Fines estrictamente académicos.

Artículo free de Nature

Dynamics of antimicrobial resistance in intestinal Escherichia Coli from children in

community settings in South Asia and sub-Saharan Africa

Dinámica de la resistencia a los antimicrobianos en Escherichia Coli intestinal de niños

en entornos comunitarios en el sur de Asia y África subsahariana

The dynamics of antimicrobial resistance (AMR) in developing countries are poorly understood, especially in
community settings, due to a sparsity of data on AMR prevalence and genetics.
We used a combination of phenotyping, genomics and antimicrobial usage data to investigate patterns of AMR
amongst atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) strains isolated from children younger than five
years old in seven developing countries (four in sub-Saharan Africa and three in South Asia) over a three-year
period.
We detected high rates of AMR, with 65% of isolates displaying resistance to three or more drug classes.
Whole-genome sequencing revealed a diversity of known genetic mechanisms for AMR that accounted for >
95% of phenotypic resistance, with comparable rates amongst aEPEC strains associated with diarrhoea or
asymptomatic carriage.
Genetic determinants of AMR were associated with the geographic location of isolates, not E. coli lineage, and
AMR genes were frequently co-located, potentially enabling the acquisition of multi drug resistance in a single
step.
Comparison of AMR with antimicrobial usage data showed that the prevalence of resistance to fluoroquinolones
and third-generation cephalosporins was correlated with usage, which was higher in South Asia than in Africa.
This study provides much-needed insights into the frequency and mechanisms of AMR in intestinal E. coli in
children living in community settings in developing countries.

Conceptos y terminos a tener en cuenta:

● Patotipo en E.coli: ​Poblaciones de la misma especie que difieren por su capacidad

patogénica (Patotipo)

Según su patogénesis y las características epidemiológicas, este grupo de bacterias se

divide en 6 patotipos: E. coli enteropatógena (EPEC, por sus siglas en inglés
Enteropathogenic E.coli), productora de toxina shiga (STEC), enterotoxigénica
(ETEC), enteroinvasiva (EIEC), enteroagregativa (EAEC) y difusamente adherente
(DAEC). Un último patotipo, ​E. coli adherente invasor (ECAI) asociado a la
 enfermedad de Crohn. Los patotipos diarreagénicos de ​E. coli afectan a diferentes
grupos poblacionales

● LEE (Locus de borrado de enterocitos):

Una vez que E. Coli está adherida a los enterocitos, inyecta a la célula una serie de proteínas
mediante el sistema de secreción tipo III (SSTT) (​figura 1B​). La mayor parte de estas
proteínas está codificada en el cromosoma de EPEC, dentro de una isla de patogenicidad de
35 kb conocida como el locus de la eliminación del enterocito o LEE (​figura 2B​).​21-23

La isla de patogenicidad LEE está organizada en cinco operones policistrónicos (LEE​1 a

LEE​5​); estos operones forman tres dominios de virulencia que codifican a los siguientes
genes: a) los operones LEE​1​, LEE​2 y LEE​3 codifican los genes de las proteínas del SSTT, las
cuales forman un complejo de aguja (CA); b) en el LEE​4 los genes de las proteínas que se
secretan a través del SSTT las cuales se conocen de forma colectiva con el nombre de Esp
(proteínas secretadas por EPEC); y c) en LEE​5 están codificadas la adhesina bacteriana
intimina y su receptor, llamado Tir porque se transloca por la misma bacteria a través del
SSTT hacia el interior de la célula

● Isla de patogenicidad: ​es una fracción del ​ADN genómico de un ​microorganismo

patógeno que le faculta como ​virulento​. Suele estar contenido en ​plásmidos​, y su
origen es una ​transferencia horizontal de material genético. Suele albergar las
secuencias codificantes de ​adhesinas​, factores de evasión de las defensas del
hospedador, ​toxinas​, ​enzimas​ degradativas de componentes celulares, etc.
● Bundle-forming pilus IV: ​Se ​encuentra en la superficie de EPEC, es esencial para la
virulencia completa de las cepas típicas de EPEC. Las cepas típicas de EPEC se
adhieren a las células huésped en grupos, un fenómeno llamado adherencia localizada
(LA), que requiere un T4bP llamado pilus formador de haces (BFP)
● Grupos clonales: ​grupo de individuos genéticamente idénticos, que han crecido en un
determinado lugar, todos originados de un solo antepasado por reproducción no
sexual
● Global enteric multicenter: ​El GEMS ​es un estudio de casos y controles de 3 años,
prospectivo, estratificado por edad, de diarrea de moderada a severa en niños de 0 a
59 meses que residen en poblaciones censuradas en cuatro sitios en África y tres en
Asia. Reclutamos niños con diarrea de moderada a severa que buscaban atención en
los centros de salud junto con uno a tres niños de control comunitario emparejados
seleccionados al azar sin diarrea. De pacientes con diarrea y controles de moderados a
severos, obtuvimos datos clínicos y epidemiológicos, mediciones antropométricas y
una muestra fecal para identificar enteropatógenos al momento de la inscripción; Se
realizó una visita domiciliaria de seguimiento aproximadamente 60 días después para
determinar el estado vital, el resultado clínico y el crecimiento a intervalos.
● Análisis de secuencia de genoma completo: ​La secuenciación completa del genoma
(también conocida como WGS o secuenciación entera del genoma) es el proceso de
determinar la secuencia de ADN completa del genoma de un organismo en un
momento dado. En otras palabras, Whole Genome Sequencing es el mapeo del ADN
único
● Contigs:​es un conjunto de segmentos de ADN superpuestos que juntos representan
una ​región consenso de ADN . [1]
​ En proyectos de ​secuenciación ascendente , un
​ en proyectos de
contig se refiere a datos de secuencia superpuestos (lecturas); [2]
secuenciación de arriba hacia abajo , contig se refiere a los clones superpuestos que
forman un ​mapa físico del genoma que se utiliza para guiar la secuenciación y el
​ Contigs puede por lo tanto referirse tanto a la secuencia de ADN
ensamblaje . [3]
superpuesta como a segmentos físicos (fragmentos) superpuestos contenidos en
clones dependiendo del contexto.

Una secuencia contig es una secuencia continua (no contigua) resultante del
reensamblaje de los pequeños fragmentos de ADN generados por ​las estrategias de
secuenciación de abajo hacia arriba . Este significado de contig es consistente con la
definición original de ​Rodger Staden (1979). [5]
​ La estrategia de ​secuenciación de
ADN de abajo hacia arriba consiste en cortar el ADN genómico en muchos
fragmentos pequeños ("abajo"), secuenciar estos fragmentos, volver a ensamblarlos
en contigs y eventualmente todo el genoma ("arriba"). Debido a que la tecnología
actual permite la secuenciación directa de solo fragmentos de ADN relativamente
 cortos (300-1000 nucleótidos), el ADN genómico debe fragmentarse en pedazos
​ En proyectos de secuenciación ascendente,​El
pequeños antes de la secuenciación. [6]
ADN ​amplificado se corta al azar en fragmentos de tamaño apropiado para la
secuenciación. Las lecturas de secuencia posteriores, que son los datos que contienen
las secuencias de los fragmentos pequeños, se colocan en una base de datos. El
​ luego busca en esta base de datos pares de lecturas
software de ensamblaje [6]
superpuestas. El ensamblaje de las lecturas de dicho par (que incluye, por supuesto,
solo una copia de la secuencia idéntica) produce una lectura contigua más larga
(contig) del ADN secuenciado. Repitiendo este proceso muchas veces, al principio
con los pares cortos iniciales de lecturas, pero luego usando pares cada vez más largos
que son el resultado del ensamblaje anterior, se puede determinar la secuencia de
ADN de un cromosoma completo.

● IS 26: ​Las secuencias de inserción (IS) son la forma más simple de ADN móvil auto
movilizable que se encuentra en bacterias y arqueas. Se definen como que contienen
solo genes necesarios para su propia transposición

A medida que la secuenciación se hizo más factible y la participación de los IS en el

movimiento de los determinantes de la resistencia a los antibióticos se hizo más
evidente, en particular la importancia de dos IS que flanquean un gen de resistencia en
una estructura ampliamente conocida como un transposón de clase I o compuesto

Recientemente, se ha documentado una reacción adicional exclusiva de IS ​26 . Con el

fin de explicar la configuración de las regiones que contienen múltiples copias ​de IS
26 [ ​36 ], se examinó nuevamente el movimiento ​de IS ​26 y, además de la ruta
conocida de formación de cointegración de copia, se pueden formar cointegrados
utilizando un mecanismo conservador cuando ambas moléculas de ADN llevar una
copia de IS ​26 [ ​37-40 ]. Este novedoso mecanismo puede rescatar los productos
circulares de los eventos de eliminación replicativos para crear estructuras que se
parezcan a transposones [ ​38​], explicando el papel crítico que desempeñan los
miembros de esta familia en la configuración de la evolución de las bacterias
Gram-negativas y Gram-positivas, particularmente en el contexto de la difusión de
 muchos determinantes diferentes de resistencia a los antibióticos dentro y entre
especies bacterianas.

● Integrón clase I:

Un integrón es un elemento genético dinámico, que codifica para una integrasa con
actividad de recombinación sitio específica y acumula una combinación de genes
estructurales organizados como un operón. Estos elementos genéticos son
considerados sistemas de expresión, debido a que son capaces de integrar y expresar
genes denominados casetes, los cuales en su mayoría confieren resistencia a los
antimicrobianos

Los integrones son elementos genéticos conocidos por su papel en la adquisición y

expresión de genes que confieren resistencia a los antibióticos. Los integrones tienen
un gen integrasa (intI), un sitio de unión (attI), en el que se insertan genes de
resistencia individuales y una secuencia promotora (Pant), que permite la expresión de
genes de resistencia (genes asociados a cassette), que no tienen promotores.

