Sie sind auf Seite 1von 6

DEUTSCHE NORM April 1999

Grundlagen des Nachweises und der


Bestimmung von Mikroorganismen in
{
Lebensmitteln mittels Impedanz-Verfahren 10115
ICS 07.100.30

Fundamentals for detection and determination of microorganisms in


foodstuffs with impedance-method

Principes fondamentaux de recherche et détermination des micro-


organismes pour produits alimentaires à base d'impedance-méthode

Vorwort
Diese Norm wurde vom Normenausschuß Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), Arbeitsausschuß
"Veterinärmedizinische Fleischuntersuchung", erarbeitet.

1 Anwendungsbereich
Diese Norm legt die Grundlagen elektrischer Verfahren mittels direkter und indirekter Impedanz-Messung zum
Nachweis und zur Bestimmung von Mikroorganismen in Lebensmitteln fest.

2 Normative Verweisungen
Diese Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese
normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend
aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen dieser Publikationen
nur zu dieser Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisun-
gen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation.
DIN ISO 5725-1
Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Meßverfahren und Meßergebnissen – Teil 1: Allgemeine Grund-
lagen und Begriffe (ISO 5725-1 : 1994)
E DIN ISO 5725-2
Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Meßverfahren und Meßergebnissen – Ein grundlegendes
Verfahren für die Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpräzision von festgelegten Meßverfahren; Identisch
mit ISO/DIS 5725-2 : 1990
E DIN ISO 5725-3
Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Meßverfahren und Meßergebnissen – Präzision unter Zwischen-
bedingungen
E DIN ISO 5725-4
Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Meßverfahren und Meßergebnissen – Grundlegende Verfahren
zur Schätzung der Richtigkeit eines Meßverfahrens; Identisch mit ISO/DIS 5725-4 : 1990
E DIN ISO 5725-5
Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Meßverfahren und Meßergebnissen – Teil 5: Alternative Methoden
für die Ermittlung der Richtigkeit eines vereinheitlichten Meßverfahrens (ISO/DIS 5725-5:1996)
E DIN ISO 5725-6
Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Meßverfahren und Meßergebnissen – Anwendungen in der
Praxis; Identisch mit ISO/DIS 5725-6 : 1990

Fortsetzung Seite 2 bis 6

Normenausschuß Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
Seite 2
DIN 10115 : 1999-04

3 Begriffe
Für die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe:

3.1 direkte Impedanz-Messung


Messung der Änderung der Impedanz in einer Meßzelle, die mit der Probenflüssigkeit gefüllt ist.

3.2 indirekte Impedanz-Messung


Messung der Änderung der Impedanz in einer Meßzelle, die mit einer Reaktionslösung, welche mit der
Probenflüssigkeit in Kontakt steht, gefüllt ist.

3.3 Probenflüssigkeit (für direkte Impedanz-Messung)


Suspension, welche in die Meßzelle für die direkte Impedanz-Messung eingefüllt wird. Sie besteht aus einem
flüssigen bzw. halbfesten Nährmedium und der flüssigen bzw. homogenisierten Probe bzw. einer entsprechenden
Keimsuspension oder einer weiteren Verdünnung davon.

3.4 Reaktionslösung (für indirekte Impedanz-Messung)


Lösung, welche in die Meßzelle für das indirekte Impedanz-Verfahren zusätzlich, aber getrennt von der
Probenflüssigkeit eingefüllt wird. Sie besteht aus chemischen Substanzen in wäßriger Lösung, in die in der
Probenflüssigkeit entstehende Gase eingeleitet und darin gelöst werden.

3.5 spezifische Stoffwechselaktivität


Fähigkeit eines bestimmten Mikroorganismus, Nährstoffe in einer bestimmten Zeiteinheit umzusetzen.

3.6 Stoffumsatz
Produkt aus der spezifischen Stoffwechselaktivität und der Konzentration von Keimen.

4 Kurzbeschreibung
4.1 Allgemeines
Meßzellen mit Probenflüssigkeit werden bebrütet. Die während der Bebrütung in der Probenflüssigkeit oder in der
Reagenzlösung eintretenden Veränderungen der Meßgrößen werden registriert. Sie sind ein Maß für den
Stoffumsatz in den Meßzellen und lassen Rückschlüsse auf die Konzentration und/oder die spezifische Stoffwechsel-
aktivität der in einer Probe enthaltenen Mikrooganismen zu.

