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Artículo

Un brote de neumonía asociado con un nuevo coronavirus


de probable origen de murciélago

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7 Recibido: 20 de Peng Zhou 1,5, Xing-Lou Yang 1,5, Xian-Guang Wang 2,5, Ben Hu 1, Lei Zhang 1, Wei Zhang 1,
Hao-Rui Si 1,3, Yan Zhu 1, Bei Li 1, Chao-Lin Huang 2, Hui-Dong Chen 2, Jing Chen 1,3, Yun Luo 1,3,
enero de 2020 Aceptado: 29 de enero de 2020 Publicado en
Hua Guo 1,3, Ren-Di Jiang 1,3, Mei-Qin Liu 1,3, Ying Chen 1,3, Xu-Rui Shen 1,3, Xi Wang 1,3,
línea: 3 de febrero de 2020 Acceso abierto Xiao-Shuang Zheng 1,3, Kai Zhao 1,3, Quan-Jiao Chen 1, Fei Deng 1, Lin-Lin Liu 4, Bing Yan 1,
Fa-Xian Zhan 4, Yan-Yi Wang 1, Geng-Fu Xiao 1 y Zheng-Li Shi 1 ✉

Desde el brote del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) hace 18 años, se ha descubierto una gran cantidad de
Buscar actualizaciones
coronavirus relacionados con el SARS (SARSr-CoV) en su reservorio natural, los murciélagos 1--4. Estudios previos han

demostrado que algunos SARSr-CoV de murciélago tienen el potencial de infectar a los humanos. 5-7. Aquí informamos la

identificación y caracterización de un nuevo coronavirus (2019-nCoV), que causó una epidemia de síndrome respiratorio

agudo en humanos en Wuhan, China. La epidemia, que comenzó el 12 de diciembre de 2019, había causado 2,794

infecciones confirmadas por laboratorio, incluyendo 80 muertes antes del 26 de enero de 2020. Se obtuvieron secuencias

del genoma completas de cinco pacientes en una etapa temprana del brote. Las secuencias son casi idénticas y

comparten una identidad de secuencia del 79,6% con el SARS-CoV. Además, mostramos que 2019-nCoV es 96%

idéntico a nivel de genoma completo a un coronavirus de murciélago El análisis de secuencia de proteínas por pares de

siete dominios de proteínas no estructurales conservados muestra que este virus pertenece a la especie de SARSr-CoV. Además,

el virus 2019-nCoV aislado del líquido de lavado broncoalveolar de un paciente crítico podría ser neutralizado por sueros

de varios pacientes. En particular, confirmamos que 2019-nCoV usa el mismo receptor de entrada celular: la enzima

convertidora de angiotensina II (ACE2) - como SARS-CoV.

Los coronavirus han causado dos pandemias a gran escala en las últimas dos décadas, el Las muestras de siete pacientes con neumonía severa (seis de los cuales son vendedores o
SARS y el síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS) 8,9. repartidores del mercado de mariscos), que ingresaron en la unidad de cuidados intensivos del
En general, se ha pensado que el SARSr-CoV, que se encuentra principalmente en los Hospital Wuhan Jin Yin-Tan al comienzo del brote, fueron enviados al laboratorio en el Wuhan
murciélagos, podría causar un brote de enfermedad en el futuro 10, 11. Aquí informamos sobre una Institute of Virology (WIV) para el diagnóstico del patógeno causal (Tabla 1 de datos extendidos).
serie de casos causados ​por un brote de enfermedad de neumonía no identificada en Wuhan, Como laboratorio de investigación de CoV, primero utilizamos cebadores de PCR pan-CoV para
provincia de Hubei, centro de China. Este brote de enfermedad, que comenzó en un mercado local analizar estas muestras. 13, dado que el brote se produjo en invierno y en un mercado, el mismo
de productos del mar, ha crecido sustancialmente para infectar a 2,761 personas en China, está entorno que las infecciones por SARS. Encontramos cinco muestras positivas para PCR para
asociado con 80 muertes y ha provocado la infección de 33 personas en 10 países adicionales al CoV. Una muestra (WIV04), recogida del líquido de lavado broncoalveolar (BALF), fue analizada
26 de enero de 2020 12) Los síntomas clínicos típicos de estos pacientes son fiebre, tos seca, por Análisis metagenómico utilizando secuenciación de próxima generación para identificar
dificultades respiratorias (disnea), dolor de cabeza y neumonía. La aparición de la enfermedad posibles agentes etiológicos. De las 10,038,758 lecturas totales, de las cuales
puede provocar insuficiencia respiratoria progresiva debido al daño alveolar (como se observa en
las imágenes transversales de tomografía computarizada de tórax) e incluso la muerte. los médicos
determinaron que la enfermedad era causada por una neumonía inducida por virus de acuerdo con Se conservaron 1.582 lecturas totales después del filtrado de las lecturas del genoma humano: 1.378
los síntomas clínicos y otros criterios, incluido un aumento de la temperatura corporal, una (87,1%) secuencias coincidieron con la secuencia de SARSrCoV (Fig. 1a). Mediante el ensamblaje
disminución en el número de linfocitos y glóbulos blancos (aunque los niveles de estos últimos a de novo y la PCR dirigida, obtuvimos un
veces eran normales), nuevo infiltrados pulmonares en la radiografía de tórax y ninguna mejora Genoma de CoV de 29,891 pares de bases que compartió 79,6% de identidad de secuencia con
obvia después del tratamiento con antibióticos durante tres días. Parece que la mayoría de los SARS-CoV BJ01 (número de acceso de GenBank AY278488.2). Se obtuvo una alta cobertura
primeros casos tenían antecedentes de contacto con el mercado original de mariscos; sin del genoma al reasignar las lecturas totales a este genoma (Datos extendidos Fig. 1). Esta
embargo,la enfermedad ahora ha progresado para transmitirse por contacto humano a humano. secuencia ha sido enviado a GISAID (https://www.gisaid.org/) (número de acceso
EPI_ISL_402124). Siguiendo el nombre dado por la Organización Mundial de la Salud (OMS),
tentativamente lo llamamos nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV). Cuatro más secuencias
genómicas completas de 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 y

