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Universidade de São Paulo

Instituto de Física

Síntese e caracterização de
nanopartículas magnéticas: Aplicação
como vetores de liberação de óxido
nítrico
Miguel Angel Mosquera Molina

a a
Orientadora: Prof Dr Rosangela Itri

Dissertação de mestrado apresentada ao Insti-

tuto de Física para a obtenção do título de Mes-

tre em Ciências

Banca examinadora:
a a
Prof . Dr . Rosangela Itri (IF-USP)

Prof. Dr. Antonio Domingues dos Santos (IF-USP)

Prof. Dr. Pietro Ciancaglini (FFCLRP-USP)

São Paulo
2013
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Serviço de Biblioteca e Informação
do Instituto de Física da Universidade de São Paulo

Mosquera Molina, Miguel Angel

Síntese e caracterização de nanopartículas magnéticas:


aplicação como vetores de liberação de óxido nítrico.
São Paulo, 2013.

Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo.


Instituto de Física. Departamento de Física Aplicada.

Orientador: Profª Drª Rosangela Itri


Área de Concentração: Física da Matéria Condensada

Unitermos: 1. Física da matéria condensada;


2. Nanopartículas; 3. Físico química; 4. Biofísica;
5. Luminescência (Química).

USP/IF/SBI-019/2013
iii

Agradecimentos
Gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos:

Ao Instituto de Física da Universidade de São Paulo (IF-USP) pelo uso de suas instalações.

À Dra. Rosangela Itri, pela conança, apoio contínuo e motivação nesse trabalho.

À Dra. Paula Haddad, pela dedicação e apoio na síntese química, medidas em espectroscopia

FTIR e valiosas discussões.

Ao Dr. Maurício da Silva Baptista, pelo uso das facilidades do Laboratório de Processos

Fotoinduzidos no Instituto de Química da Universidade de São Paulo.

À Dra. Amedea Seabra, pelo apoio e colaboração na medida da liberação de óxido nítrico.

Ao Dr. Antonio Domingues dos Santos do Departamento de Física de Materiais e Mecânica,

pelo apoio nas medidas e discussões de VSM.

Ao Dr. Pedro Kyohara e à técnica Simone P. de Toledo do Departamento de Física Geral,

pelo auxílio nas medidas de TEM.

Ao Dr. Alessandro Rodrigues do Departamento de Ciências Exatas e da Terra da UNIFESP

campus Diadema, pelo auxílio nas medidas de Espectroscopia FTIR.

Ao Dr. Elia Tfouni e às técnicas Ivana A. Borin e Aline N. Chiba, pelo uso das facilidades

do Laboratório de Fotoquímica-Inorgânica no Departamento de Química da Faculdade de

Filosoa, Ciências e Letras de Riberão Preto - USP, assim como no auxílio nas medidas de

liberação de NO e interpretação de resultados.

Aos técnicos do DFAP, Antônio Carlos, pela ajuda inicial nas medidas de DRX, e Serginho,

na confecção dos recipientes para as medidas de VSM.


iv

Aos meus amigos, Julio, Javier, Tiago, Fernando, Lindber, Carlos, Elisa, Leandro, Evandro,

Lia, Ellen, Andreza, Omar, Thaís, Helena, ... pelo apoio e conanza; e pelas risadas ao

longo do desenvolvimento deste trabalho.

À CAPES e CNPq pelo apoio nanceiro.


v

ABREVIATURAS

Principais abreviaturas utilizadas nesta dissertação

NPs : nanopartículas;

NPMs : nanopartículas magnéticas;

AO : ácido oleico;

MSA : ácido mercaptosuccínico;

DMSA : ácido dimercaptosuccínico;

NPAO : NPs recobertas com ácido oleico;

NPMSA110 : NPs funcionalizadas com MSA em razão molar de 1:10;

NPMSA140 : NPs funcionalizadas com MSA em razão molar de 1:40;

NPMSA180 : NPs funcionalizadas com MSA em razão molar de 1:80;

NPDMSA110 : NPs funcionalizadas com DMSA em razão molar de 1:10;

NPDMSA140 : NPs funcionalizadas com DMSA em razão molar de 1:40;

NPDMSA180 : NPs funcionalizadas com DMSA em razão molar de 1:80;

R-SH : tiol;

R-SNO : nitrosotiol;

NP-SNO :nanopartícula nitrosada;

FTIR : Espectroscopia Infravermelho;

DRX : Difração de Raios X;

DRX : tamanho de cristalito;

L(x) : função Lorentziana;

MET : Microscopia Eletrônica de Transmissão;

f LN : função logaritmo normal;

VSM : Magnetometria de Amostra Vibrante;

µ : momento magnético.
vi

Resumo
Neste trabalho reporta-se uma nova estratégia para a liberação de óxido nítrico (NO),

baseada em nanopartículas (NPs) de magnetita com potencial aplicação em biomedicina.

As NPs de magnetita foram preparadas pelo método de coprecipitação utilizando cloretos

ferroso e férrico, seguido de um recobrimento com ácido oleico (AO) com a nalidade de

evitar a oxidação e reduzir a agregação das mesmas. Em seguida realizamos uma troca

de ligantes por ácido mercaptosuccínico (MSA) e ácido dimercaptosuccínico (DMSA) em

diferentes razões molares. Após a funcionalização, as nanopartículas são solúveis em água e

apresentam grupos tióis ligados à superfície das NPs e expostos para a solução. As técnicas

de caracterização utilizadas foram Espectroscopia Infravermelho (FTIR), Difração de Raios-

X (DRX), Microscopia Eletrônica (MET) e Magnetometria de Amostra Vibrante (VSM).

Dos resultados de FTIR observa-se as bandas de estiramento e deformação de Fe-O

características do óxido de ferro, assim como bandas de estiramento S-H indicando a presença

dos grupos tióis e, portanto, a funcionalização das NPs com MSA e DMSA. Os dados de RX

mostram que as NPs tem estrutura da magnetita (tipo espinélio) e possuem tamanho de grão

da ordem de 11nm. A funcionalização não altera as propriedades cristalinas do material. O

tamanho de grão cristalino é compatível com os valores médios das distribuições de tamanho

observados por TEM e VSM, que indicam uma polidispersão em torno de 20%. Os resultados

de VSM também demonstraram que as NPMs tem comportamento superparamagnético a

temperatura ambiente, embora a magnetização de saturação se reduz a um valor de cerca

de 30emu/g para NPs funcionalizadas com DMSA (valor referência em bulk 92emu/g).

Os grupos tióis presentes na superfície das NPs funcionalizadas foram nitrosados através

de uma solução acidicada de nitrito de sódio, obtendo-se assim NPs nitrosadas (NP-SNO).

A quantidade de NO covalentemente ligado e liberado na superfície das NPs foi avaliado

por quimioluminescência. Os resultados mostram que as NP-SNO liberam espontaneamente

NO, em diferentes concentrações, em meio aquoso. Numa primeira etapa, avaliou-se, à tem-

peratura ambiente, o perl da liberação de NO a partir de NPs recobertas com MSA (razão

molar 1:40). Os resultados indicam a possibilidade de uma liberação controlada de óxido

nítrico, em quantidades (µM) compatíveis para aplicação em biomedicina. Numa segunda

etapa avaliou-se, de maneira comparativa, a capacidade de nitrosação e liberação de NO de

NPs funcionalizadas com MSA e DMSA a diferentes razões molares. Os resultados não evi-

denciaram uma correlação com a razão molar NP:molécula ligante, mas NPs funcionalizadas
vii

com DMSA demonstraram ser mais ecientes tanto no processo de nitrosação, quanto na

capacidade de liberar óxido nítrico. Estes resultados estão dentro dos níveis requeridos em

aplicações biomédicas. Este novo veículo liberador de NO apresenta grande potencial para

gerar quantidades desejadas de NO diretamente em alvos locais.


viii

Abstract
This work reports a new strategy for delivering nitric oxide (NO), based on magnetite

nanoparticles (NPs) with potential application in biomedicine. Magnetite NPs were prepared

through a co-precipitation method by using ferrous and ferric chlorides, followed by oleic

acid (OA) coating to avoid oxidation and reduce their aggregation. Then, we realized a

ligand exchange by mercaptosuccinic acid (MSA) and dimercaptosuccinic acid (DMSA) at

dierent molar ratios. After functionalization, NPs were soluble in water, and have free thiol

groups (SH) on their surface. We used Fourier Transform of Infrared Radiation (FTIR),

X-Ray Diraction (XRD), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Vibrate Sample

Magnetometry (VSM) to characterize the samples.

FTIR results evidenced stretching and bending absorption bands typical of Fe-O, as well

as the S-H stretching absorption bands indicating the presence of thiol groups on the iron

oxide particles. In this way, NPs were functionalized with MSA and DMSA. X-Ray data

showed that the NPs are, indeed magnetite with crystalline size of 11nm. Such a value

agrees with those obtained by TEM and VSM data analysis, within a polydispersion of

20%. Further, the functionalization did not alter the crystalline properties. VSM results

demonstrated that the thiolated NPs had a superparamagnetic behavior at room tempe-

rature. However, DMSA-coating of the NP reduced signicantly the value of saturation

magnetization (from circa 70emu/g for uncoated NP to 30emu/g).

Free thiol groups on NPs surface were nitrosated through an acidied nitrite solution,

yielding nitrosated NPs (SNO-NP). The amount of NO covalently bounded and released

on the NPs surface was evaluated by chemiluminescence. Results revealed that SNO-NP

spontaneously released NO at dierent molar ratios, in aqueous solution. In a rst stage

of this work, at room temperature, NO release prole was evaluated from NPs covered by

MSA (molar ratio 1:40). The results indicated a possibility of a controlled NO-releasing,

at amounts (µM) adequate to biomedical applications. In the second stage, we evaluated

the capacity of nitrosation and NO-releasing from NPs functionalized by MSA e DMSA

at dierent molar ratios. DMSA-coated NPs show to be ecient in nitrosation process as

well as in the ability of releasing NO. These results were at required levels for biomedical

applications. This new magnetic NO-delivery vehicle has a great potential to generate

desired amounts of NO directly to target location.


Sumário

1 Introdução 1
1.1 Estrutura Cristalográca da Magnetita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Propriedades Magnéticas de NPMs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2.1 Energia de Anisotropia Magnética - NPs e Superparamagnetismo . . 10

1.3 Óxido Nítrico - NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.3.1 Funções do NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4 Objetivos da dissertação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.5 Estrutura da dissertação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2 Procedimento de Síntese e Nitrosação das nanopartículas magnéticas 21


2.1 Materiais utilizados para a Síntese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2 Método de Síntese por coprecipitação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.3 Estabilidade e proteção das nanopartículas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.4 Funcionalização das NPs - Troca de Ligantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.5 Nitrosação das NPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.5.1 Primeira Etapa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.5.2 Segunda Etapa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3 Técnicas Experimentais 29
3.1 Espectroscopia Infravermelho - FTIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.2 Parte Experimental - FTIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.3 Difração de Raios X - DRX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.4 Parte Experimental - DRX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.6 Parte Experimental - MET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

ix
x SUMÁRIO

3.7 Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.8 Parte Experimental - VSM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.9 Liberação de NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.9.1 Medida de Quimioluminescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.10 Parte Experimental - Liberação de NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.10.1 Calibração do Analisador de NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.10.2 Medida de liberação de NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4 Resultados e Discussões 49
4.1 Espectroscopia Infravermelho - FTIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.2 Difração de Raios X - DRX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.4 Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.5 Liberação de NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.5.1 Primeira Etapa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.5.2 Segunda Etapa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

5 Conclusões 93
5.1 Caracterizações Químicas e Físicas das NPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

5.2 Liberação de NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.3 Conclusão Final . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Referências 96
A Propriedades Magnéticas 133
A.1 Consideração Semiclássica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

A.2 Consideração Quântica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137


Lista de Figuras

1.1 a. Estrutura do ácido oleico. b. Estrutura do ácido mercaptosuccínico

(MSA). c. Estrutura do ácido dimercaptosuccínico (DMSA). . . . . . . . . . 3

1.2 a b
( ) Sítio tetraédrico (Sítio A) da estrutura espinélio; ( ) Sítio octaédrico

c
(Sítio B) da estrutura espinélio; ( ) Cela unitária da estrutura espinélio e ( ) d
Ampliação de 2/8 da cela unitária da estrutura espinélio. Figura extraída da

referência [44]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 Distribuição catiônica na estrutura espinélio normal (como exemplo: ZnFe2 O4 )

e espinélio inverso (como exemplo: a magnetita, Fe3 O4 ). No espinélio normal,


2+ 3+
o cátion Zn ocupa o sítio tetraédrico (A) e o íon Fe ocupa o sítio octaé-
3+
drico (B); no espinélio inverso, o cátion Fe ocupa o sítio tetraédrico (A) e
2+ 3+
os íons Fe e Fe ocupam o sítio octaédrico (B). . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.4 Difratograma da magnetita, obtida da cha catalográca JCPDF 19-0629. 6

1.5 Modelo estrutural da magnetita indicando um eixo cristalino de fácil magne-

tização na direção cristalográca [111] com espaçamento interplanar entre as

sub-redes tetraédrica e octaédrica de 0,497nm. Na gura são apresentadas a

sub-rede tetraédrica (cinza) e a sub-rede octaédrica (branca). Figura extraída

de [41]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.6 a. Partícula magnética com eixo de fácil magnetização bem denido; b.


Energia de anisotropia em função de θ. Figura extraída de [47]. . . . . . . . 11

2.1 Esquema da obtenção das NPMs (NP), após serem recobertas com ácido

oleico, antes da troca de ligantes(NPAO) e depois da troca de ligantes com

MSA (NPMSA110, NPMSA140, NPMSA180) e com DMSA (NPDMSA110,

NPDMSA140, NPDMSA180). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

xi
xii LISTA DE FIGURAS

2.2 Esquema da nitrosação das NPs funcionalizadas com MSA ou DMSA (NP-SH)

em solução aquosa acidicada, formando-se assim as NPs nitrosadas (NP-SNO). 27

3.1 Interação dos Raios-X com os planos cristalográcos (com uma distância d)
em um cristal, com frentes de onda xx' e yy', com θ como ângulo de Bragg.

Figura extraída da referência [43]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.2 Efeito do tamanho de cristalito na curva de difração; a. Aumento da largura

da curva de difração devido à diminuição da espessura do cristal. b. Pico

de difração ideal no ângulo de Bragg que indica a distância entre os planos

cristalinos. Extraído da referência [43]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3 Distribuição Log-Normal da densidade de probabilidade de diâmetros repre-

sentada através de f LN (Equação 3.9), indicando os valores típico (DT EM ),

mediano (d0 ) e médio (<DT EM >). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.4 a. Curva de histerese de um paramagneto, indicando sua magnetização espe-

cíca de saturação (σs ), e campo coercivo (HC ), assim como sua magnetização

especíca remanente (σr ), b. Curva de histerese para um material superpa-

ramagnético (HC = 0 e σr = 0) [47]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.5 Esquema da liberação de NO no Analisador do Óxido Nítrico. a. Seringa uti-

lizada para injetar soluções contendo nitrosotióis (R-SNO), b. Balão de vidro

(célula do Analisador de NO) contendo ácido ascórbico (solução redutora dos

R-SNO) na mesma pressão do N2 , c. Cilindro de N2 a pressão de 5 - 6 Torr,

d. Mangueira através da qual o NO liberado na célula vai para o Analisador

de NO, e. Cilindro contendo O2 a pressão ∼ 421 Torr, f. Analisador de NO. 43

3.6 Mecanismo de quimioluminescência no interior do Analisador do NO. A libe-



ração de energia proveniente do decaimento do NO2 para NO2 correspondente

a um estado de menor energia produz um fóton com energia hν , detectado

pelo equipamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.7 Esquema do potenciograma (V-t) obtido do Analisador de NO. Cada pico no

potenciograma está relacionado com a concentração do óxido nítrico ([NO])

liberado a partir dos volumes (VR−SN O ) dos R-SNO injetados na célula do

equipamento (Figura 3.5). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45


LISTA DE FIGURAS xiii

3.8 Delimitação manual da linha de início, linha nal e linha de base para cada

pico através do software ( Liquid ) do equipamento. A área encerrada pelo

potenciograma, e entre as linhas de delimitação para a integração. O software

faz a integração e converte a área integrada em concentração (em µM). . . . 45

3.9 Curva de calibração do Analisador de NO, que relaciona a concentração molar

de NO ([NO]) liberado em relação ao número de moles (n) de R-SNO contidos

nos volumes injetados da solução estoque. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1 Espectro FTIR das NPs após serem obtidas (NP) e modicadas na superfície

com ácido oleico (NPAO). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50


−1 −1
4.2 Ampliação da região entre 400cm e 700cm do espectro FTIR das NPs

obtidas (NP) e recobertas com ácido oleico (NPAO), aonde são observadas as
−1 −1
bandas de deformação (δF e−O ∼ 440cm ) e estiramento (νF e−O ∼ 575cm )

correspondentes ao sítio octaédrico (Sítio B) e tetraédrico (Sítio A), respecti-

vamente [76]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.3 Interação quelante bidentada entre o grupo COO do ácido oleico e o átomo

de ferro. Figura extraída de [20]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.4 Esquema representativo do recobrimento das NPs com ácido oleico. . . . . . 52

4.5 Espectro FTIR do ácido mercaptosuccínico (MSA). . . . . . . . . . . . . . . 53

4.6 Espectro FTIR do ácido dimercaptosuccínico (DMSA). . . . . . . . . . . . . 53


−1 −1
4.7 Ampliação da região entre 2300cm e 2700cm do espectro de FTIR nor-

malizado para as moléculas de MSA e de DMSA. As bandas de absorção em


−1 −1
torno de 2530cm e 2563cm (setas na gura) correspondem ao estiramento

νSH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.8 Espectro de FTIR das NPs funcionalizadas com MSA em razões de 1:10

(NPMSA110), 1:40 (NPMSA140) e 1:80 (NPMSA180). . . . . . . . . . . . . 55

4.9 Espectro de FTIR das NPs funcionalizadas com DMSA em razões de 1:10

(NPDMSA110), 1:40 (NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180). . . . . . . . . . 56


−1 −1
4.10 Ampliação da região entre 950cm e 3000cm do espectro FTIR das NPs

funcionalizadas com MSA. Observa-se a troca de ligantes da nanopartícula


−1
através da banda em 1050cm referente ao estiramento νC−O , que indica
−1
a ligação da molécula de MSA com a NP, e as bandas entre 2853cm e
−1
2923cm referente ao estiramento ν−SH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
xiv LISTA DE FIGURAS
−1 −1
4.11 Ampliação da região entre 950cm e 3000cm do espectro FTIR das NPs

funcionalizadas com DMSA. Observa-se a troca de ligantes da nanopartícula


−1
através da banda em 1050cm referente ao estiramento νC−O , que indica
−1
a ligação da molécula de DMSA com a NP, e as bandas entre 2856cm e
−1
2920cm referente ao estiramento ν−SH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.12 Recobrimento das NPs com MSA e DMSA, tendo como resultado nal NPs

funcionalizadas com grupos tióis na superfície. . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.13 Curvas de difração de raios X das NPs após serem obtidas (NP) e após reco-

brimento com ácido oleico (NPAO). Os traços em preto, indicados na Figura,

representam as posições angulares e as intensidades de difração esperadas cor-

respondentes aos planos cristalinos (hkl ) da estrutura espinélio da magnetita

(JCPD 19-0629 - Figura 1.2). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.14 Curvas de difração de raios X das NPs, após serem funcionalizadas com

ácido mercaptosuccínico (MSA) em razão de 1:10 (NPMSA110), de 1:40

(NPMSA140) e 1:80 (NPMSA180). Os traços em preto, indicados na Figura,

representam as posições angulares e as intensidades de difração esperadas cor-

respondentes aos planos cristalinos (hkl ) da estrutura espinélio da magnetita

(JCPD 19-0629 - Figura 1.2). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.15 Curvas de difração de raios X das NPs, após serem funcionalizadas com

ácido dimercaptosuccínico (DMSA) em razão de 1:10 (NPDMSA110), de 1:40

(NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180). Os traços em preto, indicados na

Figura, representam as posições angulares e as intensidades de difração espe-

radas correspondentes aos planos cristalinos (hkl ) da estrutura espinélio da

magnetita ( JCPD 19-0629 - Figura 1.2). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.16 Ajuste do pico de difração no plano de reexão (311) através de uma função

Lorentziana (Equação 3.8) para: a. NPs após serem sintetizadas (NP), b.


NPs funcionalizadas com MSA na razão molar 1:40 (NPMSA140). . . . . . . 65

4.17 Micrograa das nanopartículas sintetizadas (NP) e sua distribuição de tama-

nhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha

tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, va-

lor médio e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . . 69


LISTA DE FIGURAS xv

4.18 Micrograa das nanopartículas recobertas com ácido oleico (NPAO) e sua

distribuição de tamanhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com

a linha vermelha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem

à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . 69

4.19 Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido mercap-

tosuccínico em razão 1:10 (NPMSA110) e sua distribuição de tamanhos. O

tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada

no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio

e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.20 Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido mercap-

tosuccínico em razão 1:40 (NPMSA140) e sua distribuição de tamanhos. O

tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada

no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio

e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.21 Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido mercap-

tosuccínico em razão 1:80 (NPMSA180) e sua distribuição de tamanhos. O

tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada

no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio

e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . 71

4.22 Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido dimer-

captosuccínico (DMSA) em razão 1:10 (NPDMSA110) e sua distribuição de

tamanhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha verme-

lha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana,

valor médio e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . 71

4.23 Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido dimer-

captosuccínico (DMSA) em razão 1:40 (NPDMSA140) e sua distribuição de

tamanhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha verme-

lha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana,

valor médio e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . 72


xvi LISTA DE FIGURAS

4.24 Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido dimer-

captosuccínico (DMSA) em razão 1:80 (NPDMSA180) e sua distribuição de

tamanhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha verme-

lha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana,

valor médio e desvio padrão da distribuição, respectivamente. . . . . . . . . . 72

4.25 a. Curva de histerese das nanopartículas após serem obtidas (NP) e após

recobrimento com ácido oleico (NPAO); b. Ampliação da região selecionada

pelo retângulo vermelho. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.26 a. Curva de histerese das nanopartículas após serem funcionalizadas com

MSA na razão de 1:10 (NPMSA110), 1:40 (NPMSA140) e 1:80 (NPMSA180);

b. Ampliação da região selecionada pelo retângulo vermelho. . . . . . . . . . 75

4.27 a. Curva de histerese das nanopartículas após serem funcionalizadas com

DMSA na razão de 1:10 (NPDMSA110), 1:40 (NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180);

b. Ampliação da região selecionada pelo retângulo vermelho. . . . . . . . . . 75

4.28 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

sintetizadas (NP). b. Distribuição de tamanhos, indicada pela função Log-


Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM corresponde

à mediana e σV SM ao desvio padrão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.29 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

após recobrimento com ácido oleico (NPAO). b. Distribuição de tamanhos,

indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste,
onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. . . . . . . . . . 79

4.30 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

funcionalizadas com MSA em razão de 1:10 (NPMSA110). b. Distribuição

de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a

partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. 80

4.31 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

funcionalizadas com MSA em razão de 1:40 (NPMSA140). b. Distribuição

de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a

partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. 81


LISTA DE FIGURAS xvii

4.32 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

funcionalizadas com MSA em razão de 1:80 (NPMSA180). b. Distribuição

de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a

partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. 82

4.33 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

funcionalizadas com DMSA em razão de 1:10 (NPDMSA110). b. Distribuição

de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a

partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. 83

4.34 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

funcionalizadas com DMSA em razão de 1:40 (NPDMSA140). b. Distribuição

de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a

partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. 84

4.35 a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas

funcionalizadas com DMSA em razão de 1:80 (NPDMSA180). b. Distribuição

de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a

partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão. 85

4.36 Dados representativos da quimioluminescência para a liberação de NO a partir

dos grupos S-NO presentes nas superfície das NPs. As echas indicam as

seguintes injeções: (i): 100µl de NPs não nitrosadas (NPMSA140); (ii): 100µl

de solução aquosa de NaNO2 ; (iii) e (iv): 100 e 10µL de da solução aquosa

das NP-SNO, respectivamente. Figura extraída de [38]. . . . . . . . . . . . . 88

4.37 Perl da Liberação de NO com respeito ao tempo. Figura extraída de [38]. . 88

4.38 Concentração de NO liberado ([NO]) em função da concentração das NPs

nitrosadas, obtidas a partir das NPs funcionalizadas com MSA em razões

molares 1:10, 1:40 e 1:80 (Tabela 4.14). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

4.39 Concentração de NO liberado ([NO]) em função da concentração das nano-

partículas nitrosadas, obtidas a partir das NPs funcionalizadas com DMSA

em razões molares 1:10, 1:40 e 1:80 (Tabela 4.15). . . . . . . . . . . . . . . . 91

A.1 Momento magnético µ na direção do ângulo sólido. . . . . . . . . . . . . . . 134


Capítulo 1

Introdução

A Nanociência tem como objeto de estudo a obtenção, caracterização e muitas vezes fun-
−9
cionalização de materiais com dimensões nanométricas (1nm = 10 m), para aplicações em

áreas da ciência como a Física, Química, Biologia e Medicina. Materiais destas dimensões

exibem propriedades físicas e químicas diferenciadas dos mesmos materiais em dimensões

maiores, devido a alta razão superfície-volume. Nas últimas décadas, vem crescendo o nú-

mero de aplicações de materiais nanoestruturados em Biomedicina [1, 2, 3]. Em especial,

o estudo de nanopartículas magnéticas (NPMs) de dimensões menores que 100nm tem se

destacado devido a alta reatividade química da superfície das mesmas, favorecendo a ligação

de biomoléculas interessantes, e por apresentarem comportamento superparamagnético a

temperatura ambiente [4, 5]. Dentro deste contexto, nanopartículas de óxido de ferro como

magnetita (Fe3 O4 ) e a maghemita (γ -Fe2 O3 ) vem sendo muito estudadas pois, além das

propriedades intrínsecas citadas acima, as mesmas apresentam difusão através de tecidos e

baixa toxicidade [5, 6, 7]. Como exemplo de aplicação, a magnetita vem sendo utilizada

com sucesso em ressonância magnética de imagem, resultando num aumento do contraste

das imagens [8]. NPs de magnetita também vem sendo investigadas como sistemas trans-

portadores e liberadores de fármacos adsorvidos em sua superfície, sendo chamadas, neste

contexto, de nanofármacos [9].

A obtenção das nanopartículas de óxidos de ferro, pode ser realizada através de processos

físicos ou químicos. No caso dos processos físicos, podemos citar, por exemplo, condensação

por gás inerte [10], plasma [11], sputtering de íons [12], e ablação por laser a partir de ma-

1
2 Introdução

teriais macroscópicos [13]. Os processos químicos para obtenção de nanopartículas ocorrem

a partir de átomos e moléculas que as formam via redução química [14], método sol-gel [15],

sonoquímica [16], método solvotérmico [4], decomposição térmica [17] e coprecipitação [18].

Os métodos de síntese por termodecomposição e coprecipitação são também conhecidos

por resultarem em partículas nanométricas de morfologia denida e baixa polidispersão [19],

sendo, portanto, adequados para aplicações em sistemas biológicos. Entretanto, para garan-

tir a estabilidade térmica e química das NPs após a síntese, evitando efeitos de agregação e

oxidação [20, 21, 22], é necessário realizar modicações na superfície das mesmas.

O ácido oleico (AO) é um surfactante normalmente utilizado para estabilizar NPs [18, 23].

Alguns trabalhos mostraram que o ácido oleico é adsorvido na superfície das nanopartículas

de óxido de ferro através da ligação química formada entre o grupo carboxila (COO ) do

ácido oleico (Figura 1.1) e o átomo de Fe da nanopartícula [20, 24, 25] . Assim, após a

adsorção do AO, as NPs cam recobertas com o surfactante, sendo fácil dispersá-las em

meio apolar.

Entretanto, para aplicações em Biomedicina, seja in vitro quanto in vivo, as NPMs de-
vem ser dispersas em meios polares, como o meio biológico (soluções aquosas), para serem

biocompatíveis. Neste contexto, vem sendo muito investigado o recobrimento das NPMs com

moléculas que expõem grupos polares à solução e que contém grupos reacionais a moléculas

de interesse biológico [26, 27, 28, 29]. Em particular, recobrimento das NPMs com ácido

dimercaptosuccínico (DMSA) (Figura 1.1), que apresenta dois grupos tióis funcionais (-SH),

vem sendo amplamente utilizado devido ao favorecimento da formação de pontes di-sulfeto

com cisteínas de algumas proteínas e peptídeos [30, 31, 32, 33].

Neste projeto de dissertação de mestrado, nos propomos, de maneira inédita, modicar

a superfície de NPMs com ácido mercaptosuccínico (MSA) que apresenta apenas um grupo

tiol por molécula (Figura 1.1), com posterior funcionalização com óxido nítrico (NO), como

veículos de transporte e liberação de NO. Existem diferentes aplicações de NO em biomedi-

cina, entre as quais podemos citar a de cicatrização de feridas [34, 35] e regulação de tono

vasomotor [36, 37]. Os resultados geraram uma patente (INPI 018120023545), um trabalho

recentemente publicado no Materials Science and Engineering C (2013) [38] e tres traba-
3

lhos aceitos para publicação no Journal of Physics (Conference Series) sobre citotoxicidade

e genotoxicidade destas nanopartículas [39, 40]. Os trabalhos publicados estão anexados no

nal desta dissertação.

Em continuidade, estudamos de maneira comparativa a liberação de NO de NPMs reco-

bertas com DMSA. Vale a pena mencionar que a utilização de MSA reduz o custo econômico

da síntese das NPs (MSA: R$ 2,24/g e DMSA: R$ 55,48/g, fonte Sigma-Aldrich).

Antes de descrevermos os métodos e resultados da síntese e caracterização das NPMs

funcionalizadas com NO, descreveremos nesta Introdução alguns conceitos que utilizaremos

ao longo da dissertação sobre as propriedades estruturais da magnetita e magnéticas de

NPMs, seguido de uma breve introdução sobre propriedades e importância do óxido nítrico

em sistemas biológicos.

Figura 1.1: a. Estrutura do ácido oleico. b. Estrutura do ácido mercaptosuccínico (MSA).


c. Estrutura do ácido dimercaptosuccínico (DMSA).
4 Introdução

1.1 Estrutura Cristalográca da Magnetita


Existem 16 óxidos de ferro compostos por Fe e O e/ou OH. Na maioria dos compostos, o

ferro apresenta estado de oxidação trivalente; apenas três compostos FeO, Fe(OH)2 e Fe3 O4
+2
contém Fe [41]. Na tabela 1.1, apresentamos os principais óxidos de ferro encontrados na

natureza [42].

Tabela 1.1: Principais óxidos de Ferro. Extraído da referência [42].

Oxihidróxidos Óxidos
Fórmula Mineral Fórmula Mineral
α-FeOOH Geotita Fe5 HO8 4H2 O Ferrihidrita
β -FeOOH Akaganeita α-Fe2 O3 Hematita
γ -FeOOH Lepidocrocita γ -Fe2 O3 Maghemita
δ '-FeOOH Feroxyhyta Fe3 O4 Magnetita

Neste trabalho estudaremos as propriedades da magnetita, um mineral preto, ferromag-

nético que contém Fe


2+ e Fe3+ . Alguns outros nomes são usados para identicar a magnetita,

tais como óxido de ferro preto, mineral de ferro magnético, ímã natural (quando a polaridade

natural está presente), tetraóxido de tri ferro, ferrita ferrosa, pedra de Hércules e Magnetei-

senerz (mineral de ferro magnético), devido a sua diversidade de utilização [41].