Los integrones se han clasificado según la secuencia de su integrasa y los más

frecuentemente detectados en cepas clínicas aisladas pertenecen a la clase I. Los
integrones de clase I contienen la región 5'-CS seguida de casetes de genes en una
región variable y, finalmente, una región conservada conocido como 3'-CS que
contiene dos genes, el gen de resistencia a amonio cuaternario (qacEδI) y el gen de
resistencia a sulfonamida (sul1); ambos genes están fijos en esta estructura. En
consecuencia, la estructura de un integrón de Clase 1 sería IntI - attI [R1 + R2 + ...] -
qacEδ1 - sul1.

Los integrones probablemente no son móviles, pero a menudo se encuentran en

transposones dentro de plásmidos conjuntivos, lo que asegura su movilidad, como se

puede ver por su amplia difusión entre bacterias.

● Plásmido Salmonella pSRC26:
● Casetes de genes integrón: ​Los casetes genéticos son pequeños elementos móviles
que no pueden moverse por sí mismos. Incluyen un sitio específico que les permite
ser reconocidos por específicas de sitio de ​recombinasas llamados Inti ​integrasas . Las
integrasas están codificadas por elementos de recolección de cassette llamados
integrones . Los casetes generalmente se encuentran, solos o junto con otros casetes,
en una ubicación específica en un ​integrón que se encuentra al lado del gen que
codifica la ​integrasa IntI . Los casetes generalmente incluyen un solo gen o ​un marco
de lectura abierto​(ORF) y el sitio de recombinación pero puede contener dos genes.
Los casetes raramente incluyen un promotor, y los genes en los casetes dependen de
promotores externos para su expresión. Muchos genes de resistencia a los antibióticos
se encuentran en ​casetes de genes, ​pero la gran mayoría de los casetes contienen
genes con otras funciones u ORF cuya función es desconocida. Los casetes de genes
se encuentran en integrones ubicados en ​transposones y en los cromosomas de
muchas bacterias.

La organización de los ​casetes genéticos es muy compacta. Generalmente incluyen un

solo gen (o marco de lectura abierto) y un sitio de recombinación aguas abajo llamado
59-be (elemento de 59 bases) y cualquier gen puede, en teoría, ser parte de un casete.
Ocasionalmente, se encuentran dos marcos de lectura abiertos (ORF) en un solo
cassette.

● Bombas de eflujo: ​Las llamadas MDRs son bombas de transporte activo sintetizadas
a partir de una proteína precursora, presentes en todas las células (bacterianas,
hongos, células cancerígenas) 1​​ . Las MDR se encargan de impulsar protones y en una
reacción de intercambio molecular exportan al espacio extracelular gran variedad de
moléculas extrañas. Estas proteínas se sintetizan en todos los seres vivos, como
mecanismo de depuración o supervivencia al ataque de agentes o moléculas externas
que puedan representar un daño potencial a la célula
----------------------------------------------------------------------------------------------------

● Sistema VITEK​: El sistema VITEK (Laboratorio bioMérieux, Argentina) es un

sistema automatizado de identificación bacteriana y estudio de sensibilidad
antimicrobiana. La identificación de las bacterias se basa en la inoculación de una
suspensión de microorganismos en tarjetas con determinados paneles de reacciones
bioquímicas. La sensibilidad antimicrobiana se lleva a cabo en forma similar a través
de tarjetas que contienen diluciones estandarizadas de distintos antibióticos
correspondientes a los puntos de corte de sensibilidad establecidos por NCCLS

VITEK 2 es un sistema que utiliza tarjetas con reactivos colorimétricos, las que son
inoculadas con la suspensión de un cultivo puro microbiano y el perfil de desarrollo es
interpretado de forma automática. Las tarjetas reactivas tienen 64 pozos que
contienen, cada uno, un sustrato de prueba individual. Con estos sustratos se miden
varias actividades metabólicas como acidificación, alcalinización, hidrólisis
enzimáticas y desarrollo en presencia de sustancias inhibidoras. Las tarjetas están
selladas en ambos lados por una película clara que evita el contacto entre las
diferentes mezclas sustrato-microorganismo y a la vez permite la transmisión del
nivel de oxígeno apropiada. Cada tarjeta tiene un tubito de transferencia pre-insertado
para la inoculación. Estas tarjetas tienen códigos de barras que contienen información
sobre el tipo de producto, número de lote, fecha de caducidad y un identificador único
que puede ser ligado a la muestra ya sea antes o después de cargar la tarjeta al
sistema. Existen 4 tipos de tarjetas reactivas disponibles para la identificación de
diferentes clases de organismos: 1. GN – Bacilos Gram negativos fermentadores y no
fermentadores. 2. GP - Cocos y bacilos no formadores de esporas Gram positivos 3.
YST – Levaduras y organismos levaduriformes 4. BCL – Bacilos formadores de
esporas Gram positivos.
● Agar Macconkey: ​El agar MacConkey es un ​medio de cultivo ​selectivo y ​diferencial
para ​bacterias diseñado para aislar selectivamente ​bacilos ​Gram negativos y ​entéricos
(encontrados normalmente en el ​tracto intestinal​) y diferenciarlos sobre la base de la
fermentación de la ​lactosa​.1​​ ​ El ​cristal violeta y las ​sales biliares inhiben el crecimiento
de organismos ​grampositivos​, lo que permite la selección y el aislamiento de bacterias
gramnegativas. Las bacterias entéricas que tienen la habilidad de fermentar ​lactosa
pueden ser detectadas utilizando el ​carbohidrato lactosa y el ​indicador de pH ​rojo
neutro

Esta fórmula fue diseñada sabiendo que las sales biliares precipitan por acción de
ácidos y que determinados microorganismos entéricos fermentan la lactosa, mientras
que otros no presentan dicha capacidad. Posteriormente, este medio fue modificado
varias veces6,7. MacConkey Agar es sólo ligeramente selectivo, dado que la
concentración de sales biliares, que inhiben los microorganismos gram positivos, es
baja en comparación con otros medios de siembra en placa entéricos. Se recomienda
el uso de este medio con muestras clínicas que posiblemente contengan flora
microbiana mixta, tales como la orina y muchas otras más, dado que permite una
agrupación preliminar de Enterobacteriaceae y otros bacilos gram negativos en
fermentadores y no fermentadores de lactosa7-10. La fórmula de MacConkey II Agar
se diseñó para mejorar la inhibición de la proliferación de la especie Proteus, lograr
una mejor diferenciación de los organismos fermentadores y no fermentadores de
lactosa y alcanzar un crecimiento superior. En MacConkey II Agar, las peptonas
proporcionan los nutrientes. El cristal violeta inhibe las bacterias gram positivas, en
especial los enterococos y estafilococos. La diferenciación de los microorganismos
entéricos se logra mediante la combinación de lactosa y el indicador de pH rojo
neutro. Se producen colonias incoloras o de

● Placas de agar de caballo: es un tipo de medios de cultivo microbiológicos

enriquecido con sangre. Como se enriquece, permite el crecimiento de ciertas
bacterias exigentes, y permite i​ndicación de la actividad hemolítica en estos
cultivos bacterianos.
 ● agar Thayer-Martin: es un ​agar Mueller-Hinton con 5% de sangre de oveja de
chocolate y ​antibióticos . Se utiliza para cultivar y aislar principalmente las ​bacterias
patógenas de ​Neisseria , incluidas ​Neisseria gonorrhoeae y ​Neisseria meningitidis ,
ya que el medio inhibe el crecimiento de la mayoría de los otros microorganismos.
Cuando se cultiva ​Neisseria meningitidis , generalmente se comienza con un fluido
corporal normalmente estéril (sangre o LCR), por lo que se usa un ​agar de chocolate
puro . El agar Thayer-Martin se desarrolló inicialmente en 1964, con una formulación
mejorada publicada en 196​6.​[1] ​[2] ​[3]
● Unidades Macfarlane
● Mueller Hinton agar: ​El agar Mueller-Hinton es un ​medio de crecimiento
microbiológico que se usa comúnmente para ​las pruebas de ​sensibilidad a los
antibióticos . También se usa para aislar y mantener especies de ​Neisseria y
Moraxella​ .

Se usa más comúnmente para las pruebas de sensibilidad de rutina de

microorganismos no fastidiosos por la técnica de difusión de disco de Kirby-Bauer.

Por qué se usa MHA para las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos?

1. Es un medio no selectivo, no diferencial. Esto significa que casi todos los

organismos enchapados aquí crecerán.
2. Contiene almidón. Se sabe que el almidón absorbe las toxinas liberadas por las
bacterias, por lo que no pueden interferir con los ​antibióticos​ . También media
la tasa de difusión de los antibióticos a través del agar.
3. Es un agar suelto. Esto permite una mejor difusión de los antibióticos que la
mayoría de las otras placas. Una mejor difusión conduce a una zona de
inhibición más verdadera.
4. MHA muestra una reproducibilidad lote a lote aceptable para las pruebas de
susceptibilidad.
5. MHA es bajo en sulfonamida, trimetoprima e inhibidores de tetraciclina (es
decir, la concentración de inhibidores timidina y timina es baja en MHA).
 6. Tanto el ácido paraaminobenzoico (PABA) como el contenido de timina /
timidina en el agar Mueller Hinton se reducen al mínimo, lo que reduce
notablemente la inactivación de sulfonamidas y trimetoprima cuando los
medios se utilizan para probar la susceptibilidad de los aislamientos
bacterianos a estos antimicrobianos.
●
● Replicador de 32 pines

------

● SRT2: ​una ​herramienta basada en mapeo de lectura para la detección rápida y precisa
de genes, alelos y tipos de secuencia multilocus (MLST) a partir de datos de WGS.
Usando> 900 genomas de patógenos comunes, mostramos que SRST2 es altamente
preciso y supera los métodos basados ​en ensamblaje en términos de detección de
genes y asignación de alelos. Aquí hemos demostrado el uso de SRST2 para la
vigilancia del genoma microbiano en una variedad de entornos de salud pública y
hospitalarios. Ante las crecientes amenazas de resistencia a los antimicrobianos y la
virulencia emergente entre los patógenos bacterianos, SRST2 representa una
herramienta poderosa para extraer rápidamente información clínicamente útil de datos
sin procesar de WGS