1 Laboratorio clave CAS de patógenos especiales, Instituto de Virología de Wuhan, Centro de Mega-Ciencia de Bioseguridad, Academia de Ciencias de China, Wuhan, China. 2 Hospital Wuhan Jin Yin-Tan, Wuhan, China. 3 Academia de Ciencias de la Universidad de China,

Beijing, China. 4 4 Centro Provincial de Hubei para el Control y Prevención de Enfermedades, Wuhan, China. 5 5 Estos autores contribuyeron igualmente: Peng Zhou, Xing-Lou Yang, Xian-Guang Wang. ✉ correo electrónico: zlshi@wh.iov.cn

Naturaleza | www.nature.com | 1
Artículo
una re Murciélago SARSr-CoV WIV16

Saccharomyces cerevisiae 100


Murciélago SARSr-CoV Rs4231
89
virus asesino M1, genoma completo (52) SARS-CoV SZ3
93 SARS-CoV BJ01
Glypta fumiferanae ichnovirus segmento C9,
Murciélago SARSr-CoV SHC014
100
secuencia completa (36) Murciélago SARSr-CoV WIV1
96
Bat SARSr-CoV LYRa11
Glypta fumiferanae ichnovirus segmento C10,
99 SARSr-CoV Rs672
secuencia completa (36)
Murciélago SARSr-CoV GX2013
99
Bat SARSr-CoV Rp3
99
SARSr-CoV (1,378)
Murciélago SARSr-CoV YNLF31C

Bat SARSr-CoV SC2018

moteado de Dulcamara, genoma completo (28) 100 Rf1

VB_PmiS-Isfahan, genoma completo (28) Virus de Murciélago SARSr-CoV SX2013

secuencia completa (24) Fago de proteus 100


Murciélago SARSr-CoV HuB2013
Hyposoter fugitivus segmento de ichnovirus B5, Murciélago SARSr-CoV HKU3-1
63 100
100 Murciélago SARSr-CoV Longquan-140

2019-nCoV BetaCoV / Wuhan / WIV02

BetaCoV
7a 100
M 7b 2019-nCoV BetaCoV / Wuhan / WIV07
si 2019-nCoV BetaCoV / Wuhan / WIV04
100
ORF1a S 3a norte
ORF1b 2019-nCoV BetaCoV / Wuhan / WIV06
100
2019-nCoV BetaCoV / Wuhan / WIV05
E 68 100
100 Bat CoV RaTG13

5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 100


Bat SARSr-CoV ZXC21

100 Bat SARSr-CoV ZC45


Posición del nucleótido del genoma
Murciélago SARSr-CoV BM48-31
100
C Bat Hp BetaCoV Zhejiang2013

100 Rousettus Bat CoV HKU9 Bat


76
Bat CoV GCCDC1

90100 92 MHV
100 Humano CoV OC43
100

80 Humano CoV HKU1

96 Tylonycteris bat CoV HKU4


Identidad de nucleótidos (%)

100 Pipistrellus bat CoV HKU5


70
MERS-CoV

100 PEDV
60
100 Scotophilus bat CoV 512
SARS-CoV BJ01 Bat CoV Miniopterus bat CoV 1
100
85
50 RaTG13 Bat CoV ZC45 Bat Miniopterus bat CoV HKU8

AlphaCoV
SARSr-CoV WIV1 Murciélago 86 86 Human CoV NL63

40 SARSr-CoV HKU3-1 Human CoV 229E


100
Rhinolophus bat CoV HKU2

100 Mink CoV

TGEV Bat SARSr-CoV


00 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
Posición del nucleótido del genoma 0.4 0.4

Fig. 1 | Caracterización del genoma de 2019-nCoV. una, Análisis metagenómico de la secuenciación de última secuencias de nucleótidos de genomas completos de coronavirus. MHV, virus de la hepatitis murina;
generación de BALF del paciente ICU06. si, Organización genómica de 2019-nCoV WIV04. M, membrana. C, Gráfico de PEDV, virus de la diarrea epidémica porcina; TGEV, virus de la gastroenteritis transmisible porcina. Las
similitud basado en la secuencia del genoma de longitud completa de 2019-nCoV WIV04. Se utilizaron secuencias de barras de escala representan 0.1 sustituciones por posición de nucleótidos. Se incluyen descripciones de
genoma de longitud completa de SARS-CoV BJ01, murciélago SARSr-CoV WIV1, coronavirus de murciélago RaTG13 y los ajustes y el software que se utilizó en los métodos.
ZC45 como secuencias de referencia. re, Árbol filogenético basado en