A estrutura cristalográca da magnetita foi estabelecida em 1915, sendo uma das pri-

meiras estruturas minerais estudada por Difração de Raios X [43] . Sua estrutura é do tipo
2+ 3+ 2−
espinélio, lembrando que os espinélios são minerais que têm a fórmula geral A B2 O4 ,

onde A e B são íons metálicos e O é oxigênio, com estrutura cúbica de face centrada (fcc),

apresentada na Figura 1.2 [44].

As estruturas do tipo espinélio podem ser classicadas de acordo com a posição (chamada

de sítio) que cátions semelhantes ocupam na estrutura, formando sub-redes tetraédricas (sítio

A) e octaédricas (sítio B). No sítio tetraédrico, o íon metálico está localizado no centro de

um tetraedro que tém íons oxigênio nos vértices (Figura 1.2); no sítio octaédrico (sítio B),

o íon metálico está localizado no centro de um octaedro que tém íons oxigênio nos vértices

(Figura 1.2). A formação de sub-redes é uma razão para a diversidade estrutural e magnética

de óxidos metálicos [42].


1.1. Estrutura Cristalográca da Magnetita 5

Figura 1.2: a b
( ) Sítio tetraédrico (Sítio A) da estrutura espinélio; ( ) Sítio octaédrico (Sítio
c d
B) da estrutura espinélio; ( ) Cela unitária da estrutura espinélio e ( ) Ampliação de 2/8
da cela unitária da estrutura espinélio. Figura extraída da referência [44].
6 Introdução

Figura 1.3: Distribuição catiônica na estrutura espinélio normal (como exemplo: ZnFe2 O4 )
2+
e espinélio inverso (como exemplo: a magnetita, Fe3 O4 ). No espinélio normal, o cátion Zn
3+
ocupa o sítio tetraédrico (A) e o íon Fe ocupa o sítio octaédrico (B); no espinélio inverso,
3+ 2+ 3+
o cátion Fe ocupa o sítio tetraédrico (A) e os íons Fe e Fe ocupam o sítio octaédrico
(B).

A estrutura é denominada de espinélio normal quando cátions semelhantes ocupam a

mesma sub-rede. A Figura 1.3 apresenta um exemplo para ZnFe2 O4 . A magnetita apresenta

estrutura espinélio inverso: os sítios tetraédricos (sítios A) estão completamente ocupados


3+ 3+ 2+
pelo íon Fe e os sítios octaédricos (sítios B) estão ocupados pelos íons Fe e Fe (Figura

1.3).

A cela unitária da magnetita contém 8 íons metálicos de sítio A, 16 de sítio B e 32

oxigênios; esta cela unitária pode ser imaginada como um cubo de aresta a (a =0,8396nm)
[41] dividida em oito pequenos cubos iguais, cada um com aresta a /2 como está apresentado
na Figura 1.2 [44]. Devido às propriedades de simetria estrutural, a magnetita apresenta

grupo espacial F 3̄dm [41, 42]. Num difratograma de Raios-X, as reexões permitidas dos

planos cristalinos correspondem aos planos (220), (311), (222), (400), (422), (511), (440) e

(531), conforme apresentado na Figura 1.4, sendo a reexão (311) a mais intensa.

Figura 1.4: Difratograma da magnetita, obtida da cha catalográca JCPDF 19-0629.


1.2. Propriedades Magnéticas de NPMs 7

1.2 Propriedades Magnéticas de NPMs


O nanomagnetismo natural é encontrado, por exemplo em bactérias magnetostáticas,

que tem vida em ambientes escuros e contém cadeias de partículas de magnetita; estas

cadeias tem comprimentos de 40 a 100 nm e são usadas para a orientação vertical das bac-

térias [45]. Partículas semelhantes são encontradas nos cérebros de alguns outros animais

como abelhas e pombos, e atualmente vem se estudando se estas partículas magnéticas con-

tribuem nas suas orientaçôes de vôo devido às propriedades magnéticas que apresentam [45].

Para compreender as propriedades magnéticas que um determinado material pode apre-

sentar, devemos levar em conta que todo material está constituido por átomos (que podem

ser iguais ou diferentes). Os elétrons presentes nos átomos, devido ao seu movimento em

torno do seu eixo e do núcleo, apresentam um momento magnético (µi ). Os núcleos apresen-

tam um outro momento magnético nuclear (que é desprezível comparado com o momento

magnético dos elétrons) [45] e, portanto, não inuencia considerávelmente nas propriedades

magnéticas do material. Na interpretação clássica, o momento magnético associado ao giro

de um elétron em órbita circular ao redor do núcleo é denido pelo magnéton de Bohr [46]:

µB = I S (1.1)

onde:

I: intensidade de corrente associada com o movimento do elétron (A).


2
S: área encerrada pela trajetória do elétron (m ).

Com:
ev
I =
2π r
e:

2
S = π r

onde:
−19
e: carga do elétron (1,6 × 10 C).

v: módulo da velocidade do elétron (m/s).

r: raio da trajetória de giro (m).


8 Introdução

Na Equação 1.1 podemos então reescrever:

ev r
µB =
2
Sabemos que do ponto de vista quântico, o momento angular está quantizado: L = n ~, e o

momento angular orbital de valor unitário (n=1) é: L = ~ = h/2π . Na mecânica clássica,

um elétron com massa (me ) que gira em uma órbita de raio r e velocidade v apresenta

momento angular L = me v r. Assim, das considerações clássica e quântica, temos: v r =

h/2πme . O magnéton de Bohr (µB ) então pode ser descrito como:

eh Joule
µB = = 9, 27 × 10−24
4πme Tesla

onde:
−27 −1
h: constante de Planck (6,627 × 10 Js ).
−31
me : massa do elétron (9,1 × 10 kg).

Considerando um volume V de material magnético composto de N átomos, os elétrons

destes átomos apresentam um momento magnético µ:

N
X
µ= µi (1.2)
i

Dene-se Magnetização M  de um material como o momento magnético total resultante

(µ) por volume (V ) tal que [47]:

µ
M= (1.3)
V
3 3
A unidade da magnetização é unidade eletromagnética/cm , ou simplesmente emu/cm 

(1emu = 10
−3
J/T). Neste trabalho adotaremos a magnetização especíca (σe ) denida como
o momento magnético (µ) por unidade de massa (m):

µ
σe = (1.4)
m
onde m é a massa do material (em gramas).

Quando um campo magnético externo é aplicado a um gás de elétrons com spin-up e


1.2. Propriedades Magnéticas de NPMs 9

spin-down, estes apresentam estados de energia diferentes devido à orientação dos mesmos

em relação ao campo magnético. No caso dos momentos magnéticos, quando um campo

magnético externo é aplicado, os momentos magnéticos são alinhados na mesma direção ou

na direção oposta ao campo magnético externo e, como resultado, os momentos magnéticos

formam sub-redes com populações diferentes. Para o gás de elétrons, o momento magnético

de spin total (µ) é dado por [47]:

µ = µB (n ↑ −n ↓) (1.5)

onde n↑ e n↓ são o número de elétrons com spin-up e spin-down, respectivamente. Este

fenômeno é conhecido como o Paramagnetismo de Pauli, e a correspondente susceptibilidade


magnética é chamada a susceptibilidade de Pauli [47].

O momento magnético nos óxidos dos metais de transição ou óxidos 3d, como a magnetita,

é medido em µB vezes o número de spins desemparelhados [45]. Assim, para compreender

o fenômeno do magnetismo na magnetita, temos que levar em conta que em cada unidade
2+
estrutural da mesma (Figura 1.2) temos íons ferroso (Fe ), que contém seis elétrons no
3+
orbital 3d e, portanto, apresentam um momento magnético 4µB , e férrico (Fe ), com cinco

elétrons na subcamada 3d e apresentam um momento magnético 5µB . Portanto, por cada


3+
unidade de fórmula da magnetita Fe3 O4 , ou FeO Fe2 O3 , temos dois íons férrico (Fe ) com
2+
momentos magnéticos antiparalelos [47] e um íon ferroso (Fe ), produzindo um momento

magnético total igual a 4µB . O valor experimental do momento magnético da magnetita é

4,1µB [45].

No caso de um magneto, seu comportamento magnético pode ser tratado do ponto de

vista clássico e quântico. Clássicamente o momento magnético é explicado a partir do alinha-

mento total dos momentos magnéticos quanticado através da magnetização de saturação

(Ms ) e da função de Langevin (L(x) ), sendo x a razão entre as energias magnética e térmica

do magneto (x = µB/kB T ), tal que [46, 47]:

M = Ms L(x) (1.6)

e:
1
L(x) = coth(x) − (1.7)
x
−7
com: B: módulo da indução magnética (Tesla); B=µ0 H, onde µ0 = 4 π× 10 Tesla metro/
10 Introdução

Ampère e H: módulo do campo magnético (Ampère/metro).

Do ponto de vista quântico, a magnetização (M ) depende da magnetização de saturação

(Ms ) e da função de Brillouin BJ (x), sendo J o momento angular total do sistema de spins

tal que [47]:

M = MS BJ (x) (1.8)

e:
2J + 1 2J + 1 1 x
BJ (x) = coth[ x] − coth[ ] (1.9)
2J 2J 2J 2J
No limite clássico, os momentos magnéticos podem ser alinhados continuamente e, as-

sumindo todos os valores para o momento angular total (J → ∞), a função de Brillouin

é simplicada, obtendo a função de Langevin (Equação 1.7). As deduções da função de

Langevin e de Brillouin são desenvolvidas no Apêndice A.1, e A.2, respectivamente.

1.2.1 Energia de Anisotropia Magnética - NPs e Superparamagne-

tismo

A direção de magnetização em relação aos eixos cristalinos é denominada de anisotropia


magnética. Abaixo de um certo diâmetro crítico, NPs podem ser consideradas com um único

domínio magnético (monodomínio) e apresentam contribuições anisotrópicas à sua energia

total associadas com algumas direções preferenciais de magnetização, tensões sofridas ou

à própria estrutura cristalina [47]. No caso da magnetita, monomodínios são formados em

partículas de 5 a 20nm de diâmetro [7], sendo a direção [111] a de fácil magnetização (Figura

1.5).

Em muitos casos, supõe-se uma anisotropia uniaxial, caracterizada por uma constante

de energia anisotrópica magnetocristalina Ka . Neste caso, a energia de anisotropia (EA ),

para uma partícula de volume V  se altera com ângulo θ  formado pelo eixo de fácil

magnetização e a direção do momento magnético (apresentada na Figura 1.6) e é escrita

como [47]:

EA = Ka V sen2 θ (1.10)
1.2. Propriedades Magnéticas de NPMs 11

Figura 1.5: Modelo estrutural da magnetita indicando um eixo cristalino de fácil mag-
netização na direção cristalográca [111] com espaçamento interplanar entre as sub-redes
tetraédrica e octaédrica de 0,497nm. Na gura são apresentadas a sub-rede tetraédrica
(cinza) e a sub-rede octaédrica (branca). Figura extraída de [41].

Figura 1.6: a. Partícula magnética com eixo de fácil magnetização bem denido; b. Energia
de anisotropia em função de θ. Figura extraída de [47].
12 Introdução

A transição de um mínimo de energia para outro (Figura 1.6) pode ser térmicamente

ativada para temperaturas T  diferentes de 0K, na qual a probabilidade de transição é

grande se a energia térmica (kB T ) é comparável ou maior que a energia de anisotropia (EA ).

Se considerarmos um conjunto de partículas magnetizadas a temperatura diferente de 0K,

na ausência de um campo magnético externo, a magnetização evoluirá com o tempo desde

que existam transições térmicamente ativadas entre os 2 mínimos de energia, tal que [47]:

dM 1 −( Ka V ) M
=− M e kB T = − (1.11)
dt τ0 τ
onde τ é o tempo de relaxação, ou inverso da frequência de salto de um mínimo de energia

para o outro. O pré-fatorτ0 é conhecido como o inverso da frequência de tentativas, sendo


−12 −9
da ordem de 10 s a 10 s [47]. Em termos simples, a Equação 1.11 descreve que sob a

inuência da energia térmica, o sistema realiza τ0−1 tentativas por segundo para ultrapassar

a barreira de energia. O tempo de relaxação é então dado por:

Ka V
τ = τ0 exp( ) (1.12)
kB T
conhecido como lei de Neel-Arrhenius [47].

O comportamento magnético observado de uma particula magnética depende da escala

de tempo da medida experimental. Para técnicas macroscópicas como medidas diretas de

magnetização M, o tempo de medida tm é normalmente da ordem de 100 s [47]. Em es-


−9 −7
pectroscopia Mossbauer tm = 10 a 10 s [47]. Portanto, se o tempo de relaxação τ é

menor que tm , a magnetização espontânea é zero, e a partícula é dita estar no estado super-

paramagnético. Se τ > tm a partícula está num estado bloqueado (ou ferromagnético) e a

magnetização é diferente de zero.

Nota-se também que se o volume da partícula varia, a energia da barreira EA também

varia. Sendo assim, para uma dada temperatura T, a partícula pode estar num regime

superparamagnético ou ferromagnético dependendo de seu tamanho. Assim, dene-se um

volume crítico superparamagnético como:

kB T tm
Vcrspm = ln( ) (1.13)
Ka τ0
1.2. Propriedades Magnéticas de NPMs 13

abaixo do qual, a uma certa temperatura T, a partícula encontra-se num estado su-

perparamagnético. Por exemplo, nanopartículas de magnetita exibem comportamento su-

perparamagnético a T ambiente para diâmetros menores que 17 nm em uma medida de

susceptibilidade magnética e menores que 9 nm em um experimento de Mossbauer [48].

Inversamente, para um dado volume V, a temperatura abaixo da qual o comportamento

ferromagnético é observado, é chamada de temperatura de bloqueio TB , dado por [47]:

Ka V
TB = (1.14)
kB ln(tm /τ0 )
As temperaturas de bloqueio para NPs de magnetita de dimensões entre 5 a 13 nm estão

na ordem de ∼ 10 a 30K [46, 47, 49].

Consideremos agora o sistema na presença de um campo magnético H aplicado ao longo


do eixo de fácil magnetização. A energia livre total passa a ser [47]:

EA = Ka V sen2 θ − µHcosθ (1.15)

Nessas condições, os estados de mínima energia não são mais equivalentes, pois um deles

será favorecido dependendo do sentido de aplicação do campo magnético, induzindo alguns

dos momentos magnéticos de partículas a se reorientarem em sua direção. Assim, mede-se

uma magnetização líquida M não nula para o sistema e o grau de reorientação aumenta

com o aumento na intensidade do campo até que, quando todos os momentos magnéticos

estão orientados, a magnetização de saturação Ms é atingida. Em materiais ferromagnéticos

formados por múltiplos domínios, as interações entre eles faz com que, após a aplicação de

um campo magnético, exista um valor não nulo para a magnetização, mesmo após a retirada

do campo. Esse valor é denominado magnetização remanente ou remanência (Mr ). Para que

esta se anule, é necessário a aplicação de outro campo magnético em sentido contrário, cujo

valor é denominado campo coercivo ou coercividade (HC ). Em regime superparamagnético,

espera-se ausência de histerese (HC =0 e Mr =0) [47].


14 Introdução

Vale a pena frisar que durante a síntese produzimos nanopartículas magnéticas com uma

certa polidispersão em tamanhos. Para analisar o comportamento da magnetização sob a

ação de um campo externo aplicado numa certa direção, devemos ter em conta que a curva

de magnetização (M x H) será resultado da superposição de diferentes curvas de Lange-

vin (Equações 1.6 e 1.7) correspondentes aos diferentes volumes de partículas na amostra

analisada. Portanto, neste caso a magnetização será dada por [47]:

Z ∞
µB
M(B,T ) = NT Ms L( )f(µ)dµ (1.16)
0 kB T

onde f(µ) corresponde a uma função de distribuição de momentos magnéticos dos grãos

da amostra, que pode ser representada através de uma função Log-Normal LN ),


(f e NT

corresponde ao número total de partículas magnéticas analisadas na amostra. Lembrando

que: µ = Ms V (Equação 1.3) e B=µ0 H, podemos reescrever a Equação 1.16 em função do

diâmetro magnético dmag das nanopartículas tal que:

∞ µ0 Ms π d3mag H
Z
M(H,T ) = NT Ms L( )fLN (dmag )d(dmag ) (1.17)
0 6kB T

Assim, a função de distribuição de momentos magnéticos pode nos fornecer informações

sobre a distribuição de tamanhos f LN (dmag ) das NPs e ser comparada com aquelas fornecidas
por outras técnicas, como por exemplo Microscopia Eletrônica de Transmissão, conforme

abordaremos nesta dissertação (Capítulo 4).


1.3. Óxido Nítrico - NO 15

1.3 Óxido Nítrico - NO


·
O óxido nítrico (NO ) possui um elétron desemparelhado, motivo pelo qual é conside-

rado um radical livre. Foi obtido pela primeira vez pelo cientista belga Jan Baptist Van

Helmont aproximadamente em 1620. As propriedades químicas do NO foram inicialmente

caracterizadas por Joseph Priestly em 1772. Em meados de 1980, o NO foi considerado como

um poluente atmosférico e metabólito bacteriano [50]. Em 1992 foi reconhecida a grande

importância do NO pela revista Science, denominando ao NO como a Molécula do Ano ;


e em 1998, F. Futchgott, Louis J. Ignarro e Ferid Murad ganharam o Prêmio Nobel pela

descoberta da complexa estrutura do NO [50, 51].

O NO é um molécula gasosa produzida no endotélio, devido à reação de L-Arginina

com oxigênio molecular catalisado pela sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS), como

apresentado na Equação 1.18 [52]:

eN OS
L-Arginina + O2 −→ NO + L-Citrullina (1.18)

O óxido nítrico é incolor e tem tamanho da ordem de ∼ 1,4 Å com tempo de vida médio
de aproximadamente 3-5 segundos em água.
·
A temperatura e pressão ambiente, NO existe

como uma espécie monomérica. NO


· apresenta alta reatividade com componentes biológicos
−2 ·
como superóxidos (O ), oxigênios, tióis, e outros [50]. O elétron desemparelhado do NO

não reside completamente no nitrogênio, mas é compartilhado entre o oxigênio e nitrogênio

[53]. Como o nitrogênio apresenta um coeciente orbital alto, a reação do NO


· com outros

radicais ocorre através do átomo de nitrogênio [54].

Para se medir a presença do NO várias técnicas foram desenvolvidas, como quimiolumi-

niscência [55, 56], método de Griess, espectroscopia de ressonância paramagnética e imagem

por ressonância [50, 51, 57].

A importância biológica da reatividade química do óxido nítrico e seus derivados tem

sido foco de muitos trabalhos, além da sua dinâmica in vivo. Devido a seu pequeno tamanho,

sua falta de carga e alta lipolicidade, NO é uma molécula altamente difusível através de

membranas celulares para agir com alvos intracelulares [38].


16 Introdução

NO é aproximadamente nove vezes mais solúvel em solventes orgânicos que em água

[53]. Consequentemente, o NO se concentra em fases hidrofóbicas nos tecidos, inclusões

em membranas lipídicas, e complexos lipoproteicos [53]. Isto traz consequências biológicas

importantes, como a fácil movimentação do NO no tecido, que é muito importante nas suas

ações biológicas.

1.3.1 Funções do NO

Em sistemas biológicos, o NO apresenta múltiplas aplicações em siologia, patologia e

farmacologia. Desde a descoberta em 1987 do NO como responsável pelas ações siológicas

do fator de relaxação derivado do endotélio (EDRF do inglês endothelium-derived relaxing


factor ), o NO tem sido envolvido em numerosos processos biológicos como, a comunicação

molecular, regulação da pressão sanguínea, mediador em um amplo espectro de atividades

tanto anti-tumorais como anti-bactericidas [58]. O NO tem sido ainda relacionado no tra-

tamento de algumas doenças como mal de Alzheimer e Parkinson [59, 60].

Em relação a células, o NO apresenta duas funções divergentes: homeostática e cito-


tóxica. O NO é produzido em pequenas quantidades em condições siológicas: regula a

vasorelaxação, controla a adesão e agregação de plaquetas e neutrólos (células sanguíneas

leucocitárias que fazem parte do sistema imunológico), está relacionado em neurotransmis-

são [61] e proliferação e contração de músculo liso [62]. Enquanto aos efeitos citotóxicos do

NO, estes são observados quando o NO é produzido em quantidades maiores pelos macrófa-

gos, hepatócitos e outras células depois da exposição das mesmas às citoquinas ou produtos

microbianos [61]. Altos níveis de NO inducem necrose celular [63].

O óxido nítrico se apresenta como agente neurotransmissor no sistema nervoso, difundindo-

se a partir de um neurônio a outro para atuar diretamente sobre os componentes intracelula-

res. NO não encontra restrições espaciais encontradas normalmente em neurotransmissores

clássicos, que mediam suas ações biológicas por ligação às proteinas associadas à membrana

do receptor em pontos discretos. NO é armazenado em vesículas sinápticas que são pequenas

esferas ligadas ao extremo dos axônios nos neurônios do sistema nervoso e apresentam um

tamanho aproximado de 10 a 20 nm. Tem sido demonstrado que o NO trabalha em conjunto

com outros sistemas neurotransmissores no organismo, tais como norepinefrina, dopamina,

serotonina e glutamato para produzir uma resposta siológica no organismo [51].


1.3. Óxido Nítrico - NO 17

Existem relatos na literatura que o NO pode ser citotóxico às células de neurônios. Uma

das principais causas é que o NO provoca a inibição mitocondrial, liberação de glutamato

e subseqüente morte citotóxica dos neurônios [63]. Altas concentrações de glutamato extra-

celular (o principal neurotransmissor exitotóxico no cérebro) pode matar os neurônios por

ativação dos receptores de glutamato; esta morte celular é conhecida como morte excitotó-

xica [63].

O óxido nítrico liberado por quase todas as células do coração exerce múltiplos efeitos

sobre a função cardíaca. Modula as respostas inotrópica (aumento ou diminuição da força de

contração do coração) e cronotrópica (aumento da frequência cardíaca) [36]. Os principais

fatores de risco cardiovasculares, tais como hipertensão sistêmica, estão associados a uma

disfunção endotelial, que é principalmente caracterizada por uma diminuição na bioatividade

do NO derivado do endotélio [62].

Existem também pró-fármacos do NO, entre eles, aqueles da classe iônico diazeniumdio-

late que espontaneamente se dissociam em taxas denidas para formar NO. Estes não só são

amplamente utilizados em estudos biológicos, mas também são de interesse como possíveis

agentes terapêuticos no tratamento de algumas doenças como câncer, por exemplo, depen-

dendo do estágio das doenças [64].

A administracão tópica de doadores de NO para investigação de cicatrização do tendão

em pacientes humanos, é apresentada como um tratamento muito mais simples e menos

susceptível de perturbar o tecido circundante. O NO é gerado pelos osteoblastos e outras

células dentro do osso em resposta a um gênero de hormônios esteroidais [65]. O uso poten-

cial do NO para tratar lesão no tendão, apresenta a necessidade de controlar concentrações

localizadas de NO para promover e não inibir a deposição de colágeno. Uma solução de al-

bumina de soro bovino nitrosada tem sido utilizada como carreadora e liberadora de NO [66].

Em termos de cicatrização, NO tem sido implicado em todas as fases de cicatrização de

feridas. Estudos demonstraram a capacidade do NO para modular citoquinas quimiotáticas

(de ação proinamatória) e controlar a deposição de colágeno, angiogênese, proliferação ce-

lular e apoptose [34, 35].


18 Introdução

O NO na circulação sanguínea apresenta um tempo de meia vida de 1,8ms, o que sig-

nica que a molécula tem pouco tempo para começar a agir no organismo. Encapsulação

em lipossomos vem sendo investigada para aumentar o tempo de vida médio do NO no sis-

tema circulatório [67]. Encontrados endogenamente, os peptídeos contendo um tiol, como a

glutationa (GHS), são considerados como carreadores e doadores de NO em mamíferos [68].

De fato, a GSH pode ser submetida à reação de nitrosação, produzindo S-nitroglutationa

(GSNO), que é considerada um S-nitrosotiol (R-SNO) [68].

Em função de todas estas possíveis aplicações de NO em Biomedicina, neste projeto de

dissertação de mestrado sintetizamos nanopartículas magnéticas como possíveis carreadoras

e liberadoras de óxido nítrico, conforme veremos a seguir.


1.4. Objetivos da dissertação 19

1.4 Objetivos da dissertação


O objetivo deste trabalho consiste na obtenção e caracterização de NPs de magnetita

visando sua aplicação biomédica como carreadoras e liberadoras de óxido nítrico (NO).

Objetivos Especícos:

• Sintetizar NPs de magnetita através da síntese por coprecipitação química dos sais

de ferro, seguida de recobrimento com ácido oleico (AO). Caracterizar as propriedades

química (composição) e físicas (estrutura, morfologia e magnetismo) das NPs formadas.

• Funcionalizar as NPs com MSA e DMSA em diferentes razões de concentração (1/10,

1/40 e 1/80), e avaliar as possíveis mudanças tanto na composição (FTIR), estrutura

(XRD), morfologia (TEM), e magnetismo (VSM) destas.

• Avaliar a efetividade da ligação e liberação do NO das NPs funcionalizadas em dife-

rentes razões de concentração de MSA e DMSA.

• Comparar os resultados obtidos de liberação de NO em NPs recobertas com MSA e

DMSA.

1.5 Estrutura da dissertação


No Capítulo 1, apresentamos uma breve descrição das aplicações biomédicas das NPs de

magnetita, assim como as propriedades estruturais e magnéticas que apresentam. Além

disto, apresentamos brevemente o óxido nítrico (NO) e suas principais propriedades, fun-

ções e aplicações biomédicas.

No Capítulo 2, apresentamos a síntese das NPs pelo método de co-precipitação química dos

sais de ferro, assim como o rol que cumprem o recobrimento com ácido oleico e funciona-

lização da sua superfície com ácido mercaptosuccínico (MSA) e ácido dimercaptosuccínico

(DMSA). Apresentamos também o protocolo de nitrosação realizado em 2 etapas nesta dis-

sertação.
20 Introdução

No Capítulo 3, apresentamos as técnicas experimentais utilizadas para as análises químicas

(composição e ligações), assim como físicas (estruturais, morfológicas e magnéticas).

No Capitulo 4 apresentamos os resultados e discussões das caracterizações realizadas das

NPs, assim como a liberação de óxido nítrico associada com a funcionalização das mesmas

com MSA e DMSA.

No Capítulo 5 apresentamos as conclusões do trabalho.

O trabalho publicado durante o desenvolvimento desta dissertação de Mestrado está apre-

sentado no Anexo I. Na parte nal desta dissertação (Apêndices A.1 e A.2) foram descritas

as funções de Langevin e Brillouin, a partir das considerações clássicas e quânticas, respec-

tivamente, que permitiram denir Magnetização na Seção 1.2.


Capítulo 2

Procedimento de Síntese e Nitrosação


das nanopartículas magnéticas

2.1 Materiais utilizados para a Síntese


Cloreto ferroso tetrahidratado (FeCl2 .4H2 O) e o cloreto férrico hexahidratado (FeCl3 .6H2 O)

foram comprados da Sigma-Aldrich. Ácido clorídrico (HCl), hidróxido de amônio (NH4 OH),

tolueno (C6 H5 -CH3 ), dimetilsulfóxido (CH3 SOCH3 ), ácido oleico, assim como o ácido mer-

captosuccínico (MSA: C4 H6 O4 S), e o ácido dimercaptosuccínico (DMSA: C4 H6 O4 S2 ), tam-

bém foram fornecidos pela Sigma-Aldrich.

2.2 Método de Síntese por coprecipitação


Para a realização deste trabalho utilizamos a infraestrutura do Laboratório de Processos

Fotoinduzidos e Interfaces do Instituto de Química da Universidade de São Paulo.

As nanopartículas foram obtidas pelo método de coprecipitação de sais de ferro seguindo

o protocolo descrito na literatura [18]. Inicialmente dissolvemos 0,2g de cloreto ferroso te-

trahidratado FeCl2 .4H2 O, e 0,5g de cloreto férrico hexahidratado FeCl3 .6H2 O separadamente

em 1ml e 4ml de HCl (1M), respectivamente, obtendo-se soluções com razões molares 1:2.

Em seguida, as soluções foram misturadas sob agitação magnética, ao mesmo tempo em que

50ml de hidróxido de amônio (0,7M) era adicionado na solução. Após a adição da base, na

21
22 Procedimento de Síntese e Nitrosação das nanopartículas magnéticas
2+ 3+ −
solução estão presentes os íons Fe , Fe e OH que reagem químicamente (Equação 2.1)

dando origem ao óxido de ferro [69]:

Fe
2+
+ 2Fe3+ + 8OH− −→ Fe3 O4 + 4H2 O (2.1)

As NPs de óxido de ferro precipitam na solução dando origem a um sólido preto. Após

cerca de 40 minutos, este precipitado foi centrifugado (5 minutos a 2500rpm) e lavado com

acetona e etanol por 3 ou 4 vezes. Em seguida, este material foi colocado num dissecador

por cerca de 8h, obtendo-se uma amostra em pó, a qual chamamos de nanopartículas recém

sintetizadas (NP).

Observa-se que durante a obtenção do precipitado, as nanopartículas eram fortemente

atraídas pela barra magnética, indicando um caráter magnético para as mesmas que será

avaliado nesta dissertação (Capítulo 4).

2.3 Estabilidade e proteção das nanopartículas


As NPs de magnetita obtidas na Seção 2.2 (já em pó), estão em contato com o ar.

Conforme mencionado na introdução, este meio pode produzir a oxidação das mesmas. Para

protegê-las realizamos um recobrimento inicial com ácido oleico [70, 71].

As NPs (∼ 5mg) foram misturadas com ácido oleico (6ml) no agitador magnético, du-

rante 3 minutos, formando-se uma massa pastosa de cor preta. Após obtenção, esta mesma

foi lavada e centrifugada (2500rpm) com acetona e etanol por três vezes, durante 5 minutos,

sendo que o precipitado obtido foi colocado num dissecador. No nal deste processo, as NPs

devem estar recobertas com ácido oleico, que será identicado por Espectroscopia Infraver-

melho (Seção 4.1). Esta amostra é chamada NPAO.

2.4 Funcionalização das NPs - Troca de Ligantes


Num primeiro estágio, as NPs recobertas com ácido oleico (∼ 10mg) foram suspensas em

1ml de tolueno; enquanto 5,56g de MSA foi diluída em 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO).

As duas soluções foram misturadas sob agitação magnética por 14h. Em seguida, realiza-

mos um procedimento de decantação e o precipitado obtido foi então lavado e centrifugado


2.4. Funcionalização das NPs - Troca de Ligantes 23

(10000rpm) com acetona e etanol por três vezes, durante 5 minutos. A centrigugação desta

amostra foi realizada inicialmente em tubo de plástico. Observamos que as paredes do mesmo

cavam com uma cor marrom na superfície interna, indicando uma contaminação de nossa

amostra no plástico. Sendo assim, decidimos utilizar tubos de vidro (COREX) durante a

centrifugação das próximas amostras funcionalizadas tanto com MSA quanto com DMSA.