4.2 Direkte Impedanz-Messung


Das Impedanz-Verfahren kann als qualitativer Nachweis (An- oder Abwesenheit bestimmter Keime oder
Keimgruppen in einer Probe) oder als quantitative Bestimmung (Anzahl koloniebildender Einheiten je Gramm oder
Milliliter einer Probe) durchgeführt werden.
In Meßzellen mit Probenflüssigkeit kommt es aufgrund mikrobiellen Stoffwechsels zu einer Veränderung der
Zusammensetzung. Dadurch werden Veränderungen der elektrischen Meßgrößen bewirkt. Zur Messung dieser
Parameter werden Elektroden benötigt, welche in die Probenflüssigkeit eintauchen. An der Phasengrenze zwischen
den (in der Regel) metallischen Elektrodenteilen und dem Elektrolyten bilden sich Ionenschichten, sogenannte
"elektrochemische Doppelschichten", aus, die meßtechnisch als ohmsche/kapazitive Anteile der elektrischen
Meßgrößen erfaßt werden können. Durch die Veränderung der Probenflüssigkeit ändert sich auch die
Zusammensetzung dieser Ionenschichten, woraus Veränderungen der entsprechenden Meßgrößen resultieren.

4.3 Indirekte Impedanz-Messung


Die Meßzellen enthalten in voneinander getrennten Teilen Probenflüssigkeit und Reaktionslösung. Die aufgrund
mikrobiellen Stoffwechsels in der Probenflüssigkeit entstehenden Gase gelangen in die Reaktionslösung mit den
darin eintauchenden Elektroden. Durch die Absorption der Gase wird die Zusammensetzung der Reaktionslösung
verändert, woraus Veränderungen der entsprechenden Meßgrößen resultieren.
Seite 3
DIN 10115 : 1999-04

5 Art und Darstellung der Meßgrößen


5.1 Art der Meßgrößen
5.1.1 Pauschale Impedanz bzw. Admittanz
Als Meßgrößen finden die Impedanz Z, gemessen in der SI-Einheit Ohm (Ω) und die sich dazu reziprok verhaltende
Admittanz Y, gemessen in der SI-Einheit Siemens (S), bzw. in den Untereinheiten Millisiemens (mS = 10–3 S) und
Mikrosiemens (µS =10–6 S), Verwendung. Beides sind komplexe Größen, die aus ohmschen und kapazitiven
Anteilen bestehen.
Für die praktische Nutzung werden im allgemeinen die Beträge der komplexen Größen verwendet. Je nach den
verschiedenen Gerätetypen wird entweder der Betrag Z der pauschalen Impedanz oder der Betrag Y der pauschalen
Admittanz gemessen und ausgewertet.

5.1.2 Bestandteile der pauschalen Impedanz bzw. Admittanz


Die pauschalen Werte der Impedanz bzw. Admittanz setzen sich aus einem Impedanzanteil der Probenflüssigkeit
der Medienimpedanz ZM (im wesentlichen ohmsches Verhalten) und einem Impedanzanteil des Elektrodensystems
oder Elektrodenimpedanz ZE (ohmsches/kapazitives Verhalten) zusammen.
Auf Grund des ohmschen Verhaltens der Probenflüssigkeit, wie es für elektrolytische Lösungen charakteristisch ist,
besteht die komplexe Impedanz der Probenflüssigkeit praktisch nur aus ihrem Realteil, der als ohmscher
Widerstand R bezeichnet wird (SI-Einheit: Ohm). Analoges gilt für die komplexe Admittanz, deren Realteil als
Leitwert, Wirkleitwert oder Konduktanz G bezeichnet wird (SI-Einheit: Siemens). Diese Größen sind von der
Geometrie der Meßzelle abhängig.
Die spezifischen Größen des Widerstands (SI-Einheit: Ohm mal Meter) und der Leitfähigkeit (SI-Einheit: Siemens
je Meter) hingegen sind als stoffabhängige Größen definiert und geometrieunabhängig. Die Verwendung der beiden
letzteren Größen ist nicht üblich, da zeitliche Veränderungen der elektrischen Größen registriert werden und die
Geometrie konstant bleibt.
Gebräuchlich ist auch eine Auftrennung in eine ohmsche Komponente Widerstand R und eine kapazitive
Komponente Kapazität C.

5.2 Darstellungsmöglichkeiten der Meßgrößen


5.2.1 Allgemeines
Grundsätzlich werden die Meßgrößen als Zeitfunktionen dargestellt, wobei in der Regel die x-Achse die Zeitachse
darstellt, geteilt in Stunden oder Minuten. Auf der y-Achse werden die Veränderungen der verschiedenen
Meßgrößen aufgetragen.