WIV07) (los números de acceso de GISAID EPI_ISL_402127–402130) que eran más del 99,9% identidad con todos los SARSr-CoV descritos anteriormente, excepto una identidad de nucleótidos
idénticos entre sí se obtuvieron posteriormente de cuatro pacientes adicionales mediante del 93.1% con RaTG13 (Tabla de datos ampliados 3). S Los genes de 2019-nCoV y RaTG13 son
secuenciación de próxima generación y PCR (Tabla de datos extendidos 2). más largos que otros SARSr-CoV. Las principales diferencias en la secuencia de S El gen de
2019-nCoV son las tres inserciones cortas en el dominio N-terminal, así como los cambios en
El genoma del virus consta de seis marcos principales de lectura abierta (ORF) que son comunes cuatro de cinco de los residuos clave en el motivo de unión al receptor en comparación con la
a los coronavirus y una serie de otros genes accesorios (Fig. 1b). Un análisis adicional indica que secuencia de SARS-CoV (Datos extendidos Fig. 3) Es necesario estudiar más a fondo si las
algunos de los genes 2019-nCoV compartieron menos del 80% de la secuencia de nucleótidos inserciones en el dominio N-terminal de la proteína S de 2019-nCoV confieren actividad de unión a
identidad al SARS-CoV. Sin embargo, las secuencias de aminoácidos de los siete dominios de ácido siálico como lo hace en MERS-CoV. La estrecha relación filogenética con RaTG13
replicasa conservados en ORF1ab que se usaron para la clasificación de especies de CoV fueron proporciona evidencia de que 2019-nCoV puede haberse originado en murciélagos.

94.4% idéntico entre 2019-nCoV y SARS-CoV, lo que sugiere que los dos virus
pertenecen a la misma especie, SARSr-CoV. Desarrollamos rápidamente un método de detección basado en qPCR sobre la base de la
Luego encontramos que una región corta de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) de un secuencia del dominio de unión al receptor de S gen, que era la región más variable del genoma
coronavirus de murciélago (BatCoV RaTG13), que se detectó previamente en Rhinolophus affinis de (Fig. 1c). Nuestros datos muestran que los cebadores podrían diferenciar 2019-nCoV de todos
la provincia de Yunnan: mostró una identidad de secuencia alta para 2019-nCoV. Llevamos a cabo los otros coronavirus humanos, incluido el murciélago SARSr-CoV WIV1, que comparte el 95%
una secuenciación completa en esta muestra de ARN (número de acceso GISAID de identidad con el SARS-CoV ( Datos ampliados Fig. 4a, b). De las muestras obtenidas de los
EPI_ISL_402131). El análisis simplificado mostró que 2019-nCoV fue muy similar en todo el genoma siete pacientes, encontramos que seis BALF y cinco muestras de torunda oral fueron positivas
a RaTG13 (Fig. 1c ), con una identidad general de secuencia del genoma del 96.2%. Usando las para 2019-nCoV durante el primer muestreo, según lo evaluado por qPCR y PCR convencional.
secuencias de genoma alineadas de 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV y SARSr-CoV de murciélago ya no se pudieron detectar muestras positivas para virus en hisopos orales, hisopos anales y
previamente reportados, no se detectaron pruebas de eventos de recombinación en el genoma de muestras de sangre tomadas de estos pacientes durante el segundo muestreo (Fig. 2a). Sin
2019-nCoV. Análisis filogenético del genoma de longitud completa y las secuencias de genes de embargo, recomendamos que otros objetivos qPCR, incluyendo el RdRp o

RdRp y Picos) mostró que, para todas las secuencias, RaTG13 es el pariente más cercano de sobre (E) Los genes se utilizan para la detección de rutina de 2019-nCoV. Sobre la base de
2019-nCoV y forman un linaje distinto de otros SARSr-CoV (Fig. 1d y Datos extendidos Fig. estos hallazgos, proponemos que la enfermedad podría transmitirse por transmisión aérea,
2). La proteína de pico de unión al receptor codificada por el S el gen era altamente aunque no podemos descartar otras posibles vías de transmisión, como una investigación
divergente de otros CoV (Datos extendidos Fig. 2), con menos del 75% de secuencia de adicional, que incluye más pacientes, es requerido.
nucleótidos

2 | Naturaleza | www.nature.com
una Primer muestreo Segundo muestreo
30-12-2019 10-01-2020
8
WIV01

WIV02
6
WIV03

registro (copia por ml)


WIV04
4
WIV05

WIV06
2
WIV07

BALF OS OS COMO Sangre

si C IgM IgG
0.4 0.4 IgM 2,0 0,50 3.00
IgG

2,00
0,3 1,5 0,30
Relación ELISA OD (IgM)

1.00

Relación ELISA OD (IgG)