SRST2 está diseñado para realizar dos tareas clave: (i) detectar la presencia de un gen
o locus, y (ii) determinar el alelo coincidente preciso o más cercano para ese locus,
entre un conjunto de posibles secuencias de alelos de referencia. El enfoque se ilustra
en la Figura 1. Se debe proporcionar una base de datos de secuencias de referencia en
formato fasta, en el que los encabezados de fasta indiquen tanto el locus (para que se
puedan comparar alelos del mismo locus) como un nombre único para cada alelo. En
el caso de los datos MLST, se proporciona una base de datos adicional de perfiles ST
como texto delimitado por tabuladores, que asigna ST a combinaciones únicas de
alelos. Los datos actuales de MLST (secuencias de alelos y definiciones de perfil),
adecuados para su uso con SRST2, se pueden descargar de pubmlst.org
automáticamente utilizando el script getmlst.py suministrado con SRST2. Otras bases
de datos de secuencias se pueden formatear fácilmente para usar con SRST2 usando
 los scripts provistos con el programa. Se puede analizar cualquier cantidad de bases
de datos de secuencias en una sola ejecución, lo que permite la tipificación simultánea
de MLST, genes de resistencia y genes de virulencia.

● Paquete R STATS

R es un entorno de software libre para computación estadística y gráficos, R es un

entorno y ​lenguaje de programación​ con un enfoque al ​análisis estadístico​.

● Replicón: ​Se conoce como replicón a la unidad de ​ADN en la cual ocurre un acto
individual de replicación. Cada replicón dispara solo una vez en cada ​ciclo celular​. El
replicón debe poseer los elementos de control necesarios para la replicación. Tiene un
origen en el cual se inicia la replicación y puede o no tener un sitio de terminación.
Las bacterias y arqueobacterias pueden contener información genética adicional en
forma de ​plásmidos​, cada plásmido representaría un replicón.

El genoma de E. Coli se replica de manera bidireccional desde un sitio único en el

locus oriC. Dos horquillas de replicación surgen del sitio oriC y se mueven alrededor
del genoma. El iniciador de la replicación es la proteína DnaA que se une a múltiples
regiones llamadas cajas DnaA en el sitio oriC. La dnaA es una proteína de unión a
ATP y su unión con el ADN se regula dependiendo si se une ATP, ADP o ningún
nucleótido.

Uno de los mecanismos por los cuales se controla la actividad del origen del replicón
es mediante la metilación del ADN. El oriC de la bacteria E. Coli contiene 11 copias
de la secuencia GATC/CTAG el cual es un blanco para metilación en la posición N6
de la adenina por la enzima Dam metilasa.

Antes de la replicación el sitio palindrómico se metila en las adeninas de cada hebra.

A través de la replicación se insertan las bases no modificadas a las hebras hijas. Esto
genera ADN hemimetilado en el cual se aprecia una hebra metilada y una hebra no
metilada. La habilidad de un plásmido dependiente de oriC de replicarse depende de
su estado de metilación. Si el plásmido se encuentra metilado, es sometido a una sola
 ronda de replicación lo que ocasiona que los productos hemimetilados se acumulen.
El sitio GATC/CTAG puede permanecer hemimetilado alrededor de 13 minutos.

​ es un ​algoritmo y
● BLAST:​( herramienta de búsqueda de alineación local básica ) [2]
un programa para comparar información ​primaria de secuencias biológicas, como las
secuencias de ​aminoácidos de ​proteínas o los ​nucleótidos de ​secuencias de ​ADN y / o
ARN . Una búsqueda BLAST permite a un investigador comparar una secuencia de
nucleótidos o proteína de sujeto (llamada consulta) con una biblioteca o ​base de ​datos
de secuencias, e identificar secuencias de biblioteca que se asemejan a la secuencia de
consulta por encima de un cierto umbral.
● Plásmido pCERC2 y pCERC1: ​pCERC1, que contiene estos genes de resistencia
fue recuperado y secuenciado. Se construyeron deleciones, y la región de replicación
pCERC1 se limitó a un segmento de 1 kb que porta genes para ARN que están
estrechamente relacionados con los ARN de iniciación de replicación ColE1. Los
ensayos de reacción en cadena de la polimerasa, desarrollados para detectar el grupo
de genes sul2-strA-strB en este contexto, identificaron un plásmido de resistencia a
estreptomicina y sulfonamida, pCERC2, idéntico a pCERC1 sin el casete dfrA14 en
dos E. Coli aislamientos. El análisis bioinformático reveló plásmidos similares a
pCERC1 y dos miembros más de esta familia. Uno, el probable progenitor, lleva solo
el gen sul2 adyacente al pequeño elemento móvil CR2. El otro tiene un grupo de
genes de resistencia variante que ha evolucionado a partir de pCERC2 mediante la
adquisición del determinante de resistencia a la tetraciclina tet (A). Se han detectado
pCERC1 y pCERC2 en muchos países, lo que indica una distribución global y
parecen haber estado circulando en bacterias Gram negativas durante más de 25 años.
El otro tiene un grupo de genes de resistencia variante que ha evolucionado a partir de
pCERC2 mediante la adquisición del determinante de resistencia a la tetraciclina tet
(A). Se han detectado pCERC1 y pCERC2 en muchos países, lo que indica una
distribución global y parece haber estado circulando en bacterias Gram negativas
durante más de 25 años. El otro tiene un grupo de genes de resistencia variante que ha
evolucionado a partir de pCERC2 mediante la adquisición del determinante de
 resistencia a la tetraciclina tet (A). Se han detectado pCERC1 y pCERC2 en muchos
países, lo que indica una distribución global y parece haber estado circulando en
bacterias Gram negativas durante más de 25 años.
● Unicycler:
La plataforma de secuenciación de ADN Illumina genera lecturas precisas pero cortas,
que pueden usarse para producir ensamblajes genómicos precisos pero fragmentados.
Las plataformas de secuenciación de ADN de Pacific Biosciences y Oxford Nanopore
Technologies generan lecturas largas que pueden producir ensamblajes genómicos
completos, pero la secuenciación es más costosa y propensa a errores. Existe un
interés significativo en combinar datos de estas tecnologías de secuenciación
complementarias para generar conjuntos "híbridos" más precisos. Sin embargo,
existen pocas herramientas que realmente aprovechen los beneficios de ambos tipos
de datos, a saber, la precisión de las lecturas cortas y el poder de resolución
estructural de las lecturas largas. Aquí presentamos Unicycler, una nueva herramienta
para ensamblar genomas bacterianos a partir de una combinación de lecturas cortas y
largas, que produce ensamblajes que son precisos, completos y rentables. Unicycler
 crea un gráfico de ensamblaje inicial a partir de lecturas cortas utilizando el
ensamblador de novo SPAdes y luego simplifica el gráfico utilizando información de
lecturas cortas y largas. Unicycler utiliza un nuevo alineador semi-global para alinear
lecturas largas al gráfico de ensamblaje. Las pruebas en lecturas sintéticas y reales
muestran que Unicycler puede ensamblar contigs más grandes con menos desarme
que otros ensambladores híbridos, incluso cuando la profundidad de lectura larga y la
precisión son bajas. Unicycler es de código abierto (GPLv3) y está disponible en
github.com/rrwick/Unicycler. Las pruebas en lecturas sintéticas y reales muestran que
Unicycler puede ensamblar contigs más grandes con menos ensamblajes que otros
ensambladores híbridos, incluso cuando la profundidad de lectura larga y la precisión
son bajas. Unicycler es de código abierto (GPLv3) y está disponible en
github.com/rrwick/Unicycler. Las pruebas en lecturas sintéticas y reales muestran que
Unicycler puede ensamblar contigs más grandes con menos desarme que otros
ensambladores híbridos, incluso cuando la profundidad de lectura larga y la precisión
son bajas.

● Prokka: una ​herramienta de software de línea de comandos para anotar

completamente un borrador de genoma bacteriano en aproximadamente 10 minutos en
una computadora de escritorio típica. Produce archivos de salida que cumplen con los
estándares para su posterior análisis o visualización en navegadores genómicos.
● BlaTEM: ​Las β-lactamasas TEM representan una de las familias de β-lactamasas
clínicamente más significativas. El primero en descubrirse en este grupo, TEM-1, se
considera de amplio espectro e hidroliza las cefalosporinas tempranas, además de
muchas penicilinas. TEM-1 se ha convertido en la β-lactamasa más comúnmente
encontrada y es ubicua entre las ​Enterobacteriaceae ( ​48 , ​49​) TEM-3 fue la primera
de las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), que tienen un espectro de sustrato
aumentado, incluidas las cefalosporinas de tercera generación, pero son susceptibles a
los inhibidores de la β-lactamasa como el ácido clavulánico. La mayoría de los tipos
TEM descubiertos posteriormente son BLEE. Sin embargo, algunas TEM
β-lactamasas son resistentes a los inhibidores, y ahora se están descubriendo tipos de
TEM que son resistentes a inhibidores y ESBL. Algunas mutaciones puntuales
 selectas, dentro de las aproximadamente 75 mutaciones que distinguen enzimas TEM
específicas, son responsables de estos fenotipos general

Resumen

La dinámica de la resistencia a los antimicrobianos (AMR) en los países en desarrollo es

poco conocida, especialmente en entornos comunitarios, debido a la escasez de datos sobre la
prevalencia y la genética de la AMR. Utilizamos una combinación de fenotipo, genómica y
datos de uso de antimicrobianos para investigar los patrones de AMR entre cepas de
Escherichia coli enteropatógenas atípicas (aEPEC), aisladas de niños menores de 5 años en 7
países en desarrollo (4 en África subsahariana y 3 en Asia meridional) durante un período de
3 años. Detectamos altas tasas de AMR, con el 65% de los aislamientos mostrando resistencia
a tres o más clases de drogas. La secuenciación del genoma completo reveló una diversidad
de mecanismos genéticos conocidos para AMR que representaron > 95% de la ​resistencia
fenotípica​, con tasas comparables entre las cepas aEPEC asociadas con diarrea o con una
presentación asintomática. ​Los determinantes genéticos de la ​AMR se asociaron con la
ubicación geográfica de los aislamientos​, no con el linaje de E. coli​, y los genes de la AMR
con frecuencia se ubicaron conjuntamente, lo que potencialmente permitió la adquisición de
resistencia a múltiples medicamentos en un solo paso. La comparación de la AMR con los
datos de uso de antimicrobianos mostró que la prevalencia de resistencia a las
fluoroquinolonas y las cefalosporinas de tercera generación se correlacionó con el uso, que
fue mayor en el sur de Asia que en África. ​Este estudio proporciona información muy
necesaria sobre la frecuencia y los mecanismos de la AMR en E. coli intestinal en niños
que viven en entornos comunitarios en países en desarrollo.