Esta primeira amostra de razão molar 1:40 e foi objeto de estudo do trabalho publicado na

referência [38].

Numa segunda etapa do trabalho, as nanopartículas recobertas com ácido oleico (∼

20mg) foram suspensas em tolueno; enquanto MSA e DMSA foram dissolvidos em 10ml de

DMSO, com massas proporcionais às razões molares NP:MSA ou NP:DMSA (1:10, 1:40 e

1:80). Misturamos as soluções de NP e MSA (ou DMSA) sob agitação magnética durante

16h. Nesta parte xamos a massa das NPs para que a mudança fosse devida apenas à

funcionalização com MSA ou DMSA. Após este periodo de tempo, o processo de lavagem

e secagem foi realizado como mencionado no parágrafo anterior. Identicamos estas par-

tículas em função da razão molar como NPMSA110 e NPDMSA110 para razões molares

1:10 respectivamente. De maneira análoga temos as amostras NPMSA140, NPDMSA140,

NPMSA180 e NPDMSA180. O processo inteiro de obtenção, recobrimento com AO e troca

de ligantes das NPs é representado na Figura 2.1.

O pH da solução foi medido no nal de cada etapa realizada, como indica a Figura 2.1.

O fato mais importante na obtenção das NPs funcionalizadas com MSA e DMSA foi o

intervalo de tempo empregado na centrifugação. No caso de MSA, as NPs levam de 10 a 15

min para precipitar, enquanto no caso das NPs com DMSA estas levam de 3 a 5 min para

precipitar.
24 Procedimento de Síntese e Nitrosação das nanopartículas magnéticas

Figura 2.1: Esquema da obtenção das NPMs (NP), após serem recobertas com ácido oleico,
antes da troca de ligantes(NPAO) e depois da troca de ligantes com MSA (NPMSA110,
NPMSA140, NPMSA180) e com DMSA (NPDMSA110, NPDMSA140, NPDMSA180).
2.5. Nitrosação das NPs 25

2.5 Nitrosação das NPs


2.5.1 Primeira Etapa

Na primeira etapa, o processo de nitrosação foi realizado no Laboratório de Fisicoquímica

do Instituto de Química da Universidade de Campinas (IQ-UNICAMP), sob coordenação

do Dr. Marcelo G de Oliveira, e em colaboração com a Dra. Amedea Seabra (UNIFESP).

Uma suspensão aquosa das NPs funcionalizadas com MSA (NPMSA140) foi ltrada com

ltros da Millipore (10kDa de massa molar de corte, Millipore, Billerica, MA, USA). As

NPs (NPMSA140) foram lavadas com água deionizada e centrifugadas cinco vezes durante

10 minutos a 13400g numa centrífuga RF Micromax (Thermo IEC, Milford, MA, USA).

Os grupos tióis presentes na superfície das NPs foram nitrosados através da adição de uma

solução acidicada de NaNO2 , conforme será descrito na Seção 2.5.2.2. Neste passo, 4,6mg da

amostra NPMSA140 ltrada foi suspensa em 1ml de água deionizada, contendo 5µl de HCl

aquoso (6mM). Um volume de 200µl de NaNO2 aquoso (60mM) foi adicionado à suspenção

de NPMSA140. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, a solução com as NPs

em suspensão foi novamente ltrada e lavada com água deionizada [38].

2.5.2 Segunda Etapa

O segundo estágio desta experiência foi realizado no Laboratório de Fotoquímica Inorgâ-

nica no Departamento de Química da Faculdade de Filosoa, Ciências e Letras de Riberão

Preto - USP, sob a coordenação do Dr. Elia Tfouni, conjuntamente com a colaboração da

Dra. Amedea Seabra (UNIFESP), e auxílio das técnicas Ivana A. Borin e Aline N. Chiba.

2.5.2.1 Materiais utilizados


Nitrito de sódio (NaNO2 ) foi utilizado para nitrosação das NPs, enquanto ácido ascórbico

(C6 H8 O6 ) e hidróxido de sódio (NaOH) foram utilizados na preparação da solução redutora,

todos fornecidos pela Sigma-Aldrich.


26 Procedimento de Síntese e Nitrosação das nanopartículas magnéticas

2.5.2.2 Nitrosação das NPs recobertas com MSA e DMSA


Diluímos 0,0454g de NaNO2 em 10ml de água milli-Q, obtendo-se uma solução de NaNO2

(65,8mM). Em seguida, 5mg de cada uma das NPs funcionalizadas com MSA ou DMSA fo-

ram suspensas em 1ml de água milli-Q. A última solução foi misturada com 200µl da solução

de NaNO2 (Figura 2.2).

Na nitrosação das NPs funcionalizadas tanto com MSA e DMSA (denotadas por NP-

SH na Figura 2.2), a formação dos nitrosotióis (NP-SNO) foi imediata após a mistura da

suspensão das NP-SH com a solução de nitrito de sódio, aonde a solução apresentou uma

cor rosa intensa (que pode ser também laranja) [72]. Na solução de nitrito de sódio estão
+ − −
presentes H e NO2 . Nesta solução acidicada o nitrito (NO2 ) está em equilíbrio químico

com o ácido nitroso, tal que:


NO2 (aq) + H+ (aq)  HNO2 (aq) (2.2)

O ácido nitroso agirá como agente nitrosador dos tióis, levando a formação das nanopar-

tículas nitrosadas (NP-SNO) (Figura 2.2).

2.5.2.3 Solução redutora utilizada para medidas de detecção de NO


A solução redutora é uma solução aquosa preparada com 5ml de ácido ascórbico (160mM)

ajustando seu pH (∼11), com NaOH (5M). O ácido ascórbico (pH∼11) é utilizado para fazer

tanto a calibração como a medida da liberação de NO, conforme será descrito na Seção 3.10.

O ácido ascórbico (agente redutor) em meio básico favorece a conversão do nitrosotiol

em óxido nítrico, conforme será descrito na Seção 3.9, que é detectado pelo Analisador

de NO. Este redutor é fraco para reduzir somente os nitrosotióis, e não nitrito ou nitrato

possívelmente presentes [73].


2.5. Nitrosação das NPs 27

Figura 2.2: Esquema da nitrosação das NPs funcionalizadas com MSA ou DMSA (NP-SH)
em solução aquosa acidicada, formando-se assim as NPs nitrosadas (NP-SNO).
Capítulo 3
Técnicas Experimentais

3.1 Espectroscopia Infravermelho - FTIR


Os átomos das moléculas oscilam constantemente ao redor de suas posições de equili-
−10 −9
brio. As amplitudes destas oscilações são extremamente pequenas (10 a 10 cm) e suas
13 14
frequências são altas (10 a 10 Hz). Algumas destas frequências são da mesma ordem
−5 −1
de grandeza da frequência de radiação infravermelho (comprimento de onda ∼ 10 a 10

cm), conforme apresentado na Tabela 3.1 [74].

Tabela 3.1: Valores do comprimento de onda (λ), número de onda (ν ) e frequência (ν ) na


região IR. Extraído da referência [74].

Região −1
λ (cm) ν (cm ) ν (Hz)
Infravermelho
Próximo 7,8 × 10−5 - 2,5 × 10−4 4000 - 12800 1,2× 1014 - 3,8 × 1014
−4 −3 12 14
Médio 2,5 × 10 - 5 × 10 200 - 4000 6 × 10 - 1,2 × 10
−3 −1 11 12
Longe 5 × 10 - 1 × 10 10 - 200 3 × 10 - 6 × 10

Sabemos que a radiação eletromagnética pode ser caracterizada por seu comprimento de

onda (λ), sua frequência (ν ), e seu número de onda (ν ), onde:

ν
ν= (3.1)
c/n

29
30 Técnicas Experimentais
8
sendo c a velocidade da luz no vácuo (2,997925 × 10 m/s), e (c/n) a velocidade da luz

no meio cujo índice de refração é n, no qual o comprimento de onda é medido. O índice

de refração do ar é 1,0003. A frequência é independente do meio e sua unidade é Hertz


−1
(Hz) e a unidade do número de onda (ν ) é cm . No jargão técnico da espectroscopia de

infra-vermelho (IV), o número de onda também pode ser chamado de frequência.

Uma amostra irradiada com radiação infravermelho, com número de onda (ν ) variando
−1
entre 400 a 4000 cm , absorverá e transmitirá a radiação diferentemente para cada ν. Como

resultado podemos gracar a porcentagem da radiação transmitida em função do número

de onda ν, tal que bandas de absorção presentes neste gráco são associadas a movimentos

caracteríticos intramoleculares [75].

Na Tabela 3.2 apresentamos os valores do número de onda ν reportados na literatura

relativos às principais bandas de absorção esperadas neste trabalho, devido à adsorção de

AO, MSA e DMSA na superfície das NPs de óxido de ferro.

Tabela 3.2: Modos vibracionais IV usados para análise de espectros das NPs de magnetita.

Ligação Modo ν
Referência
Vibracional cm−1 )
(
estiramento 566-632 [18, 76, 77, 78]
Fe-O-Fe
deformação 400-440 [77, 78]
deformação 920-1640 [20, 79]
O-H
estiramento 3400-3500 [20, 49]
C-O estiramento 1000-1300 [20]

COO
estiramento 1520-1600 [20, 80, 81]
(simétrico-assimétrico)
S-H estiramento 2548-2570 [74, 79, 82, 83]
3.2. Parte Experimental - FTIR 31

3.2 Parte Experimental - FTIR


As medidas FTIR foram realizadas em um Espectrômetro Shimadzu Prestige-21 (Shi-
−1
madzu Corporation, Kyoto, Japan) com uma resolução de 2cm ; as medidas foram re-

alizadas na Central de Análises da UNIFESP-Diadema. As medidas foram realizadas em


−1
pastilhas de KBr que apresentam transparência ao infravermelho na região de 400-4000cm .

Neste contexto, nanopartículas em pó foram trituradas com KBr (espectroscópico, de alta

pureza). Para se formar as pastilhas, a mistura foi colocada em uma prensa hidráulica, ao

mesmo tempo que o ar foi extraído com uma bomba mecânica.

Antes de se realizar cada medida de FTIR das NPs, realizamos uma medida de back-

ground (do ar), que foi descontada automáticamente pelo software do equipamento, obtendo-

se assim o espectro de FTIR para cada uma das amostras analisadas.


32 Técnicas Experimentais

3.3 Difração de Raios X - DRX


A Difração de Raios X (X-Ray Diraction ou XRD) desempenha um papel importante

dentre as técnicas de determinação das propriedades estruturais de muitos materiais orgâ-

nicos e inorgânicos. Os difratogramas experimentais permitem a identicação de compostos

cristalinos, bem como a determinação dos parâmetros de rede, tamanho de grão cristalino,

orientação preferencial e grau de cristalinidade dos materiais.

O fenômeno de difração ocorre quando uma onda eletromagnética incide num conjunto

de objetos espalhadores regularmente espaçados (apresentado na Figura 3.1) e quando o

comprimento de onda da radiação é da mesma ordem de magnitude das distâncias entre

os centros espalhadores [43], ou seja, da ordem de Angstrom para átomos e raios X. As

primeiras considerações sobre o fenômeno de difração de raios X em cristais foram feitas pelo

físico alemão Max von Laue em 1912. Num cristal, os centros espalhadores são formados

por átomos contidos em planos virtuais, os quais são denominados planos cristalográcos e

indexados através dos índices de Miller (hkl ), separados uma distância (dhkl ). Por meio de

relações geométricas entre o feixe incidente e o feixe difratado pelos planos, W. L. Bragg

formulou a equação através da qual é possível obter o espaçamento entre os planos cristalinos

sabendo-se o ângulo de incidência e o comprimento de onda do feixe incidente, conhecida

como a lei de Bragg, e dada por [43]:

nλ = 2dhkl Senθhkl (3.2)

onde:

n: ordem da difração λ: comprimento de onda

(normalmente considera-se n=1). da radiação incidente.

dhkl : distância interplanar. θhkl : metade do ângulo de difração medido

Assim, num difratograma de R-X, conhecendo-se λ, para cada θhkl medido experimen-

talmente, determina-se o correspondente espaçamento interplanar dhkl .


3.4. Parte Experimental - DRX 33

Figura 3.1: Interação dos Raios-X com os planos cristalográcos (com uma distância d ) em
um cristal, com frentes de onda xx' e yy', com θ como ângulo de Bragg. Figura extraída da
referência [43].

3.4 Parte Experimental - DRX


A identicação estrutural das amostras foi realizada através de medidas de Difração

de Raios X (XRD - "X-Ray Diraction" ) no Laboratório de Cristalograa do Instituto de


Física da USP. O equipamento usado consiste de um difratômetro de pó da Rigaku-Denki

(Rint2000) com um gerador de raios X convencional. A janela de saída dos raios X dispõe

de um monocromador montado sobre um sitema de colimação para selecionar a radiação

característica CuKα (λ=1,5418Å).

As NPs em pó são compactadas sobre uma lâmina de vidro em uma área de ∼2cm2 . O

feixe de raios X difratado é registrado por um detetor de cintilação. A varredura angular

compreendeu o intervalo de 20
o a 70
o o
com passos de 0,05 a cada 5 segundos. Durante o

tempo da medida, o difratômetro foi mantido nas condições de 40kV e 30mA. O espalhamento

difuso do substrato de vidro foi subtraido como uma linha de base de cada difratograma.

Como vimos na Introdução (Seção 1.1) a estrutura da magnetita é cúbica de face centrada

(F 3dm), tal que o parâmetro de rede pode ser obtido a partir das reexões de Bragg (hkl)

[43]:
34 Técnicas Experimentais

a
dhkl = √ (3.3)
h2 + k 2 + l2
a
A partir das Equações 3.2 e 3.3, o parâmetro de rede ( ) numa cela cúbica é dado por:

λ √
a= h2 + k 2 + l2 (3.4)
2senθhkl
Supondo que um cristal tenha uma certa espessura na direção perpendicular a um con-

junto particular de planos de Bragg, os raios X incidentes chegam em cada um dos planos

formando ângulos iguais ao ângulo de Bragg θB , e alguns outros raios formam ângulos mai-

ores e menores ao ângulo de Bragg. Como resultado, o pico de difração apresenta uma certa

largura, que aumenta com a diminuição da espessura do cristal [43], como representado na

Figura 3.2.

O tamanho de grão cristalino (DRX ) pode ser obtido através da fórmula de Scherrer, tal

que [43]:

0, 89λ
DRX = (3.5)
βhkl Cosθhkl
onde βhkl é a largura a meia altura do pico de difração, desconvoluido do alargamento

instrumental b. Considerando que o pico de difração possa ser ajustado através de uma

função Lorentziana (Equação 3.8), a largura a meia altura é (Figura 3.2):

B2 = βhkl
2
+ b2 (3.6)

Na fórmula de Scherrer (Equação 3.5), temos:

0, 89λ
DRX = p (3.7)
B2 − b2 Cosθhkl
A função Lorentziana L(x) (Equação 3.8) [49] é dada por:

1 Γ/2
L(x) = (3.8)
π (x − x0 )2 + (Γ/2)2
onde:

Γ: largura a meia altura.


x0 : centro da função.
3.4. Parte Experimental - DRX 35

Figura 3.2: Efeito do tamanho de cristalito na curva de difração; a. Aumento da largura da


curva de difração devido à diminuição da espessura do cristal. b. Pico de difração ideal no
ângulo de Bragg que indica a distância entre os planos cristalinos. Extraído da referência
[43].

No nosso caso, a largura a meia altura é Γ = B ou b, dependendo se estamos considerando


o pico de difração do difratograma obtido das NPs ou o alargamento instrumental obtido a

partir de uma amostra de silício policristalino (fornecido no laboratório), respectivamente.

A identicação estrutural das NPs analisadas foi realizada comparando-se os difratogra-

mas experimentais obtidos com o padrão cristalográco disponível na cha cristalográca

JCPDF 19-0629 (Figura 1.4).


36 Técnicas Experimentais

3.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET


No estudo de sistemas nanoestruturados é necessário conhecer a distribuição de tama-

nhos da nanopartícula. Para tal nalidade, no presente trabalho foi utilizada a técnica de

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) para, além de analisarmos a morfologia das

NPs sintetizadas, podermos avaliar sua distribuição de tamanhos.

O Microscópio Eletrônico tem dois modos de operação: campo claro e campo escuro.

Destas duas modadlidades a primeira é a mais comumente usada. Na formação da imagem

em campo claro, o feixe direto não espalhado pela amostra atinge o plano da imagem, en-

quanto que as regiões escuras correspondem às regiões de maior espalhamento de elétrons

(menor número de eletróns chega ao plano imagem). Na outra modalidade (campo escuro),

a formação da imagem ocorre com o feixe direto sendo interceptado antes de atingir o plano

da imagem (regiões escuras da imagem) e os elétrons espalhados pela amostra são direciona-

dos para o sistema de formação da imagem nal (regiões claras da imagem). A modalidade

de campo escuro permite a observação dos planos cristalinos do material através de suas

reexões de Bragg, pois a imagem é formada apenas pelos elétrons espalhados pelo plano

cristalino desejado [49]. Esta modalidade não foi utilizada neste trabalho.

Conforme mencionado, a análise de uma micrograa eletrônica nos permite avaliar a dis-

tribuição de tamanhos das NPs formadas. Os correspondentes histogramas de distribuição

de tamanhos, podem ser ajustados por uma função Log-Normal (Equação 3.9) [84]:

1 1 1 log(d/d0 ) 2
f LN (d) = √ exp (− (
2 σ
)) (3.9)
σ 2π d

onde f LN indica a função de densidade da probabilidade (PDF do inglês Probability Distri-

bution Function) das nanopartículas ter um diâmetro d; d0 é a mediana (posição que separa

a população na metade 50% acima e 50% abaixo de um certo tamanho d) e σT EM é o desvio

padrão, conforme apresentados na Figura 3.3.


3.5. Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET 37

Existem três parâmetros importantes na análise de tamanhos através de uma função

Log-Normal (fLN ), indicados na Figura 3.3. São eles:

1. Valor típico: posição do máximo da densidade de probabilidade;

2
DT EM = d0 e(−σT EM ) (3.10)

2. Mediana (d0 ), indica uma posição de equilíbrio da população;

3. Valor médio: centro de gravidade da distribuição.

2
σT EM
< DT EM >= d0 e(− 2
)
(3.11)

Quando os três valores anteriormente mencionados são iguais, a distribuição é simétrica.

No caso da Figura 3.3 apresentamos uma distribuição Log-Normal assimétrica.

Figura 3.3: Distribuição Log-Normal da densidade de probabilidade de diâmetros repre-


sentada através de f LN (Equação 3.9), indicando os valores típico (DT EM ), mediano (d0 ) e
médio (<DT EM >).
38 Técnicas Experimentais

3.6 Parte Experimental - MET


A identicação da morfologia das NPs e distribuição de tamanhos foi realizada utilizando-

se um Microscópio Eletrônico Jeol 220 com um canhão termoiônico de LaB6 , com uma volta-

gem de trabalho de 150kV, no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Física

da Universidade de São Paulo. Este microscópio eletrônico dispõe de cinco lentes magnéti-

cas: uma objetiva, duas condensadoras e duas projetoras.

As NPs colocadas no MET foram primeiro diluidas em água e/ou tolueno. As NPs

recobertas com MSA e DMSA foram diluídas em água, devido ao comportamento hidrofí-

lico (NPMSA110, NPMSA140, NPMSA180, NPDMSA110, NPDMSA140 e NPDMSA180),

enquanto as NPs diluidas em tolueno, devido ao comportamento hidrofóbico, foram as amos-

tras NP e NPAO.

Após as NPs serem diluídas no respectivo solvente, uma gotícula de cada diluição foi

pipetada sobre grades de cobre de 3mm de diâmetro recobertas com uma camada na de

parlodion (C12 H16 N4 O18 ), as quais foram inseridas no MET.

De cada uma das micrograas obtidas, foram consideradas aproximadamente entre 200

e 400 nanopartículas de cada imagem cujos diâmetros foram avaliados pelo programa de

análise de imagens " ImageJ v.1.45s ". A partir dos resultados foi possível construir um his-

tograma de distribuição de tamanhos que apresenta o comportamento típico de uma função

Log-Normal (fLN ) apresentado na Equação 3.9 [84].

As micrograas foram realizadas em duplicata para cada uma das NPs mencionadas

neste trabalho.
3.7. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 39

3.7 Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM


Na técnica de magnetometria de amostra vibrante (VSM do inglês Vibrate Sample Mag-
netometry ), um material magnético é colocado em um campo magnético uniforme (no nosso
caso, entre os pólos de um eletroimã), inicialmente com campo magnético nulo (H=0) e

o material desmagnetizado, com o qual a magnetização é nula (σ =0). Com o aumento do

campo magnético, os momentos magnéticos se alinhan produzindo um incremento no mo-

mento magnético µ, e do mesmo modo na magnetização até atingir um valor constante,

chamada magnetização especíca de saturação (σs ). Nesta condição, pode se armar que to-

dos (ou a grande maioria) dos momentos magnéticos do material estão alinhados na mesma

direção com o campo H. No caso de materiais ferri ou ferromagnéticos, quando o campo

magnético é reduzido até zero, a partir da saturação, a magnetização não se reduz a zero

(Figura 3.4 a). Ao invés disto, o material permanece magnetizado, o qual é caracterizado

por uma magnetização remanente σr . Invertendo a direção do campo magnético, a magneti-

zação começa a se reduzir até atingir um valor de H onde a magnetização é nula ( i.e., total
desordem dos momentos magnéticos). Este valor do campo é chamado de campo magnético

coercivo ( HC ). O módulo do campo continua aumentando em direção oposta até que a

magnetização atinge um valor valor mínimo -σs , e este ciclo vai se repetir. Esta curva (σ ×
H) é chamada de curva de histerese. Como comentado na Introdução (Seção 1.2), no caso de

nanopartículas superparamagnéticas, espera-se que σr =0 e HC =0 (Figura 3.4 b). Maiores

detalhes podem ser encontrados nas referências [45, 46, 47].

Como visto na Introdução, no caso de um conjunto de nanopartículas que apresentam

uma certa polidispersão, a partir da Equação 1.17 temos que o momento magnético total

das NPMs depende do seu tamanho e de sua magnetização de saturação, tal que [85]:

∞ µ0 Ms π d3mag H
Z
µ = NT Ms V L( )fLN (dmag )d(dmag ) (3.12)
0 6kB T
A função f LN (Equação 3.9) é a função de distribuição de probabilidade de tamanhos das
nanopartículas magnéticas representada por um diâmetro magnético característico (dmag ).
40 Técnicas Experimentais

onde:

NT : número de nanopartículas magnéticas num volume V.

µ0 : permeabilidade magnética do vácuo (4 π × 10−7 Tm/A).

T : temperatura do sistema (K).


d: diâmetro das nanopartículas magnéticas (nm).

dmag : valor mediano do diâmetro das nanopartículas magnéticas (nm).

H: módulo do campo magnético aplicado no VSM (kOe).

A partir da Equação 3.12 ajustamos os momentos magnéticos das NPs obtidas experi-

mentalmente, resultando na distribuição de tamanhos das mesmas (Seção 4.4).

Figura 3.4: a. Curva de histerese de um paramagneto, indicando sua magnetização especíca


de saturação (σs ), e campo coercivo (HC ), assim como sua magnetização especíca remanente
(σr ), b. Curva de histerese para um material superparamagnético (HC = 0 e σr = 0) [47].
3.8. Parte Experimental - VSM 41

3.8 Parte Experimental - VSM


A caracterização das propriedades magnéticas das NPs foram realizadas no Magnetô-

metro de Amostra Vibrante (VSM - Vibrating Sample Magnetometer) Modelo EGG550 no

Laboratório de Novos Materiais e Semicondutores do Instituto de Física da Universidade de

São Paulo (IF-USP).

A magnetização especíca σe (em emu/g) é obtida dividindo-se o momento magnético

pela massa da amostra (Equação 1.4). O equipamento experimental foi calibrado com um

material de momento magnético de saturação (µs ) conhecido, neste caso com Óxido de Ni-

quel (µs =1,332emu), fornecido no laboratório.

Numa primeira etapa, as NPMs (∼10-20mg) foram colocadas em frascos de acrílico,

que apresentam um comportamento diamagnético, e não interferem na medida do momento

magnético das NPs. Numa segunda etapa foram utilizados canudos de plástico, devido a

uma melhora no sinal detectado. Cada medida experimental de VSM foi realizada ∼ 30

min, no qual a varredura do campo magnético foi de -20kOe a 20kOe.

Após a calibraçaõ do equipamento de VSM, colocamos as NPs no interior do campo

magnético fornecido pelo eletroimã (-20kOe-20kOe); o aparelho registra a mudança dos va-

lores do momento magnético com respeito ao campo magnético. A partir destes valores

calculamos o momento magnético total, que são apresentados na Seção 4.4. Os resultados

obtidos por VSM foram realizados em duplicata.


42 Técnicas Experimentais

3.9 Liberação de NO
A liberação de NO em fase gasosa é quanticada através de uma reação de quimiolu-

minescência [55, 56]. O reagente mais usado em quimioluminescência em fase gasosa é o

ozônio, de tal maneira que:

NO + O3 −→ NO∗2 + O2 (3.13)


NO2 −→ NO2 + hν (3.14)

A última reação exotérmica libera 200kJ/mol, correspondente aos fótons emitidos num

intervalo de comprimentos de onda ente 600 e 3000nm. Para comprimentos de onda menores

a 800nm, os fótons liberados são detetados com alta eciência quântica, o que signica que

só uma fração pequena é emitida e detectada ecientemente [86].

3.9.1 Medida de Quimioluminescência

A Figura 3.5 apresenta um esquema representativo do experimento realizado para detec-

tar a liberação de óxido nítrico de moléculas ou nanopartículas contendo grupos nitrosotióis

(representados aqui por R-SNO). Injeta-se uma solução com R-SNO dentro de uma célula

(balão) contendo ácido ascórbico (solução redutora); como consequência, libera-se óxido ní-

trico (NO) em atmosfera inerte devido à presença do N2 na célula. A pressão da célula é de 5

a 6 Torr, mesma pressão do cilindro de N2 . O N2 é também responsável pelo arrastre do NO

liberado dentro do equipamento. Este evita a possível oxidação dos compostos gerados na

célula. Durante a medida de liberação de NO, o equipamento encontra-se numa sala escura.
3.9. Liberação de NO 43

Figura 3.5: Esquema da liberação de NO no Analisador do Óxido Nítrico. a. Seringa


utilizada para injetar soluções contendo nitrosotióis (R-SNO), b. Balão de vidro (célula
do Analisador de NO) contendo ácido ascórbico (solução redutora dos R-SNO) na mesma
pressão do N2 , c. Cilindro de N2 a pressão de 5 - 6 Torr, d. Mangueira através da qual o
NO liberado na célula vai para o Analisador de NO, e. Cilindro contendo O2 a pressão ∼
421 Torr, f. Analisador de NO.

No interior do equipamento, o O2 fornecido pelo cilindro é mantido numa pressão de 6,1

psig (420,60 mbar). A partir do oxigênio inserido no equipamento é gerado o ozônio (O3 ),

que reage com o óxido nítrico formando-se como produto óxido nitroso excitado (NO2 ) e

oxigênio molecular (O2 ), apresentado na Equação 3.13. O óxido nitroso excitado produz a

liberação de energia proveniente do decaimento do elétron para um estado de menor energia

formando-se NO2 (Equação 3.14). Este processo descrito corresponde ao mecanismo de

quimioluminescência. O fóton liberado é detectado no interior do Analisador de NO, como

representa o esquema na Figura 3.6.


44 Técnicas Experimentais

Figura 3.6: Mecanismo de quimioluminescência no interior do Analisador do NO. A liberação



de energia proveniente do decaimento do NO2 para NO2 correspondente a um estado de
menor energia produz um fóton com energia hν , detectado pelo equipamento.

A quantidade de corrente redox é típicamente gerada pela oxidação do NO (liberado

pelos R-SNO) em NO2 (obtido depois da emissão do fóton). Em sistemas biológicos é ex-

tremamente pequena (da ordem de 1 - 10 pA). Então, o desenvolvimento de eletrodos para

detecção amperimétrica de NO requer uma alta sensibilidade eletrônica e um circuito de

ultra amplicação de baixo ruido [50].

O sinal devido à liberação do fóton é convertido no Analisador num sinal de voltagem

(mV). A quantidade de fótons chegando no detector é proporcional ao número de moles de

NO que se oxidam no mecanismo de quimioluminescência. Pode-se dizer então que a partir

de um volume inserido dos R-SNO, obtém-se uma certa quantidade de fótons (associada ao

número de moles liberado de NO). Consequentemente, o sinal de voltagem (mV), registrado

no Analisador de NO, é diretamente proporcional à concentração de NO liberado pelos R-

SNO.

Como resultado deste processo, o Analisador do NO fornece a mudança do sinal de vol-

tagem (mV) em relação ao intervalo de tempo (min) medido. Este potenciograma (V-t)

permite interpretar a medida de liberação de NO, em função do tempo, a partir de um

volume dos R-SNO inserido na célula do equipamento (Figura 3.7).

Quanto mais vertical o pico (subida ou descida), signica uma detecção mais rápida no

tempo; o processo de detecção é mais lento quando o pico apresenta uma certa largura, como

apresentado na Figura 3.7.


3.9. Liberação de NO 45

Figura 3.7: Esquema do potenciograma (V-t) obtido do Analisador de NO. Cada pico no
potenciograma está relacionado com a concentração do óxido nítrico ([NO]) liberado a partir
dos volumes (VR−SN O ) dos R-SNO injetados na célula do equipamento (Figura 3.5).

A área dos picos representa a concentração de óxido nítrico detectado. Para calcular esta

área, delimitamos manualmente o início, m e base dos picos. Feito isso, o programa Liquid
(software do equipamento) faz a integração e converte o resultado em concentração (Figura

3.8). Como sabemos o volume de R-SNO injetado e sua concentração, podemos obter como

resultado a concentração molar de NO liberado ou o número de moles.

Figura 3.8: Delimitação manual da linha de início, linha nal e linha de base para cada pico
Liquid ) do equipamento.
através do software ( A área encerrada pelo potenciograma, e entre
as linhas de delimitação para a integração. O software faz a integração e converte a área
integrada em concentração (em µM).
46 Técnicas Experimentais

3.10 Parte Experimental - Liberação de NO


Na primeira etapa deste trabalho, a calibração do equipamento assim como a medida de

liberação de NO foram realizadas no Laboratório de Fisicoquímica do Instituto de Química

da Universidade de Campinas (IQ-UNICAMP). O equipamento utilizado foi um analisador

de quimioluminescencia de NO (NOA 280i, GE Analytical, Boulder, CO, USA).

Na segunda parte deste trabalho, a calibração assim como a medida de liberação de NO

foram realizadas no Laboratório de Fotoquímica-Inorgânica no Departamento de Química da

Faculdade de Filosoa, Ciências e Letras de Riberão Preto - USP. O equipamento utilizado foi

um analisador de quimioluminescência de NO (Sievers 280i Nitric Oxide Analyser - General

Electric, USA).

Para ambos analisadores de NO, o limite inferior de detecção é de 1nM.

3.10.1 Calibração do Analisador de NO

Para realizar a curva de calibração do Analisador de NO foi utilizada uma solução pa-

drão (solução estoque) contendo R-SNO. A partir da curva de calibração, pode-se medir a

liberação de NO de alguma outra solução contendo R-SNO.