Relación ELISA OD
0.2 0.2 1.0 0,10
0,10 0,10

0.1 0.5 0.5


0,05 0,05

00 00 00 00

Paciente sano Paciente sano


9

19

20
01

02
20

20
-2

-2
2-

1-
2

1
-1

-1

-0

-0
30

31

01

10

Fig. 2 | Investigación molecular y serológica de muestras de pacientes. Relaciones ELISA OD para IgM e IgG, respectivamente. C, Prueba serológica de anticuerpos 2019-nCoV en cinco
una, Detección molecular de 2019-nCoV en siete pacientes. La información del paciente se puede encontrar en las pacientes (Tabla de datos ampliados 2). El asterisco indica los datos recopilados de la UCI-06 del paciente el 10
Tablas de datos extendidos 1, 2. Los métodos de detección se describen en los Métodos. AS, hisopo anal; OS, hisopo de enero de 2020. si, C, El límite fue de 0.2 para el análisis de IgM y de 0.3 para el análisis de IgG, de acuerdo con
oral. si, Dinámica de los niveles de anticuerpos 2019-nCoV en un paciente que mostró signos de enfermedad el 23 de los niveles de los controles sanos.
diciembre de 2019 (UCI-

06). Relación OD, densidad óptica a 450–630 nm. La derecha y la izquierda y los ejes indican

Para la detección serológica de 2019-nCoV, utilizamos una proteína nucleocápsida (N) (Dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50%) de 2019-nCoV a una dilución de 1: 40-1: 80. También
desarrollada previamente de murciélago SARSr-CoV Rp3 como antígeno para los ensayos mostramos que este virus podría neutralizarse de forma cruzada con suero de caballo
inmunoabsorbentes ligados a enzimas IgG e IgM (ELISA), ya que esta proteína compartía 92% de anti-SARS-CoV (regalo de L. -F. Wang) a diluciones de 1:40; sin embargo, el potencial de
identidad de aminoácidos con N proteína de 2019-nCoV (Datos extendidos Fig. 5) y no mostró reactividad cruzada con anticuerpos contra el SARS-CoV necesita ser confirmado con suero
reactividad cruzada contra otros coronavirus humanos excepto SARSr-CoV 7) Solo pudimos obtener anti-SARS-CoV de humanos (Tabla de Datos Extendida 4).
cinco muestras de suero de los siete pacientes con infecciones virales, monitoreamos los niveles
de anticuerpos virales en un paciente (UCI-06) 7, 8, 9 y 18 días después del inicio de la Se sabe que ACE2 es un receptor celular para el SARS-CoV 14) Para determinar si 2019-nCoV
enfermedad (Tabla de datos extendidos 2). Se observó una clara tendencia en los títulos de IgG e también usa ACE2 como receptor de entrada celular, realizamos estudios de infectividad de virus
IgM, que aumentaron con el tiempo, excepto que el título de IgM disminuyó en la última muestra usando células HeLa que expresaron o no las proteínas ACE2 de humanos, murciélagos de
(Fig. 2b). Como segundo análisis, probamos muestras de 5 de los 7 virus positivos pacientes herradura chinos, civetas, cerdos y ratones. Mostramos que 2019-nCoV es capaz de usar todas las
alrededor de 20 días después del inicio de la enfermedad por la presencia de anticuerpos virales proteínas ACE2, excepto ACE2 de ratón, como receptor de entrada para ingresar a las células que
(tablas de datos extendidas 1, 2). Todas las muestras de pacientes, pero no muestras de expresan ACE2, pero no las células que no expresaron ACE2, lo que indica que ACE2 es
individuos sanos, fueron muy positivas para IgG viral (Fig. 2b). También hubo tres IgM -muestras probablemente el receptor celular a través del cual 2019-nCoV ingresa a las células (Fig. 3 También
positivas, que indican una infección aguda. mostramos que 2019-nCoV no utiliza otros receptores de coronavirus, como la aminopeptidasa N
(APN) y la dipeptidil peptidasa 4 (DPP4) (Datos extendidos Fig. 7).

A continuación, aislamos con éxito el virus (llamado 2019-nCoV BetaCoV / Wuhan / WIV04 / El estudio proporciona un informe detallado sobre 2019-nCoV, el probable agente
2019) de las células Vero E6 y Huh7 usando la muestra BALF del paciente ICU-06. Se observaron etiológico responsable de la epidemia en curso del síndrome respiratorio agudo en China y
efectos citopatógenos claros en las células después de la incubación durante tres días (Extendido otros países. Se observó seroconversión positiva a virus y nucleótidos específicos de virus
Datos Fig. 6a, b). La identidad de la cepa WIV04 se verificó en células Vero E6 por microscopía de en todos los pacientes evaluados y proporciona evidencia de un asociación entre la
inmunofluorescencia usando el anticuerpo N viral viral de reacción cruzada (Datos extendidos Fig. enfermedad y la presencia de este virus. Sin embargo, todavía hay muchas preguntas
6c, d) y por secuenciación metagenómica, la mayoría de las lecturas de que se asignó a urgentes que quedan por responder. La asociación entre 2019-nCoV y la enfermedad no ha
2019-nCoV, y el análisis de qPCR mostró que la carga viral aumentó del día 1 al día 3 (Datos sido verificada por experimentos con animales para cumplir con los postulados de Koch para
extendidos Fig. 6e, f). Las partículas virales en secciones ultrafinas de células infectadas mostraron establecer una causa relación entre un microorganismo y una enfermedad. Todavía no
una morfología de coronavirus típica, como se visualiza por electrón microscopía (Datos extendidos conocemos la rutina de transmisión de este virus entre los huéspedes. Parece que el virus se
Fig. 6g).Para confirmar aún más la actividad de neutralización de las muestras virales positivas para está volviendo más transmisible entre los humanos.Debemos monitorear de cerca si el virus
IgG, realizamos ensayos de neutralización en suero en células Vero E6 utilizando los sueros de continúa evolucionando para volverse más virulento, debido a la escasez de tratamientos
cinco pacientes que fueron positivos para IgG. Demostramos que todas las muestras fueron específicos y considerando la relación de 2019-nCoV con el SARS-CoV, algunos
capaces de neutralizar 100 DICT 50 medicamentos y vacunas preclínicas contra