Información principal (Main)

Ciertos patotipos de ​Escherichia coli son causas importantes de diarrea en los niños,
especialmente en los países en desarrollo de África subsahariana y Asia meridional ​1 . La ​E.
coli intestinal también es una fuente importante y un reservorio de genes que codifican la
resistencia a los antimicrobianos (AMR). Un ​patotipo ​de ​E. coli intestinal , conocido como ​E.
coli enteropatógena atípica (aEPEC), se define por la presencia de la ​isla de patogenicidad
llamada locus de borrado de enterocitos (LEE)​, además de la ausencia de toxinas Shiga (que
denotan ​E. coli enterohemorrágica ) y “​bundle-forming pilus​” IV (Bfp)​(indicando EPEC
típico) ​2 . ​E. coli enteropatógena atípica causa una variedad de síntomas de la enfermedad
que van desde diarrea esporádica y persistente hasta una colonización asintomática ​1 , ​3 , ​4 ,
5 . ​Recientemente identificamos distintos linajes de aEPEC, incluidos 10 grupos clonales
comunes ​6​ .

Se ha informado de AMR en ​E. coli de varias especies animales, el medio ambiente y en

pacientes hospitalizados a nivel mundial ​7 , ​8 , ​9 , ​10 , ​11 , ​12 . Muchas cepas exhiben
resistencia a múltiples fármacos (MDR; resistencia a uno o más agentes en al menos 3
categorías antimicrobianas diferentes ​13 ). Las cepas resistentes a las fluoroquinolonas y / o
que producen β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) o carbapenemasas son motivo de
especial preocupación ​14 . Aunque varios estudios recientes de ​E. coli patógena de países del
África subsahariana y Asia meridional han informado aumentos en las BLEE ​15 ,​16 , además
de aumentar la resistencia a la gentamicina 17 , ​18 y la ciprofloxacina 18 , ​19 , ​20 , ​21 , ​22 ,
estos datos se derivan principalmente de E. coli responsable de infecciones extra
intestinales en entornos hospitalarios. Por lo tanto, sigue habiendo grandes l​agunas en el
conocimiento de la prevalencia global de la AMR en la E. coli intestinal humana,
particularmente en los países en desarrollo donde la carga de enfermedades infecciosas es
más alta y la AMR ​puede provocar infecciones que no responden al tratamiento​ 14​ .

Mejorar nuestro conocimiento de la AMR entre ​E. coli que vive en el intestino es importante
por 2 razones: (1) ​E. coli es una causa principal de infecciones extra intestinales y las cepas
que colonizan el tracto gastrointestinal de los pacientes son el reservorio principal de estas
infecciones; y (2) la mayoría de los AMR en ​E. coli está codificada en elementos genéticos
móviles que son transferibles entre bacterias, lo que permite la rápida diseminación y
mantenimiento de genes de resistencia entre bacterias de diferentes especies ​23 , ​24 . Aunque
los antimicrobianos no se recomiendan para el tratamiento de la gastroenteritis no
complicada, se administran comúnmente a niños con diarrea en países en desarrollo para
tratar la disentería ​25 y diarrea prolongada, de la cual aEPEC es una causa principal ​4 , ​5
Aquí presentamos datos de AMR de 185 aislamientos de aEPEC recolectados durante el
Global Enteric Multicenter Study (GEMS) ​1 , ​26 . ​Utilizando datos de susceptibilidad
fenotípica y ​análisis de secuencia de genoma completo​, determinamos la prevalencia, los
mecanismos de resistencia y los posibles factores de variación en los perfiles de AMR​.
Estos aislamientos, recolectados de niños sanos que viven en un entorno comunitario y niños
con diarrea en 7 sitios en África subsahariana y el sur de Asia, brindaron una oportunidad
única para investigar la prevalencia de la AMR en bacterias intestinales que no se
seleccionaron en función del perfil AMR.

Resultados

Perfiles de susceptibilidad antimicrobiana

Las pruebas de susceptibilidad de 185 aislamientos de aEPEC (tabla complementaria ​1 ) a 16

antimicrobianos (tabla complementaria ​2 ) revelaron resistencia a 14 de los fármacos
investigados (figura ​1a ; tabla complementaria ​3 ), con 121 aislamientos MDR (65%; figura
1c​ ).

No se detectó resistencia a los medicamentos de 'última línea', amikacina (un

aminoglucósido) o meropenem (un carbapenem)​. Solo 35 aislamientos ​(19%) fueron
susceptibles a todos los medicamentos probados​: 17 de casos (18%) y 18 de controles
(20%). La resistencia a los antimicrobianos 'más viejos' fue común, con 121 ​(65%)
aislamientos resistentes a ​ampicilina​, 124 (​67%) a trimetoprima​, 122 (​66%) a
trimetoprima / sulfametoxazol y 104 ​(56%) a tetraciclina ​(Fig. ​1a ) . Aproximadamente la
mitad (​n  = 96, 52%) los aislamientos fueron resistentes a 3 o más de estos fármacos​. La
resistencia a la estreptomicina fue común (43%), aunque este antibiótico no se usa para tratar
la diarrea. La resistencia a otros aminoglucósidos probados fue rara (3%), con 5 aislamientos
de la India resistentes a la tobramicina, cuatro de los cuales también fueron resistentes a la
gentamicina. La resistencia a las fluoroquinolonas fue relativamente poco frecuente, con 31
aislamientos (17%) resistentes a la norfloxacina y 8 (4%) resistentes tanto a la norfloxacina
como a la ciprofloxacina. La resistencia al cloranfenicol (11%) y azitromicina (7%) también
fue infrecuente. Entre los antibióticos β-lactámicos, la resistencia a la ampicilina fue común
(65%), pero la resistencia a la ceftriaxona (3%), ceftazidima (3%) y cefepima (2%) fue rara
(Fig. ​1a, b​ ).

Fig. 1: Prevalencia del contenido de genes asociados a AMR y fenotipos de AMR en 185
aislados de aEPEC.
Determinantes genéticos de la AMR

Los genomas de los 185 aislamientos de aEPEC se seleccionaron para determinar los
determinantes genéticos conocidos de AMR, incluidos los genes adquiridos horizontalmente
y las mutaciones puntuales en los genes cromosómicos asociados con la resistencia a las
fluoroquinolonas y la nitrofurantoína (Figura ​1b ; Figura complementaria ​1 y Tabla
complementaria ​4 ). Se detectaron más de 40 genes AMR adquiridos diferentes, junto con 4
mutaciones puntuales (​2 en ​gyrA , 1 en ​parC (tanto ​gyrA y ​parC están asociados con la
resistencia a quinolona) y 1 en ​RTCNA​(​asociado con resistencia a la nitrofurantoína)). Se
observó una gran diversidad de genotipos de AMR, con 104 combinaciones distintas de
determinantes de AMR en los 185 aislamientos (Fig. ​1b , Fig. ​1 complementaria ). Sin
embargo, se detectaron 4 genes AMR adquiridos en más de la mitad de los aislados. Estos
​ EM (ampicilina), ​strA y ​strB (estreptomicina) y ​sul2 (sulfonamidas). Se
fueron alelos de ​bla T
detectaron alelos de genes de dihidrofolato reductasa ( ​dfr ) que codifican resistencia a
trimetoprima en 132 aislados (71%). Los más comunes de estos fueron ​dfrA1 (12%), ​dfrA5
(23%), ​dfrA7(​ 20%) y ​dfrA8​ (16%).

Investigación de elementos genéticos móviles asociados con la transferencia de genes

AMR

Como la MDR era común en las bacterias estudiadas (Fig. ​1 ), planteamos la hipótesis de que
esto se debía a la transferencia conjunta de grupos de genes AMR a través de elementos
móv​iles. ​La matriz de co-ocurrencia por pares de genes AMR era escasa (figura
complementaria ​2 ), con solo unos pocos grupos de genes frecuentemente detectados juntos
en el mismo genoma. ​El valor medio de co-ocurrencia en todos los pares de genes fue de 6.4
cepas. ​La Figura ​2a muestra redes de co-ocurrencia de genes AMR, construidas usando
diferentes umbrales para la co-ocurrencia a través de la colección aEPEC​. La red de genes
más común comprendía ​sul2 , ​strA y ​strB , que coexistieron en 112 genomas (61%); la
combinación de ​sul2 , ​strA​y ​strB ocurrió con ​bla ​TEM-198 en 46 (25%) y con ​bla T
​ EM-191
en 20 (11%; y los genomas complementarios Fig. ​2 y Fig. ​2a ). Usando un umbral mínimo de
co-ocurrencia en ≥20 cepas (media más SD de todos los valores de co-ocurrencia),
​ EM-198 , así
detectamos una gran red de genes que comprenden ​sul2 , ​strA , ​strB y ​bla T
como ​sul1​ , ​bla T
​ EM -191 , ​dfrA14​ , ​dfrA8​ , ​dfrA7​ , ​tet (A)​ y ​tet (B)​.