3.10.1.1 Primeira Etapa


Na primeira etapa, as curvas de calibração foram obtidas com soluções aquosas de S-

glutatotiona (solução estoque), que foram preparadas no momento da realização da medida

e imediatamente inseridas no Analisador de NO [38].

3.10.1.2 Segunda Etapa


Utilizamos uma solução equimolar de MSA e NaNO2 . Com esta nalidade, foram dissol-

vidos 0,015g de MSA (n=0,0001mol) em 1mL de água milli-Q, resultando em uma concen-

tração de 0,1M; adicionamos, então, 0,0069g de NaNO2 (n=0,0001mol). A solução obtida

apresentou uma cor rosa intenso, o qual indicou a presença dos S-nitrosotióis (R-SNO) [72].

A solução foi então diluída a 100µM (solução estoque).

A partir da solução estoque foram injetados no equipamento volumes crescentes (1µl, 3µl,

5µl e 7µl) com a nalidade de calibrar o equipamento. O analisador forneceu as concentrações

de NO liberado ([NO]) para cada injeção, conforme apresentado na Tabela 3.3.


3.10. Parte Experimental - Liberação de NO 47

Tabela 3.3: Volume injetado da solução estoque e o número de moles correspondentes, assim
como a concentração do NO liberado ([NO]) fornecida pelo equipamento.

Volume injetado da Número de moles


[NO]
solução estoque de 100µM correspondentes
(µl) (mol) (µM)
−10
1 1 ×
10 457,9
−10
3 3 ×
10 1288,9
−10
5 5 ×
10 1734,4
−10
7 7 ×
10 3305,0

Com os dados da Tabela 3.3, construimos uma curva de calibração do equipamento

(Figura 3.9). A partir desta curva, determinou-se um fator de correção experimental para a

concentração nominal da solução estoque e a indicada pelo aparelho devido à quanticação

de liberação de NO (área do pico no potenciograma, Figura 3.8). No caso de MSA, para uma

solução estoque de 100µM de R-SNO, o Analisador de NO resultou numa concentração de

106,24µM. Portanto, aplicamos um fator de correção de 0,94 para as concentrações fornecidas

pelo aparelho das concentrações molares de NPs nitrosadas. No caso de NPs funcionalizadas

com DMSA, o fator de correção foi de 0,88.

Figura 3.9: Curva de calibração do Analisador de NO, que relaciona a concentração molar
de NO ([NO]) liberado em relação ao número de moles (n) de R-SNO contidos nos volumes
injetados da solução estoque.
48 Técnicas Experimentais

3.10.2 Medida de liberação de NO

Após a calibração do equipamento com determinação do fator de correção para as soluções

estoques utilizadas contendo MSA, procedemos com as medidas de liberação de NO das NPs

funcionalizadas com MSA e DMSA, respectivamente. Para isto, injetamos as NPs nitrosadas

(NP-SNO) no analisador de NO (Figura 3.5) e como resultado obtivemos picos de emissão

de luminescência (Figura 3.7) em função da concentração das NPs injetadas. Conforme

explicado no item anterior, a integral destes picos fornece a concentração molar de NO

liberado de cada solução contendo NPs nitrosadas.

Como procedimento, realizamos dois tipos de experimentos a seguir.

3.10.2.1 Primeira Etapa


Cinética da liberação de NO a partir da NP funcionalizada com MSA (razão
molar 1:40)
O perl de liberação de NO das NP-SNO foi obtido em tempo real através da quimi-

oluminescência. As NP-SNO foram obtidas a partir da adição de 2,2mg da NPMSA140

em 200µl de água deionizada. Após homogenização desta solução, alíquotas de 10µl desta

supensão foram adicionadas a 3ml de água deionizada contendo 10µl de HCl (0,6M). Um

volume de 30µl da solução aquosa de NaNO2 (50mM) foi adicionado à suspensão das NP-

SNO. A suspensão nal foi homogenizada e protegida da luz com folha alumínio e mantida a
o
temperatura ambiente (25 C) para as medidas de cinética. A estabilidade dos grupos S-NO
o
presentes na superfície das NPs foi cinéticamente monitorada a 25 C, no escuro, injetando

5µl da solução das NP-SNO na célula do analisador de NO, para diferentes intervalos de

tempo, num total de 6,7h. Antes de cada injeção das NP-SNO, estas foram fortemente

homogenizadas num vórtex. A cinética de liberação de NO foi realizada em duplicata [38].

3.10.2.2 Segunda Etapa


Liberação de NO a partir das NPs funcionalizadas com MSA e DMSA
Injetamos volumes xos de 5µl das soluções das NP-SNO na célula do Analisador. O

tempo de medida foi de 1 a 2 min de aquisição. O software do equipamento forneceu

a concentração de NO liberado ([NO]) assim como as concentrações experimentais destas

soluções, que foram corrigidas conforme explicado no item anterior.


Capítulo 4
Resultados e Discussões

4.1 Espectroscopia Infravermelho - FTIR


A Figura 4.1 apresenta os espectros de FTIR das NPs obtidas do processo de síntese

(NP) e recobertas com ácido oleico (NPAO). Conforme Tabela 3.2, as bandas de estira-

mento (νF e−O ) e deformação (δF e−O ) da ligação Fe-O correspondentes à magnetita ocorrem
−1 −1
na região entre 400cm e 650cm [78]. Através de uma ampliação desta região (Figura
−1 −1
4.2), podemos identicar duas bandas em 440cm e 575cm correspondentes a δF e−O e

νF e−O , que são associadas aos sítios octaédrico e tetraédrico da estrutura espinélio, respec-

tivamente [78]. No espectro FTIR da NP, observamos também a presença de bandas em


−1 −1
1622cm e 3424cm (Figura 4.1) correspondentes à deformação δOH e estiramento νOH ,
−1 −1 −1
respectivamente [49, 79]. Observa-se também ombros em 1392cm , 2332cm e 2362cm ,

que podem estar associados a alguma impureza.

49
50

Figura 4.1: Espectro FTIR das NPs após serem obtidas (NP) e modicadas na superfície com ácido oleico (NPAO).
Resultados e Discussões
4.1. Espectroscopia Infravermelho - FTIR 51

−1 −1
Figura 4.2: Ampliação da região entre 400cm e 700cm do espectro FTIR das NPs
obtidas (NP) e recobertas com ácido oleico (NPAO), aonde são observadas as bandas de
−1 −1
deformação (δF e−O ∼ 440cm ) e estiramento (νF e−O ∼ 575cm ) correspondentes ao sítio
octaédrico (Sítio B) e tetraédrico (Sítio A), respectivamente [76].

Para NPs modicadas supercialmente com AO, aparecem duas pequenas bandas de ab-
−1 −1
sorção em 1096cm e 1285cm (Figura 4.1) associadas às bandas de estiramento da ligação
−1 −1
C-O (νC−O ) [20]; apresentam-se também bandas de absorção em 1541cm e 1641cm cor-

respondentes aos estiramentos assimétrico νas (COO− ) e simétrico νs (COO− ) , respectivamente


−1 −1
[20]. As bandas em 2844cm e 2914cm correspondem aos estiramentos simétrico
(CH2 ) νs
−1
e assimétrico νas (CH2 ) da cadeia do surfactante. Observa-se também os ombros em 2362cm
−1
e 2332cm , embora mais atenuados. A banda de estiramento νOH também é atenuada em

relação ao observado para o espectro FTIR da NP.


52 Resultados e Discussões

Portanto, a partir das bandas dos espectros de FTIR das NPs sintetizadas (NP) e re-

cobertas com ácido oleico (NPAO), podemos inferir uma interação de quelação bidentada

entre o grupo COO do ácido oleico e o átomo de Fe [20], apresentado na Figura 4.3, de

acordo com a literatura [20]. Sendo assim, as NPs recobertas com AO devem apresentar

certa estabilidade em solventes apolares devido à repulsão estérica entre as caudas hidrofó-

bicas presentes na sua superfície (Figura 4.4).


Figura 4.3: Interação quelante bidentada entre o grupo COO do ácido oleico e o átomo
de ferro. Figura extraída de [20].

Figura 4.4: Esquema representativo do recobrimento das NPs com ácido oleico.

Nas Figuras 4.5 e 4.6 são apresentados os espectros de FTIR normalizados das moléculas

de MSA e DMSA, respectivamente.


4.1. Espectroscopia Infravermelho - FTIR 53

Figura 4.5: Espectro FTIR do ácido mercaptosuccínico (MSA).

Figura 4.6: Espectro FTIR do ácido dimercaptosuccínico (DMSA).


54 Resultados e Discussões

A partir das Figuras 4.5 e 4.6, e da Tabela 3.2, observamos bandas de absorção en torno de
−1 −1
927cm e 933cm δ(OH) fora do plano [20], em torno de 1693cm−1 e
associadas à deformação
−1 −
1697cm referentes ao estiramento simétrico da ligação COO (νs (COO − ) ) [20, 80, 81], e em
−1 −1
torno de 2530cm e 2563cm referentes ao estiramento da ligação S-H (νSH ) [74, 79, 82, 83]

presentes tanto na molécula de MSA como na de DMSA. Esta região está ampliada na Figura

4.7.

−1−1
Figura 4.7: Ampliação da região entre 2300cme 2700cm do espectro de FTIR normali-
−1
zado para as moléculas de MSA e de DMSA. As bandas de absorção em torno de 2530cm
−1
e 2563cm (setas na gura) correspondem ao estiramento νSH .

Da Figura 4.7, observamos uma diminuição na intensidade das bandas de estiramento

(νSH ) para o DMSA em relação ao MSA, provavelmente devido à dimerização dos grupos

tióis [38].

As Figuras 4.8 e 4.9 apresentam os espectros de FTIR das NPs funcionalizadas com MSA

e DMSA em diferentes razões molares (1:10, 1:40 e 1:80).


4.1. Espectroscopia Infravermelho - FTIR

Figura 4.8: Espectro de FTIR das NPs funcionalizadas com MSA em razões de 1:10 (NPMSA110), 1:40 (NPMSA140)
e 1:80 (NPMSA180).
55
56

Figura 4.9: Espectro de FTIR das NPs funcionalizadas com DMSA em razões de 1:10 (NPDMSA110), 1:40
(NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180).
Resultados e Discussões
4.1. Espectroscopia Infravermelho - FTIR 57

De maneira análoga, as duas bandas características das ligações (δF e−O e νF e−O ) da es-
−1 −1
trutura espinélio do óxido de ferro aparecem na região entre 400cm e 600cm (Figuras 4.8
−1 −1
e 4.9), enquanto as bandas em torno de 1050cm e 1285cm são associadas ao estiramento

da ligação C-O (νC−O ), e a ligação do Ferro com o grupo carboxila das moléculas de MSA

e DMSA (Figura 4.3).


−1
A banda em torno de 3430cm é associada ao estiramento da ligação OH (νOH ), en-
−1 −1
quanto as bandas em torno de 1400cm e 1610cm correspondem aos estiramentos simé-

trico (νas (COO − ) ) e assimétrico (νs (COO − ) ) dos grupos carboxila. Em particular, bandas de
−1 −1
absorção associadas ao grupo tiol (SH) estão presentes em torno de 2860cm e 2920cm

[18, 38] (Figuras 4.8 e 4.9), muito mais pronunciadas para as NPs funcionalizadas com

DMSA. Ampliações desta região para as NPs recobertas com MSA e DMSA são apresenta-

das nas Figuras 4.10 e 4.11, respectivamente. Para ambas NPs, a ausência de bandas extras
−1 −1
entre 400cm e 500cm indica que não houve dimerização dos grupos tióis (S-S) durante

a funcionalização das superfícies das NPs [38].

−1 −1
Figura 4.10: Ampliação da região entre 950cm e 3000cm do espectro FTIR das NPs
funcionalizadas com MSA. Observa-se a troca de ligantes da nanopartícula através da banda
−1
em 1050cm referente ao estiramento νC−O , que indica a ligação da molécula de MSA com
−1 −1
a NP, e as bandas entre 2853cm e 2923cm referente ao estiramento ν−SH .
58 Resultados e Discussões

−1 −1
Figura 4.11: Ampliação da região entre 950cm e 3000cm do espectro FTIR das NPs
funcionalizadas com DMSA. Observa-se a troca de ligantes da nanopartícula através da
−1
banda em 1050cm referente ao estiramento νC−O , que indica a ligação da molécula de
−1 −1
DMSA com a NP, e as bandas entre 2856cm e 2920cm referente ao estiramento ν−SH .

Assim, através da análise de FTIR concluimos que a troca de ligante na superfície das

NPs foi eciente. A Figura 4.12 propõe um esquema representativo de funcionalização da

superfície das NPs com os grupos tióis.

Figura 4.12: Recobrimento das NPs com MSA e DMSA, tendo como resultado nal NPs
funcionalizadas com grupos tióis na superfície.
4.2. Difração de Raios X - DRX 59

4.2 Difração de Raios X - DRX


A Figura 4.13 apresenta os difratogramas das nanopartículas obtidas após a síntese por

coprecipitação (NP), e recobertas com ácido oleico (NPAO), assim como as Figuras 4.14

e 4.15 apresentam os difratogramas das nanopartículas obtidas após a troca de ligantes

com MSA em razões de concentração de 1:10 (NPMSA110), de 1:40 (NPMSA140) e 1:80

(NPMSA180); e com ácido dimercaptosuccínico (DMSA) em razões de concentração de 1:10

(NPDMSA110), de 1:40 (NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180), respectivamente. O padrão

da estrutura espinélio da magnetita (cha JCPD 19-0629) também é apresentado em cada


um dos difratogramas para efeito comparativo. Assim, através das Figuras 4.13, 4.14 e 4.15,

podemos inferir que as nanopartículas sintetizadas (NP) correspondem, de fato, à magnetita,

e que a modicação realizada na superfície das mesmas por adsorção de AO e posterior troca

por MSA e DMSA não alterou a estrutura cristalográca das NPs. A partir dos ajustes da

função Lorentziana (Equação 3.8) para cada pico de difração, temos os ângulos de Bragg

para os planos cristalinos ( hkl ). A Tabela 4.1 apresenta os ângulos de Bragg para cada

plano cristalino identicado para as amostras NP e NPAO, enquanto as Tabelas 4.2 e 4.3

apresentam os ângulos de Bragg obtidos da difração das nanopartículas funcionalizadas com

MSA e DMSA, respectivamente. As Tabelas 4.1, 4.2 e 4.3 também incluem os ângulos de

Bragg esperados conforme o padrão da magnetita (cha JCPD 19-0629).


60 Resultados e Discussões

Figura 4.13: Curvas de difração de raios X das NPs após serem obtidas (NP) e após reco-
brimento com ácido oleico (NPAO). Os traços em preto, indicados na Figura, representam
as posições angulares e as intensidades de difração esperadas correspondentes aos planos
JCPD 19-0629 - Figura 1.2).
cristalinos (hkl ) da estrutura espinélio da magnetita (

Figura 4.14: Curvas de difração de raios X das NPs, após serem funcionalizadas com
ácido mercaptosuccínico (MSA) em razão de 1:10 (NPMSA110), de 1:40 (NPMSA140) e
1:80 (NPMSA180). Os traços em preto, indicados na Figura, representam as posições angu-
lares e as intensidades de difração esperadas correspondentes aos planos cristalinos (hkl ) da
estrutura espinélio da magnetita ( JCPD 19-0629 - Figura 1.2).
4.2. Difração de Raios X - DRX 61

Figura 4.15: Curvas de difração de raios X das NPs, após serem funcionalizadas com ácido
dimercaptosuccínico (DMSA) em razão de 1:10 (NPDMSA110), de 1:40 (NPDMSA140) e
1:80 (NPDMSA180). Os traços em preto, indicados na Figura, representam as posições
angulares e as intensidades de difração esperadas correspondentes aos planos cristalinos
JCPD 19-0629 - Figura 1.2).
(hkl ) da estrutura espinélio da magnetita (

Tabela 4.1: Ângulos de Bragg correspondentes aos picos de difração obtidos dos difratogra-
mas das nanopartículas após serem obtidas (NP) e recobertas com ácido oleico (NPAO) -
Figura 4.13.

Plano de 2θ (graus) 2θ (graus)


Reexão cha catalográca experimental
hkl JCPD 19-0629 NP NPAO
220 30,10 30,50(1) 30,28(1)
311 35,42 35,89(1) 35,67(1)
400 43,05 43,54(1) 43,33(1)
422 53,39 53,97(1) 53,76(1)
511 56,94 57,52(1) 57,30(1)
440 62,52 63,14(1) 62,91(1)
62 Resultados e Discussões

Tabela 4.2: Ângulos de Bragg para cada pico de difração obtidos dos difratogramas das
nanopartículas funcionalizadas com MSA em diferentes razões de concentração.

Planos de 2θ (graus) 2θ (graus)


Reexão cha catalográca experimental
hkl JCPD 19-0629 NPMSA110 NPMSA140 NPMSA180
220 30,10 30,34(1) 30,42(2) 30,33(1)
311 35,42 35,76(1) 35,82(1) 35,73(1)
400 43,05 43,43(1) 43,47(1) 43,41(1)
422 53,39 53,89(1) 53,92(3) 53,84(1)
511 56,94 57,41(1) 57,45(1) 57,40(1)
440 62,52 63,02(1) 63,03(1) 63,02(1)

Tabela 4.3: Ângulos de Bragg para cada pico de difração obtidos dos difratogramas das
nanopartículas funcionalizadas com DMSA em diferentes razões de concentração.

Planos de 2θ (graus) 2θ (graus)


Reexão cha catalográca experimental
hkl JCPD 19-0629 NPDMSA110 NPDMSA140 NPDMSA180
220 30,10 30,34(1) 30,39(1) 30,51(1)
311 35,42 35,74(1) 35,78(1) 35,90(1)
400 43,05 43,39(1) 43,43(1) 43,56(1)
422 53,39 53,84(1) 53,89(1) 53,98(1)
511 56,94 57,37(1) 57,43(1) 57,53(1)
440 62,52 62,98(1) 63,05(1) 63,14(1)

Conforme podemos observar, notamos um desvio sistemático nos valores de θhkl em

relação aos tabelados em torno de 0,3


o a 0,4
o provavelmente devido a um pequeno desali-

nhamento do sistema de medida, mas que não afeta de maneira signicativa a conclusão

dos resultados. Este desvio na medida também pode ser atribuído à espessura da amostra

colocada no difratômetro, pois a largura do pico muda com a espessura do cristal, como

mencionado na Seção 3.4.

A partir dos ângulos θhkl medidos experimentalmente, calculamos as distâncias dhkl cor-

respondentes através da lei de Bragg (Equação 3.2) e o parâmetro de rede (Equação 3.4).

Os valores para cada amostra encontram-se nas Tabelas 4.4, 4.5 e 4.6.
4.2. Difração de Raios X - DRX 63

Tabela 4.4: Distância interplanar dhkl (Equação 3.2) e parâmetro de rede a (Equação 3.4)
para as NPs após serem obtidas (NP) e após recobrimento com ácido oleico (NPAO).

Plano de NP NPAO
Reexão dhkl a dhkl a
hkl (nm) (nm) (nm) (nm)
220 0,2931(1) 0,8289(3) 0,2923(1) 0,8267(2)
311 0,2502(1) 0,8299(1) 0,2517(1) 0,8348(1)
400 0,2078(1) 0,8313(3) 0,2088(1) 0,8353(2)
422 0,1699(1) 0,8323(3) 0,1705(1) 0,8353(2)
511 0,1602(1) 0,8325(1) 0,1608(1) 0,8355(1)
440 0,1473(1) 0,8330(1) 0,1477(1) 0,8356(1)

Tabela 4.5: Distância interplanar dhkl (Equação 3.2) e parâmetro de rede a (Equação 3.4)
para as NPs após ser realizada a troca de ligantes com MSA em diferentes razões molares.

Plano de NPMSA110 NPMSA140 NPMSA180


Reexão dhkl a dhkl a dhkl a
hkl (nm) (nm) (nm) (nm) (nm) (nm)
220 0,2945(2) 0,8332(5) 0,2938(3) 0,8310(9) 0,2947(1) 0,8335(3)
311 0,2511(1) 0,8328(2) 0,2507(1) 0,8314(3) 0,2513(1) 0,8334(2)
400 0,2084(1) 0,8334(2) 0,2082(1) 0,8327(5) 0,2084(1) 0,8337(2)
422 0,1701(1) 0,8333(3) 0,1701(2) 0,8331(7) 0,1703(1) 0,8342(2)
511 0,1605(1) 0,8340(1) 0,1604(1) 0,8335(3) 0,1605(1) 0,8341(1)
440 0,1475(1) 0,8344(1) 0,1475(1) 0,8343(2) 0,1475(1) 0,8344(1)

Tabela 4.6: Distância interplanar dhkl (Equação 3.2) e parâmetro de rede a (Equação 3.4)
para as NPs após ser realizada a troca de ligantes com DMSA em diferentes razões molares.

Plano de NPDMSA110 NPDMSA140 NPDMSA180


Reexão dhkl a dhkl a dhkl a
hkl (nm) (nm) (nm) (nm) (nm) (nm)
220 0,2946(2) 0,8334(7) 0,2941(1) 0,8319(3) 0,2930(2) 0,8288(5)
311 0,2513(1) 0,8333(2) 0,2509(1) 0,8322(1) 0,2501(1) 0,8296(2)
400 0,2086(1) 0,8342(4) 0,2083(1) 0,8333(3) 0,2078(1) 0,8311(3)
422 0,1703(1) 0,8341(3) 0,1701(1) 0,8334(4) 0,1699(1) 0,8322(3)
511 0,1606(1) 0,8345(1) 0,1605(1) 0,8337(1) 0,1602(1) 0,8324(1)
440 0,1476(1) 0,8348(1) 0,1474(1) 0,8341(1) 0,1472(1) 0,8330(1)
64 Resultados e Discussões

A partir dos resultados das Tabelas 4.4, 4.5 e 4.6, calculamos a média do parâmetro de

a
rede ( ) obtida para cada amostra levando em conta todas as reexões (hkl ) medidas em

cada difratograma. A Tabela 4.7 apresenta os valores calculados.

Tabela 4.7: Média dos parâmetro de rede para as nanopartículas sem e com recobrimento.

NPs a (nm)
NP 0,831(2)
NPAO 0,834(7)
NPMSA110 0,834(1)
NPMSA140 0,833(2)
NPMSA180 0,834(1)
NPDMSA110 0,834(1)
NPDMSA140 0,833(1)
NPDMSA180 0,831(2)

Portanto, os resultados de a concordam com o valor teórico esperado de a =0,8396 nm

[41] com desvio porcentual de 0,7%.

A partir das Tabelas 4.4, 4.5 e 4.6, observa-se que as distâncias interplanares dhkl estão

próximas dos valores fornecidos pela cha catalográca JCPD 19-0629, dados para cada
plano de reexão: (220)−→ 0,2967nm; (311)−→ 0,2532nm; (400)−→ 0,2099nm; (422)−→

0,1715nm; (511)−→ 0,1616nm; (440)−→ 0,1485nm.

Para obtermos os valores de grão cristalino DRX das amostras, ajustamos uma função

Lorentziana (Equação 3.8) em cada um dos picos de difração, obtendo valores de largura

a meia altura. A Figura 4.16 a. mostra um exemplo de ajuste para a reexão (311) da

amostra NP, enquanto a Figura 4.16 b. apresenta o mesmo ajuste para a reexão (311) da

amostra NPMSA140. A partir destes valores e conhecendo-se a largura intrínseca b do feixe

de R-X, calculamos β e os respectivos tamanhos de grão através da Equação 3.5 para todas

as reexões medidas experimentalmente de cada amostra estudada. A Tabela 4.8 apresenta

os resultados de DRX para as amostras NP e NPAO, enquanto a Tabela 4.9 apresenta DRX

para as NPs recobertas com MSA e DMSA.


4.2. Difração de Raios X - DRX 65

Figura 4.16: Ajuste do pico de difração no plano de reexão (311) através de uma função
Lorentziana (Equação 3.8) para: a. NPs após serem sintetizadas (NP), b. NPs funcionali-
zadas com MSA na razão molar 1:40 (NPMSA140).
66 Resultados e Discussões

Tabela 4.8: Tamanho do grão cristalino das NPs antes (NP) e após recobrimento com ácido
oleico (NPAO), calculado a partir de cada pico de difração.

Plano de DRX (nm)


Reexão NP NPAO
220 11,9(4) 10,8(2)
311 10,7(2) 11,8(2)
400 9,7(7) 11,3(2)
422 11,4(1,6) 10,0(5)
511 10,2(3) 11,0(2)
440 10,2(3) 11,0(2)

Tabela 4.9: Tamanho do grão cristalino calculado a partir de cada pico de difração das NPs
após ser realizada a troca de ligantes com MSA e DMSA em diferentes razões molares.

DRX (nm)
ex

0
11

14

18
e

0
11

14

18

SA

SA

SA
R

SA

SA

SA
de

M
M

D
no

P
la

N
P

220 10,0(5) 9,5(1,0) 11,0(4) 10,6(7) 10,1(3) 9,6(5)


311 10,8(2) 10,5(4) 11,7(3) 11,4(3) 10,6(2) 11,4(3)
400 10,1(3) 9,1(8) 10,3(4) 10,3(5) 10,5(4) 9,8(3)
422 8,7(6) 7,0(1,2) 11,5(6) 9,6(6) 10,2(7) 11,7(1,0)
511 9,8(2) 9,2(6) 10,8(3) 10,1(3) 9,8(2) 9,7(3)
440 10,3(2) 10,5(3) 10,4(2) 10,2(2) 10,1(2) 10,5(2)

Conforme podemos observar das Tabelas 4.8 e 4.9, DRX varia de cerca de 9nm a 11nm,

para todas as amostras considerando os valores obtidos de todas as reexões cristalográcas.

Ressaltamos, entretanto, que as reexões em (422), (511), (440) são afetadas pelo fator de

Debye-Waller [44], o que não estamos levando em consideração na análise dos dados. Assim,

analisando o tamanho de grão DRX obtido da reexão (311), mais intensa e bem denida

em cada difratograma (Tabela 4.10), percebemos que o tamanho de grão cristalino pode ser

avaliado como (11,1 ± 0,7) nm dos dados de difração de R-X, sem nenhuma tendência a

aumento ou diminuição com recobrimento por AO ou troca de ligantes por MSA ou DMSA

em diferentes razões molares.


4.2. Difração de Raios X - DRX 67

Tabela 4.10: Tamanho de grão cristalino calculado para as reexões (311) de todas as
amostras.
NPs DRX 311 (nm)
NP 10,7(2)
NPAO 11,8(2)
NPMSA110 10,8(2)
NPMSA140 10,5(8)
NPMSA180 11,7(3)
NPDMSA110 11,4(3)
NPDMSA140 10,6(2)
NPDMSA180 11,4(3)
68 Resultados e Discussões

4.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET


As Figuras 4.17 e 4.18 apresentam as micrograas e histogramas das NPs sintetizadas

(NP) e recobertas com ácido oleico (NPAO), respectivamente. As Figuras 4.19, 4.20 e 4.21

apresentam as micrograas e histogramas de distribuição de tamanhos das NPs após serem

funcionalizadas com ácido mercaptosuccínico (MSA) em razões de concentrações de 1:10

(NPMSA110), 1:40 (NPMSA140) e 1:80 (NPMSA180) respectivamente; enquanto as Figu-

ras 4.22, 4.23 e 4.24 apresentam os resultados para as NPs após serem funcionalizadas com

ácido dimercaptosuccínico (DMSA) em razões de concentrações de 1:10 (NPDMSA110), 1:40

(NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180), respectivamente.

O ajuste dos histogramas (linha vermelha contínua, Figura 4.17 a Figura 4.24) para cada

distribuição de tamanhos das nanopartículas foi realizado através de uma função Log-Normal
(Equação 3.9), da qual extraímos o valor mediano (d0 ) da distribuição, e o desvio padrão

(σT EM ). A partir destes valores e, utilizando as Equações 3.10 e 3.11, são obtidos o valor

típico (DT EM ) correspondendo ao máximo da função de densidade de probabilidade, e o

valor médio (D<T EM >) dos diâmetros na distribuição de tamanhos, respectivamente. A

Tabela 4.11 apresenta os resultados obtidos.

Para ns comparativos em cada um dos histogramas apresentados nesta seção, indicamos

o tamanho de grão cristalino DRX obtido a partir da análise do pico de difração da reexão

do plano cristalográco (311) (Tabelas 4.8 e 4.9).


4.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET 69

Figura 4.17: Micrograa das nanopartículas sintetizadas (NP) e sua distribuição de tama-
nhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no
histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da
distribuição, respectivamente.

Figura 4.18: Micrograa das nanopartículas recobertas com ácido oleico (NPAO) e sua
distribuição de tamanhos. O tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha
vermelha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor
médio e desvio padrão da distribuição, respectivamente.
70 Resultados e Discussões

Figura 4.19: Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido mercap-
tosuccínico em razão 1:10 (NPMSA110) e sua distribuição de tamanhos. O tamanho de grão
cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e
σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição, respectiva-
mente.

Figura 4.20: Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido mercap-
tosuccínico em razão 1:40 (NPMSA140) e sua distribuição de tamanhos. O tamanho de grão
cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e
σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição, respectiva-
mente.
4.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET 71

Figura 4.21: Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido mercap-
tosuccínico em razão 1:80 (NPMSA180) e sua distribuição de tamanhos. O tamanho de grão
cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no histograma, d0 , <DT EM > e
σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição, respectiva-
mente.

Figura 4.22: Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido dimer-
captosuccínico (DMSA) em razão 1:10 (NPDMSA110) e sua distribuição de tamanhos. O
tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no histograma,
d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição,
respectivamente.
72 Resultados e Discussões

Figura 4.23: Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido dimer-
captosuccínico (DMSA) em razão 1:40 (NPDMSA140) e sua distribuição de tamanhos. O
tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no histograma,
d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição,
respectivamente.

Figura 4.24: Micrograa das nanopartículas após serem funcionalizadas com ácido dimer-
captosuccínico (DMSA) em razão 1:80 (NPDMSA180) e sua distribuição de tamanhos. O
tamanho de grão cristalino DRX é destacado com a linha vermelha tracejada no histograma,
d0 , <DT EM > e σT EM correspondem à mediana, valor médio e desvio padrão da distribuição,
respectivamente.
4.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET 73

Tabela 4.11: Valor mediano (d0 ) e desvio padrão (σT EM ) obtidos do ajuste da função Log-
Normal (Equação 3.9) aos histogramas da distribuição de tamanhos para cada amostra.
Valor típico (DT EM ) e valor médio (<DT EM >) obtidos a partir das Equações 3.10 e 3.11,
respectivamente.