Naturaleza | www.nature.com | 3
Artículo
DAPI ACE2 – FITC N – Cy3 Unir Nota agregada en la prueba: Desde que se aceptó este documento, la ICTV ha designado el virus
como SARS-CoV-2 15; Además, la OMS ha publicado el nombre oficial de la enfermedad causada
por este virus, que es COVID-19 dieciséis.
HACE2

Contenido en línea

Cualquier método, referencias adicionales, resúmenes de informes de Nature Research, datos de


origen, datos extendidos, información complementaria, agradecimientos, información de revisión
por pares; detalles de contribuciones de autores e intereses en competencia; y declaraciones de
bACE2

datos y disponibilidad de códigos están disponibles en https: // doi. org / 10.1038 /


s41586-020-2012-7.

1) Li, W. et al. Los murciélagos son reservorios naturales de coronavirus similares al SARS. Ciencias 310, 676-679 (2005).

2. Ge, X.-Y. et al.Aislamiento y caracterización de un coronavirus tipo SARS de murciélago que usa el receptor ACE2. Naturaleza
sACE2

503, 535-538 (2013).


3) Yang, L. et al.Nuevos betacoronavirus similares al SARS en murciélagos, China, 2011. Emerg. Infect. Dis.
19, 989–991 (2013).
4. Hu, B. et al. El descubrimiento de un rico acervo genético de coronavirus relacionados con el SARS de murciélago proporciona nuevos

conocimientos sobre el origen del coronavirus del SARS. PLoS Pathog. 13,

e1006698 (2017).
5. Menachery, VD et al. Un grupo de coronavirus de murciélago circulante similar al SARS muestra potencial para la emergencia
humana. Nat. Med. veintiuno, 1508-1513 (2015).
cACE2

6. Menachery, VD et al., Similar al SARS WIV1-CoV preparado para la emergencia humana. Proc. Natl Acad.
Sci. USA 113, 3048-3053 (2016).
7. Wang, N. et al. Evidencia serológica de infección por coronavirus de murciélago relacionada con el SARS en humanos, China. Virol. Sin. 33, 104-107

(2018).

8) Drosten, C. et al.Identificación de un nuevo coronavirus en pacientes con síndrome respiratorio agudo


severo. N. Engl. J. Med. 348, 1967-1976 (2003).
9) Zaki, AM, van Boheemen, S., Bestebroer, TM, Osterhaus, ADME & Fouchier, RAM Aislamiento de un nuevo
coronavirus de un hombre con neumonía en Arabia Saudita. N. Engl. J. Med. 367, 1814-1820 (2012).
mACE2

10. Cui, J., Li, F. y Shi, ZL Origen y evolución de los coronavirus patógenos. Nat. Rev.
Microbiol 17, 181-192 (2019).
11) Fan, Y., Zhao, K., Shi, Z.-L. y Zhou, P. Bat coronavirus en China. Virus 11, 210 (2019).
12. Comisión de Salud Municipal de Wuhan. Comunicado de prensa relacionado con la nueva infección por coronavirus (en
chino) http://wjw.wuhan.gov.cn/front/web/showDetail/2020012709194 (2020).
Sin transfectar

13. Poon, LL et al. Identificación de un nuevo coronavirus en murciélagos. J. Virol. 79, 2001-2009
(2005)
14. Li, W. et al., La enzima convertidora de angiotensina 2 es un receptor funcional para el coronavirus del SARS. Naturaleza
426, 450–454 (2003).
15. Gorbalenya, AE et al. Coronavirus agudo severo relacionado con el síndrome respiratorio agudo - la especie y sus
virus, una declaración del Grupo de Estudio Coronavirus. Preprint en
Fig. 3 | Análisis del uso del receptor de 2019-nCoV. Determinación de la infectividad del virus en células
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.07.937862v1 (2020).
HeLa que expresaron o no expresaron (sin transfectar) ACE2. La expresión del plásmido ACE2 con la 16. Observaciones del Director General de la OMS en la sesión informativa de los medios de comunicación sobre 2019-nCoV el 11 de

etiqueta S se detectó usando un anticuerpo monoclonal anti-etiqueta S de ratón. HACE2, ACE2 humano; febrero de 2020. https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s- remarks-at-
the-media-briefing-on-2019-ncov-on-11-february-2020 (OMS, 11 de febrero
bACE2, ACE2 de
2020).
Rhinolophus sinicus ( murciélago); cACE2, civeta ACE2; sACE2, porcina ACE2 (cerdo); mACE2, ratón ACE2. Verde,
ACE2; rojo, proteína viral (N); azul, DAPI (núcleos). Barras de escala, 10 μm. Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en mapas publicados y
afiliaciones institucionales.