Fig. 2: Co-ocurrencia y caracterización de elementos móviles comunes de genes

asociados a AMR en cepas aEPEC.
La resolución del contexto genético de los genes AMR generalmente no es posible utilizando
datos de secuencia de lectura corta, porque las secuencias repetidas (como las secuencias de
inserción) y los números variables de copias de plásmidos causan incertidumbre en los
gráficos de ensamblaje de nov​o ​27 , ​28 . Por lo tanto, solo buscamos hacer amplias
clasificaciones sobre los posibles elementos móviles asociados con las redes de genes AMR
presentes en los genomas de aEPEC, mediante la comparación con elementos que
previamente se ha encontrado que movilizan estas combinaciones de genes.

Los genes ​sul2 , ​strA y ​strB frecuentemente se mueven juntos en plásmidos pequeños
(aproximadamente 6,000 pares de bases (kbp)) relacionados con pCERC2 ​29 (Fig. ​2b ). La
combinación de la cadena principal del ​plásmido pCERC2 y ​las secuencias ​sul2 , ​strA y ​strB
estaba presente en 42 aislamientos, 40 de los cuales (95%) también portaban secuencias del
gen ​dfrA , incluidos ​dfrA1 , ​dfrA14 y ​dfrA8 . En algunos genomas, las secuencias de
plásmidos podrían resolverse por completo, lo que demuestra que el gen ​dfr estaba ubicado
en el plásmido. Por ejemplo, GEMS cepa 400897 llevada ​el gen ​dfrA1 adyacente a ​strB en un
plásmido similar a pCERC2, mientras que la cepa GEMS 402635 portaba ​dfrA14 insertado
dentro de ​strA​ como en pCERC1 ​29​ (Fig. ​2b​ ).

​ EM
Los ​genes sul2 , ​strA y ​strB también se presentan junto con los genes ​bla T
(predominantemente ​bla ​TEM-198 ) en el transposón Tn ​6029 , que se encuentra
comúnmente en ​E. coli en un rango de cadenas principales plasmídicas distintas ​27 , ​29 , ​30
(Fig. ​2c ) Tn ​6029 es movilizado por las copias flanqueantes de IS ​26 . Una tercera copia de
​ EMy los otros genes AMR, ​lo que resulta en la separación del
IS ​26 se encuentra entre ​bla T
transposón en 2 contigs separados en ensamblajes de lectura corta (Fig. ​2c ). Detectamos la
presencia de ambos Tn ​6029 ​contigs ​en 33 genomas, por lo que es probable que lleven el
transposón completo. Como la secuencia flanqueante IS ​26 está presente en muchos lugares
diferentes, no pudimos determinar el sitio de inserción de Tn ​6029 dentro del genoma
borrador. Sin embargo, Tn ​6029 se encuentra con frecuencia dentro de Tn ​1696 , que incluye
un integrón de clase I que transporta genes AMR variables (que a menudo incluyen genes ​dfr
) dentro del casete, y ​sul 1 downstream ​(Aclaración: ​upstream (algo así como ​contra
corriente o ​río arriba)​ si es hacia el extremo 5', o ​downstream (​río abajo​) si es hacia el
extremo 3​) abajo del cassette. Para un ejemplo de una estructura de transposón compuesta del
plásmido ​Salmonella pSRC26 ​31 , véase la Fig. ​2c . En total, identificamos secuencias de
integrones de clase I ​en 38 genomas de aEPEC, 26 de los cuales incluyeron ambos Tn ​6029
contigs. En la Fig. ​2c se ​muestra un gráfico de ensamblaje de ejemplo​, que muestra cómo
estos contigs están conectados entre sí de manera consistente con los transposones
compuestos previamente secuenciados . En general, identificamos 5 casetes de genes integron
diferentes, el más frecuente de los cuales portaba ​dfrA7 ( ​n  = 30 genomas, incluidos 25 con
Tn ​6029 ), mientras que los otros portaban ​dfrA1 ( ​n ​ = 4), ​dfrA1 y ​aadA ( ​n  = 1 genoma,
que también portaba Tn ​6029​ ), ​dfrA17​ y ​aad5​ ( ​n​  = 2), y ​dfrA5​ ( ​n​  = 1).

Encontramos 2 genes comunes que ​codifican bombas de eflujo de resistencia a la tetraciclina​.

El más frecuente fue ​tet (A) , que se encontró en 63 (34%) genomas de aEPEC. Aunque ​tet
(A) está asociado con el transposón Tn ​1721 , el transposón completo se detectó en solo 3
genomas. El gen ​tet (B) se detectó en 50 (27%) genomas, cinco de los cuales también
portaban ​tet (A) . El gen ​tet (B) puede ser movilizado por Tn ​10 , que está flanqueado por
genes IS ​10 , pero el transposón completo estaba presente en solo 2 genomas. El enlace de ​tet
(A) o ​tet (B)a​ otros elementos relacionados con AMR no se pudo resolver a partir del
borrador de los ensamblajes del genoma, sin embargo, ambos se encontraron en asociación
con otros genes comunes de AMR (Fig. ​2a​ ).

Aunque no es posible resolver secuencias de plásmidos a partir de ​proyectos de ensambles de

lectura corta o determinar el enlace entre replicones de plásmidos específicos y genes AMR
32 , nuestra ​detección de marcadores de replicones de plásmid​os reveló varios que a menudo
se asocian con plásmidos de AMR grandes (Figura complementaria ​1d ) . Los más
prevalentes entre la colección aEPEC fueron FII ( ​n  = 131, 71%) y FIBA ​( ​n  = 104, 56%).
En particular, los plásmidos F también están asociados con el transporte de genes para
determinantes de virulencia, como las adhesinas de ​E. coli enteropatógena , pero nuestros
datos no permitieron determinar qué plásmidos se asociaron con genes AMR versus genes de
virulencia. Se detectó un replicón de plásmido IncC (también conocido como IncA / C) en 4
genomas que portaban ​bla ​TEM-198 pero no ​sul2, strA o ​strB . Sin embargo, no fue posible
​ EM-198 estaba localizado en este plásmido.
determinar si el gen ​bla T

Predicción de fenotipos de AMR a partir de genotipos

La resistencia in vitro se explica en gran medida por la presencia de determinantes genéticos

conocidos de AMR (Fig. ​1 , Tabla ​1 ). Para la mayoría de las drogas, la detección de genes de
resistencia fue sensible (> 95%) y específica (> 90%) en la predicción del fenotipo AMR. ​La
frecuencia de errores muy graves (falla en la detección de resistencia fenotípica) excedió el
umbral mínimo aceptable de 1.5% para 5 drogas (Tabla ​1 ). Estos fueron: ampicilina (4.9%),
estreptomicina (2.2%), trimetoprima (2.2%), trimetoprima / sulfametoxazol (2.2%) y
tetraciclina (2.2%). También se detectaron errores importantes (prediciendo resistencia
cuando no hay ninguno presente) para estos y otros antimicrobianos (Tabla ​1​) Las tasas de
error graves más altas se observaron para estreptomicina (26.5%), ampicilina (7.0%),
trimetoprima (5.9%), trimetoprima / sulfametoxazol (5.4%) y tetraciclina (4.3%). La
sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN)
para cada fármaco se muestran en la Tabla ​5 complementaria . La sensibilidad y el VPN
fueron superiores al 90% para todos los medicamentos probados, con excepción de la
azitromicina (85% de sensibilidad) y la ampicilina (85% de VPN). La especificidad y el VPP
fueron más variables, lo que refleja las tasas de error resumidas anteriormente (Tabla ​1​ ).

Tabla 1 Comparación de perfiles de AMR fenotípicos y genotípicos de 185 aislados de

aEPEC
Posibles fuentes de variación en los perfiles de AMR

Dada la diversidad de perfiles de AMR en nuestras cepas aEPEC, determinamos si la

distribución de los genes de AMR estaba asociada con el estado de la enfermedad, el linaje
filogenético o la ubicación geográfica de la que se aisló cada cepa. Primero, comparamos la
frecuencia de fenotipos y genotipos de AMR entre aEPEC aislados de casos de diarrea y
controles asintomáticos. Solo  se utilizaron datos de casos confirmados ( ​n  = 94) y controles
( ​n = 88) para este análisis. Para cada clase de fármaco, ni el fenotipo de AMR ni el de AMR
predichos a partir del genotipo fueron estadísticamente diferentes entre los casos y los
controles (Tabla complementaria ​6 ). Las frecuencias de genes AMR individuales también
fueron similares en aislamientos obtenidos de casos y de controles (Fig. ​3a​) Como los
determinantes de la AMR se distribuyeron por igual entre los casos y los controles, todos los
aislamientos se agruparon para un análisis posterior del linaje y la región.

Fig. 3: El contenido del gen AMR se explica por la región de aislamiento, no por el
estado de la enfermedad o el grupo clonal.
El análisis discriminante de los componentes principales ​33 en la matriz binaria de los
determinantes genéticos de AMR (​Tabla complementaria ​4 ; Fig. ​3b, c ) reveló que los
primeros 20 componentes principales representaron > 93% de la variación en los perfiles de
AMR y fueron retenidos para el análisis discriminante por filogenética linaje (grupos clonales
como se definió anteriormen​te ​6 ; Figura complementaria ​1 ) o por origen geográfico (África
Oriental, África Occidental y Asia; Figura ​3​ y Figura complementaria ​3​ ).