NPMs d0 (nm) σT EM (nm) DT EM (nm) <DT EM > (nm) DRX 311 (nm)
NP 8,4 0,3 7,7(2) 8,0(2) 10,7(2)
NPAO 10,1 0,2 9,5(3) 9,8(3) 11,8(2)
NPMSA110 11,3 0,4 9,9(8) 10,6(7) 10,8(2)
NPMSA140 13,5 0,1 13,3(2) 13,4(2) 10,5(4)
NPMSA180 11,0 0,3 10,2(4) 10,6(4) 11,7(3)
NPDMSA110 11,4 0,3 10,0(9) 10,5(7) 11,4(3)
NPDMSA140 10,7 0,2 10,1(3) 10,4(2) 10,6(2)
NPDMSA180 13,3 0,3 12,3(5) 12,8(4) 11,4(3)

A partir da análise das Figuras 4.17 a 4.24 e os valores de d0 , DT EM e <DT EM > (Ta-

bela 4.11) observamos que estes são valores próximos entre si, evidenciando, em todos os

casos, uma distribuição de tamanhos aproximadamente simétrica. No caso da amostra NP

sintetizada (sem recobrimento), a mesma apresenta o menor valor de diâmetro ∼ 8 nm em

comparação com os valores observados para outras amostras (de 10 a 13 nm) e aos tama-

nhos do grão determinados por RX (DRX ). Vale a pena ressaltar, entretanto, que o valor

de DRX encontra-se dentro da distribuição para a amostra NP (Figura 4.17). Mais ainda, a

frequência com que as NPs com tamanhos da ordem de 10 a 11 nm aparecem na distribuição

(cerca de 50% da frequência das NPs de tamanho ∼ 8 nm - Figura 4.17) justica que estas

NPs maiores contribuam signicativamente para a largura dos picos de difração observados.

Como consequência, observamos DRX > DT EM para NPs sem recobrimento.

Por outro lado, para NPs recobertas tanto com AO como com MSA e DMSA, observa-

mos um deslocamento dos valores médios, máximos e medianos da distribuição para valores

maiores mais próximos aos tamanhos de grão cristalino DRX calculados. Note-se que, en-

tretanto, para as amostras recobertas com MSA 1:40 (Figura 4.20) e DMSA 1:80 (Figura

4.24), as correspondentes distribuições de tamanho são deslocadas para valores maiores que

os valores de DRX . Talvez a presença destas partículas maiores esteja relacionada a um

maior recobrimento da superfície das mesmas, sem alterar o tamanho do núcleo cristalino.
74 Resultados e Discussões

4.4 Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM


A Figura 4.25 apresenta a variação da magnetização especíca com o campo magnético

aplicado para as nanopartículas sintetizadas (NP) e recobertas com ácido oleico (NPAO),

enquanto a Figura 4.26 apresenta as curvas de histerese das NPs após funcionalização com

MSA na razão de 1:10 (NPMSA110), 1:40 (NPMSA140) e 1:80 (NPMSA180), e a Figura

4.27 apresenta as curvas de histerese das NPs funcionalizadas com DMSA na razão de 1:10

(NPDMSA110), 1:40 (NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180).

Figura 4.25: a. Curva de histerese das nanopartículas após serem obtidas (NP) e após
recobrimento com ácido oleico (NPAO); b. Ampliação da região selecionada pelo retângulo
vermelho.
4.4. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 75

Figura 4.26: a. Curva de histerese das nanopartículas após serem funcionalizadas com MSA
na razão de 1:10 (NPMSA110), 1:40 (NPMSA140) e 1:80 (NPMSA180); b. Ampliação da
região selecionada pelo retângulo vermelho.

Figura 4.27: a. Curva de histerese das nanopartículas após serem funcionalizadas com
DMSA na razão de 1:10 (NPDMSA110), 1:40 (NPDMSA140) e 1:80 (NPDMSA180); b.
Ampliação da região selecionada pelo retângulo vermelho.
76 Resultados e Discussões

Nas Figuras 4.25, 4.26 e 4.27, podemos observar um comportamento superparamagné-

tico de todas as amostras estudadas. Uma ampliação da região em torno de H=0 (exemplo

na Figura 4.25) indica uma baixa magnetização especíca remanente (σr ∼ 0,1-0,5 emu/g),

evidenciando que os momentos magnéticos estão aleatoriamente orientados na ausência do

campo magnético; já o campo coercivo (responsável pela anulação da magnetização rema-

nente) apresenta também valores baixos (Hc ∼ 5-10 Oe), como esperado para NPs superpa-

ramagneticas. Os valores de saturação da magnetização especíca (σs ) foram obtidos através

da média dos valores atingidos da magnetização especíca para valores máximos do campo

magnético, e são apresentados na Tabela 4.12.

Tabela 4.12: Magnetização especíca de saturação (σs ) das NPMs.

NPMs σs (emu/g)
NP 62,2(2)
NPAO 62,4(3)
NPMSA110 66,0(1)
NPMSA140 71,6(1)
NPMSA180 63,9(1)
NPDMSA110 31,6(1)
NPDMSA140 29,31(3)
NPDMSA180 36,4(2)

Sabemos da literatura que a magnetização especíca da magnetita bulk é da ordem de

∼ 85 a 100 emu/g e um campo coercivo entre 115-150 Oe [87], enquanto para nanopartículas
de magnetita não modicadas na superfície σs ∼ 92emu/g [49, 87]. No nosso caso, estamos

encontrando um valor de σs menor que o reportado na literatura, provavelmente devido à

formação de uma camada de spins desalinhados próxima à superfície.

Por outro lado, observamos que σs não se alterou após o recobrimento com ácido oleico

(Tabela 4.12). No caso das nanopartículas recobertas com MSA observa-se um pequeno

incremento no comportamento magnético, o que poderia indicar um aparente recobrimento

paramagnético com MSA; já no caso do DMSA, o valor de σs decresce em quase 50%,

indicando que o DMSA deve estar contribuindo com uma camada diamagnética. Levando-se

em conta que ambas NPs funcionalizadas com MSA e DMSA, independentemente das razões

molares; apresentam comportamento superparamagnético a temperatura ambiente, aquelas

recobertas com MSA apresentam-se como melhores candidatas pra aplicações biomédicas

devido ao seu maior valor de magnetização de saturação (σs ).


4.4. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 77

Como apresentamos na Introdução (Capítulo 1) e Metodologia (Capítulo 3), as curvas

do momento magnético podem ser ajustadas através da Equação 3.12, fornecendo funções

de distribuição de tamanhos para NPMs. Os ajustes às curvas do momento magnético e os

respectivos histogramas são apresentados nas Figuras 4.28 a 4.35. Os valores de diâmetro

magnético (dV SM ) correspondente à mediana da distribuição são apresentados na Tabela

4.13, em comparação aos valores de DRX e d0 (T EM )


78 Resultados e Discussões

Figura 4.28: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


sintetizadas (NP). b. Distribuição de tamanhos, indicada pela função Log-Normal (fLN -
Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana e σV SM ao desvio
padrão.
4.4. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 79

Figura 4.29: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas após
recobrimento com ácido oleico (NPAO). b. Distribuição de tamanhos, indicada pela função
Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM corresponde à mediana
e σV SM ao desvio padrão.
80 Resultados e Discussões

Figura 4.30: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


funcionalizadas com MSA em razão de 1:10 (NPMSA110). b. Distribuição de tamanhos,
indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM
corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão.
4.4. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 81

Figura 4.31: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


funcionalizadas com MSA em razão de 1:40 (NPMSA140). b. Distribuição de tamanhos,
indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM
corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão.
82 Resultados e Discussões

Figura 4.32: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


funcionalizadas com MSA em razão de 1:80 (NPMSA180). b. Distribuição de tamanhos,
indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM
corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão.
4.4. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 83

Figura 4.33: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


funcionalizadas com DMSA em razão de 1:10 (NPDMSA110). b. Distribuição de tamanhos,
indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM
corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão.
84 Resultados e Discussões

Figura 4.34: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


funcionalizadas com DMSA em razão de 1:40 (NPDMSA140). b. Distribuição de tamanhos,
indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM
corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão.
4.4. Magnetometria de Amostra Vibrante - VSM 85

Figura 4.35: a. Ajuste do momento magnético (Equação 3.12) para as nanopartículas


funcionalizadas com DMSA em razão de 1:80 (NPDMSA180). b. Distribuição de tamanhos,
indicada pela função Log-Normal (fLN - Figura 3.9) obtida a partir do ajuste, onde dV SM
corresponde à mediana e σV SM ao desvio padrão.
86 Resultados e Discussões

Tabela 4.13: Tamanho de grão cristalino (DDRX ), valor mediano (d0 T EM ), desvio padrão
(σT EM ) da distribuição de tamanhos obtidos da Microscopia Eletrônica, e valor mediano do
diâmetro magnético (dV SM ), e seu desvio padrão (σV SM ) obtidos a partir da distribuição de
tamanhos fornecida do ajuste da variação do momento magnético (µ) às curvas do momento
magnético de cada amostra.

NPMs DRX (nm) d0 T EM (nm) σT EM (nm) dV SM (nm) σV SM (nm)


NP 10,7(2) 8,4 0,3 8,9 0,2
NPAO 11,8(2) 10,1 0,2 8,2 0,2
NPMSA110 10,8(2) 11,3 0,4 8,0 0,2
NPMSA140 10,5(8) 13,5 0,1 8,0 0,2
NPMSA180 11,7(3) 11,0 0,3 8,0 0,2
NPDMSA110 11,4(3) 11,4 0,3 8,0 0,2
NPDMSA140 10,6(2) 10,7 0,2 8,0 0,2
NPDMSA180 11,4(3) 13,3 0,3 7,8 0,2

Conforme podemos observar, a amostra sintetizada e não modicada supercialmente

(NP) apresenta um valor mediano da distribuição dV SM da ordem de 9nm, compatível com

os valores de TEM e ligeiramente menor que o DRX .

Por outro lado, a modicação da superfície seja pela adsorção de AO quanto pela troca

de ligantes com MSA ou DMSA aparentemente diminui o valor mediano da distribuição para

8nm, mas devemos ressaltar que a distribuição continua a apresentar uma certa largura (∼

2nm) compatível com os valores observados por TEM e de grão cristalino observados por

R-X.

Portanto, os resultados conjuntos das técnicas utilizadas de caracterização dão suporte

para concluir que as NPs sintetizadas (NP) correspondem a NPs de magnetita, com carácter

superparamagnético a temperatura ambiente, apresentam morfologia uniforme e esférica,

cujos tamanhos da ordem de 10nm (e polidispersão em tornde de 2nm) são apropriados para

aplicações biomédicas. Os resultados de FTIR indicam que a funcionalização da superfície

destas NPs com MSA ou DMSA foi feita de maneira eciente, de tal maneira que as mesmas

apresentam grupos funcionais tióis na superfície (Figura 4.12).


4.5. Liberação de NO 87

4.5 Liberação de NO
4.5.1 Primeira Etapa

No primeiro estágio deste projeto de dissertação de Mestrado foi realizado o estudo da

liberação de NO, a partir da amostra NPMSA140 nitrosada, como indicado na Seção 2.5.1.

A Figura 4.36 apresenta os dados representativos de quimioluminescência para injeções

de (i) 100µl da suspensão de NPMSA140 não nitrosada e (ii) 100µl de solução aquosa de
nitrito de sódio (amostras controle). Conforme observamos, a ausência de sinal garante que

o Analisador mede apenas NO liberado de NPs contendo grupos nitrosotióis. Por outro

lado, os picos em (iii) e (iv) correspondem às injeções de 100 e 10 µl da solução aquosa

das NP-SNO, respectivamente. Observa-se uma maior intensidade para a injeção de 100µl

(pico (iii)) comparada com a injeção de 10µl (pico (iv)). Estes resultados mostraram que o

procedimento de nitrosação foi efetivo, de tal maneira que NO foi ligado às nanopartículas

magnéticas funcionalizadas com MSA (razão 1:40) indicando, portanto, que estas NPs podem

ser consideradas como veículos carreadores de NO.

Em relação ao perl de liberação de NO com respeito ao tempo, a Figura 4.37 apresenta


o
a liberação total de NO depois de 1h, 2,3h, 4,2h e 6,7h à temperatura de 25 C no escuro.

Pode-se observar que este novo material tem a capacidade de liberar NO espontaneamente

por muitas horas à temperatura ambiente. Como reportado anteriormente na literatura para

moléculas de S-nitrosotióis (R-SNO) de baixo peso molecular, como a S-glutationa (GSNO),

os grupos S-NO sofrem clivagem homolítica, liberando-se assim NO (Equações 4.1 e 4.2)

[29]. Os produtos de decomposição depois da liberação de NO são dímeros de MSA ligados

através de ponte disulfeto, de acordo com as reações [38]:

NP − MSA − SNO −→ NP − MSA − S · + NO · (4.1)

NP − MSA − S · + NP − MSA − S · −→ NP − MSA − S − S − MSA − NP (4.2)


88 Resultados e Discussões

onde NP-MSA-SNO representa a molécula adsorvida de ácido mercaptosuccínico nitrosado

sobre a superfície das NPs, enquanto NP-MSA-S


· representa o radical thiil formado após

a ruptura homolítica da ligação S-N, e os dimeros resultantes NP-MSA-S-S-MSA-NP são

esperados permanecer adsorvidos na superfície das NPs [38]. Embora desorção dos dímeros

não possa ser desconsiderada, sua ocorrência deve ser pequena devido à adsorção estabelecida

entre os grupos carboxila do MSA e a superfície do óxido de ferro.

Figura 4.36: Dados representativos da quimioluminescência para a liberação de NO a partir


dos grupos S-NO presentes nas superfície das NPs. As echas indicam as seguintes injeções:
(i): 100µl de NPs não nitrosadas (NPMSA140); (ii): 100µl de solução aquosa de NaNO2 ;
(iii) e (iv): 100 e 10µL de da solução aquosa das NP-SNO, respectivamente. Figura extraída
de [38].

Figura 4.37: Perl da Liberação de NO com respeito ao tempo. Figura extraída de [38].
4.5. Liberação de NO 89

Vale a pena ressaltar que a quantidade de NO liberado (µmol/mg) tem grande poten-

cial para ser usado em diversas aplicações biomédicas. Particularmente, esta quantidade é

adequada para promover cicatrização de feridas in vivo, como reportado na literatura [34].
Mais ainda, o perl de liberação de NO (Figura 4.37) pode ser aplicado em situações que

requerem um uxo de NO liberado localmente por horas como, por exemplo, para acelerar

cicatrização ou inibir adesão de plaquetas e formação de trombos em dispositivos médicos

em contato com sangue [88].

Este é o primeiro trabalho referente à funcionalização de NPs magnéticas como carrea-

doras e liberadoras de NO e gerou uma patente (INPI 018120023545). O perl de liberação

de NO está de acordo com outros nanomateriais baseados em dendrímeros modicados, e

nanopartículas de sílica liberadoras de NO [68]. Ressalta-se também, de maneira inovadora,

o uso de MSA como agente de funcionalização de NPMs.

Tendo em vista explorar melhor a potencialidade destas NPs, resolvemos estender o tra-

balho investigando o papel da razão molar NP:MSA, assim como comparar os resultados

obtidos com NPs funcionalizadas com DMSA, que apresentariam em princípio, dois grupos

tióis expostos para reagir com NO.

4.5.2 Segunda Etapa

4.5.2.1 Liberação de NO a partir das NPs funcionalizadas com MSA e DMSA


Nesta parte experimental, injetamos 5µl de solução no analisador de NO (Figura 3.5)

contendo NP-SNO que foram funcionalizadas com MSA e DMSA nas razões molares 1:10,

1:40 e 1:80. As Tabelas 4.14 e 4.15 apresentam os resultados de concentração de NO liberado

em função da concentração de NPMSA e NPDMSA injetadas, respectivamente.

A Figura 4.38 apresenta as concentrações de NO liberado ([NO]) em função das concen-

trações nais das soluções de NP-SNO para as NPs funcionalizadas com MSA, enquanto a

Figura 4.39 apresenta para as funcionalizadas com DMSA.


90 Resultados e Discussões

Tabela 4.14: Concentrações das NP-SNO fornecidas pelo equipamento e corrigidas, obtidas
a partir da funcionalização das NPs com MSA, e respectivas concentrações de NO [NO]
liberado.
Solução das NP-SNO obtidas das NPs funcionalizadas com MSA
Concentração Concentração [NO]
Amostra Fator de correção
experimental (µM) nal (µM) (µM)
NPMSA110 17,58 16,53 271 ± 40
NPMSA140 10,98 0,94 10,32 131,5± 14,4
NPMSA180 11,87 11,16 150,4 ± 1,5

Tabela 4.15: Concentrações das NP-SNO fornecidas pelo equipamento e corrigidas, obtidas
a partir da funcionalização das NPs com DMSA, e respectivas concentrações de NO [NO]
liberado.
Solução das NP-SNO obtidas das NPs funcionalizadas com DMSA
Concentração Concentração [NO]
Amostra Fator de correção
experimental (µM) nal (µM) (µM)
NPDMSA110 41,43 36,46 1067,8 ± 136,9
NPDMSA140 14,46 0,88 12,72 224,6 ± 52,8
NPDMSA180 48,80 42,94 997,2 ± 58,7
4.5. Liberação de NO 91

Figura 4.38: Concentração de NO liberado ([NO]) em função da concentração das NPs


nitrosadas, obtidas a partir das NPs funcionalizadas com MSA em razões molares 1:10, 1:40
e 1:80 (Tabela 4.14).

Figura 4.39: Concentração de NO liberado ([NO]) em função da concentração das nanopar-


tículas nitrosadas, obtidas a partir das NPs funcionalizadas com DMSA em razões molares
1:10, 1:40 e 1:80 (Tabela 4.15).
92 Resultados e Discussões

Conforme observamos das Figuras 4.38 e 4.39 e Tabelas 4.14 e 4.15, NPs funcionalizadas

com DMSA nas razões molares de 1:10, 1:40 e 1:80 respondem à nitrosação de maneira mais

efetiva que NPs funcionalizadas com MSA. Isto porque para um mesmo volume analisado

de solução (5µl), NPs recobertas com DMSA apresentam um maior grau de nitrosação (da

ordem de 35 a 42 µM) em relação a MSA (da ordem de 12 a 18 µM). Ou seja, a nitro-

sação em NPs funcionalizadas com DMSA parece ser mais eciente que com as NPs com

MSA adsorvido. Mais ainda, a quantidade de [NO] liberado por NPs nitrosadas é tam-

bém maior para NPs recobertas com DMSA: note que a produção de [NO] é da ordem de

1000µM para concentrações de NPDMSA nitrosadas de cerca de 40µM (Figura 4.39), resul-

tando numa razão de 25, enquanto para MSA a produção de [NO] da ordem de 250µM para

concentrações de 17µM de NPMSA nitrosadas resulta numa razão da ordem de 15. Prova-

velmente, como DMSA possui dois grupos tióis disponiveis para reagir com NO, a eciência

da nitrosação é maior. Dentro deste contexto, poderíamos concluir que NPMs recobertas

com DMSA seriam melhores candidatas a veículos de transporte e liberação de óxido nítrico.

Entretanto, os resultados de liberação de [NO] de NPs recobertas com MSA e DMSA na

razão de 1:40 são similares e não compreendidos por nós. Além disso, o aumento na razão

NP:MSA e DMSA, o que deveria inuenciar o grau de modicação da superfície das NPs,

não parece ter papel importante na taxa de nitrosação das mesmas.

Assim, concluimos de maneira preliminar, que a taxa de liberação de [NO] de grupos

nitrosotióis adsorvidos na superfície das NPMs independe da razão molar NP:MSA ou

NP:DMSA empregada. Novos experimentos são necessários para uma melhor interpreta-

ção destes resultados.

Para nalizar, gostaríamos de ressaltar aqui que avaliações toxicológicas destes nanoma-

teriais já foram iniciadas. Resultados preliminares realizados pelas Dra. Paula Haddad e

Dra. Amedea Seabra (ambas da UNIFESP) demonstraram que as NPs tioladas via MSA e

DMSA apresentam baixa citotoxicidade e genotoxicidade em linfócitos humanos. Por outro

lado, quando nitrosadas aumentam o nivel de apoptose e morte celular , mostrando potencial

aplicação em células tumorais [39, 40, 89].


Capítulo 5
Conclusões

5.1 Caracterizações Químicas e Físicas das NPs


• A partir dos experimentos de FTIR concluimos que as NPs obtidas pelo método de

síntese por coprecipitação correspondem a óxidos de ferro devido às bandas caracterís-


−1
ticas de deformação δF e−O e estiramento νF e−O entre 400-650cm que aparecem nos

espectros. Além disso, as moléculas de MSA e DMSA são adsorvidas na superfície das

NPs via ligação do grupo carboxila com átomos de Fe.

• A partir dos resultados de difração de R-X podemos concluir que as NPs obtidas,

recobertas com AO e funcionalizadas com MSA e DMSA apresentam difratogramas,

parâmetros de rede e distâncias interplanares correspondentes à estrutura espinélio

da magnetita, conforme comparação com a cha catalográca. O tamanho de grão

cristalino pode ser avaliado como (11,1 ± 0,7)nm sem nenhuma tendência ao aumento
ou diminuição com recobrimento por AO ou troca de ligantes por MSA e DMSA. Tal

tamanho é apropriado para aplicações biomédicas.

• Dos resultados de TEM podemos inferir que as NPs tem morfologia esférica, com

tamanhos da ordem do tamanho de grão cristalino, mas apresentam uma certa poli-

dispersão em torno de 20%. A funcionalização da superfície seja com MSA ou DMSA

não altera o tamanho médio das NPs.

93
94 Conclusões

• Dos resultados de VSM podemos concluir que as NPs tem um comportamento su-

perparamagnético à temperatura ambiente. Para as NPs tanto recobertas com AO

quanto funcionalizadas com MSA, a magnetização de saturação é da ordem de (67 ±


5)emu/g. Entretanto, as NPs funcionalizadas com DMSA apresentam uma magnetiza-

ção de saturação da ordem de (32,9 ± 3,5)emu/g. Estes valores estão abaixo do valor

da literatura (∼ 92emu/g), indicando uma diminuição da σs devido à modicação da

superfície da NP. Em particular, para DMSA, tal recobrimento diminue signicativa-

mente o valor de σs , provavelmente devido à formação de uma camada diamagnética

na superfície da NP.

A análise das curvas de histerese fornece distribuições de tamanho das NPMs compa-

tíveis com a análise de TEM.

5.2 Liberação de NO
• NPMs funcionalizadas tanto com MSA quanto com DMSA podem ser potenciais can-

didatas a veículos de transporte e liberação de óxido nítrico.

• A quantidade de óxido nítrico liberado pelas NPMs tem potencial aplicação em bio-

medicina, associada à possibilidade de liberação controlada (cinética de liberação).

• A liberação de óxido nítrico (NO) é maior no caso das NPs funcionalizadas com DMSA,

nas razões NP:DMSA 1:10 e 1:80. Tal resultado pode ser atribuido à presença de dois

grupos tióis (-SH) neste ligante, o qual permite uma maior ligação e liberação de óxido

nítrico pelas NPs nitrosadas.

5.3 Conclusão Final


• Embora NPs funcionalizadas com DMSA parecem ser mais adequadas como veículos

de transporte e liberação de NO do que as recobertas com MSA; elas afetam de maneira

mais signicativa as propriedades magnéticas do material (σs decresce por um fator 3).

Além disso, como mencionamos na Introdução deste trabalho, MSA é menos custoso

nanceiramente que DMSA, o que favorece economicamente um processo de produção

de nanopartículas magnéticas como carreadoras de NO para aplicações biomédicas.


5.3. Conclusão Final 95

No nosso trabalho, demonstramos que em ambos os casos (NPs nitrosadas a partir de

NPs funcionalizadas com MSA e DMSA), ocorre nitrosação e liberação de óxido nítrico,

embora em graus diferentes. Portanto, ambas podem ser utilizadas como veículos de

transporte e liberação de NO.


Referências Bibliográcas

[1] A. Kunzmann, B. Andersson, T. Thurnherr, H. Krug, A. Scheynius, and B. Fadeel,

Toxicology of engineered nanomaterials: Focus on biocompatibility, biodistribution


and biodegradation, Biochimia et Biophysica Acta 1810 (2011) 361373.

[2] X. Q. Zhang, X. Xu, N. Bertrand, E. Pridgen, A. Swami, and O. C. farokhzad,

Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized


medicine, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 13631384.

[3] L. Y. Yang, X. Zhang, M. Ye, J. Jiang, R. Yang, T. Fu, Y. Chen, K. Wang, C. Liu,

and W. Tan, Aptamer-conjugated nanomaterials and their applications, Advanced


Drug Delivery Reviews 63 (2011) 13611370.
[4] X. M. Liu and J. K. Kim, Solvothermal synthesis and magnetic properties of

magnetite nanoplatelet, Materials Letters 63 (2009) 428430.

[5] Z. Zhang and A. Chai, Core-shell magnetite-silica composite nanoparticles enhancing

DNA damage induced by a photoactive platinum-diimine complex in red light,


Journal of Inorganic Biochemistry 117 (2012) 7176.

[6] Y. Zhang, N. Kohler, and M. Zhang, Surface modication of superparamagnetic

magnetite nanoparticles and their intracellular uptake, Biomaterials 23 (2002)


15531561.

[7] A. K. Gupta and M. Gupta, Cytotoxicity suppression and cellular uptake

enhancement of surface modied magnetic nanoparticles, Biomaterials 26 (2005)


15651573.

97
98 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[8] L. X. Tiefenauer, A. Tschirky, G. Khüne, and R. Y. Andres, In vivo evaluation of

magnetite nanoparticles for use as a tumor contrast agent in MRI, Magnetic


Resonance Imaging 14 (1996), no. 4, 391402.
[9] P. S. Haddad and A. B. Seabra, Biomedical Applications of Magnetic Nanoparticles.
Nova Science Publishers, 1ra ed., 2012.

[10] A. Simchi, R. Ahmadi, S. M. Reihani, and A. Mahdavi, Kinetics and mechanism of

nanoparticle formation and growth in vapor phase condensation process, Materials


and Design 28 (2007) 850856.
[11] M. Shigeta and T. Watanabe, Two-dimensional analysis of nanoparticle formation in

induction thermal plasmas with counterow cooling, Thin Solid Films 516 (2008)
44154422.

[12] S. H. Cho, S. Lee, D. Y. Ku, T. S. Lee, B. Cheong, W. M. Kim, and K. S. Lee,

Growth behavior and optical properties of metal-nanoparticle dispersed dielectric

thin lms formed by alternating sputtering, Thin Solid Films 447-448 (2004) 6873.
[13] M. L. Paramês, J. Mariano, M. S. Rogalski, N. Popovici, and O. Conde,  UV pulsed
laser deposition of magnetite thin lms, Materials Science & Engineering B 118

(2005) 246249.

[14] M. Mukherjee and A. Mahapatra, Catalytic eect of silver nanoparticle on electron

transfer reaction: Reduction of [Co(NH3)5Cl](NO3)2 by iron (II), Colloids and


Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 350 (2009) 17.
[15] N. J. Tang, W. Zhong, H. Y. Jiang, X. L. Wu, W. Liu, and Y. W. Du,

Nanostructured magnetite ( F3o4) thin lms prepared by sol-gel method, Journal de


Magnetism and Magnetic Materials 282 (2004) 9295.
[16] Y. Mizukoshi, S. Seino, K. Okitsu, T. Kinoshita, Y. Otome, T. Nakagawa, and T. A.

Yamamoto, Sonochemical preparation of composite nanoparticles of Au/γ -Fe2o3 and


magnetic separation of glutathione, Ultrasonics Sonochemistry 12 (2005) 191195.
[17] Y. H. Kim, D. K. Lee, B. G. Jo, J. H. Jeong, and Y. S. Kang, Synthesis of oleate

capped Cu nanoparticles by thermal decomposition, Colloids and Surfaces A:


Physicochemic. Eng. Aspects 284-285 (2006) 364368.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 99

[18] Y. Cha, M. Kim, Y. Choa, J. Kim, B. Nam, J. Lee, D. H. Kim, and K. H. Kim,

Synthesis and Characterization of Surface-Coated Superparamagnetic Magnetite


Nanoparticle, IEEE Transactions on Magnetics 46 (2010), no. 2, 443446.
[19] A. Figuerola, R. D. Corato, L. Manna, and T. Pellegrino, From iron oxide

nanoparticles towards advanced iron-based inorganic materials designed for

biomedical applications, Pharmacological Research 62 (2010) 126143.

[20] L. Zhang, R. He, and H. C. Gu, Oleic acid coating on the monodisperse magnetite

nanoparticles, Applied Surface Science 253 (2006) 26112617.

[21] M. T. L. López, J. D. G. Durán, A. V. Delgado, and F. G. Caballero, Stability and

magnetic characterization of oleate-covered magnetite ferrouids in dierent nonpolar

carriers, Journal of Colloid and Interface Science 291 (2005) 144151.

[22] M. Rudolph, J. Erler, and U. A. Peuker, A TGA-FTIR perspective of fatty acid


adsorbed on magnetite nanoaprticles-decomposition steps and magnetite reduction,

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 397 (2012) 1623.

[23] F. Yazdani and M. Edrissi, Eect of pressure on the size of magnetite nanoparticles

in the coprecipitation synthesis, Materials Science and Engineering B 171 (2010)


8689.

[24] C. R. Vestal and Z. J. Zhang, Eects of surface coordination chemistry on the

magnetic properties of MnFe2o4 spinel ferrite nanoparticles, Journal of the American


Chemical Society 125 (2003) 98289833.

[25] L. H. Reddy, J. L. Arias, J. Nicolas, and P. Couvreur, Magnetic nanoparticles design

and characterization, toxicity and biocompatibility, pharmaceutical and biomedical

applications, Chemical Reviews 112 (2012) 58185878.

[26] D. B. Shieh, F. Y. Cheng, C. H. Su, C. S. Yeh, M. T. Wu, Y. N. Wu, C. Y. Tsai, C. L.

Wu, D. H. Chen, and C. H. Chou, Aqueous dispersions of magnetite nanoparticles

with NH+3 surfaces for magnetic manipulations of biomolecules and MRI contrast
agents, Biomaterials 26 (2005) 71837191.
100 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[27] C. H. Liu, C. J. Yu, and W. L. Tseng, Fluorescence assay of catecholamines based on

inhibition of peroxidase-like activity of magnetite nanoparticles, Analytica Chimica


Acta 745 (2012) 143148.

[28] M. P. Garcia, R. M. Parca, S. B. Chaves, l P Silva, A. D. Santos, Z. G. M. Lacava,

P. C. Morais, and R. B. Azevedo, Morphological analysis of mouse lungs after

treatment with magnetite-based magnetic uid stabilized with dmsa, Journal of


Magnetism anf Magnetic Materials 293 (2005) 277282.

[29] R. Mejías, S. P. Yagüe, L. Gutiérrez, L. I. Cabrera, R. Spada, P. Acedo, C. J. Serna,

F. J. Lázaro, A. Villanueva, M. P. Morales, and D. F. Barber, dimercaptosuccinic

acid-coated magnetite nanoparticles for magnetically guided in vivo delivery of


interferon gamma for cancer immunotherapy, Biomaterials 32 (2011) 29382952.

[30] P. S. Haddad, T. M. Martins, L. D. Souza-Li, L. M. Li, K. Metze, R. L. Adam,

M. Knobel, and D. Zanchet, Structural and morphological investigation of magnetic

nanoparticles based on iron oxides for biomedical applications, Materials Science and
Engineering C 28 (2008) 489494.

[31] B. M. Raafat, A. E. Barbary, E. Touson, and S. Aziz, Di- Mercapto Succinic Acid
( DMSA) and vitamin C chelating potency in lead intoxication, regarding oxidative
stress and apoptotic related proteins in rabbits, Journal of Genetic Engineering and
Biotechnology 9 (2011) 121131.

[32] K. Jomova and M. Valko, Advances in metal-induced oxidative stress and human

disease, Toxicology 283 (2011) 6587.

