humana. 2da. Edición. Pearson Prentice Hall. España.
Viljoen GJ, Nel KH y Crowther JR (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook. Springer. Holanda.

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