La variación en AMR no se asoció con el grupo clonal, aparte de CG378, que se caracterizó
por la ausencia de los genes AMR más comunes: variantes de ​bla ​TEM , ​sul2 , ​tet (A ) y ​tet
(B) , y la presencia del gen ​catA poco común. , detectado en 7 de 9 aislamientos CG378 en
comparación con 15 de 176 no CG378 ( ​P  <10 -4 , ​prueba exacta de Fisher​, dos colas). La
variación en los determinantes de AMR se asoció con la región de origen (Fig. ​3b y Fig. ​3b
suplementaria ). La función discriminante 1 (DF1) separó aislamientos asiáticos de africanos
y se asoció con ​gyrA p​ olimorfismos de un sólo nucleótido; DF2 separó los aislamientos de
África oriental y occidental y se asoció con ​dfrA8 , ​dfrA5 , ​tet (A) y ​sul2 . La Figura ​3d
muestra la distribución de los alelos ​dfrA a través de los sitios GEMS. Por ejemplo, ​dfrA1
predominó en los sitios asiáticos y ​dfrA8 fue más común en los sitios de África occidental,
mientras que ​dfrA14 y ​dhfr7 fueron comunes en Mozambique y Kenia, respectivamente.
Además, ​tet (A) fue más común en los sitios de África occidental y oriental que en Asia.
Estas diferencias genéticas se reflejaron en los fenotipos AMR, como la resistencia a la
ciprofloxacina (​n  = 8, 12%) y cefalosporinas de tercera generación (ceftazidima y
ceftriaxona, ambas ​n  = 6; 9%) se identificaron solo en cepas de Asia, mientras que la
resistencia a la tetraciclina fue más común en África (África Oriental, ​n  = 44, 60%; África
occidental, ​n  = 33, 72%) que en los aislamientos asiáticos, ​n  = 27, 41%; ​P  <0.05, prueba
exacta de Fisher, dos colas; Fig. ​4​a​ ).

Fig. 4: Fenotipos de AMR por región y uso de antimicrobianos en los sitios de estudio.

Diferencias en el uso local de drogas antimicrobianas

Los amplios patrones de uso de antimicrobianos en el tratamiento de la diarrea en los sitios de

estudio GEMS mostraron que trimetoprima / sulfametoxazol y penicilinas se usaron con
mayor frecuencia en sitios africanos, mientras que los macrólidos (azitromicina) y
fluoroquinolonas (en particular ciprofloxacina) se usaron con mayor frecuencia en Asia ( Fig.
4b, c ). ​Estos patrones de uso de antimicrobianos mostraron cierta asociación con los
fenotipos de AMR​, en la medida en que observamos niveles más altos de uso y resistencia
para azitromicina y fluoroquinolonas en sitios asiáticos, y para trimetoprima en sitios
de África Oriental (Fig. ​4​) Sin embargo, ​no pudimos probar formalmente estas
asociaciones, debido al pequeño número de observaciones en algunos sitios de estudio y
pequeñas variaciones en el uso ​de la mayoría de los medicamentos entre los sitios​. Por lo
tanto, investigamos las asociaciones entre el uso y la resistencia para los 2 medicamentos que
mostraron un uso sustancial (> 10%) en 3 o más sitios de estudio: ciprofloxacina y
trimetoprima. A través de los 7 sitios, el uso de ​ciprofloxacina se asoció significativamente
con la prevalencia de sustituciones en la regiones determinantes de resistencia a quinolona
(QRDRs)​, ​gyrA y ​parC (​Coeficiente de determinación ​( ​R ​2 ) = 0,87, ​P ​ ​=  0,002; Fig. ​5​)
Por el contrario, el uso de trimetoprima no se asoció con la prevalencia de genes ​dfr
adquiridos horizontalmente que confieren resistencia al fármaco ( ​R 2​  = 0.04, ​P​  > 0.5).

Fig. 5: Relación entre el uso de ciprofloxacina en los sitios de estudio GEMS y la

resistencia a la ciprofloxacina en aEPEC.
 Discusión

La AMR y los datos de uso informados aquí, se recopilaron en 7 sitios de estudio en Asia y
África, utilizando los mismos protocolos, lo que permite las comparaciones entre los sitios ​26
, ​34 . No se dispone de datos nacionales de vigilancia de AMR de estos países; y los datos de
AMR sobre ​E. coli en estos países pertenecen principalmente a aislamientos que causan
infecciones extra intestinales, y a un número limitado de medicamentos (principalmente
cefalosporinas y fluoroquinolonas de tercera generación) ​1​4 , ​19 , ​21 , ​22 , ​35​. Además, los
datos de fondo disponibles públicamente sobre el uso de antimicrobianos en los siete sitios de
estudio son limitados. Por ejemplo, la base de datos MIDAS de IMS Health incluye datos de
uso para India, Pakistán y Bangladesh informados en conjunto sin métodos detallados de
recopilación o interpretación de datos; y no hay datos para Mozambique, Gambia, Kenia y
Malí.

Casi la mitad de todos los aislamientos fueron resistentes a las penicilinas, trimetoprima
y tetraciclinas. ​Las tasas de resistencia a estos fármacos fueron generalmente ​más bajas
entre los aislamientos asiáticos (21-62%) ​que en los aislamientos de África (59-84%);
mientras que en los ​s​itios asiáticos se detectó resistencia a fármacos más nuevos, como
ceftriaxona, fluoroquinolonas y azitromicina ​(Fig. ​4a ). Estos patrones fueron ampliamente
consistentes con los datos de uso de antimicrobianos en los sitios de estudio correspondientes,
que mostraron que ​la ciprofloxacina y la azitromicina se usaban comúnmente para tratar
la diarrea en Asia, mientras que el trimetoprim-sulfametoxazol era la base del
tratamiento en África (Fig. ​4b, c ). Las altas frecuencias de resistencia a la ciprofloxacina en
los sitios asiáticos son similares a las tasas reportadas previamente entre los casos clínicos de
E. coli en intestino (incluidos múltiples patotipos) en estos países ​17 , ​19 , ​21 , ​22 , ​36 .
Detectamos aislados productores de BLEE en los sitios de estudio de Asia, pero no en África.
Se han informado niveles mucho más altos de infecciones por ​E. coli extra-intestinales
(incluida la bacteriemia) en hospitales de Asia y África ​16 , ​19 , ​35 , especulamos que esto
puede reflejar la selección debido al uso de cefalosporina de tercera generación a tasas más
altas en hospitales que en la comunidad, y / o la difusión de los linajes de ​E. coli
extra-intestinales productores de BLEE , como ST131.

De acuerdo con nuestros datos relacionados con los fenotipos de AMR, encontramos que ​los
determinantes genéticos de la resistencia eran similares en bacterias aisladas de casos
diarreicos y controles asintomáticos ​(Fig. ​3a , Tabla complementaria ​6 ) y ​no estaban
asociadas con el linaje clonal de la cepa, pero asociado con la región geográfica donde se
aislaron las bacterias (​Fig. ​3b, c ; Suplementaria Fig. ​3 ). Estos hallazgos son consistentes
con la hipótesis de que las diferencias en las frecuencias de los genes que codifican AMR en
diferentes regiones reflejan la selección debido a las diferencias en la exposición a los
antimicrobianos (Fig. ​4b, c ). En un fuerte apoyo de esta explicación, las mutaciones en los
QRDRs de ​gyrA y parC se asoció significativamente con la frecuencia del uso de
ciprofloxacina en los siete sitios de estudio (Fig. ​5 ). El mismo patrón de mutaciones
puntuales en los QRDR de genes cromosómicos se ha observado en otras enterobacterias
asociadas con el sur de Asia, incluidas ​Salmonella enterica serovar Typhi ​37 , ​38 y ​Shigella
sonnei ​39​ .

La situación era más compleja para los genes AMR transferidos horizontalmente asociados
con la resistencia a fármacos más antiguos. Aunque los alelos ​dfr individuales se
distribuyeron de manera diferente entre los sitios (Fig. ​3d ) y contribuyeron a los
componentes ortogonales de la función discriminante regional (Fig. ​3b ), la prevalencia
general de los genes ​dfr fue relativamente alta (50-90%) en cada sitio y no asociado
significativamente con el uso de trimetoprima para la diarrea (Figs. ​3d y ​4b, c​) De manera
similar, los genes que codifican la resistencia a la ampicilina, la estreptomicina y la
tetraciclina fueron comunes en los sitios donde estos medicamentos rara vez o nunca se
usaron para el tratamiento de la diarrea. También encontramos evidencia de varios elementos
comunes que median la AMR a estos medicamentos más antiguos, incluidos los plásmidos
pequeños y los integrones de clase I (Fig. ​2 ). Esto podría deberse a: (1) una falta de costo de
aptitud física asociada con estas resistencias​(Aclaración: sí hay poco o ningún costo de
acondicionamiento físico tienen más probabilidades de persistir en ausencia de
tratamiento con antibióticos. Ejemplo: ​Una cepa de mosca de D. melanogaster, C4 es resistente a la toxina del
hongo, la alfa-amanitina. La alfa-amanitina bloquea la actividad del ARN pol II. Esta cepa tiene una mutación que altera la estructura del
ARN pol II y es así como es resistente a la toxina. Tiene una ventaja en presencia de la toxina. Sin embargo, en ausencia de la toxina, tiene
una supervivencia pobre en comparación con su contraparte de tipo salvaje que no tiene la mutación. La mutación tiene una ventaja en
presencia de la toxina pero una desventaja en ausencia de la toxina. En otras palabras, la mutación tiene un costo de aptitud​, lo que
resulta en el mantenimiento de los genes en la población de ​E. coli después de que el
consumo de drogas disminuye ​8 , ​10 , ​30 , ​40 , ​41 ; (2) co-selección para resistencia a
múltiples fármacos cuyos genes asociados están presentes en los mismos elementos móviles
42 ,​43 ; y / o (3) selección debido a la exposición al fármaco no relacionada con el
tratamiento de la diarrea. No pudimos distinguir entre hipótesis utilizando nuestros datos,
aunque es bastante probable la exposición a antimicrobianos de otras fuentes. Por ejemplo,
aunque encontramos que la trimetoprima, sola o combinada con sulfametoxazol, se usó con
menos frecuencia en la India que los agentes alternativos para el tratamiento de la diarrea,
otros estudios han reportado el uso frecuente de trimetoprima en hospitales, entornos
comunitarios 36 y agricultura en la India; También hay evidencia de su presencia en el medio
ambiente, particularmente en aguas superficiales 44​. Los estudios futuros se beneficiarían de
datos adicionales sobre exposiciones a antimicrobianos clínicos y agrícolas, y ensayos para
agentes antimicrobianos seleccionados en orina y el medio ambiente.

