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COLETA, TRANSPORTE, RECEPÇÃO E PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA Prof. Samira Mantilla
COLETA, TRANSPORTE, RECEPÇÃO E
PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE
MICROBIOLÓGICA
Prof. Samira Mantilla
INTRODUÇÃO A coleta de amostras para avaliação de lotes de alimentos processados deve obedecer a
INTRODUÇÃO
A coleta de amostras para avaliação de lotes de alimentos
processados deve obedecer a planos de amostragem
A obtenção correta das amostras, seu transporte para o lab e
sua preparação são etapas fundamentais para o sucesso da
análise.
O número de unidades a serem coletadas para análise e os
critérios adotados para aprovação ou reprovação de um produto
definem um plano de amostragem.
INTRODUÇÃO Lote: uma quantidade de alimentos de mesma composição e características, produzida sob as mesmas
INTRODUÇÃO
Lote: uma quantidade de alimentos de mesma
composição e características, produzida sob as
mesmas condições.
Amostra de lote: um determinado número de
entidades individuais, escolhidas ao acaso, para
representar o lote.
Lote inteiro não pode ser analisado (perda
econômica)
INTRODUÇÃO Unidades de amostras são cada uma destas entidades individuais. Logo: uma amostra de lote
INTRODUÇÃO
Unidades de amostras são cada uma destas entidades
individuais.
Logo: uma amostra de lote é sempre composta de n unidades
de amostra e cada uma é analisada individualmente.
Qualquer conclusão à respeito do lote depende do conjunto de
resultados da análise das n unidades de amostra.
Unidade analítica: é a quantidade de alimento usada na análise
de uma unidade de amostra.
COLETA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 1- Coleta de alimentos em embalagens individuais Sempre que possível
COLETA DE AMOSTRAS PARA
ANÁLISE
1- Coleta de alimentos em
embalagens individuais
Sempre que possível na embalagem original, fechada
e intacta;
Se a embalagem unitária tiver uma quantidade de
alimentos 2 x menor do que a unidade analítica =
coletar várias embalagens
COLETA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 2- Coleta de alimentos em embalagens não individuais Transferir porções
COLETA DE AMOSTRAS PARA
ANÁLISE
2- Coleta de alimentos em
embalagens não individuais
Transferir porções representativas da
massa total para frascos ou sacos
estéreis, sob condições assépticas
COLETA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Critérios para seleção e preparação dos frascos de coleta: Com
COLETA DE AMOSTRAS PARA
ANÁLISE
Critérios para seleção e preparação
dos frascos de coleta:
Com tampas à prova de vazamentos
De material aprovado para contato com alimento e de
preferência pré-esterilizados
Tamanho adequado
COLETA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Lembre-se: 1 unidade de amostra deve conter no mínimo 2x
COLETA DE AMOSTRAS PARA
ANÁLISE
Lembre-se:
1 unidade de amostra deve conter no mínimo
2x a unidade analítica (3 a 4 x para
separação da contra-amostra)
200 g ou 300-500 mL são suficiente para a
maioria dos alimentos
COLETA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Um frasco de coleta não deve ser completamente preenchido Os
COLETA DE AMOSTRAS PARA
ANÁLISE
Um frasco de coleta não deve ser
completamente preenchido
Os frascos e utensílios devem ser
esterilizados (autoclave, estufa, vapor
fluente, flambagem em chama, imersão em
etanol 70%)
PROCEDIMENTOS PARA COLETA CUIDADOS ASSÉPTICOS – NÃO CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA!!!! Sempre misturar toda a massa
PROCEDIMENTOS PARA COLETA
CUIDADOS ASSÉPTICOS – NÃO
CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA!!!!
Sempre misturar toda a massa antes de coletar
Quando não for possível = porções de diferentes
partes do conteúdo
Ex: água de torneira
PROCEDIMENTOS PARA COLETA Para compor uma unidade de amostra com porções de diferentes pontos de
PROCEDIMENTOS PARA COLETA
Para compor uma
unidade de amostra
com porções de
diferentes pontos de
alimento em grandes
peças sólidas: usar
facas, pinças estéreis
para cortar pedaços
menores do alimento.
PROCEDIMENTOS PARA COLETA 3- Coleta de alimentos envolvidos em surtos de ETA: Tentar analisar o
PROCEDIMENTOS PARA COLETA
3- Coleta de alimentos envolvidos
em surtos de ETA:
Tentar analisar o mais cedo possível
Não adianta coleta amostras de alimentos
que tenham sofrido abuso de T°C ou
deteriorados
PROCEDIMENTOS PARA COLETA Se não houver sobras: coletar os vasilhames, amostras dos ingredientes, amostras de
PROCEDIMENTOS PARA COLETA
Se não houver sobras:
coletar os vasilhames,
amostras dos
ingredientes, amostras
de refeições similares
PROCEDIMENTOS PARA COLETA 4- Coleta de amostras de água Água clorada: neutralizar o cloro residual:
PROCEDIMENTOS PARA COLETA
4- Coleta de amostras de água
Água clorada: neutralizar o cloro
residual: 0,1 mL solução 10%
tiossulfato de sódio para cada 100 mL
de amostra.