[33] P. Parvex, R. Rozen, A. Dziarmaga, and P. Goodyer, Studies of urinary cystine

precipitation in vitro: ontogeny of cystine nephrolithiasis and identication of

meso-2,3-dimercaptosuccinic acid as a potential therapy for cystinuria, Molecular


Genetics and Metabolism 80 (2003) 419425.

[34] T. P. Amadeu, A. B. Seabra, M. G. de Oliveira, and A. M. A. Costa, Nitric Oxide


donor improves healing if applied on inamatory and proliferative phase, Journal of
Surgical Research 149 (2008) 8493.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101

[35] A. B. Seabra and N. Duran, Nanotechnology allied to nitric oxide release materials

for dermatological applications, Current Nanoscience 8 (2012) 520525.


[36] J. Tamargo, R. caballero, R. Gómez, L. Núñez, M. Vaquero, and E. Delpón, Efectos

del óxido nítrico sobre la función cardíaca, Revista Española de Cardiología


Suplementos 6 (2006) 3A20A.
[37] V. Bansal, H. Toga, and U. Raj, Tone dependent nitric oxide production in ovine

vessels in vitro, Respiration Physiology 93 (1993) 249260.


[38] M. M. Molina, A. B. Seabra, M. G. Oliveira, R. Itri, and P. S. Haddad, Nitric oxide

donor superparamagnetic iron oxide nanoparticles, Materials and Science and


Engineering C 33 (2013) 746751.
[39] R. Lima, A. Ludescher, M. M. Molina, R. Itri, A. B. Seabra, and P. S. Haddad, Nitric

oxide releasing iron oxide magnetic nanoparticles for biomedical application: cell

viability, apoptosis and cell death evaluations, Journal of Physics: Conference Series
429 (2013).
[40] R. Lima, J. Oliveira, M. M. Molina, R. Itri, P. S. Haddad, and A. B. Seabra, Iron

oxide nanoparticles show no toxicity in the comet assay in lymphocytes: A promising

vehicle as a nitric oxide releasing nanocarrier in biomedical applications, Journal of


Physics: Conference Series 429 (2013).
[41] R. M. Cornell and U. Schwertmann, The Iron Oxides Structures, Properties,
Reactions, Occurrences and Uses. Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim,

2da ed., 2003.

[42] U. Schwertmann and R. M. Cornell, Iron Oxides in the Laboratory Preparation and
Characterization. Wiley-VCH Verlag, 2da ed., 2000.

[43] B. D. Cullity and S. R. Stock, Elements of X-Ray Diraction. Prentice Hall, 3ra ed.,

2001.

[44] B. D. Cullity and C. D. Graham, Introduction to Magnetic Materials. John Wiley and

Sons Inc. Publication, 1ra ed., 2009.

[45] R. Skomski, Simples Models of Magnetism. Oxford Graduate Texts, 2008.


102 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[46] M. Getzla, Fundamentals of Magnetism. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New

York, 2008.

[47] A. P. Guimarães, Principles of Nanomagnetism. Springer-Verlag Berlin Heidelberg,

2009.

[48] J. L. Dormann, D. Fiorani, and E. Tronc, Magnetic relaxation in ne-particle

systems, Advanced in Chemical Physics 98 (2007) 283494.

[49] E. L. Duarte, Síntese e Caracterização de Nanopartículas baseadas em Óxidos de


Ferro. Tese de doutorado, Universidade de São Paulo - Instituto de Física, 2005.
[50] X. Zhang, Electrochemical Sensors, Biosensors and their biomedical applications.
Academic Press, 2008.

[51] A. Dhir and S. K. Kulkarni, Nitric oxide and major depression, Nitric Oxide 24
(2011) 125131.

[52] F. B. Jensen, The role of nitrite in nitric oxide homeostasis: A comparative


perspective, Biochemica et Biophysica Acta 1787 (2009) 841848.

[53] J. R. J. Lancaster, The Physical Properties of Nitric Oxide, Academic Press (2000)
209224.

[54] J. M. Fukuto, J. Y. Cho, and C. H. Switzer, Nitric Oxide. Academic Press, 2000.

[55] A. J. Friedman, G. Han, M. S. Navati, M. Chacko, L. Gunther, A. Aleri, and J. M.

Friedman, Sustained release nitric oxide releasing nanoparticles: Characterization of

a novel delivery platform based on nitrite containing hydrogel/glass composites,

Nitric Oxide 19 (2008) 1220.

[56] O. von Bohlen und Halbach, Nitric oxide imaging in living neuronal tissues using

ourescent probes, Nitric Oxide Biology and Chemistry 9 (2003) 217228.

[57] B. Bonavida, ed., Nitric Oxide and Cancer. Springer Science + Business Media, 2010.

[58] A. Weigert and B. Brüne, Nitric oxide, apoptosis and macrophage polarization during

tumor progression, Nitric Oxide 19 (2008) 95112.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 103

[59] M. A. Smith, M. Vasák, M. Knipp, R. J. Castellani, and G. Perry,

Dimethylargininase, a nitric oxide regulatory protein, in Alzheimer disease, Free


Radical Biology & Medicine 25 (1998) 898902.

[60] N. Shahani and A. Sawa, Protein S-nitrosylation: Role for nitric oxide signaling in
neuronal death, Biochimia et Biophysica Acta 1820 (2012) 736742.

[61] S. F. Kim, The role of nitric oxide in prostaglandin biology: Update, Nitric Oxide
25 (2011) 255264.

[62] M. Sarr, M. Chataigneau, N. Etienne-Selloum, A. M. Diallo, C. Schott, M. Geard,

J. C. Stoclet, V. B. Schini-Kerth, and B. Muller, targeted and persitent eects of NO


by S-nitrosation of tissue thiols in arteries with endothelial dysfunction, Nitric Oxide
17 (2007) 19.

[63] G. C. Brown, Nitric oxide and neuronal death, Nitric Oxide 23 (2010) 153165.

[64] H. Chakrapani, T. C. Wilde, M. L. Citro, M. M. Goodblatt, L. K. Keefer, and J. E.

Saavedra, Synthesis, nitric oxide release, and anti-leukemic activity of

glutathione-activated nitric oxide pro-drugs, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16


(2008) 26572664.

[65] S. J. Wimalawansa, M. T. Chapa, C. Yallampalli, R. Zhang, and D. J. Simmons,

Prevention of corticosteroid-induced bone loss with nitric oxide donor nitroglycerin in

male rats, Bone 21 (1997), no. 3, 275280.

[66] S. P. Nichols, W. L. Storm, A. Koh, and M. H. Schoensch, of nitric oxide: Targeted

delivery of therapeutics to bone and conective tissues, Advanced Drug Delivery


Reviews 64 (2012) 11771188.

[67] S. L. Huang, Liposomes in ultrasonic drug and gene delivery, Advanced Drug
Delivery Reviews 60 (2008) 11671176.

[68] A. B. Seabra, G. F. P. de Souza, L. L, M. N. Eberlin, and M. G. Oliveira.,

S-nitrosoglutathione incorpored in poly(ethylene glycol) matrix: potencial use for

topical nitric oxide delivery, Nitric Oxide 11 (2004) 263272.


104 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[69] M. Zhang, G. Pan, D. Zhao, and G. He, Xafs study of starch-stabilized magnetite

nanoparticle and surface speciation of arsenate, Environmental Pollution 159 (2011)


35093514.

[70] D. Li, D. Jiang, M. Chen, J. Xie, Y. Wu, S. Dang, and J. Zhang, An easy fabrication

of monodisperse oleic-acid coated Fe3O4 nanoparticles, Materials Letters 64 (2010)


24622464.

[71] P. C. Papaphilippou, A. Pourgouris, O. Marinica, alina Taculescu, G. I.

Athanasopoulos, L. Vekas, and T. Krasia-Christoforou, Fabrication and

characterization of superparamagnetic and thermoresponsive hydrogels based on

oleic-acid-coated fe3 o4 nanoparticles, hexa (ethylene glycol) methyl ether methacrylate

and 2-(acetoacetoxy) ethyl methacrylate, Journal of Magnetism and Magnetic


Materials 323 (2011) 557563.
[72] N. Hogg, Biological chemistry and clinical potential of S-nitrosothiols, Free Radical
Biology & Medicine 28 (2000), no. 10, 14781486.
[73] M. K. Iwatsuki, M. Yamaguchi, and M. Inoue, Role of ascorbic acid in the

metabolism of S-nitroso-glutathione, Federation of European Biochemical Societies


Letters 389 (1996) 149152.
[74] N. B. Colthup, L. H. Daly, and S. E. Wiberley, Introduction to Infrared and Raman
Spectroscopy. Academic Press, 3ra ed., 1990.

[75] R. T. Conley, Infrared Spectroscopy. Allyn and Bacon, 1990.

[76] Y. Ge, Y. Zhang, J. Xia, M. Ma, S. He, F. Nie, and N. Gu, Eect of surface charge

and agglomerate degree of magnetic iron oxide nanoparticles on KB cellular uptake in


vitro, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 73 (2009) 294301.
[77] L. Slavov, M. V. Abrashev, T. Merodiiska, C. Gelev, R. E. vanderberghe, I. M.

Deneva, and I. Nedkov, Raman spectroscopy investigation of magnetite nanoparticles

in ferrouids, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 322 (2010) 19041911.


[78] J. Mürbe, A. Rechtenbach, and J. Töpfer, Synthesis and physical characterization of

magnetite nanoparticles for biomedical applications, Materials Chemistry and


Physics 110 (2008) 426433.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 105

[79] S. Chawla and S. K. Jayanthi, Fabrication of ZnO: Mn nanoparticles with organic


shell in a highly alkaline aqueous environment, Applied Surface Science 257 (2011)
29352939.

[80] K. Yang, H. Peng, Y. Wen, and N. Li, Re-examination of characteristic FTIR


spectrum of secondary layer in bilayer oleic acid-coated Fe3Oe4 nanoparticles,
Applied Surface.
[81] A. I. Lesnikovich, T. M. Shunkevich, V. N. Naumenko, S. A. Vorobyova, and M. V.

Baykov, Dispersity of magnetite in magnetic liquids and the interaction with a

surfactant, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 85 (1990) 1416.


FTIR spectra of HSCH2CH2SH, CH3SCH2sh, and CH3SSCH3 in
[82] Y. Li and S. Li, 

argon and nitrogen matrices, Spectrochimia Acta 50A (1994) 509519.

[83] R. Rostamian, M. Naja, and A. Rafati, Synthesis and characterization of

thiol-functionalized silica nano hollow sphere as a novel adsorbent for removal of

poisonous heavy metal ions from water: Kinetics, isotherms and error analysis,

Chemical Engineering Journal 171 (2011) 10041011.


[84] J. F. Hochepied, P. Bonville, and M. P. Pileni, Nonstoichimetric zinc ferrite

nanocrystal synthesis and unusual magnetic properties, The Journal of Physical


Chemistry B 104 (2000) 905912.
[85] A. Tamion, M. Hillenkamp, F. Tournus, E. Bonet, and V. Dupuis, Accurate

determination of the magnetic anisotropy in cluster-assembled nanostructures,

Applied Physics Letters 95 (2009) 0625031  0625033.


[86] A. Fontijn, A. J. Sabadell, and R. J. Ronco, Homogeneous chemiluminescent

measurement of nitric oxide with ozone, Analytical Chemistry 42 (1970), no. 6,


576579.

[87] T. M. M. T. Alves, Síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de ferro para

aplicações biomédicas, Master's thesis, Universidade Estadual de Campinas, 2007.

[88] A. B. Seabra, R. Silva, G. F. P. Souza, and M. G. Oliveira, Antithrombogenic

Polynitrosated Polyester/Poly(methyl methacrylate) Blend for the Coating of


Blood-Contacting Surfaces, Articial Organs 32(4) (2008) 262267.
106 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[89] A. B. Seabra, P. S. Haddad, M. M. Molina, R. Itri, and M. G. de Oliveira, Nitric

oxide ( NO) releasing-superparamagnetic iron oxide nanoparticles for biomedical


applications, Nitric Oxide Biology and Chemistry 27 (2012) S38.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 107

ANEXO I

TRABALHOS PUBLICADOS EM

PERIÓDICO INTERNACIONAL
Materials Science and Engineering C 33 (2013) 746–751

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Materials Science and Engineering C


journal homepage: www.elsevier.com/locate/msec

Nitric oxide donor superparamagnetic iron oxide nanoparticles


Miguel M. Molina a, Amedea B. Seabra b, Marcelo G. de Oliveira c, Rosangela Itri a, Paula S. Haddad b,⁎
a
Instituto de Física, Universidade de São Paulo, São Paulo, São Paulo, 05508–090, Brazil
b
Departamento de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal de São Paulo, Diadema, SP, 09972–270, Brazil
c
Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, 13083–970, Brazil

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: This work reports a new strategy for delivering nitric oxide (NO), based on magnetic nanoparticles (MNPs),
Received 16 August 2012 with great potential for biomedical applications. Water-soluble magnetic nanoparticles were prepared
Received in revised form 14 October 2012 through a co-precipitation method by using ferrous and ferric chlorides in acidic solution, followed by a
Accepted 30 October 2012
mercaptosuccinic acid (MSA) coating. The thiolated nanoparticles (SH-NPs) were characterized by Fourier
Available online 12 November 2012
transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD), transmission electron microscopy (TEM),
Keywords:
and vibrating sample magnetometry (VSM). The results showed that the SH-NPs have a mean diameter of
Magnetite nanoparticles 10 nm and display superparamagnetic behavior at room temperature. Free thiol groups on the magnetite
Nitric oxide surface were nitrosated through the addition of an acidified nitrite solution, yielding nitrosated magnetic
S-nitrosothiol nanoparticles (SNO-NPs). The amount of NO covalently bound to the nanoparticles surface was evaluated
Iron oxide nanoparticles by chemiluminescense. The SNO-NPs spontaneously released NO in aqueous solution at levels required for
Nanomaterials biomedical applications. This new magnetic NO-delivery vehicle has a great potential to generate desired
Nanotechnology amounts of NO directed to the target location.
© 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction for drug delivery [11–17], in part due to their low toxicity, and mainly
because they can be guided in vivo to the specific target sites by an
It is well known that the endogenous molecule nitric oxide (NO) is external magnetic field [18]. In this context, iron oxide particles,
involved in several physiological processes, such as the control of such as magnetite (Fe3O4) or maghemite (γ-Fe2O3), are the most
vascular tone, the inhibition of platelet aggregation, smooth muscle common MNPs used for biomedical applications. These NPs are of
cell replication, immune response, neuronal communication, and comparable size to important biological systems (at diameters smaller
wound healing [1]. On the other hand, several pathologies are associ- than 100 nm), presenting superparamagnetic behavior at room tem-
ated to dysfunctions in endogenous NO production. NO is considered perature [19–22], high effective surface areas, low sedimentation
a unique biomolecule due to its chemical nature: small size, lack of rates, and improved diffusion through tissues [1,23].
charge and high lipophilicity, which makes NO a highly diffusible In general, in vitro studies of iron oxide MNPs demonstrated little
molecule capable of diffusing through cell membranes to interact or no toxicity of this material, indicating the biocompatibility of this
with intracellular targets, without the action of membrane channels nanovector [24,25]. Moreover, coated nanoparticles are found to be
or receptors. [2]. As a free radical in the biological medium, NO can less toxic compared to uncoated nanoparticles, due to the presence
readily react with biomolecules, leading to its inactivation. Therefore, of the biocompatible coating, which also lower protein adsorption
there is great interest in the development of NO-releasing drugs and on nanoparticle surface [26]. Similarly, in vivo studies based on
matrices which are capable of stabilizing and releasing NO locally, intravenous/intraperitoneal administrations of iron oxide MNPs coated
directly into different tissues and organs [3]. with different biocompatible ligands showed no long-term implications
In recent decades, many different systems have been proposed for of their use when administered at clinically relevant concentrations
drug delivery, such as micelles [4–6], nanoparticles [7,8] and polymers [27]. In vivo, iron oxide nanoparticles are reported to be metabolized
[9]. In these systems, the drug may be captured, attached, adsorbed, or to iron ions, which are incorporated to the biological iron storage
encapsulated in or on nanomatrices [10]. Among the nanostructured pool, such as erythrocytes, indicating the safe use of this nanomaterial
materials, magnetic nanoparticles (MNPs) appear as good candidates [27]. Moreover, these nanoparticles have already been tested in phase
I trial in patients with prostate cancer and no systemic toxicity was
reported after several months post application [28]. Taken together,
these results indicate that iron oxide nanoparticles are safe for several
⁎ Corresponding author at: Departamento de Ciências e da Terra, Universidade
Federal de São Paulo, Rua Artur Riedel, 275- Diadema, SP, CEP: 09972–270, Brazil.
biomedical applications.
Tel.: + 55 11 3319 3300; fax: + 55 11 4043 6428. Specific interactions with biomolecules usually require chemical
E-mail address: haddadps@gmail.com (P.S. Haddad). modifications on the MNP surface. To our best knowledge, this is the

0928-4931/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.msec.2012.10.027
M.M. Molina et al. / Materials Science and Engineering C 33 (2013) 746–751 747

first work that describes the synthesis and characterization of surface- scanning performed on all samples ranged from 20 to 70º with 0.05º
modified MNPs as vehicles to carry and deliver NO molecules. step-width at 5 s per angle. The average size of the nanoparticles
was calculated from the full width at half maximum of the (311) re-
2. Materials and methods flection (spinel structure) using the Scherrer's equation [30].

2.1. Materials 2.2.6. Transmission electron microscopy (TEM)


Photomicrographies of the nanoparticles were obtained using a
Mercaptosuccinic acid (MSA), sodium nitrite (NaNO2), iron (III) Philips CM200 transmission electron microscope (TEM) with an energy
chloride hexahydrate (FeCl3.6H2O), iron(II) chloride tetrahydrate, dispersive spectrometer, operating at 160 kV.
ammonium hydroxide (Sigma Aldrich Ch. Co., Inc., USA) and hydrochloric
acid (12 mol/L, Synth, USA) were used as received. Aqueous solutions 2.2.7. Vibrating sample magnetometry (VSM)
were prepared using analytical grade water from a Millipore Milli-Q A VSM was used to obtain the magnetization versus magnetic field
Gradient filtration system. loop (M versus H) at room temperature up to H = 20 kOe. The appa-
ratus was calibrated with a Ni pattern. The magnetization measure-
2.2. Methods ments were carried out on a known quantity of powdered sample,
slightly pressed and conditioned in cylindrical Lucite holders.
2.2.1. Synthesis of magnetic nanoparticles
The NPs were synthesized by using a co-precipitation method, as 2.2.8. Detection of total free NO released from nitrosated ultra filtered
previously reported [29]. In brief, 4.0 mL of FeCl3·6H2O and 1.0 mL MNPs
of FeCl2·4H2O (molar ratio 2:1), prepared in 1.0 mol/L HCl, were The total amount of NO released from nitrosated MNPs (SNO-NPs)
mixed and stirred, while a volume of 50 mL of NH4OH (0.7 mol/L) was measured by chemiluminescence using a Sievers chemilumines-
was added as precipitator. At this stage, the solution was centrifuged cence NO analyzer® (NOA 280i, GE Analytical, Boulder, CO, USA).
and the precipitate was decanted, followed by the addition of 6.0 mL Aliquots of 10 and 100 μL of aqueous suspensions of SNO-NPs (3.8 mg
of oleic acid. This mixture was then stirred for 20 min. The solution of nanoparticles/mL), and controls (aqueous suspension of SH-MNPs,
was centrifuged several times and the new precipitate was washed and aqueous solution of sodium nitrite) were injected into the sampling
several times with ethanol and acetone, leading to a NP covered with compartment which contained 5.0 mL of an aqueous solution of
oleic acid. ascorbic acid (160 mmol/L at pH 11). This condition allowed the detec-
tion of free NO released from S-NO groups present on nanoparticles
2.2.2. Adsorption of mercaptosuccinic acid surface, without the influence of nitrite. Calibration curves were
Oleic acid coated-NPs (~ 10.0 mg) were suspended in 1.0 mL of obtained with aqueous solutions of S-nitrosoglutathione, which were
toluene while MSA was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO). The freshly prepared and immediately analyzed (data not shown).
two solutions were mixed and vigorously stirred for 14 h producing
a black powder that was isolated by centrifugation. This procedure 2.2.9. Kinetics of NO release from SNO-NPs in aqueous solution
led to ligand exchange and, hence, to the formation of water stable The NO release profile from nitrosated nanoparticles was obtained
thiol-containing NPs (SH-NPs). in real time by chemiluminescence. SNO-NPs were freshly prepared
by adding 2.20 mg of SH-MNPs to 200 μL of deionized water and ho-
2.2.3. Nitrosation of MSA-coated MNPs mogenized. After homogenization, aliquots of 10 μL of this suspen-
An aqueous suspension of MSA-coated NPs was filtered in a sion were added to 3.0 mL of deionized water that contained 10 μL
Microcon centrifugal filter device containing ultrafiltration membranes of aqueous HCl (0.6 mol/L). A volume of 30 μL of aqueous NaNO2
(MWCO 10-kDa molar mass cut-off filter, Millipore, Billerica, MA, USA). (50 mmol/L) was added to the SH-NPs suspension. The final suspen-
The SH-NPs were washed with water and centrifuged 5 times for sion was homogenized, protected from light with an aluminum foil,
10 min at 13,400 g in a Micromax RF centrifuge (Thermo IEC, Milford, and kept at room temperature (25 °C) for kinetic measurements.
MA, USA). The thiol groups present on the surface of MNPs were The stability of S-NO groups present on the surface of the MNPs
nitrosated through the addition of an acidified sodium nitrite solution. was kinetically monitored at 25 °C, in the dark, by injecting 5.0 μL
In this step, an amount of 4.6 mg of filtered SH-NPs was suspended in of the sample into the NO analyzer, at different time intervals over
1.0 mL of deionised water containing 5 μL of 6.0 mol/L aqueous HCl. A 6.7 h. Before each injection, the samples were vigorously homoge-
volume of 200 μL of aqueous sodium nitrite (60 mmol/L) was added nized in a vortex. The experiments were performed in duplicate.
to the SH-MNPs. After 15 min of incubation at room temperature, the
nanoparticles suspension was filtered by centrifugal ultrafiltration and 3. Results and discussion
washed with deionised water, as described above.
The transfer of NPs from the organic to the aqueous phase provides
2.2.4. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy biostability to the particles at physiological pH. Synthetic MNPs are
Dry Fe3O4-MSA (1:40) nanoparticles were mixed with pure potas- generally surface-modified with hydrophobic ligands, becoming
sium bromide (KBr) powder using a w/w sample:KBr ratio of 1:100. unstable in aqueous suspension. In this work, the nanoparticles were
These mixtures were ground into fine powders, pressed in a mechan- initially coated with oleic acid and were therefore insoluble in water.
ical press to form translucent pellets and analyzed using a Bomen Replacement of oleic acid by MSA led to MNPs containing sulphydryl
B-100 spectrometer (Hartmann & Braun, Baptiste, Quebec, Canada). (SH) groups on the surface, as identified by FTIR spectroscopy. This
A pure KBr pellet was used as background. The FTIR spectra were reg- technique is useful to identify the most important stretching vibra-
istered from 700 to 4000 cm −1 at a resolution of 2 cm −1. tions of the MSA ligand attached on the particle surface [31].
Fig. 1 shows the IR spectrum of the synthesized NP coated with
2.2.5. X-ray diffraction (XRD) MSA at the molar ratio 1:40. The sharp band at 580 cm −1 is a finger-
The diffractograms were obtained with approximately 200 mg print of Fe–O–Fe bond [32,33]. On the other hand, the peaks at
of powdered Fe3O4-MSA onto a glass substrate of 2 × 2 cm. The 3437 cm −1 (νOH), 1707 cm −1 (νCO), 1611 cm −1 (νassymCOO) and
measurements were performed in reflection set-up, with a conven- 1408 cm −1 (νsymCOO) are assigned to the carboxylic group. It is pos-
tional X-ray generator (CuKα radiation of 1.5418 Å and a graphite sible to observe that there are two small peaks at 2845 and 2924 cm −1
monochromator) coupled to a scintillation detector. The angular that can be are attributed to the νSH of the free thiol group of the MSA
748 M.M. Molina et al. / Materials Science and Engineering C 33 (2013) 746–751

Table 1
Particle size (diameter) and values of saturation magnetization of sample 1: NPs coated
with oleic acid and of sample 2: MSA-coated NPs obtained by XRD, TEM and VSM,
respectively. The uncertainties are displayed in parenthesis.

Sample DRX TEM VSM


(nm) (nm) σ (emu/g)

1 12.4 (0.6) 12.3 72.6 (0.5)


2 12.7 (0.5) 14.4 71.6 (0.5)

(Fig. 3A and C) reveals in some particles a dark-core light-shell type


of contrast. Such a kind of contrast may be related to differences in
the mean atomic number of the material in these two regions,
suggesting that the nanoparticles are formed by a Fe-oxide shell
with an inner oxygen-poor core. This core–shell morphology is in
agreement with the formation of Fe3O4 during the synthesis [36].
The magnetization analysis, displayed in Fig. 4, was carried out
Fig. 1. FTIR spectrum of Fe3O4-MSA (molar ratio 1:40) nanoparticles in the 400–
4000 cm−1 range. The bands at 3437 (2924 and 2845), 1707, 1611, 1408 and through isothermal magnetic measurements in an applied field at
580 cm−1 are associated with the νOH, νSH, ν(CO), νasym(COO), νsym(COO) and room temperature. The hysteresis loops show MNP superparamagnetic
Fe–O–Fe vibrations, respectively [33]. behavior. Values of saturation magnetization around 72 emu/g were
found (Table 1), compatible with that found for Fe3O4 magnetite [37],
in spite of the ligand exchange from sample 1 to sample 2.
ligand [34]. Furthermore, the absence of bands between 400 and Therefore, the combined results obtained by VSM, FTIR, DRX and
500 cm −1 indicates that there was no dimerization of thiol groups TEM give support to conclude that the ligand exchange produced crys-
(S-S) during the preparation procedures. talline SH-NPs with narrow size distribution and superparamagnetic
Fig. 2 shows the X-ray diffractograms from two synthesized behavior at room temperature.
samples: MNPs coated with oleic acid (sample 1) followed by MSA In the present study, thiol groups present on the nanoparticle
exchange at molar ratio 1:40 (sample 2), respectively, along with surface (SH-NPs) were nitrosated by the addition of sodium nitrite in
their characterization as the inverted spinel structure [35]. The diffrac- acidified solution, leading to the formation of SNO-NPs (Scheme 1). In
tion measurements demonstrated that the crystallographic structure acidified aqueous solution, nitrite (NO2−) is in equilibrium with nitrous
of MNPs corresponds to magnetite (Fe3O4) (JCPDS 20–596). Crystallite acid (HNO2), according to Eq. (1):
sizes from 10 to 12 nm (Table 1) were obtained from Scherrer's equa-
 þ
tion [30] by taking into account the (311) Bragg's reflection. NO2 ðaqÞ þ H ðaqÞ⇄HNO2 ðaqÞ ð1Þ
The morphologies and size distribution of the NPs were analyzed
by transmission electron microscopy. Fig. 3A shows a representative Thus, nitrous acid is considered the nitrosating agent of SH groups
image from sample 1. As can be observed, NPs are well defined with leading to the formation of SNO groups [38].
spherical contours, although they clearly present aggregation. The The yield of the S-nitrosation reaction can be controlled by adjusting
analysis of the size histogram displayed in Fig. 3B reveals a broad the molar ratio of available –SH groups to HONO (Scheme 1). Both –SNO
distribution with a mean dimension of 12 nm and polydispersity and the remaining free –SH groups exposed on the surface of the MNPs
of 20%. On the other hand, the replacement of oleic acid by MSA will confer them hydrophilicity, assuring their stability in aqueous sus-
favors MNP dispersion (Fig. 3C, sample 2). The size histogram (Fig. 3D) pension, as desired for future applications.
shows that the NP average size increases from 12 to 14 nm; however, Fig. 5 shows representative chemiluminescence data for injections
the polydispersity decreases to 8%. of (i) 100 μL of aqueous non-nitrosated MSA-coated magnetic
Analysis of the size distribution histograms (Fig. 3B and D) indi- nanoparticles (SH-NPs) and (ii) 100 μL of aqueous sodium nitrite, as
cates that ligand exchange favors the stabilization of larger particles. control samples. The arrows in Fig. 5 indicate the injections. As
A careful observation of the contrast of the MNPs in the TEM images expected, no signals of NO were detected for the control samples.
Peaks (iii) and (iv) correspond to injections of 100 and 10 μL, respec-
tively, of aqueous SNO-NPs. Peaks (iii) and (iv) correspond to the
total NO released from SNO-MNPs. The presence of intense peaks
can be observed for the SNO-NPs samples and the intensity of NO
detection was found to be higher for the injection of 100 μL of
SNO-NPs samples (peak (iii)), compared to the injection of only
10 μL of the same sample (peak (iv)). These results show that
SH-NPs were readily nitrosated by the addition of sodium nitrite at
low pH (Scheme 1).
It was found that the amount of NO released from the particle sur-
face of aqueous suspension of 3.8 mg of SNO-NPs was 160 μmol L −1
as assayed by chemiluminescence. This result showed that NO
was successfully bound to the MSA-coated MNPs, leading to a new
platform for NO delivery system, with great potential to be used in
several NO-based biomedical applications. Particularly, the amount
of NO released (μmol L −1) might be used to promote wound healing
in vivo, as previously reported [39].
Fig. 2. X-ray powder diffraction from samples coated with oleic acid (sample 1)
Concerning the NO release profile over time, Fig. 6 shows the
and with MSA (sample 2) displaying the Bragg peak reflections of magnetite. The total NO released from SNO-NPs after 1.0, 2.3, 4.2 and 6.7 h at 25 °C
diffractograms are displaced for better visualization. in the dark, measured by chemiluminescence. One can observe that
M.M. Molina et al. / Materials Science and Engineering C 33 (2013) 746–751 749

Fig. 3. (A) TEM image of sample 1: NPs covered with oleic acid. (B) Corresponding size histogram of sample 1. Size: 12 nm; polydispersity: 20%. (C) TEM image of sample 2:
MSA-coated NPs. (D) Corresponding size histogram of sample 2. Size: 14 nm; polydispersity: 8%. The scale bar corresponds to 100 nm for all images.

this new material is able to spontaneously release NO in aqueous The decomposition products after the NO release from the NP-SNO
suspension, in the dark, and at room temperature, for several hours. are dimmers of the mercaptosuccinic acid bound by a sulfur bridge,
As previously reported for low molar mass S-nitrosothiols (RSNOs), according to the reactions:
such as S-nitrosoglutathione (GSNO), the S-NO groups undergo ho-
• •
molytic bond cleavage with free NO release [40]. NP−MSA−SNO→NP−MSA−S þ NO ð2Þ

• •
NP−MSA−S þ NP−MSA−S →NP−MSA−S−S−MSA−NP ð3Þ

where NP-MSA-SNO represent the S-nitroso mercaptosuccinic acid


molecules adsorbed on the NPs surface, NP-MSA-S • represents the

Scheme 1. (Left panel) S-nitrosation of MSA-coated magnetic nanoparticles (SH-NPs)


Fig. 4. Magnetization curves at room temperature for sample 1: NPs coated with oleic by nitrous acid (HNO2), generated from acidified aqueous sodium nitrite, leading to
acid and sample 2: MSA-coated NPs. the formation of (right panel) S-nitrosated nanoparticles (SNO-NPs).
750 M.M. Molina et al. / Materials Science and Engineering C 33 (2013) 746–751

nanoparticles. This tool can be used to increase local NO delivery from


the nanoparticle directly to the target site of application.