Tampoco pudimos determinar la ubicación precisa de la mayoría de los genes AMR y los
elementos móviles asociados a partir de nuestros datos de secuencia de lectura cort​a​. Otros
experimentos como la conjugación o la secuencia de lectura larga ​3​8 , ​45 , ​46 podrían
resolver esto en el futuro. Sin embargo, es notable que los plásmidos similares a ​pCERC ​(que
a menudo tenían resistencia a la estreptomicina, sulfonamidas y trimetoprima) son comunes
en ​E. coli , posiblemente porque su pequeño tamaño (~ 6 kb) impone un bajo costo de aptitud
29 , ​47.​. También es notable que estos y muchos de los otros genes AMR que detectamos
también están asociados con transposones compuestos que pueden integrarse en el
cromosoma bacteriano, donde se mantienen a un costo de acondicionamiento físico más bajo
que los plásmidos codificadores de resistencia grandes ​27 , ​31 , ​38 . Muchos de los elementos
móviles que detectamos se han informado ampliamente en ​E. coli y otras Enterobacteriaceae
de muestras intestinales y extra intestinales humanas y muestras de animales ​29 , ​38 , ​48 , ​49 ,
50 . ​E. coli enteropatógena atípica tiene múltiples reservorios y nuestra colección incluyó una
amplia diversidad filogenética dentro de la población de ​E. coli (90 linajes únicos ​6 ); y ​no
encontramos diferencias en la AMR entre los aislamientos cultivados de los casos y la
colonización asintomática​. Por lo tanto, aunque los aislamientos no fueron recolectados para
el propósito específico de la vigilancia de AMR, pueden ser ampliamente representativos de
E. coli​ intestinal en estos entornos.

Nuestros datos llenan vacíos importantes de información sobre la prevalencia de AMR entre
E. coli intestinal en niños de países en desarrollo de África y Asia. En particular, nuestro
estudio demostró que la resistencia a múltiples fármacos 'más antiguos' (ampicilina,
tetraciclina, estreptomicina y trimetoprima-sulfametoxazol) era común en todos los sitios, y
que la resistencia a los antimicrobianos 'más nuevos', como las fluoroquinolonas y la
azitromicina, solo ha surgido en sitios asiáticos donde se usan estos medicamentos en el
tratamiento de la diarrea. La resistencia a los medicamentos más antiguos también era común
en estos sitios, de modo que solo los aislamientos asiáticos eran resistentes a siete u ocho
categorías de antimicrobianos, lo que indica que los patrones cambiantes de uso de
antimicrobianos conducen a una acumulación de determinantes de resistencia en lugar de su
reemplazo

Métodos

Aislamientos de aEPEC y secuencias de genoma completo correspondientes

Un total de 185 aislados de aEPEC confirmados de niños de 0 a 5 años en sitios GEMS

ubicados en Gambia, Malí, Kenia, Mozambique, Bangladesh, India y Pakistán ​34 se
incluyeron en el análisis ​1 , ​6 , ​26 , ​34 . Su colección, selección para secuenciación,
secuenciación de genoma completo y análisis filogenómico se han descrito previamente ​6 .
Brevemente, los aislamientos fueron principalmente de muestras fecales en las que aEPEC
solo (o con ​Giardia lamblia ) fue el único patógeno detectado, donde se pudo obtener un
cultivo puro. Todos estos aislamientos de casos de diarrea fueron secuenciados ( ​n  = 94);
controles incluidos para edad, sexo y sitio de estudio también fueron incluidos (​n  = 88). Tres
aislamientos fueron de niños cuyo estado de caso / control era incierto. Se recogieron
muestras fecales en los sitios de estudio antes del tratamiento antimicrobiano, aunque no se
puede descartar la exposición previa a los antimicrobianos de otras fuentes. Los niños control
tampoco estaban recibiendo ningún tratamiento antimicrobiano.

Se generaron secuencias de genoma completo para los 185 aislamientos de aEPEC en el

Wellcome Trust Sanger Institute usando la plataforma Illumina HiSeq (lecturas de pares de
extremos de 100 pb) y se ensamblaron usando Velvet, como se describió anteriormente ​6 , ​51
. Los detalles de los aislamientos individuales, los números de acceso para las lecturas y
ensamblajes de la secuencia del genoma correspondiente (depositados colectivamente bajo
BioProject ​ERP001141 ) y los metadatos asociados se proporcionan en la Tabla
complementaria ​1​ .

Caracterización fenotípica de perfiles AMR

La prueba de susceptibilidad antimicrobiana a 16 antimicrobianos se realizó utilizando el
sistema VITEK2 (bioMérieux) o un método de dilución en aga​r. En la Tabla ​2
complementaria se muestra un resumen de los medicamentos, los métodos de prueba y los
puntos de corte de concentración inhibitoria mínima (MIC) utilizados para determinar el
estado susceptible, intermedio o resistente de cada medicamento . Los controles utilizados
fueron tres aislados de ​S. enterica de referencia con perfiles de resistencia conocidos que
fueron amablemente proporcionados por el Laboratorio de Salud Pública de la Unidad de
Diagnóstico Microbiológico. Estas cepas tenían los siguientes perfiles: (1) susceptibles a
todos los medicamentos probados; (2) resistente a ampicilina, estreptomicina, tetraciclina,
cloranfenicol, sulfatiazol, trimetoprima, kanamicina, espectinomicina y gentamicina; y (3)
resistente a estreptomicinamod , tetraciclina, kanamicina, ácido nalidíxico y ciprofloxacina.

Para los ensayos VITEK2, los aislamientos puros se tiñeron en placas de agar MacConkey y
se incubaron a 37 ° C durante la noche. Los aislamientos se subcultivaron luego en placas de
agar sangre de caballo (HBA) para cultivo fresco y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Se
seleccionaron de una a tres colonias de cada placa de HBA y se suspendieron en solución
salina a una absorbancia de ~ 0,5 unidades MacFarlane antes de someterse a análisis
VITEK2. Los datos brutos MIC de los ensayos VITEK2 se muestran en la Tabla
complementaria ​7​ .

La susceptibilidad a estreptomicina, cloranfenicol, azitromicina y tetraciclina se determinaron

utilizando un método de dilución en agar. Las suspensiones bacterianas se prepararon como
se describe anteriormente. A cada uno de los 32 pocillos de acero inoxidable, se añadieron
450 µl de caldo nutritivo que contenía agar al 0,05%, seguido de 50 µl de suspensión
bacteriana. Cada placa que contiene antimicrobianos de agar Mueller Hinton para pruebas de
susceptibilidad y dos placas de agar Mueller Hinton y MacConkey de control se inocularon
usando un replicador de 32 pines. Cada pin entregó 2 µl a la placa de manera que el número
final de unidades formadoras de colonias en cada muestra fue de ~ 10 4. Las placas se
incubaron durante la noche a 37 ° C y se inspeccionaron al día siguiente. El crecimiento en
una placa de Mueller Hinton que contiene antimicrobianos se registró como fenotípicamente
resistente al fármaco, mientras que no se registró crecimiento como susceptible.
Se utilizaron los puntos de corte MIC del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a
los Antimicrobianos (EUCAST) (versión 6) cuando estaban disponibles ​52 . Existen
diferencias entre las pautas del EUCAST y el Instituto de Estándares Clínicos y de
Laboratorio (CLSI) en términos de puntos de corte MIC y los medicamentos que se
analizarán. Como la tetraciclina no tiene puntos de interrupción MIC definidos bajo el
esquema EUCAST, utilizamos el punto de interrupción CLSI MIC. La estreptomicina y la
azitromicina no tienen puntos de corte MIC establecidos en ninguno de los esquemas ​53 , ​54 .
Investigaciones previas propusieron un punto de ruptura de 16 µg ml -1 para estreptomicina
en ​E. coli 5​ 4 . Hay poca información disponible sobre la distribución MIC de azitromicina
para ​E. coli.​ Se ha propuesto un punto de ruptura de 16 µg ml -1 para ​S. enterica basado en
un estudio en el que la mayoría de los aislamientos mostraron MIC de 4–8 µg ml -1 (ref. ​53 ).
Para el presente estudio, el MIC de punto de interrupción para cada uno de estos fármacos se
estableció en el valor conservador de 16 µg ml -1 . Los datos de susceptibilidad a los
antimicrobianos para cada aislado se muestran en la Tabla complementaria ​3​ .

Detección de genes AMR

Se descargó una versión con formato SRST2 de la base de datos ​55 del gen ARG-ANNOT
AMR de ​https://github.com/katholt/srst2 . Todos los conjuntos de lectura de secuencia se
examinaron contra la base de datos usando SRST2 para detectar la presencia de genes de
resistencia adquiridos conocidos en cada genoma ​56 . Los genes de la β-lactamasa, ​ampC1 ,
ampC2 y ​ampH , se excluyeron del análisis, ya que en ​E. coli son genes centrales que
normalmente no confieren resistencia a los antibióticos. Los resultados se transformaron en
una tabla binaria en R para indicar la presencia / ausencia de alelos de genes de resistencia
adquiridos (Tabla complementaria ​4​ ).

Detección de polimorfismos de un solo nucleótido que confieren resistencia a las

fluoroquinolonas y a la nitrofurantoína.