INFORMAÇÕES QUE DEVEM ACOMPANHAR AS AMOSTRAS Tipo de amostra e processo usado na fabricação –
INFORMAÇÕES QUE DEVEM
ACOMPANHAR AS AMOSTRAS
Tipo de amostra e processo usado na fabricação –
lingüiça defumada
Fabricante, data fabricação, código do lote
Solicitante da análise
Data e local da coleta
Razão da análise
TRANSPORTE E ESTOQUE DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Regra geral: transportar e estocar amostras de alimentos
TRANSPORTE E ESTOQUE DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Regra geral: transportar e estocar amostras de
alimentos da mesma forma (comercialização).
Assim:
A- alimentos comercialmente estéreis em embalagens
herméticas = t°C ambiente, proteger t°C maiores que
45°C
B- alimentos com baixa atividade de água: t°C
ambiente e proteger umidade
TRANSPORTE E ESTOQUE DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE C- alimentos perecíveis refrigerados: refrigeração até o momento
TRANSPORTE E ESTOQUE DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
C- alimentos perecíveis refrigerados: refrigeração até o
momento da análise. Não ser congelado; tempo
máximo entre coleta e análise= 36 h.
D- alimentos perecíveis congelados: congelados;
temperatura de estocagem não > -10°C
E- transporte refrigerado de amostras perecíveis
resfriadas ou congeladas: cx isopor com gelo (por até
24-30h)
Se for prolongado = gelo seco
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE RECEPÇÃO Observar as condições da embalagem e do
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
RECEPÇÃO
Observar as condições da
embalagem e do transporte
Amostra com embalagem já
aberta (surtos): identificar o
fato no laudo final de análise
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Estocagem das amostras até a análise: Refrigeradas perecíveis:
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Estocagem das amostras até a análise:
Refrigeradas perecíveis: mantidas sob
refrigeração. (máximo até o dia seguinte)
Congeladas: mantidas no máximo a -18 °C
(máximo 7 dias)
Não perecíveis: estocadas em lugar fresco,
protegidas da umidade e da luz
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE PREPARAÇÃO Envolve duas etapas Retirada de unidade analítica
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
PREPARAÇÃO
Envolve duas etapas
Retirada de unidade analítica
(representativa)
Preparação das diluições decimais
seriadas
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Manutenção das amostras após a análise: Após a
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Manutenção das amostras após a análise:
Após a retirada das alíquotas para análise, as
amostras devem ser embaladas em sacos
plásticos de primeiro uso, identificadas e
mantidas congeladas X amostras estáveis em
temperatura ambiente.
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 1- Preparação de alimentos sólidos ou líquidos concentrados
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
1- Preparação de alimentos sólidos
ou líquidos concentrados
A- abertura da embalagem
B- retirada da unidade analítica: 25 g –
homogeneização com diluente
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Cuidados: Assépticos: câmara de fluxo laminar, instrumentos
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Cuidados:
Assépticos: câmara de fluxo laminar,
instrumentos estéreis
Alimentos congelados- sempre que possível
não descongelar
Análise de Salmonella (enriquecimento
prévio)= unidade analítica adicional
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE C- homogeneização e preparo da 1° diluição da
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
C- homogeneização e preparo da 1° diluição da
unidade analítica:
A homogeneização é precedida por uma
diluição inicial (10 -1 )= 25g + 225 mL
Diluente: água peptonada 0,1%; água salina
peptonada ou tampão fosfato pH 7,2
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE OBS: Salmonella: diluição inicial é feita no caldo
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
OBS: Salmonella: diluição inicial é feita no caldo de
enriquecimento
Homogeneização pode ser feita:
Agitação manual – 25 x
Alimentos sólidos em peça: trituração liquidificador
(8000 a 15000 rpm/1-2 mim) ou “stomacher”
Alimentos gordurosos: toucinho defumado = diluente
suplementado com Tween 80 ou Triton X-100
(emulsificação) – liquidificador bx rotação
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE O INTERVALO ENTRE A HOMOGENEIZAÇÃO DA UNIDADE ANALÍTICA
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
O INTERVALO ENTRE A
HOMOGENEIZAÇÃO DA UNIDADE
ANALÍTICA E A PREPARAÇÃO DAS
DILUIÇÕES POSTERIORES NÃO DEVE
ULTRAPASSAR 3 MINUTOS!!!