4. Conclusion

This work describes the preparation and characterization of MNPs


as new NO-delivery platform. Firstly, NPs were prepared through
the co-precipitation method, and coated with (MSA), leading to the
formation of a stable aqueous dispersion of thiolated nanoparticles
(SH-NPs). The free thiol (SH) groups of MSA ligand were used as
sites to covalently bind NO. SH-NPs were S-nitrosated leading to the
formation of SNO-NPs, which acted as NO donors in aqueous solution.
This new NO-releasing nanomaterial might find important bio-
medical applications, since due to the importance of NO in vivo, vehi-
cles that act as NO carriers and donors are extremely attractive for
diverse pharmacological applications [45,46]. Toxicological evalua-
Fig. 5. Representative chemiluminescence data for NO release from S-NO groups
present on the surface of NPs. The arrows indicate the following injections: (i) 100 μL tions of NO-releasing MNPs are currently in progress.
of aqueous solution of non-nitrosated MSA-coated magnetic nanoparticles (SH-NPs);
(ii) 100 μL of aqueous solution of sodium nitrite; (iii) and (iv) 100 and 10 μL, respec- Acknowledgements
tively, of aqueous suspension of SNO-NPs.

The authors acknowledge the financial support of FAPESP (proc.


thiyl radical formed after the homolitic S-N bond cleavage, and nr. 2001/10125-0) and CNPq (proc. nr. 310209/2010 and 309390/
NP-MSA-S-S-MSA-NP the resulting dimmers which are expected to 2011-7). Thanks are also due to Elisa Ferreira for her assistance with
remain adsorbed on the NPs surface. Although desorption of the the NOA, Dr. Mauricio S. Baptista (IQUSP) for the use of laboratory
dimmers from the NPs surface cannot be excluded, it is unlikely that facilities, Dr. Antonio Domingues (IFUSP) for the VSM measurements
this will happen in significant extent, considering that the strong Simone Ferreira and Pedro K. Kiyohara for technical assistance with
adsorption established between the carboxyl groups of the dimmer TEM measurements and Prof. Carol Hollingworth Collins for assis-
and the hydrated iron oxide surface remain unchanged. tance in revising the manuscript. R. Itri, A.B. Seabra and M.G. Oliveira
This NO release profile might find biomedical applications, which acknowledge CNPq research fellowships. P.S. Haddad acknowledges
require a NO flux released locally over a range of hours. For example, FAPESP research fellowship. M.M. Molina is a recipient of a Capes
by adjusting the dose of NO release, this material might be used to fellowship.
accelerate/promote wound healing or to coat blood-contact medical
devices to inhibit platelet adhesion and thrombus formation [41]. In References
both cases, a sustained NO release directly to the site of application
is desired, for a time frame of hours. In addition, due to the versatile [1] L.J. Ignarro, Nitric Oxide, Biology and Pathobiology, Academic Press, San Diego,
CA, 2000.
chemistry of S-NO groups, it is possible to modulate the rates of NO [2] F.S. Dioguardi, J. Nutrigenet. Nutrigenomics 4 (2011) 90–98.
release from SNO-NPs in order to adjust it to a particular biomedical [3] A.B. Seabra, N. Duran, J. Math. Chem. 20 (2010) 1624–1637.
application. For instance, the rates of NO release can be greatly acceler- [4] Y. Matsumura, Jpn. J. Clin. Oncol. 38 (2008) 793–802.
[5] H.M. Aliabadi, M. Shahin, D.R. Brocks, A. Lavasanifiar, Clin. Pharmacokinet. 47
ated by stimulation of the materials with visible light [40]. Therefore, (2008) 619–634.
this new material acts as a new vehicle to carry NO, it may load high [6] M. Yokoyama, J. Artif. Organs 8 (2011) 238–244.
amounts of NO, and deliver it in a sustained manner for several hours. [7] K.E. Uhrich, S.M. Cannizzaro, R.S. Langer, K.M. Shakesheff, Chem. Rev. 99 (1999)
3181–3198.
Although this is the first work based on the preparation of
[8] E. Soussan, S. Cassel, M. Blanzat, I. Rico-Lattes, Angew. Chem. Int. Ed. 48 (2009)
NO-releasing iron oxide magnetic nanoparticles, the NO release profile 274–288.
from this new material is in accordance with other NO-releasing [9] E. Gullotti, Y. Yeo, Mol. Pharm. 6 (2009) 1041–1051.
[10] R. Singh, J.W. Lillard, Exp. Mol. Pathol. 86 (2009) 215–223.
nanomaterials based on –S-NO modified dendrimers, and NO-releasing
[11] P. Tartaj, M.P. Morales, S. Veintemillas-Verdaguer, T.G. Carreno, C.J. Serna, J. Phys.
silica nanoparticles, already reported in the literature [42–46]. One D: Appl. Phys. 36 (2003) R182–R197.
major advantage of this material is the superparamagnetic behavior of [12] D.L. Huber, Small 1 (2005) 482–501.
[13] B. Fang, S. Gon, M. Park, K.N. Kumar, V.M. Rotello, K. Nusslein, M.M. Santore,
Colloids Surf. B 87 (2011) 109–115.
[14] J.E. Rosen, F.X. Gu, Langmuir 27 (2011) 10507–10513.
[15] L.A. Thomas, L. Dekker, M. Kallumadil, P. Southern, M. Wilson, S.P. Nair, Q.A.
Pankhurst, I.P. Parkin, J. Mater. Chem. 19 (2009) 6529–6535.
[16] M. Jeun, S. Bae, A. Tomitaka, Y. Takemura, K.H. Park, S.H. Paek, K.W. Chung, Appl.
Phys. Lett. 95 (2009) 2501–2503.
[17] T.K. Nguyen, L. Thanha, A.W. Greena, Nano Today 5 (2010) 213–230.
[18] P.S. Haddad, A.B. Seabra, in: A.I. Martinez (Ed.), Iron Oxides: Structure, Properties
and Applications, Nova Science Publishers, 2012.
[19] C.P. Bean, I.S. Jacobis, J. Appl. Phys. 30 (1956) 1448–1452.
[20] B.D. Cullity, C.D. Graham, Introduction to magnetic materials, 1st ed., Addison-Wesley
Publishing Company Inc., 1972.
[21] M.P. Morales, S. Veintemillas-Verdaguer, M.I. Montero, C.J. Serna, A. Roig, L. Casas,
B. Martinez, F. Sandiumenge, Chem. Mater. 11 (1999) 3058–3064.
[22] X. Batlle, A. Labarta, J. Phys. D: Appl. Phys. 35 (2002) R15–R42.
[23] D. Portet, B. Denizot, E. Rump, J.J. Lejeune, P. Jallet, J. Colloid Interface Sci. 238
(2001) 37–42.
[24] A. Petri-Fink, B. Steitz, A. Finka, J. Salaklang, H. Hofmann, Eur. J. Pharm. Biopharm.
68 (2008) 129–137.
[25] M. Mahmoudi, M.A. Shokrgozar, A. Simchi, M. Imani, A.S. Milani, P. Stroeve, H. Vali,
U.O. Hafeli, S. Bonakdar, J. Phys. Chem. C 113 (2009) 2322–2331.
[26] M. Mahmoudi, H. Hofmann, B. Rothen-Rutishauser, A. Petri-Fink, Chem. Rev. 112
Fig. 6. NO release profile from SNO-NPs in aqueous suspension, at 25 °C, in the dark for (2012) 2323–2338.
up to 6.7 h. [27] Y.-F. Li, C. Chen, Small 7 (2011) 2965–2980.
M.M. Molina et al. / Materials Science and Engineering C 33 (2013) 746–751 751

[28] M. Johannsen, U. Gneveckow, K. Taymoorian, B. Thiesen, N. Waldöfner, R. Scholz, [37] P.S. Haddad, E.L. Duarte, M.S. Baptista, G.F. Goya, C.A.P. Leite, R. Itri, Prog. Colloid
K. Jung, A. Jordan, P. Wust, S.A. Loening, Int. J. Hyperthermia 23 (2007) 315–323. Polym. Sci. 128 (2004) 232–238.
[29] Y.J. Cha, M.J. Kim, Y.H. Choa, J. Kim, B. Nam, J. Lee, D.H. Kim, K.H. Kim, IEEE Trans. [38] M.G. de Oliveira, S.M. Shishido, A.B. Seabra, N.H. Morgon, J. Phys. Chem. A 106
Magn. 46 (2010) 443–446. (2002) 8963–8970.
[30] H.P. Klug, L.E. Alexander, X-ray diffraction procedures for polycrystalline and [39] T.P. Amadeu, A.B. Seabra, M.G. de Oliveira, A.M.A. Costa, J. Surg. Res. 149 (2008)
amorphous materials, John Wiley & Sons, New York, 1974. 84–93.
[31] R.D. Rutledge, C.L. Warner, J.W. Pittman, R.S. Addleman, M. Engelhard, W. Chouyyok, [40] R. Mejías, S. Pérez-Yagüe, L. Gutiérrez, L.I. Cabrera, R. Spada, P. Acedo, C.J. Serna,
M.G. Warner, Langmuir 26 (2010) 12285–12292. F.J. Lázaro, A. Villanueva, M.P. Morales, D.F. Barber, Biomaterials 32 (2011)
[32] R.A. Niquist, R.O. Kagel, Infrared spectra of inorganic compounds (3800–45 cm−1), 2938–2952.
1st ed., Academic Press, New York, 1971. [41] A.B. Seabra, R. da Silva, G.F.P. de Souza, M.G. de Oliveira, Artif. Organs 32 (2008)
[33] F. Del Monte, M.P. Morales, D. Levy, A. Fernandez, M. Ocaña, A. Roig, E. Molins, 262–267.
K. O'Grady, C.J. Serna, Langmuir 13 (1997) 3627–3634. [42] J.H. Shin, S.K. Metzger, M.H. Schoenfisch, J. Am. Chem. Soc. 129 (2007) 4612–4619.
[34] S. Chawla, K. Jayanthi, Appl. Surf. Sci. 12 (2011) 3925–3927. [43] N.A. Stasko, M.H. Schoenfisch, J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 8265–8271.
[35] R. Itri, J. Depeyrot, F.A. Tourinho, M.H. Sousa, Eur. Phys. J. E 4 (2001) 201–208. [44] N.A. Stasko, T.H. Fischer, M.H. Schoenfisch, Biomacromolecules 9 (2008) 834–841.
[36] P.S. Haddad, T.R. Rocha, E.R. Souza, T.M. Martins, M. Knobel, D. Zanchet, J. Colloid [45] D.A. Riccio, M.H. Schoenfisch, Chem. Soc. Rev. 41 (2012) 3731–3741.
Interface Sci. 339 (2009) 344–350. [46] S. Sortino, Chem. Soc. Rev. 39 (2010) 2903–2913.
S38 Abstracts / Nitric Oxide 27 (2012) S2–S50

of proteins, specific immobilisation, and production of novel modi- P-80


fied proteins for pathophysiology in diseases involving oxidative
dysfunction [2]. Nitration in proteins is a physiologically relevant Regulation of the E3 ubiquitin ligase RNF25 by nitric oxide
process and the formation of 3-nitrotyrosine in vivo was first pro- Pamela C. Wille, Steven S. Gross
posed as an in vivo marker of the production of reactive nitrogen Weill Medical College of Cornell University, New York, NY, USA
species (RNS).
The electrosynthetic methodology was applied for the perfor- The ubiquitin–proteasome pathway regulates protein turnover in
mance of selectively nitration of hen egg white lysozyme (HEWL) normal homeostasis and directs damaged proteins for degradation
at tyrosines 20 and 23. We performed the electrosynthesis of the by the 26S proteasome. Proteasomal degradation is a highly regulated
mononitration at Tyr23 and bisnitration at Tyr20 and Tyr23. Unmod- process, initiated by the conjugation of a series of ubiquitin moieties to
ified, mononitrated and bisnitrated lysozymes were used to study lysine residues in proteins forming a polyubiquitin chain that is recog-
the role of nitration on the structure and thermostability in phos- nized by the proteasome. Aberrant ubiquitination of proteins has been
phate buffer conditions at pH 7.0. On one hand, we followed the observed in a variety of diseases, including cardiovascular, neurode-
change in structure of lysozymes by high field nuclear magnetic res- generative and hematopoietic disease. Nitric oxide (NO) has been
onance (NMR) and circular dichroism (CD) spectroscopies. On the shown to both positively and negatively alter the stability of several
other hand, variations on the thermal stability were followed by proteins, enhancing degradation of some, while preventing the degra-
CD and dynamic light scattering (DLLS). Finally, we performed lytic dation of others. We hypothesize that modulation the activity of E3
activities and computational molecular dynamics studies for com- ubiquitin ligases, changing the pool of proteins that are targeted for
parison to our experimental data. proteasomal degradation, constitutes a generic mechanism whereby
NO modulates cell functions. Using a proteomic approach, we identi-
References fied and characterized proteins whose ubiquitination is altered by NO
donors in HEK cells. Immunopurification of polyubiquitinated pro-
[1] Walton DJ, Heptinstall. J. Prep. Biochem. Biotechnol. 2000;30:1. teins followed by mass spectrometry identified the E3 ubiquitin ligase,
[2] Turko IV, Murad F. Pharmacol. Rev. 2002;54:619. Ring Finger 25 (RNF25) protein, as a putative target of NO-regulated
ubiquitination. RNF25 protein was found to decrease, while RNF25
http://dx.doi.org/10.1016/j.niox.2012.04.136 ubiquitination increased with GSNO treatment, suggesting that NO
enhances RNF25 degradation. Notably, RNF25 contains 11 cysteine
residues that potentially serve as targets for NO-mediated S-nitrosy-
lation. Studies further revealed that RNF25 undergoes selective S-nit-
P-79
rosylation on Cys198 and/or Cys201 within the RING domain and
RNF25-mediated autoubiquitination is accelerated by low levels of
Nitric oxide (NO) releasing-superparamagnetic iron oxide nano- NO. Studies are in progress to identify protein targets of RNF25-med-
particles for biomedical applications iated ubiquitination and whose lifetimes are thus modulated by NO.
Amedea B. Seabra a, Paula S. Haddad a,b, Miguel M. Molina b,
Rosangela Itri b, Marcelo G. de Oliveira c http://dx.doi.org/10.1016/j.niox.2012.04.138
a
Universidade Federal de São Paulo, Diadema, Brazil,
b
Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil,
c
Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Brazil NO and immunology/inflammation
In this work, superparamagnetic iron oxide nanoparticles were
used a new strategy for nitric oxide (NO) releasing material aimed
P-81
on biomedical applications. Co-precipitation technique of ferric and
ferrous chlorides was used to synthesize magnetic nanoparticles.
Mercaptosuccin acid (MSA), a thiol-containing small molecule, was Array of gold ultramicroelectrodes for the simultaneous elec-
used to coat the nanocrystal surfaces, leading to the formation of trochemical detection of nitric oxide and peroxynitrite
water soluble thiolated nanoparticles. MSA-coating magnetic Fethi Bedioui a,b, Damien Quinton a,b, Sophie Griveau a,b,
nanoparticles were characterized by Fourier transform infrared Loan To Thi Kim a,b, Laurent Griscom c,d, Florence Razan c,d,
spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD) measurements and Virginie Escriou a,b
a
transmission electron microscopy (TEM). Thiolated iron oxide nano- CNRS UMR 8151, Paris, France,
b
particles were found to be superparamagnetic at room temperature. Chimie ParisTech, Paris, France,
c
NO was bound to the surface of magnetic nanoparticles through nitro- CNRS UMR 8029, Bruz, France,
d
sation of thiol groups, present on the surface of the nanoparticles, by ENS Cachan, Cachan, France
addition of acidified sodium nitrite aqueous solution. Formation of We report here on the design of assembled arrays of ultramicro-
nitrosated magnetic nanoparticles was confirmed by detecting free electrodes (UMEs) for the simultaneous and dynamic sensing of
NO released from nanoparticles by chemiluminescence technique. nitric oxide (NO) and peroxynitrite (ONOO–) released by cultured
These results showed that 160 mmolL 1 of NO can be released from cells.The arrayed microelectrodes were designed in such a way to
an aqueous solution of 3.8 mg of nitrosated MSA-magnetic nanopar- solve the sensitivity problem posed by the low concentrations of
ticles/mL of water. Real time NO detection of NO release from the target analytes: over 200 UMEs were short-circuited using pho-
magnetic nanoparticles indicates that visible light can be used as tolithographic techniques and divided into two sections. Our results
important tool to modulate the rates of NO from nitrosated-magnetic show that the short-circuited electrodes behave as typical UMEs
nanoparticles. Overall, the results show that these particles can be over our experimental timescale whilst showing enhanced sensitiv-
used as smart vehicle to carry and delivery NO in biomedical applica- ity. One section of arrayed UMEs was oriented toward the chemical
tions, since the nanoparticles might be guided to the target site under modification of the electrodes surfaces to obtain selective NO-sensor
a magnetic field to delivery NO direct to the desired target site. with the desired selectivity against interfering analytes. To do so, we
developed new combination of electropolymerisable membranes for
http://dx.doi.org/10.1016/j.niox.2012.04.137
the selective detection of NO, adapted to the arrayed configuration.
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Nitric oxide releasing iron oxide magnetic nanoparticles for biomedical applications: cell

viability, apoptosis and cell death evaluations

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2013 J. Phys.: Conf. Ser. 429 012034
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Nitric oxide releasing iron oxide magnetic nanoparticles for


biomedical applications: cell viability, apoptosis and cell death
evaluations

R de Lima1, JL de Oliveira1, A Ludescher2, MM Molina3, R Itri3, AB Seabra2 and


PS Haddad2*
1
Departamento de Biotecnologia, Universidade de Sorocaba, CEP 18023-000,
Sorocaba, S.P., Brazil
2
Departamento de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal de São Paulo,
Diadema, SP, Brazil
3
Instituto de Física, Universidade de São Paulo, CEP 05314-970, São Paulo, SP, Brazil

*E-mail: haddadps@gmail.com

Abstract. Nitric oxide (NO) is involved in several physiological and pathophysiological


processes, such as control of vascular tone and immune responses against microbes. Thus,
there is great interest in the development of NO-releasing materials to carry and deliver NO for
biomedical applications. Magnetic iron oxide nanoparticles have been used in important
pharmacological applications, including drug-delivery. In this work, magnetic iron oxide
nanoparticles were coated with thiol-containing hydrophilic ligands: mercaptosuccinic acid
(MSA) and dimercaptosuccinic acid (DMSA). Free thiol groups on the surface of MSA- or
DMSA- coated nanoparticles were nitrosated, leading to the formation of NO-releasing iron
oxide nanoparticles. The cytotoxicity of MSA- or DMSA-coated magnetic nanoparticles
(MNP) (thiolated nanoparticles) and nitrosated MSA- or nitrosated DMSA- coated MNPs (NO-
releasing nanoparticles) were evaluated towards human lymphocytes. The results showed that
MNP-MSA and MNP-DMSA have low cytotoxicity effects. On the other hand, NO-releasing
MNPs were found to increase apoptosis and cell death compared to free NO-nanoparticles.
Therefore, the cytotoxicity effects observed for NO-releasing MNPs may result in important
biomedical applications, such as the treatment of tumors cells.

1. Introduction

The increasing exploration of nanotechnology in biological and medical applications has led to
significant improvements in diagnosis, prevention, and treatment of diseases. Iron oxide magnetic
nanoparticles (MNPs) have been explored in biomedical applications such as drug delivery [1-3] and
therapy [4-6], since they are considered less toxic than their metallic counterparts. Moreover, MNPs
offer further advantages such as high saturation magnetization and superparamagnetic behaviour.
Among iron oxide MNPs, magnetite is a very promising choice due to its already proven
biocompatibility.
Co-precipitation of Fe2+ and Fe3+ ions under alkaline conditions has been routinely used for the
synthesis of magnetite nanoparticles (Fe3O4) [7], although more well-designed procedures involving

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high temperature decomposition of iron(0) or iron(III) precursors stabilized by surfactant molecules


have been reported [8]. The use of Fe2O3 and Fe3O4 nanoscale particles also includes drug targeting of
cancer cells, tracking target cells using labeling, and imaging techniques like magnetic resonance
tomography. In vivo studies with Fe3O4 nanoscale particles have demonstrated severe inflammatory
and toxicity responses in rats exposed to nanoscale particles through inhalation [9-10]. Other studies
have demonstrated that MNPs (Fe3O4) cause oxidative trauma to human bronchoalveolar epithelial
and murine neuronal cells leading to loss of cell viability, and causing a change in electrical activity
[11-12]. In contrast to these findings, other studies performed with microscale and nanoparticulate
Fe3O4 described them both to be nontoxic under in vitro test conditions in human small airway
epithelial and mouse fibroblast cells [13]. Therefore, it is of interest to observe the difference in the
bio-nano interaction between Fe3O4 nano- and microscale particles in human lung cells [14] in vitro
and to correlate the effect with their physicochemical properties.
Most studies under in vitro conditions consider the basic physicochemical characteristics of the
nanoscale particles, such as shape, size, and surface coating. However, recent studies have shown that
the surface of the nanoscale particles changes after interaction with the surrounding environment
through solvation, protein corona formation, and agglomeration [15-16]. The biomedical applicability
of MNPs is greatly improved by coating their surfaces with biocompatible ligands [17]. MNPs having
suitable surface characteristics have a great potential for in vitro and in vivo applications. The effects
of MNPs coated with biocompatible ligands containing functional groups such as COOH and SH as
well as different sizes of MNPs are critical determinants in toxicological studies [18]. In this context, a
good candidate to interact on the surface of these nanoparticles covered with biocompatible ligands is
the nitric oxide (NO) molecule.
NO is involved in several physiological and pathophysiological processes, such as the control of
vascular tone, the inhibition of platelet aggregation, and the immune response against microbes [19].
Thus, there is a great interest in the development of NO-releasing vehicles that are able to stabilize and
release NO locally direct to the target site, in diverse biomedical applications.
This work reports the synthesis of surface-modified MNPs as vehicles to carry and deliver NO
molecules and the evaluation of the cytotoxicity of these nanoparticles. MNPs, synthesised through the
co-precipitation technique [7], were functionalized with NO. To this end, MNPs were coated with two
thiol-containing ligands: mercaptosuccinic acid (MSA) and 2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA),
leading to the formation of stable aqueous dispersions of thiolated nanoparticles (SH-MNPs). Free
thiol (SH) groups were used as sites to covalently bind NO to the surface of MNPs. Cytotoxicity of
SH-MNPs and NO-releasing MNPs were evaluated towards human lymphocytes. The results show
that SH-MNPs were not cytotoxic. However, the presence of NO on the MNPs surface was
responsible to increase cell death, apoptosis and cytotoxic effects, in a concentration-dependence
manner. These results indicate that NO-releasing nanoparticles may result in important biomedical
applications, such as the treatment of tumors.

2. Methods

2.1 Synthesis of MNPs


MNPs were synthesized by using the co-precipitation method, as previously reported [20, 21]. In brief,
4.0 mL of FeCl3•6H2O and 1.0 mL of FeCl2•4H2O (molar ratio 2:1), prepared in 1.0 mol/L HCl, were
mixed and stirred while a volume of 50 mL of NH4OH (0.7 mol/L) was added as precipitator. At this
stage, the solution was centrifuged and the precipitate was decanted, followed by the addition of 6.0
mL of oleic acid. This mixture was then stirred for 20 minutes. The solution was centrifuged several
times and the new precipitate was washed several times with ethanol and acetone, leading to MNP
covered with oleic acid.

2
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2.2 Adsorption of thiolated ligands


Oleic acid coated-MNPs (~10.0 mg) were then dissolved in 1.0 mL of toluene while MSA or DMSA
(molar ratio Fe3O4:MSA or DMSA = 1:40) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO). The
solutions were mixed and vigorously stirred for 14 h producing a black powder that was isolated by
centrifugation. This procedure led to ligand exchange and, hence, to the formation of water stable
thiol-containing MNPs (SH-MNPs) [21].

2.3 Nitrosation of thiolated magnetic nanoparticles


Thiolated nanoparticles (SH-MNPs) were nitrosated leading to the formation of SNO-MNPs by adding
excess of sodium nitrite solution [21]. Excess of unreacted nitrite was removed from MNP suspension
by centrifugal ultrafiltration.

2.4 Cell description


For the analyses involving lymphocytes, the cells were separated from whole blood using Ficoll-
Paque™ PLUS medium (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). The blood was provided by donors
aged between 18 and 24 years (who freely signed terms of agreement forms) and the project was
approved by the Ethics Committee of the University of Sorocaba (protocol #008/08). Blood samples
were collected at a suitable location by a qualified professional, using disposable materials throughout
the procedure. The lymphocytes were placed in RPMI 1600 culture medium (Cultilab) containing 300
µg/mL of L-glutamine and 200 µg/mL of NaHC3, supplemented with 5% bovine fetal serum, 50
µg/mL of gentamicin sulfate (antibiotic), and 2 µg/mL of amphotericin B (antifungal). The culture was
kept at 37°C, under a humidified atmosphere containing 5% CO2.

2.5 Incubation of cells with MNPs


Human lymphocytes cells were incubated with: SH-MNPs (both MSA- and DMSA-coated MNPs) and
SNO-MNPs at nanoparticle concentrations (0.01; 0.05 and 0.1 mg/mL) for 1 h. In addition, the cells
were also incubated with the nanoparticle ligands, (free MSA or free DMSA) at the same
concentrations for 1 h. Negative and positive controls employed phosphate buffered saline (PBS) and
H2O2 (200 µmolol/L), respectively.

2.6 Tali analysis


Cell viability was measured using a Tali™ Apoptosis Kit consisting of Annexin V Alexa Fluor® 488
and Propidium Iodide (Invitrogen), and a Tali™ image-based cytometer, which enabled the numbers
of viable, apoptotic, and dead cells to be counted. The cells that had been treated with SH-MNPs (both
MSA- or DMSA-coated MNPs) and SNO-MNPs at nanoparticle concentrations (0.01; 0.05 and 0.1
mg/mL), nanoparticles were centrifuged and concentrated to 1 x 106 cells per mL. 100 µL aliquots of
sample were prepared according to the specifications of the kit, and the tests were performed in
triplicate.

3. Results and Discussion

3.1 Nitrosation of thiolated MNPs leading to nitrosated MNPs (SNO-MNPs)


Thiol groups on the surface of nanoparticles (SH-MNPs) were nitrosated by the addition of sodium
nitrite, leading to the formation of SNO-MNPs. Indeed, nitrous acid is considered the nitrosating agent
of SH groups leading to the formation of SNO groups [22]. Figure 1 shows schematically a
representation of the coating of MNPs with MSA or DMSA (a), and subsequent functionalization of
the nanoparticle surface with NO (b).

3
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(a)

(b)

Figure 1. a) Ligand exchange of MNPs with oleic acid leading to the formation of SH-MNPs (coated
either with MSA or DMSA; b) Functionalization of SH-MNPs with NO molecules [21].

3.2 Tali analysis – Cell viability


Overall, cell viability studies show that SH-MNPs were not toxic towards human fibroblasts (Figure
2). A detailed observation of the results indicates that MSA-MNPs can be considered to have slightly
higher cell viability, compared to DMSA-MNPs. These results are consistent with published work, in
which little cytotoxicity was observed upon incubation of fibroblasts with DMSA-MNPs [23]. In
addition, exposure of lymphocytes to free MSA or DMSA (used as MNPs ligands) showed no toxic
effects on cells. Although preliminary, these promising results indicate that thiolated MNPs (coated
with either MSA or DMSA) can be used as an inert vehicle in drug delivery aimed at biomedical
applications.
On the other hand, nitrosated nanoparticles (SNO-MNPs) decrease cell viability in comparison
with the thiolated MNPs, for all tested concentrations (Figure 2). Thus, NO-releasing MNPs can be
used to promote cytotoxicity.

3.3 Apoptosis and cell death

Figure 3 shows apoptosis and cell death upon incubation of human lymphocytes with thiolated MNPs
(MSA- or DMSA-MNPs) and nitrosated MNPs (NO-releasing MNPs). It can be observed that NO-
releasing MNPs caused higher apoptosis indices and cell death, compared with thiolated nanoparticles.
Moreover, for NO-releasing MNPs, apoptotic cells indices were found to be higher in comparison with
cell death. This preliminary result suggests that NO-releasing MNPs may have genotoxic effects on
cell, under the experimental conditions.

4
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Figure 2. Cell viability of human lymphocytes treated with thiolated MNPs (MSA-MNPs or DMSA-
MNPs), and NO-releasing MNPs (SNO-MSA-MNPs or SNO-DMSA-MNPs), at different
concentrations, as indicated in the Figure. Incubation time: 1 h. MNPs were also incubated with only
the ligands: MSA or DMSA, under the same experimental conditions.

Figure 3. Percentage of apoptosis and cell death of human lymphocytes incubated with: thiolated
MNPs coated with MSA (MSA-MNP) or DMSA (DMSA-MNP), nitrosated MNPs (SNO-MSA-MNP
and SNO-DMSA-MNP), at different concentrations, as indicated in the Figure. Incubation time: 1 h.
Cells were also incubated only with the ligands: MSA or DMSA, under the same experimental
conditions.

Taken together, the results show a low value of apoptosis and cell death upon exposure of
lymphocytes to MNPs. This result is in accordance with published work that reported a lower
susceptibility of lymphocytes in comparison with other cell types [16].

5
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On the other hand, these initial results show that NO-releasing MNPs increased cell apoptosis and
death.

4. Conclusions

This work describes the preparation of MNPs as a new NO-delivery platform. Firstly, NPs were
prepared through the co-precipitation method, and coated with thiol groups, leading to the formation
of a stable aqueous dispersion of thiolated nanoparticles (SH-MNPs). Free thiols groups on the MNPs
surfaces were used as sites to covalently bind NO. Toxicological evaluations of thiolated and NO-
releasing MNPs were investigated using human lymphocytes. The results showed that thiolated MNPs
(MSA- or DMSA-coated MNPs) were not cytotoxic, and did not cause apoptosis and cell death,
indicating that these nanoparticles can be safely used as drug delivery vehicles. On the other hand,
NO-releasing MNPs were found to cause toxic effects on cells, and to increase apoptosis and cell
death. In this regard, NO-releasing MNPs might be considered a promising approach to combat
tumors, since the nanoparticles can be guided to the target site through the application of an external
magnetic field, and release NO directly to the desired tissue/cell, where NO can have its cytotoxic
effect.

5. Acknowledgements

Supported from FAPESP, CNPq, CAPES, Brazilian Network in Nanotoxicology (MCT-CNPq). The
authors would like to thank Prof. Mauricio S. Baptista (IQ-USP) for the use of laboratory facilities and
Prof. Carol H. Collins for revising the manuscript.

6. References

[1] Yokoyama M 2011 J. Artif. Organs. 8, 238.