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enfermedades infecciosas emergentes que son causadas por este grupo de virus en el futuro. permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. copia de esta licencia, visite
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Lo más importante es que se deben implementar regulaciones estrictas contra la domesticación
y el consumo de vida silvestre.
© El autor (es) 2020

4 | Naturaleza | www.nature.com
Métodos
Extracción de ARN y PCR
Informes de datos Cada vez que se utilizaron kits comerciales, se siguieron las instrucciones del fabricante sin
No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los modificaciones. El ARN se extrajo de 200 μl de muestras con el kit de ARN viral puro puro
experimentos no fueron aleatorizados y los investigadores no fueron cegados a la asignación (Roche). El ARN se eluyó en 50 μl de tampón de elución y se utilizó como plantilla para
durante los experimentos y la evaluación de resultados. RT-- PCR.
Para el análisis qPCR, cebadores basados ​en el S Se diseñó el gen de 2019-nCoV:
Coleccion de muestra RBD-qF1, 5′-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3 '; RBD-qR1,
El hospital Jinyintan (Wuhan, China) recolectó muestras humanas, incluyendo hisopos 5′-CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-3'. El ARN extraído como se describió anteriormente se
orales, hisopos anales, muestras de sangre y BALF, con el consentimiento de todos los usó para qPCR usando HiScript II One Step qRT - PCR SYBR Green Kit (Vazyme Biotech).
pacientes y el comité de ética del hospital designado para las enfermedades infecciosas Las PCR convencionales también se realizaron utilizando los siguientes pares de cebadores:
emergentes lo aprobó. o preferencia de edad a menos que se indique lo contrario. Para los ND-CoVs-951F, 5′-TGTKAGRTTYCCTAAYATTAC-3 '; ND-CoVs-1805R,
hisopos, se añadió 1,5 ml de DMEM que contenía 2% de FBS a cada tubo. El sobrenadante 5′-ACATCYTGATANARAACAGC-3'. μl qPCR mezcla de reacción contenía 10 μl 2 × One
se recogió después de la centrifugación a 2.500 rpm, agitando en vórtex durante 60 sy un Step SYBR Green mix, 1 μl One Step SYBR Green Enzyme mix, 0.4 μl 50 × ROX Reference
período de reposo de 15-30 min. El sobrenadante de los hisopos o se añadió BALF (sin Dye 1, 0.4 μl de cada cebador (10 μM) y 2 μl plantilla de ARN. realizado de la siguiente
pretratamiento) al tampón de lisis para la extracción de ARN o al medio de transporte viral manera: 50 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 30 s seguido de 40 ciclos que consisten en 95 °
para el aislamiento del virus. El medio de transporte viral estaba compuesto por una C durante 10 sy 60 ° C durante 30 s, y un paso de curva de fusión predeterminado en un ABI
solución salina equilibrada de Hank (pH 7,4) que contenía BSA (1%), anfotericina (15 μg ml −1), 7500 en tiempo real Máquina de PCR.
penicilina G (100 unidades ml −1) y estreptomicina (50 μg ml −1).

El suero se separó por centrifugación a 3.000. gramo durante 15 min dentro de las 24 h de la Prueba serológica