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE D- diluições seriadas da amostra homogeneizada Preparação da
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
D- diluições seriadas da amostra
homogeneizada
Preparação da 2° diluição
Usar o mesmo diluente (alimentos gordurosos
não adicionar Tween novamente)
Seleção do número das diluições
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Transferência de volumes entre as diluições: Pipetas diferentes
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Transferência de volumes entre as diluições:
Pipetas diferentes para cada diluição
Pipetas com capacidade no máximo 10 x superior
Agitar o tubo 25 x
Liberação do volume com a ponta da pipeta na
parede do tubo
Não flambar a pipeta
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 2- Preparação de amostras para análise pela técnica
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
2- Preparação de amostras para
análise pela técnica da lavagem
superficial ou pela técnica do
esfregaço de superfície
Alimentos cuja contaminação é
predominantemente superficial
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 2 a- Técnica da lavagem superficial Aplicação: carcaça
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
2 a- Técnica da lavagem superficial
Aplicação: carcaça aves, cortes de aves, cascas de
ovos
Procedimento: amostra para o fraco + diluente (1:1),
agitar vigorosamente 50 x
Salmonella: o diluente é a solução de enriquecimento e
este é usado para realização das outras análises
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Carcaça de aves: não se usa 1:1 e
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Carcaça de aves: não se usa 1:1 e sim 300 mL
do diluente independente do peso da carcaça
Cálculo dos resultados: expressos em UFC/g
ou NMP/g
Inicialmente calcular UFC/mL de água de
lavagem. Depois converter em UFC/g. Se a
diluição for 1:1 o resultado será o mesmo.
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE 2 b- Técnica do esfregaço de superfície Aplicação:
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
2 b- Técnica do esfregaço de
superfície
Aplicação: carcaças bov, suínos, aves, superfície
equipamentos
Procedimento: molde estéril delimitar área a ser
amostrada. Aplicar o “swab” com pressão.
No exame de superfícies secas: umedecer o “swab”
Técnica do esfregaço de superfície
Técnica do esfregaço de superfície
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Esfregaço de ½ carcaça de bovino e suínos:
RECEPÇÃO E PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS PARA ANÁLISE
Esfregaço de ½ carcaça de bovino e suínos:
Selecionar 5 pontos demarcados com moldes estéreis
de 10 cm 2 e aplicar o “swab”. Colocar o 5 “swab”num
frasco com 25 mL, vortex 2 min ou manual –análises
Carcaça aves: 5 pontos de 10 cm 2 (dorso, asas,
antecoxas e pescoço). Idem
MÉTODOS DE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS A avaliação de qualidade microbiológica de um produto fornece
MÉTODOS DE ANÁLISE
MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS
A avaliação de qualidade microbiológica de
um produto fornece informações que
permitem avaliá-lo quanto às condições de
processamento, armazenamento e
distribuição para o consumo, sua vida útil e
quanto ao risco à saúde coletiva.
MÉTODOS DE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS Plano de amostragem n= número unidades retiradas de um
MÉTODOS DE ANÁLISE
MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS
Plano de amostragem
n= número unidades retiradas de um único lote de
produto, analisadas independentemente
c= número total de unidades analisadas que podem
apresentar resultados superior ao limite m
m= limite inferior
M= limite superior
MÉTODOS DE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS Um alimento é considerado aceitável se o resultado for
MÉTODOS DE ANÁLISE
MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS
Um alimento é considerado aceitável se o
resultado for menor que m e inaceitável se
for maior que M.
Exemplo: M= 10 6 ; m= 10 5 ; n=5; c=3
Se uma unidade der resultados > 10 6 , o lote
deve ser rejeitado; ou se 4 ou + unidades
derem resultados > 10 5
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS 1- Contagem por plaqueamento • Plaqueamento de alíquotas do alimento
MÉTODOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
1- Contagem por plaqueamento
• Plaqueamento de alíquotas do alimento
homogeneizado e de suas diluições em meios de
cultura sólidos selecionados em função do
microrganismo a ser enumerado.
• Pode ser feito por: semeadura na superfície do meio
ou semeadura em profundidade.
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS As placas são incubadas, depois as colônias são enumeradas. Enumeração
MÉTODOS DE
CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
As placas são incubadas,
depois as colônias são
enumeradas.
Enumeração manualmente
ou com auxilio do contador
automático
É a metodologia mais usada
em laboratórios.
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS 2- Determinação do Número Mais Provável • Técnica dos tubos
MÉTODOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
2- Determinação do Número Mais
Provável
• Técnica dos tubos múltiplos
• Muito usada para estimar a contagem
de alguns tipos de microrganismos
(coliformes, Enterococcus)
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS O produto á submetido a pelo menos três diluições decimais
MÉTODOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
O produto á submetido a pelo menos três diluições
decimais seriadas
Alíquotas iguais de cada uma das diluições são
transferidas para tubos contendo meios específicos.
Os tubos são incubados e os tubos positivos são
identificados
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS A positividade pode ser indicada pela formação de gás e
MÉTODOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
A positividade pode ser indicada pela formação de
gás e turvação do meio
Pelo número de tubos positivos determina-se o NMP
por grama do produto, tendo como base a tabela
estatística.
Resultados imprecisos, permite apenas uma
estimativa do número de microrganismos presentes.
Referências Bibliográficas BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº
Referências Bibliográficas
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
Instrução Normativa Nº 62, DE 26 DE AGOSTO DE
2003.Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises
Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e
Água.
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos.
São Paulo: Editora Atheneu, 182 p., 2004.
SILVA, JUNQUEIRA, SILVEIRA. Manual de Métodos de Análise
Microbiológica de Alimentos. 2 ed. São Paulo: Livraria Varela,
317 p., 1997.