[2] Uhrich K E, Cannizzaro S M, Langer R S and Shakesheff K M 2011 Chem. Rev., 99, 3181.
[3] Nguyen T K, Thanha L and Greena, A W, Nano Today 2002, 5, 213.
[4] Fang B, Gon S, Park M, Kumar K N, Rotello V M, Nusslein K and Santore M M 2011 Colloids
and Surfaces B: Biointerfaces, 87, 109.
[5] Rosen J E and Gu F X 2011 Langmuir. 27, 10507.
[6] Pankhurst, Q A, Connolly J, Jones S K and Dobson J. 2004 J. Phys. D:Appl. Phys. 2003, 36, R167.
[7] Haddad P S, Duarte E L, Baptista M S, Goya G F, Leite, C A P and Itri R 2004 Progr. Colloid
Polym.Sci.,128, 232.
[8] Wang L, Ding W and Zhang F 2010 J. Nanosci. Nanotechnol. 10, 8617.
[9] Zhu M T, Feng W Y, Wang B, Wang T C, Gu Y Q, Wang M, Wang Y, Ouyang H, Zhao Y L and
Chai Z F 2008 Toxicology. 247, 102.
[10] Bhattacharya K, Davoren M, Boertz J, Schins R P, Hoffmann E and Dopp E 2009 Part. Fibre
Toxicol. 6, 17.
[12]Gramowski A, Flossdorf J, Bhattacharya K, Jonas L, Lantow M, Rahman Q, Schiffmann D, Weiss
D G and Dopp E 2010 Environ. Health Perspect. 118, 1363.
[13] Mahmoudi M, Simchi A, Milani A S and Stroeve P 2009 J. Colloid Interface Sci. 336, 510.
[14] Bhattacharya K, Hoffmann E, Schins R F P, Boertz J, Prantl E M, Alink G M, Byrne H J,
Kulbusch T A J, Rahman Q, Wiggers H, Schultz C and Dopp E 2012 Toxic. Sci. 126,173.
[15] Lynch I, Cedervall T, Lundqvist M, Cabaleiro-Lago C, Linse S and Dawson K A 2007 Adv.
Colloid Interface Sci., 134, 167.
[16] Nel A E, Madler L, Velegol D, Xia T, Hoek E M, Somasundaran P, Klaessig F, Castranova V and
Thompson M 2009 Nat. Mater. 8, 543.

6
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[17] Murray C B, Norris D J and Bawendi M G 1993 J. Am. Chem. Soc. 115, 8706.
[18] Hong S C, Lee J H, Lee J, Kim H Y, Park J Y, Cho J, Lee J, Han D H 2011 Int. J. Nanomed. 6,
3219.
[19] Seabra A B and Duran N 2010 J. Mat. Chem. 20, 1624.
[20] Cha Y J, Kim M J, Choa Y H, Kim J, Nam B, Lee J, Kim D H and Kim H 2010 IEEE Trans.
Magn.,46, 443.
[21] Molina M M, Seabra A B, de Oliveira MG, Itri R, Haddad PS. 2013 Mat. Sci. Engin. C. 33, 746.
[22] Kemp M, Go Y M and Jones D P 2008 Free Radic. Biol. Med. 44 921.
[23] Aufann M, Decome L, Rose J, Orsiere T, De Meo M, Briois V, Chaneac C, Olivi L, Berge J L,
Lefranc B, Botta A, Wiesner M R and Bottero J Y 2006 Environ. Sci. Technol. 40, 4367.

7
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Iron oxide nanoparticles show no toxicity in the comet assay in lymphocytes: A promising

vehicle as a nitric oxide releasing nanocarrier in biomedical applications

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Iron oxide nanoparticles show no toxicity in the comet assay in


lymphocytes: A promising vehicle as a nitric oxide releasing
nanocarrier in biomedical applications

R de Lima1, J L Oliveira1, P S K Murakami2, M A M Molina3, R Itri3, P Haddad2


and A B Seabra2*
1
Departamento de Biotecnologia, Universidade de Sorocaba, Rodovia Raposo Tavares
Km 92 , CEP 18023-000, Sorocaba, SP, Brazil
2
Departamento de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal de São Paulo, Rua
São Nicolau 210, CEP 09913-030, Diadema, SP, Brazil
3
Instituto de Física, Universidade de São Paulo, CP 66318, CEP 05314-970, SP, Brazil

*E-mail: amedea.seabra@unifesp.br

Abstract. This work reports the synthesis and toxicological evaluation of surface modified
magnetic iron oxide nanoparticles as vehicles to carry and deliver nitric oxide (NO). The
surface of the magnetic nanoparticles (MNPs) was coated with two thiol-containing
hydrophilic ligands: mercaptosuccinic acid (MSA) or dimercaptosuccinic acid (DMSA),
leading to thiolated MNPs. Free thiols groups on the surface of MSA- or DMSA-MNPs were
nitrosated leading to NO-releasing MNPs. The genotoxicity of thiolated-coated MNPs was
evaluated towards human lymphocyte cells by the comet assay. No genotoxicity was observed
due to exposure of human lymphocytes to MSA- or DMSA-MNPs, indicating that these
nanovectors can be used as inert vehicles in drug delivery, in biomedical applications. On the
other hand, NO-releasing MPNs showed genotoxicity and apoptotic activities towards human
lymphocyte cell cultures. These results indicate that NO-releasing MNPs may result in
important biomedical applications, such as the treatment of tumors, in which MNPs can be
guided to the target site through the application of an external magnetic field, and release NO
directly to the desired site of action.

1. Introduction
Nitric oxide (NO) is a key molecule involved in several important physiological processes, such as the
dilation of blood vessels, inhibition of platelet adhesion and aggregation, cell communication, wound
healing, immune responses, apoptosis and anti-cancer activities, among others [1]. NO is a gaseous
free-radical and one of the smallest endogenous molecules with the ability to function as a chemical
messenger, particularly in cells of the vascular endothelium and immune system. Medical and
scientific interest in NO has grown exponentially since 1992, when it was nominated “Molecule of the
Year” [2]. Its documented physiological impacts are ever expanding, and NO is now known as one of
the most important mediators of intra- and extracellular processes and is one of the major targets of the
pharmaceutical industry [3]. Administration of high doses of NO (micro and milli concentrations) are
known to play a key role in the immunological system and thus to initiate tumor regression [4].

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Although NO is used in many biomedical applications, its utility is limited by its short half-life
and instability during storage. As a free radical, in the biological medium, NO can ready react with
biomolecules, such as hemoglobin, leading to its inactivation. Therefore, there is great interest in the
development of NO-releasing drugs and matrices which are capable of stabilizing and releasing NO
locally, directly into different tissues and organs [5]. Among the nanostructured materials aimed at
drug delivery, magnetic nanoparticles (MNPs), in particular iron oxide nanoparticles, such as
magnetite (Fe3O4), are considered a promising material for biomedical applications [6]. Indeed, MNPs
have been used for targeted drug delivery to specific cells, tissues or organs, for enhancing magnetic
resonance imaging contrast and for hyperthermia treatments [7]. In drug delivery, iron oxide MNPs
can be easily transported in vivo to the desired site of action by application of an external electrical-
magnetic field. Magnetization disappears upon removal of the magnetic field, leading the iron oxide
MNPs to remain at the target site for a certain period [8].
However, in order to propose the use of MNPs in biomedical applications, such as vehicles for
drug delivery, it is mandatory to investigate the toxicological aspects of these nanomaterials. In this
context, nanomaterial safely, in particular nanogenotoxicology, is an increasing issue in the field of
nanotechnology [9,10]. Recent papers highlighted that many nanomaterials induce cytotoxicity and
oxidative stress. Conflicting data have been reported [9,10]. Therefore, there is great interest in the
characterization of possible toxic effects of nanomaterials, in particular MNPs, aimed for
pharmacological applications. In this context, this work reports the synthesis and evaluation of
genotoxicity of surface-modified MNPs, as vehicles to carry and deliver NO in biomedical
applications.

2. Methods

2.1. Synthesis of magnetic nanoparticles (MNPs)


A co-precipitation method was used to synthesize MNPs [11]. Briefly, 4.0 mL of FeCl3•6H2O solution
and 1.0 mL of FeCl2•4H2O solution (molar ratio 2:1) in 1.0 mol/L HCl were mixed and stirred, while a
volume of 50 mL of NH4OH (0.7 mol/L) was added as precipitator. The solution was centrifuged and
the precipitate was decanted, followed by the addition of 6.0 mL of oleic acid. This mixture was
stirred for 20 minutes. The solution was centrifuged several times and the new precipitate was washed
several times with ethanol and acetone, leading to MNPs covered with oleic acid.
Oleic acid coated-MNPs (~10.0 mg) were suspended in 1.0 mL of toluene while
mercaptosuccinic acid (MSA) or 2,3 dimercaptosuccinic acid (DMSA) (molar ratio Fe3O4:MSA or
DMSA = 1:40) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) in a second tube. The solutions were
mixed and vigorously stirred for 14 h producing a black powder that was isolated by centrifugation.
This procedure led to ligand exchange and, hence, to the formation of water stable thiol-containing
MNPs (SH-NPs).

2.2. Nitrosation of thiolated magnetic nanoparticles

The thiol groups (SH) on the surface of MSA- or DMSA-coated MNPs were nitrosated by sodium
nitrite (NaNO2) leading to the formation of S-nitroso-MNPs, which are spontaneous NO donors. In
this step, filtered MSA- or DMSA-MNPs were suspended in deionised water. A volume of 200 μL of
aqueous sodium nitrite (60 mmol/L) was added to the MNPs. After 15 min of incubation at room
temperature, the nanoparticle suspension was filtered by centrifugal ultrafiltration by using a Microcon
centrifugal filter device containing ultrafiltration membranes (MWCO 10-kDa molar mass cut-off
filter, Millipore, Billerica, MA, USA) and washed with deionised water to remove excess unreacted
nitrite.

2
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2.3. Cell description


For the analyses involving lymphocytes, the cells were separated from whole blood using Ficoll-
Paque™ PLUS medium (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). The blood was provided by donors
aged between 18 and 24 years (who freely signed terms of agreement forms) and the project was
approved by the Ethics Committee of the University of Sorocaba (protocol #008/08). Blood samples
were collected using disposable materials throughout the procedure. The lymphocytes were placed in
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1600 culture medium (Cultilab) containing 300 μg/mL of L-
glutamine and 200 μg/mL of NaHC3, supplemented with 5% bovine fetal serum, 50 μg/mL of
gentamicin sulfate (antibiotic) and 2 μg/mL of amphotericin B (antifungal). The culture was kept at
37°C, under a humidified atmosphere containing 5% CO2.

2.4. Incubation of human lymphocytes with MNPs


Human lymphocytes were incubated with MSA- or DMSA-MNPs (thiol-containing MNPs, as control
groups) and nitrosated-MSA (SNO-MSA) or nitrosated-DMSA (SNO-DMSA)- MNPs at the following
nanoparticle concentrations: 0.01; 0.1 and 0.5 mg/mL, for 1 and 24 h. Negative and positive controls
employed phosphate buffered saline (PBS) and H2O2 (200 μmolol/L), respectively.

2.5. Comet assay


Each treatment group involved 10 μL of lymphocytes in 110 μL of low melting point agarose (0.6%)
and the mixtures were placed onto microscope slides that had been pre-coated with normal melting
point agarose (1.5%). Coverslips were positioned over the materials, and the slides were placed in a
refrigerator for polymerization. After polymerization, the coverslips were removed, and the slides
were treated for 90 minutes with an ice-cold (4°C) lysis solution (2.5 mol/L NaCl, 0.1 mol/L
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 10 mmol/L tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), 1%
Triton X-100TM, pH 10). All groups were incubated in an electrophoresis buffer (0.3 mol/L NaOH, 1
m mol/L EDTA, pH 13) for 20 minutes, followed by electrophoresis for 20 minutes at 1.3 V/cm. After
electrophoresis, the slides were covered with a neutralizing solution (0.4 mol/L Tris, pH 7.5) for 5
min, washed three times with distilled water, and allowed to rest overnight at room temperature. Prior
to staining, the dry slides were left in a fixing solution (15% w/v trichloroacetic acid, 5% (w/v) zinc
sulfate, and 5% glycerol) for 10 minutes, and were further washed three times with distilled water.
After these procedures, the slides were allowed to rest at room temperature for 1.5 hours. They were
then rehydrated with distilled water and stained for approximately 15 minutes with silver staining
solution consisting of 34 mL of solution A (0.2% w/v ammonium nitrate, 0.2% w/v silver nitrate,
0.5% w/v tungstosilicic acid, 0.15% v/v formaldehyde, and 5% w/v sodium carbonate) and 66 mL of
solution B (5% sodium carbonate), followed by a bath in distilled water and a bath in stop solution.
Lastly, the slides were further washed with distilled water and allowed to dry at room temperature.
Staining using silver is analogous to fluorescence, where the positive charge of the silver enables it to
bind with DNA and DNA fragments, producing the characteristic color. Throughout the procedures
involving cellular material, both natural light and light from fluorescent lamps were avoided to prevent
possible influence on the results.
Analyses were performed using the Zeiss Axovert optical microscope and at least 100 cells were
counted on each slide, with 3 slides for each test (around 300 cells). The experiment was performed in
triplicate, giving a total of 900 cells analysed for each sample tested. The comet assay analyses were
performed by assigning a score of 0 to 4, according to the quantity of DNA in the tail, and the length
of the tail: Class 0 corresponded to intact cells, Class 1 corresponded to cells with minimal damage;
Class 2 to average damage; Class 3 to severe damage; and Class 4 to cells with maximum damage
[12]. For this visual method, the number of cells found for each score was multiplied by the value of
the score and the values were summed at the end of the analysis of each slide. Since the score
depended on the number of cells observed, an index of tail damage (TD) was created by dividing the
score given to the slide by the number of cells analysed on the slide.

3
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3. Results and Discussion

3.1. Synthesis of MSA- or DMSA-coated MNPs


Iron oxide MNPs comprised by Fe3O4 were coated with two thiol-containing hydrophilic ligands:
MSA or DMSA (Figure 1).

(i) (ii)

Figure 1. Chemical representation of MSA (i) and DMSA (ii) used as coating for MNPs.

Figure 2 represents schematically the nanoparticle preparation. The presence of thiol-containing


ligands (MSA or DMSA) on the nanoparticle surface is responsible to increase water-solubility of the
nanoparticles, to provide thermal stabilization, and to avoid nanoparticle aggregation, in addition, it
represents an important site for bioconjugation. Indeed, in this work, free thiols groups (SH) on the
nanoparticle surfaces were used to load NO to the nanoparticle.

Figure 2. Schematic representation of the synthesis of MSA- or DMSA-coated MNPs, leading to the
formation of thiol-containing nanoparticles.

3.2. Nitrosation of thiols groups on MSA- or DMSA-coated MNPs


Thiol groups on MSA- or DMSA-coated nanoparticles were nitrosated by the addition of sodium
nitrite, leading to the formation of S-nitroso-MNPs (SNO-MNPs) (Figure 3). In acidified aqueous
solution, nitrite (NO2-) is in equilibrium with nitrous acid (HNO2), which is considered the nitrosating
agent of -SH groups leading to the formation of -SNO [13]. SNO moieties act as spontaneous NO
donors, due to homolitic S-N bond cleavage, with free NO release [13], as represented in Figure 3.

4
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Figure 3. Schematic representation of nitrosation of thiols groups of MSA- or DMSA-MNPs upon


incubation with nitrite, leading to the formation of SNO-MNPs, which are spontaneous NO donors.

3.3. Genotoxicity of MNPs (Comet Assay)


The genotoxicities of thiolated and nitrosated MNPs toward human lymphocytes were evaluated by
comet assay that detects DNA single strand breaks, alkaline labile sites, and excision processes in
individual cells. Figure 4 shows the DNA damage (as expressed in % tail DNA content) due to
exposure of lymphocytes to MSA-MNPs (thiolated NPs) and SNO-MSA-MNPs (S-nitroso-MSA-
MNPs) for 1 and 24 h, at different nanoparticle concentrations (0.5; 0.1 and 0.01 mg/mL), as indicated
in the Figure. As can be observed, MSA-MNPs were found to be not genotoxic at all tested
concentrations, after 1 and 24 h of exposure to human lymphocytes (Figure 4). The values of tail DNA
were shown to be similar to the values obtained for the negative control, indicating the absence of
genotoxicity of these MNPs.
However, NO-releasing MNPs (SNO-MSA-MNPs) were found to be genotoxic, under the same
experimental conditions (Figure 4). The genotoxicity was higher after 24 h of cell exposition, in
comparison to 1 h of exposure, indicating a time-dependence toxicity of NO-releasing MNPs. No
concentration-dependence was observed for SNO-MSA-MNPs, since the values of DNA damage were
similar for all tested MNPs concentrations.
Figure 5 shows the DNA damage due exposure of lymphocytes to DMSA-MNPs (thiolated
NPs) and SNO-DMSA-MNPs (S-nitroso-DMSA-MNPs) for 1 and 24 h, at different nanoparticle
concentrations, as indicated in the Figure. MSA-MNPs exhibited low genotoxicity. Although, the
intensity of DNA damage was found to be discrete, a slight toxicity was observed for DMSA-MNPs at
all concentrations studied, after 1 and 24 h of exposition. By comparing the genotoxicity of MSA-
MNPs (Figure 4) with DMSA-MNPs (Figure 5) it can be noted that MSA-coated MNPs are less
genotoxic in comparison with DMSA-MNPs, although both nanpparticles can be considered not toxic
to cells.
On the other hand, the genotoxicity of SNO-DMSA-MNPs was higher related to DMSA-NPs.
As expected, the presence of NO on NP surface led to toxic effects. Moreover, the DNA damage
depended on the time of exposure, since 24 h of cell incubation with SNO-DMSA-MNPs resulted in a

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more intensive genotoxicity, compared with exposure of only 1 h. SNO-DMSA-MNPs at different


concentrations caused similar DNA damage (Figure 5).

Figure 4. Results of DNA tail damage obtained for human lymphocyte cells after treatments with:
MSA-MNP (MSA-coated magnetic nanoparticles) and SNO-MSA-MNP (S-nitrosated MSA-coated
magnetic nanopartilces) at concentrations 0.5, 0.1 and 0.01 mg/mL. Exposure time: 1 and 24 h, as
indicated in the Figure.

Uncoated iron oxide MNPs were found to have toxic effects towards cells [14]. However,
MNPs toxicity can be greatly reduced by coating their surface [14]. In this context, this report shows
that MSA- and DMSA-coated iron oxide MNPs are not genotoxic towards human lymphocytes. This
result can be understood by assuming that both MSA and DMSA (the later to a lesser extend) are
responsible to create a barrier for direct contact between the MNPs and the exposed cell, inhibiting
possible toxic effects. Therefore, MSA- or DMSA-coated MNPs offer a high potential in biomedical
applications, in particular, in drug delivery.
Both SNO-MSA-MNPs and SNO-DMSA-MNPs exhibited genotoxic effects on lymphocytes,
under the experimental conditions employed in this study. Indeed, NO can both promote and inhibit
cell damage, apoptosis, acting as anti- or pro- oxidant agents [1,4]. The biological roles of NO are
greatly influenced by its source of production, concentration and flux. In fact, large concentrations of
NO (i.e., micromolar) produce reactive nitrogen species, which along with reactive oxygen species
result in oxidative and nitrosative stress, leading to DNA base deamination, nitrosylation/nitrosation of
enzymes, impaired cellular function, enhanced inflammatory reactions, inhibited mitochondrial
respiration and cell apoptosis [1,4]. On the other hand, lower NO concentrations (i.e., nano to
picomolar) present anti-apoptotic effects, promote angiogenesis, wound healing and inhibition of
platelet adhesion [1,4]. The concentrations used in this present work (0.01 to 0.5 mg of SNO-
MNPs/mL) were high enough to promote genotoxic effects towards cells.
Based on the results reported here, NO-releasing MNPs might find important application against
tumor cell lines. Indeed, in cancer science, NO therapies have been tested against numerous healthy
and tumor cell lines, revealing that susceptibility depends on concentration, cell type, and the oxygen
environment surrounding the site of NO delivery [4]. Due to the ability to have genotoxic effects
against cells, SNO-MNPs can be used to carry and to delivery NO directly to the target site, since the
MNPs can be guided to tumors cells, upon application of an external magnetic field. These
nanoparticles would be able to release NO direct to cancer cells, where NO has its toxic effects. At the

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present moment, toxicological evaluations of NO-releasing MNPs towards tumors cell lines are under
progress.

Figure 5. Results of DNA tail damage obtained for human lymphocyte cells after treatments with:
DMSA-MNP (DMSA-coated magnetic nanoparticles) and SNO-DMSA-MNP (S-nitrosated DMSA-
coated magnetic nanopartilces) at concentrations 0.5, 0.1 and 0.01 mg/mL. Exposure time: 1 and 24 h,
as indicated in the Figure.

4. Conclusions

This work describes the genotoxicity of thiolated and nitrosated iron oxide MNPs. Thiol-coated MNPs
showed no genotoxicity towards human lymphocyte cells, while nitroso-MNPs were found to lead to
toxic effects on the cells, under the same experimental conditions. These results indicate the promising
use of MSA or DMSA for coating MNPs aimed for biomedical applications, such as drug delivery.
Moreover, due to the genotoxicity of SNO-MNPs, these nanoparticles might find important
applications in cancer treatment, since these nanomaterials could be employed to deliver high amounts
of NO directly to the target site of application, where NO can have its cytotoxic effects.

5. Acknowledgements

FAPESP, CNPq, CAPES, INOMAT (MCT/CNPq) and Brazilian Network in Nanotoxicology


(MCT/CNPq). The authors would like to thanks Prof. Mauricio S. Baptista (IQ-USP) for the use of
laboratory facilities and Prof. Carol H.Collins for revising the manuscript.

6. References
[1] Carpenter A W and Schoenfisch M H 2012 Chem. Soc. Rev. 41 3742
[2] Cullota E and Koshland Jr. 1992 Science 258 1861
[3] Serafim R A M, Primi M C, Trossini G H G and Ferreira E I 2012 Curr. Med. Chem. 19 386
[4] Choudhari S K, Sridharan G, Gadbail A and Poornima V 2012 Oral Oncol. 48 475
[5] Seabra A B and Duran N 2010 J. Mat. Chem. 20 1624
[6] Majewski P and Thierry B 2007 Crit. Rev. Solid State 32 203

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[7] Mahmoudi M, Sant S, Wang B, Laurent S, Sen T, Lord O T, Walter M J, Dasgupta R, Walker D
and Clark S M 2011 Adv. Drug Delivery Rev. 63 24
[8] Klostergaard J and Seeney CE 2012 Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 8 S37
[9] Li Y-F and Chen C 2011 Small 7 2965
[10] Mahmoudi M, Hofmann H, Rothen-Rutishauser R and Petri-Fink A 2012 Chem. Rev. 112 2323
[11] Cha Y J, Kim M J, Choa Y H, Kim J, Nam B, Lee J, Kim D H and Kim K 2010 HIEEE Trans.
Magn. 46 443
[12] Lima R ,Feitosa L, Maruyama C R Barga M A, Yamawaki P C, Vieira I J Teixeira E M,
Corrêa A C, Mattoso L H C and Fraceto L F 2012 Int. J. Nanomed. 7 3555
[13] Seabra A B, Martins D M, da Silva R, Simões M M S G, Brocchi M and de Oliveira MG 2010
Artif. Organs 34 E204
[14] Auffan M, Decome L, Rose J, Orsiere T, De Meo M, Briois V, Chaneac C, Olivi L, Le Franc J L
B, Botta A, Wiesner M and Bottero J Y 2006 Environ. Sci. Technol. 40 4367

8
Apêndice A
Propriedades Magnéticas

A.1 Consideração Semiclássica




Assumindo que o campo magnético externo é orientado na direção z, da forma: B =

B k.
b A energia magnética associada aos momentos magnéticos orientados em certo ângulo,

entre θ e θ + dθ , com respeito ao eixo z é dada por:



E = −→

µ ·B

sendo µ o momento magnético. A componente do momento magnético ao longo do eixo

z é:

µz = µCosθ

Considerando que o ângulo sólido seja:

dΩ = Senθ dθ dφ

Se o momento magnético apresenta a mesma probabilidade de se dirigir em qualquer

direção entre θ e θ + dθ ; esta probabilidade está denida pelo razão entre o ângulo sólido

subtendido na direção θ respecto ao campo magnético e o ângulo sólido em todo o espaço.

Matematicamente temos:

133
134 Propriedades Magnéticas

Figura A.1: Momento magnético µ na direção do ângulo sólido.

R 2π
dΩ
p(Ω) = R 2π0 R π (A.1)
0 0
dΩ

No numerador integramos a parte azimutal do ângulo sólido, pois devemos considerar

todas as possíveis direções do ângulo θ, entanto que no denominador o ângulo sólido é inte-

grado em todo o espaço. Fazendo as contas, resulta:

1
p(Ω) = Senθ dθ (A.2)
2

A probabiliadade que a uma temperatura T apresente a energia E = −µBCosθ, e dado

pelo fator de Boltzmann:

p(E) = e(−E/kB T ) = e(µBcosθ/kB T ) (A.3)


A.1. Consideração Semiclássica 135

Então, a probabilidade do momento magnético apresentar uma energia magnética E e

estar em uma direção entre θ e dθ é o produto das probabilidades anteriores (Equações A.2

e A.3), que resulta:

dω = p(Ω) × p(E) (A.4)

1 µBCosθ
dω = Senθ dθ × exp( ) (A.5)
2 kB T

O valor médio do momento magnético ao longo do campo é:

R
µz dω
< µz >= R (A.6)


0
µCosθeµCosθ/kB T 12 Senθdθ
Rπ (A.7)
0
eµCosθ/kB T 12 Senθdθ

Fazemos uma mudança de variável:

µB
x= e y = Cosθ (A.8)
kB T
Então:

dy = −Senθdθ

e:

Rπ R1
0
−→ −1

com o qual resulta:

R1
yexy dy
< µz >= µ R−11 (A.9)
−1
exy dy

temos:
136 Propriedades Magnéticas

exy dx = x1 exy
R

1 xy
R
yexy dx = x2
e (xy − 1)
Resultando:

< µz > ex + e−x 1


= x −x
− (A.10)
µ e −e x

< µz > 1
= coth x − (A.11)
µ x

< µz >
= L(x) (A.12)
µ

onde L(x) é a função de Langevin, se consideramos um campo magnético externo pequeno


ou altas temperaturas, i.e. x  1, podemos aproximar:

1 x
coth x = + + ϑ(x3 ) (A.13)
x 3

com o qual a função de Langevin é:

x
L(x) ≈ (A.14)
3
Finalmente, a expressão resultante do valor médio do momento magnético ao longo do

campo:

µ2 B
< µz >T = µL(x) = (A.15)
3kB T

e consequentemente a magnetização (Equação 1.6) é :

M = Ms L(x) (A.16)

com a magnetização de saturação:

Ms = nµ (A.17)
A.2. Consideração Quântica 137

A.2 Consideração Quântica


Considerando um sistema mecânico quântico e substituindo os momentos magnéticos

por espins mecânicos quânticos com momento angular J = 1/2. Sendo J (momento angular
total) com valor esperado J(J + 1). e possui dois valores permitidos para as componentes do
momento magnético no eixo z , mJ = ±1/2, é dizer, os espins estão alinhados paralelamente

o antiparalelamente respectivamente na direção do campo B. A energia é dada por:

E = gmJ µB B (A.18)

onde a g é razão giromagnética do elétron (g = 2) e mJ = ±1/2. O valor médio do

momento magnético a uma temperatura dada é:

P1/2 −gmJ µB B/kB T


mJ =−1/2 µB gmJ e
< µz >= P1/2 (A.19)
−gmJ µB B/kB T
mJ =−1/2 e

Iterando a somatoria:

−µB eµB B/kB T + µB e−µB B/kB T


< µz >= (A.20)
eµB B/kB T + e−µB B/kB T

µB B
< µz >= µB tanh( ) (A.21)
kB T

Se consideramos um campo magnético externo pequeno ou altas temperaturas, i.e.


µB B
kB T
 1, podemos aproximar:

µB B µB B
tanh( )≈ (A.22)
kB T kB T

Teriamos:

µB B
< µz >= µB (A.23)
kB T
Considerando o caso geral, quando J é um valor enteiro ou semienteiro, utilizaremos a

função de partição Z:
138 Propriedades Magnéticas

J
X J
X
Z= exp(mJ gµB B/kB T ) = exmJ (A.24)
mJ =−J mJ =−J

com:

gµB B
x= (A.25)
kB T

valor médio para o número quântico do momento angular total:

mJ exmJ
P
< mJ >= P xm (A.26)
e J

A derivada parcial da função de partição Z (Equação A.24) é:

∂Z
= (−J)ex(−J) + (−J + 1)ex(−J+1) + ... + (J − 1)ex(J−1) + (J)exJ (A.27)
∂x

Então:

∂Z X
= mJ exmJ (A.28)
∂x

Da função de partição Z (Equação A.24) e de sua derivada parcial (Equação A.28) no

valor médio para o número quântico m(J) (Equação A.26), temos:

1 ∂Z
< mJ >= (A.29)
Z ∂x

A magnetização pode ser escrita como:

M = ngµB < mJ > (A.30)

da Equação A.29, temos:

ngµB ∂Z
M= (A.31)
Z ∂x
A.2. Consideração Quântica 139

ngµB ∂Z ∂B
M= (A.32)
Z ∂B ∂x
Mas:

∂ ln Z 1 ∂Z
= (A.33)
∂B Z ∂B
Da Equação A.25, temos:

∂B kB T
= (A.34)
∂x gµB

Então a magnetização é:

∂ ln Z ∂ ln Z ∂x
M = nkB T = nkB T (A.35)
∂B ∂x ∂B

Desenvolvendo a Equação A.24, temos:

Z = ex(−J) + ex(−J+1) + ... + ex(J−1) + ex(J) (A.36)

Do qual resulta:

e−xJ − ex(J+1)
Z= (A.37)
1 − ex

e−xJ − ex(J+1) e−x/2


Z= × −x/2 (A.38)
1 − ex e

1 1
ex(J+ 2 ) − ex(J+ 2 )
Z= (A.39)
e−x/2 − ex/2

A função de partição pode ser escrita como:

Senh(J + 12 )x
Z= (A.40)
Senh( x2 )
140 Propriedades Magnéticas

Aplicando o logaritmo à função de partição, temos:

1 x
ln Z = ln[Senh(J + )x] − ln[Senh( )] (A.41)
2 2

Derivando parcialmente com respeito a x:

∂ ln Z 1 cosh[(J + 12 )x] 1 cosh( x2 )


= (J + ) − (A.42)
∂x 2 senh[(J + 21 )x] 2 senh( x2 )

∂ ln Z 1 1 1 x
= (J + ) coth[(J + )x] − coth( ) (A.43)
∂x 2 2 2 2

da Equação A.25, temos:

∂x gµB
= (A.44)
∂B kB T

Das equações A.43 e A.44, a magnetização é:

1 1 1 x gµB
M = nkB T {(J + ) coth[(J + )x] − coth( )} × ( ) (A.45)
2 2 2 2 kB T

2J + 1 2J + 1 1 x
M = nµB gJ{( ) coth[( )x] − coth( )} (A.46)
2J 2 2J 2

Fnalmente:

M = Ms BJ (x) (A.47)

A magnetização de saturação Ms :

Ms = nµB gJ (A.48)
A.2. Consideração Quântica 141

A função de Brillouin BJ (x):

2J + 1 2J + 1 1 x
BJ (x) = ( ) coth[( )x] − coth( ) (A.49)
2J 2 2J 2