recolección, seguido de inactivación a 56 ° C durante 1 h, y luego se almacenó a 4 ° C hasta su uso. Los kits de ELISA de IgG e IgM anti-SARSr-CoV internos se desarrollaron utilizando la proteína
SARSr-CoV Rp3 N como antígeno, que compartía más del 90% de identidad de aminoácidos con
todos los SARSr-CoV 2) Para los análisis de IgG, las placas ELISA MaxiSorp Nunc-immuno de 96
Aislamiento de virus, infección celular, microscopía electrónica y ensayo de pocillos se recubrieron (100 ng por pocillo) durante la noche con proteína N recombinante. Se
neutralización. usaron sueros humanos a una dilución de 1:20 durante 1 ha 37 ° C. El anticuerpo monoclonal
Las siguientes líneas celulares se utilizaron para el aislamiento del virus en este estudio: células Vero E6 y conjugado con IgG HRP (Kyab Biotech) se usó a una dilución de 1: 40,000. Se calculó el valor de
Huh7, que se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10%. Todas las líneas celulares se analizaron y no DO (450-630 nm). Para los análisis de IgM, se recubrieron placas ELISA MaxiSorp Nuncimmuno de
tenían contaminación por micoplasma, se enviaron para identificación de especies y se autenticaron mediante 96 pocillos (500 ng por pocillo). ) durante la noche con IgM antihumana (cadena μ) Se utilizaron
evaluación morfológica mediante microscopía Ninguna de las líneas celulares estaba en la lista de líneas sueros humanos a una dilución 1: 100 durante 40 minutos a 37 ° C, seguido de incubación con un
celulares comúnmente identificadas erróneamente (por ICLAC). anticuerpo conjugado con anti-Rp3 N HRP (Kyab Biotech) a una dilución de 1: 4.000. Se calculó el
valor de OD (450–630 nm).
Las monocapas de células cultivadas se mantuvieron en su medio respectivo. La muestra BALF
positiva para PCR del paciente ICU-06 se centrifugó a 8,000 gramo
durante 15 min, filtrados y diluidos 1: 2 con DMEM suplementado con 16 μg ml −1 tripsina antes de
agregarla a las células Después de la incubación a 37 ° C durante 1 h, el inóculo se eliminó y se Examen del receptor ACE2 para la infección 2019-nCoV
reemplazó con medio de cultivo nuevo que contenía antibióticos (ver más abajo) y 16 μg ml −1 tripsina. Las células HeLa que expresaban ACE2 de forma transitoria se prepararon usando Lipofectamine
Las células se incubaron a 37 ° C y se observaron diariamente para detectar efectos citopatógenos. 3000 (Thermo Fisher Scientific) en una placa de 96 pocillos; se usaron células transfectadas
El sobrenadante del cultivo se examinó para detectar la presencia de virus mediante métodos simuladas como controles.2019-nCoV cultivado en células Vero E6 se usó para la infección a una MOI
qRT-PCR desarrollados en este estudio, y las células se examinaron mediante microscopía de de 0,5. APN y DPP4 se analizaron de la misma manera. El inóculo se eliminó después de la absorción
inmunofluorescencia usando el anti-SARSr- CoV Rp3 N anticuerpo que se generó internamente (1: durante 1 hy se lavó dos veces con PBS y se complementó con medio. A las 24 h después de la
1,000) Penicilina (100 unidades ml −1) infección, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehído al 4% en PBS (pH 7,4 )
durante 20 minutos a temperatura ambiente. La expresión de ACE2 se detectó utilizando un
y estreptomicina (15 μg ml −1) fueron incluidos en todos los medios de cultivo de tejidos. anticuerpo monoclonal anti-S de ratón y una IgG H&L de cabra marcada con FITC (Abcam, ab96879).
Las células Vero E6 se infectaron con el nuevo virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5 La replicación viral se detectó utilizando un anticuerpo de conejo contra la proteína Rp3 N ( generado
y se recolectaron 48 h después de la infección. Las células se fijaron con glutaraldehído al 2,5% (p / internamente, 1: 1,000) y una IgG anti-conejo de cabra conjugada con Cy3 (1: 200, Abcam,
v) y tetróxido de osmio al 1%, se deshidrataron a través de una serie graduada de concentraciones ab6939).Los núcleos se tiñeron con DAPI (Beyotime). Los patrones de tinción se examinaron usando
de etanol (de 30 a 100%) e incrustadas con resina epoxi. Se prepararon secciones ultrafinas (80 nm) microscopía confocal en un microscopio FV1200 (Olympus).
de células incrustadas, depositadas en rejillas de cobre recubiertas con Formvar (malla 200), teñidas
con acetato de uranilo y citrato de plomo, y analizadas usando un microscopio electrónico Tecnai G2
de 200 kV.
Secuenciación de alto rendimiento, detección de patógenos y ensamblaje del genoma

La prueba de neutralización del virus se realizó en una placa de 96 pocillos. Las muestras de
suero del paciente se inactivaron por calor mediante incubación a 56 ° C durante 1 hora antes de Las muestras del paciente BALF o del sobrenadante de cultivos de virus se usaron para la extracción
su uso. Las muestras de suero se diluyeron a 1:10, 1:20, 1: 40 o 1:80, y luego se añadió un de ARN y la secuenciación de próxima generación (NGS) usando secuenciadores BGI MGISEQ2000
volumen igual de stock de virus y se incubó a 37 ° C durante 60 minutos en un 5% de CO 2 incubadora.Se
e Illumina MiSeq 3000. El análisis metagenómico se realizó principalmente en base a la plataforma de
utilizaron suero de caballo diluido anti-SARS-CoV o muestras de suero de individuos sanos como bioinformática MGmapper (PE_2.24 y SE_2.24) .Las lecturas de NGS sin procesar fueron procesadas
control. Después de la incubación, se inocularon mezclas de 100 μl en una monocapa de células primero por Cutadapt (v.1.18) con una longitud mínima de lectura de 30 pares de bases. BWA
Vero E6 en una placa de 96 pocillos durante 1 h. Cada suero se evaluó por triplicado. Después de (v.0.7.12-r1039) se utilizó para alinear las lecturas a una base de datos local con un filtro parámetro
eliminar el sobrenadante, la placa se lavó dos veces con medio DMEM. Las células se incubaron de hits de 0.8 FMM ((coincidencia + falta de coincidencia) / valor de longitud de lectura ≥ fracción] y
con DMEM suplementado con FBS al 2% durante 3 días. Posteriormente, se verificaron las puntaje de alineación mínimo de 30. Los parámetros para el procesamiento posterior de las lecturas
células para detectar efectos citopatógenos. asignadas se establecieron en un tamaño mínimo de abundancia normalizada de 0.01,
Artículo
el recuento mínimo de lecturas de 20 y se establecieron en los parámetros
predeterminados.Una base de datos local de ácido nucleico para humanos y mamíferos se Disponibilidad de datos

usó para filtrar las lecturas de los genomas del huésped antes de mapear las lecturas a la Los datos de secuencia que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en GISAID

base de datos de virus. Microsoft Office 2010. Las lecturas de NGS se ensamblaron en (https://www.gisaid.org/) con los números de acceso EPI_ISL_402124, EPI_ISL_402127 - EPI_ISL_402130 y

genomas usando Geneious (v.11.0.3) y MEGAHIT (v.1.2.9). La secuenciación de PCR y EPI_ISL_402131; GenBank con números de acceso MN996527 - MN996532; National Genom Data Center, National

Sanger se realizó para llenar los huecos en el genoma. Amplificación rápida 5 'de los Genom Data Center, National Genom Data Center, National Genom Data Center, MN996532; National Genom Data

extremos de ADNc (RACE) se realizó para determinar el extremo 5 'de los genomas Center Instituto de Genómica de Beijing, Academia de Ciencias de China (https://bigd.big.ac.cn/databases?lang=en)

usando un kit SMARTer RACE 5' / 3 '(Takara). Los genomas se anotaron usando Clone con los números de acceso SAMC133236 – SAMC133240 y SAMC133252.