Mutaciones cromosómicas, conocidos por estar asociados con la resistencia a las

fluoroquinolonas en ​E. coli , se extrajeron de las llamadas de polimorfismo de nucleótido en
todo el genoma único obtenido en base previamente en la cartografía de las lecturas a las ​E.
coli cepa 12009 O103: H2 genoma de referencia ​6 . Estos incluyeron mutaciones específicas
en las regiones determinantes de resistencia a quinolonas de ​gyrA , ​gyrB , ​parC y ​parE 5​ 7 , y
sustituciones no sinónimas en ​nfsA (residuos 11-15) que confieren resistencia a
nitrofurantoína ​58​ , ​59​ .

Análisis estadístico de la predicción del fenotipo AMR a partir del genotipo

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete R Stats versión 3.4.0. La
capacidad de los genotipos para predecir los fenotipos de susceptibilidad a los medicamentos
se evaluó comparando los fenotipos de susceptibilidad a los antimicrobianos (S, I y R) con la
presencia de genes y mutaciones asociados a AMR conocidos. Los errores en la predicción de
la susceptibilidad a los antimicrobianos se caracterizaron como muy importantes (llamando a
un aislado resistente susceptible) o mayores (llamando a un aislado susceptible resistente) ​60
, ​61 . Los estándares actualmente aceptados para errores muy grandes y tasas de errores
mayores son <1.5% y <3%, respectivamente ​60​. Aquí, se dijo que ocurrieron errores muy
importantes cuando un aislado era fenotípicamente resistente, pero no se detectaron genes o
mutaciones de resistencia conocidos, mientras que se cometieron errores importantes cuando
un aislado portaba determinantes de resistencia conocidos pero era fenotípicamente
susceptible. El análisis estadístico para determinar la sensibilidad, especificidad, VPP y VPN
se calculó en el paquete epiR (v0.9-93) ​62 para R, utilizando la función ​epi.stats con
intervalos de confianza de 0.95 para cada antimicrobiano probado.

Reconstrucción genómica de grupos demográficos mediante análisis discriminante de

componentes principales.

La matriz de determinantes genéticos de AMR (específicamente los datos en la Tabla

complementaria ​4 con solo determinantes genéticos de AMR utilizados y aislados con dos
mutaciones puntuales en ​gyrA tratados como presentes para generar una matriz binaria) se
utilizó como entrada para el análisis discriminante de los componentes principales que se
utilizaron. implementado en el paquete adegenet (v2.1.0) en R ​33​. Los primeros 20
componentes principales, que juntos explicaron> 93% de la varianza en el contenido del gen
AMR, se retuvieron para el análisis discriminante para explorar la capacidad de los
componentes principales de discriminar entre grupos de cepas definidas por región geográfica
de origen (África Occidental: Gambia y Mali; África Oriental: Kenia y Mozambique; y Asia:
Bangladesh, India y Pakistán) o pertenencia a un grupo clonal. Los dos componentes
principales que más contribuyeron al análisis discriminante fueron graficados y etiquetados
con los determinantes genéticos cuya variación contribuyó más a esos componentes. También
se trazaron las probabilidades de pertenencia al grupo posterior para cada función
discriminante.

Construcción de red de concurrencia

Se construyó una matriz de coincidencia por pares de genes AMR adquiridos mediante la
transformación de la matriz de contenido de genes binarios AMR en R. Las relaciones de
co-ocurrencia se visualizaron entre todos los pares de genes utilizando el paquete de mapas
de fenat (v1.0.8) en R ( ​https: / /CRAN.R-project.org/package=pheatmap ) (Figura
complementaria ​2 ). Las redes de genes concurrentes, en los que los nodos representan genes
y los bordes representan una frecuencia de concurrencia que excede un umbral dado
(establecido en ≥20, ≥33, ≥46, ≥100 genomas), se visualizaron en R usando el paquete igraph
(v1.1.2) ​63​ en R.

Cribado del replicón plasmídico

Se descargó una versión con formato SRST2 de la base de datos de PlasmidFinder ​64 de
https://github.com/katholt/srst2 para la detección de 80 secuencias de marcadores de
replicones de plásmidos conocidas. Todos los conjuntos de lectura de secuencia se
examinaron contra la base de datos usando SRST2 para detectar la presencia de estos
replicones en cada genoma. Los resultados se transformaron en una tabla binaria en R para
indicar presencia / ausencia.

Visualización de AMR y genotipos de plásmidos contra un árbol genético central

Se extrajo un subárbol que representa las relaciones entre los 185 aislamientos aEPEC de
GEMS de la filogenia de núcleo completo que publicamos anteriormente ​6 mediante la poda
de todos los demás consejos usando los paquetes R ape (v5.1) ​65 y geiger (v2.0.6) ​66 . La
presencia de genes AMR adquiridos, mutaciones y replicones de plásmidos se trazó como un
mapa de calor contra la filogenia utilizando la función plotTree para R (
https://github.com/katholt/plotTree​ ).

Investigación de mecanismos de movilización de genes AMR

Los genes comunes asociados a AMR que se demostró que coexisten, específicamente ​bla
TEM-198 , ​sul1 , ​sul2 , ​strA , ​strB , múltiples alelos ​dfrA , ​tet (A) y ​tet (B) , se investigaron
más a fondo en los ensamblajes del genoma de aEPEC para determinar si fueron
transportados en los mismos elementos móviles. Los ensamblajes del genoma aEPEC
generados previamente ​6 fueron interrogados con BLAST (v2.3.30), utilizando como
consultas los genes AMR y las secuencias de los plásmidos pCERC1 (acceso ​JN012467 ) y
pCERC2 (acceso ​KX291024 ), y los transposones Tn ​6029(​ acceso ​GQ150541 ) ​27 , Tn ​1721
(acceso ​X61367 ) ​67 y Tn ​10 (acceso ​AF223162 ) ​68 . Por ejemplo, si la columna vertebral
pCERC2 y los genes AMR se detectaron en un solo contig en el ensamblaje del genoma,
inferimos que estos genes se movían juntos en un plásmido relacionado con pCERC2. Dos
aislamientos representativos de aEPEC que se identificaron como portadores de un esqueleto
de plásmido similar a ​pCERC2 con diferentes ​inserciones de genes ​dfr (cepas 402635 y
400879) se seleccionaron como representantes para un análisis posterior. Estos genomas se
volvieron a ensamblar con Unicycler (v0.2.0) ​69 , anotado con Prokka (v1.12)​70 y en
comparación con las secuencias de referencia para pCERC1 y pCERC2 usando BLAST.
Luego se exploraron las comparaciones utilizando la Herramienta de comparación Artemis
71​ y se trazaron con genoplotR (v0.8.7) en R​ 72​ .

Se infirió que los aislados de ​E. coli enteropatógenos atípicos eran probablemente portadores
de Tn ​6029 o transposones relacionados si BLAST detectaba toda la región de ​repC a ​strB en
un solo contig y también se detectaba una variante ​bla ​TEM (predominantemente ​bla
TEM-198 ) en El genoma. (Tenga en cuenta que no es posible ensamblar la secuencia
​ EM está separado del resto
completa del transposón a partir de lecturas cortas, ya que ​bla T
del transposón por copias repetidas de IS ​26 que causan una ruptura en el gráfico de
ensamblaje). Una cepa representativa que coincide con este patrón (401596) se volvió a
montar con Unicycler ​69​y la conectividad de los genes Tn ​6029 en los gráficos de ensamblaje
resultantes se visualizaron usando Bandage (v0.8.1) ​73​ .

Las distribuciones de los integrones de clase I con diferentes regiones de cassette se

exploraron mediante la extracción de las secuencias de ADN que abarcan desde los genes
int1 a ​sul1 utilizando BLAST y MUMmer (v3.23) ​74 . Se ​identificaron diferentes alelos ​dfrA
dentro de las secuencias resultantes mediante búsquedas BLAST de la base de datos
ARG-ANNOT ​55 . Los representantes de cada secuencia de integrones de clase I distinta
(definida por el gen ​dfrA transportado) se volvieron a ensamblar con Unicycler ​69 y se
enviaron al sitio web ​75 del Repositorio de casetes de resistencia a antibióticos (RAC) para
una anotación detallada.

Datos de uso de antimicrobianos y correlación con resistencia

Los datos sobre el uso de antimicrobianos en cada uno de los siete sitios GEMS se obtuvieron
como parte del protocolo GEMS original ​1 , ​26 . Estos datos incluyen detalles de los
antimicrobianos prescritos para todos los casos que presentan diarrea acuosa o disentería en
las clínicas del estudio y fueron documentados por un miembro del equipo clínico de GEMS
26 . Dos de los medicamentos registrados se excluyeron del análisis actual: pivmecillinam,
porque no se usó a ningún nivel discernible, y metronidazol, que es activo contra protozoos y
bacterias anaerobias obligatorias solo ​76 y, por lo tanto, no pertenece a ​E. coli​, que es
intrínsecamente resistente a este agente. La frecuencia de las recetas para cada medicamento
en cada sitio se visualizó en R, utilizando el paquete ggplot2 (v2.2.1) ​33​ .

La relación entre las frecuencias de uso de ciprofloxacina y trimetoprima y los determinantes

genéticos asociados se investigó a través de modelos de regresión lineal en R utilizando la
función ​lm . Para la ciprofloxacina, los determinantes genéticos eran o mutaciones puntuales
asociadas a resistencia a uno o más de quinolona en ​gyrA (mutaciones puntuales en ​parC sólo
se produjo cuando ​gyrA mutaciones también estaban presentes), o la presencia de los genes
del plásmido transmitidas ​qepA o ​qnrS . La evidencia genética de resistencia a trimetoprima /
sulfametoxazol requirió la combinación de al menos un gen ​dfrA junto con ​sul1 o ​sul2​. Los
datos se visualizaron en R utilizando el paquete ggplot2 ​33​ .