Manager Professional Suite 8 (software Sci-Ed).

Agradecimientos Agradecemos a P. Zhang y A. Du del centro de instalaciones centrales de WIV por su ayuda en la producción de
micrografías de microscopía electrónica de transmisión; H.-Z. Liu y P. Yu de WIV por análisis bioinformáticos. Este trabajo fue
apoyado conjuntamente por la Prioridad Estratégica Programa de investigación de la Academia de Ciencias de China (CAS)
Análisis filogenético (XDB29010101 a Z.-LS y XDB29010104 a PZ), Fundación de Ciencias Naturales de China para excelentes académicos (81822028
a
La gestión y el análisis de secuencia de rutina se llevaron a cabo utilizando DNAStar. La alineación
PZ, 31770175 a Z.-LS y 31800142 a BH), Mega-Proyecto para Enfermedades Infecciosas del Ministro de Ciencia y
de secuencias de secuencias completas del genoma se realizó utilizando MAFFT (v.7.307) con Tecnología de la República Popular de China (2018ZX10305409-004- 001 a PZ), Asociación de promoción de innovación
parámetros predeterminados. Las alineaciones de codones de secuencias de genes S y RdRp de juvenil de CAS (2019328 a X.-LY).

longitud completa se convirtieron a partir de las alineaciones de proteínas correspondientes por


Contribuciones de autor Z.-LS, PZ, Y.-YW y G.-FX concibieron el estudio X.-GW, C.-LH,
PAL2NAL (v.14); las alineaciones de proteínas fueron creadas por Clustal Omega (v.1.2.4) utilizando H.-DC, FD, Q.-JC, F.-XZ y L.-LL recolectaron muestras de pacientes. X.-LY, BY, WZ, BL, JC,
parámetros predeterminados. Se generaron árboles filogenéticos de máxima probabilidad utilizando X.-SZ, YL, HG, R.-DJ, M.-QL, YC, XW, X.-RS y KZ realizaron experimentos de qPCR, serología y cultivo de virus.
LZ, YZ, H.-RS y BH realizaron el genoma secuenciación y anotaciones.
RAxML (v.0.9.0) con el modelo de sustitución GTR + G y

Conflicto de intereses Los autores declaran no tener conflictos de intereses.


1,000 réplicas de arranque.
Información adicional Información complementaria está disponible para este documento en https://doi.org/10.1038/s41586-020-

Resumen de informes 2012-7.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación Correspondencia y solicitudes de materiales. debe dirigirse a Z.-LS
de la naturaleza vinculado a este documento. Información de reimpresiones y permisos está disponible en http://www.nature.com/reprints.
Datos extendidos Fig. 1 | Lecturas en bruto de NGS del mapeo de muestra WIV04 a la secuencia 2019-nCoV. los X eje indica la posición del nucleótido del genoma y el eje y representa la profundidad de lectura del
mapeo.
Artículo

Datos extendidos Fig. 2 | Árboles filogenéticos basados ​en las secuencias completas del gen S y RdRp método de probabilidad que utiliza el modelo de sustitución GTR + G con valores de arranque determinados por
de coronavirus. una, si, Árboles filogenéticos sobre la base de las secuencias de genes de S ( una) y RdRp ( si) se1000 repeticiones. Se muestran valores de arranque de más del 50%.
muestran. 2019-nCoV y bat CoV RaTG13 se muestran en negrita y en rojo. Los árboles se construyeron
utilizando el máximo
Datos extendidos Fig. 3 | Alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína S1 de 2019-nCoV a secuencias. Las inserciones cortas en el dominio N-terminal del 2019-nCoV están indicadas por los
SARS-CoV y murciélagos SARSr-CoV seleccionados. El cuadro rojo indica el motivo de unión al receptor cuadros azules. Bat CoV RaTG13 se obtuvo de R. affinis
del SARS-CoV y la región homóloga de otros coronavirus. Los residuos de aminoácidos clave implicados en encontrado en la provincia de Yunnan Bat CoV ZC45 se obtuvo de R. sinicus encontrado en la provincia de Zhejiang.

la interacción con ACE2 humano están numerados en la parte superior del alineado
Artículo

Datos extendidos Fig. 4 | Método de detección molecular utilizado para detectar 2019-nCoV. una, Curva como plantilla Las secuencias del cebador y las condiciones experimentales se describen en los Métodos. si, Especificidad
estándar para cebadores qPCR. El producto de PCR del S gen que se diluyó en serie en el rango de 10 8 a 10 1 ( líneas de los cebadores qPCR Se usaron muestras de nucleótidos de los patógenos indicados.
de izquierda a derecha) se utilizó

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