5.2.2 Darstellung von Absolutwerten


Die Meßgrößen können als Absolutwerte dargestellt werden, wobei die Skalierung der y-Achse so gewählt wird, daß
der verfügbare Platz am Bildschirm bzw. im Ausdruck optimal genutzt wird (z. B. Skalierung von 100 Ω bis 300 Ω).
Werden mehrere Kurvenverläufe in ein Diagramm eingetragen, so besitzt diese Darstellung den Nachteil, daß die
einzelnen Kurven entlang der y-Achse möglicherweise verschoben sind, was Vergleiche erschwert. Die
Verschiebung resultiert beispielsweise aus geringfügigen Unterschieden im Füllstand der einzelnen Meßzellen, aus
unterschiedlich starkem Verdampfen von Wasser beim Dampfsterilisieren oder durch leicht unterschiedliche
Nährlösungschargen.
Um diesen meist unerwünschten Effekt zu beseitigen, können die Meßgrößen als bezogene Werte dargestellt
werden, wobei grundsätzlich zwei Varianten möglich sind.

5.2.3 Darstellung von bezogenen Absolutwerten


Die Meßgrößen werden auf den jeweiligen Anfangswert bezogen, wodurch die Skalierung der y-Achse immer bei 0
beginnt. Dabei kann auch der Anfangswert (Basiswert) angegeben werden. Dargestellt werden somit
Veränderungen, die von diesem Basiswert ausgehen.

5.2.4 Darstellung von prozentual bezogenen Größen


Bei dieser Darstellung werden die verschiedenen Größen als prozentuale Veränderung, bezogen auf den Anfangs-
wert (= 100 %), dargestellt.
Seite 4
DIN 10115 : 1999-04

6 Chemikalien und Nährmedien


6.1 Allgemeines
Chemikalien und Nährmedienbestandteile müssen für bakteriologische Zwecke geeignet sein. Trockennährböden
müssen nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet werden. Das verwendete Wasser muß entweder in
Glasgeräten destilliert oder entmineralisiert und mindestens von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine
Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen.

6.2 Nährmedien
Die Zusammensetzung der Nährmedien richtet sich nach der Fragestellung des Impedanznachweises. Es können
flüssige oder halbfeste Kollektiv-, Elektiv- und Selektivmedien eingesetzt werden.
Die Nährmedien müssen an die Verhältnisse des Meßprinzips angepaßt sein.

7 Impedanzmeßsystem
7.1 Allgemeines
Das Impedanzmeßsystem ist die Gesamtheit der Ausrüstung, bestehend im wesentlichen aus der Bebrütungseinheit,
den Gefäßen zur Aufnahme der Probenflüssigkeit, der Impedanzmeßeinrichtung und dem Rechner mit Software.

7.2 Bebrütungseinheit
Die Bebrütungseinheit muß eine Temperatureinstellung, entsprechend den Wachstumseigenschaften der
verschiedenen Mikroorganismen, und eine Temperaturkonstanthaltung auf 1 °C während der gesamten Bebrütungs-
dauer ermöglichen, da sowohl das Wachstum der Mikroorganismen als auch die elektrischen Meßgrößen
temperaturabhängig sind. Diese Thermostatisierung kann mittels Wasserbad, Brutschrank oder Thermoblock
erfolgen. Eine Möglichkeit zur Temperaturüberwachung, z. B. eine Temperaturmeßzelle, sollte vorhanden sein.

7.3 Meßzellen
7.3.1 Allgemeines
Meßzellen sind Gefäße zur Aufnahme der Probenflüssigkeit bzw. der Probenflüssigkeit und der Reaktionslösung. Sie
besitzen ein Elektrodensystem zur Messung der elektrischen Meßgrößen. Sie können grundsätzlich als wiederver-
wendbare Meßzellen oder als Einweg-Meßzellen ausgeführt sein und werden in die Bebrütungseinheit eingesteckt
oder eingehängt. Ein Zusammenfassen von mehreren Meßzellen zu Modulen ist gleichfalls möglich.

7.3.2 Meßzellen für das direkte Impedanz-Verfahren


Die wiederverwendbaren Meßzellen müssen wasch- und dampfsterilisierbar sowie entkalkbar und damit chemisch
beständig sein. Einmalzellen müssen steril verpackt sein. Das Elektrodensystem ist von der Probenflüssigkeit
umgeben.

7.3.3 Meßzellen für das indirekte Impedanz-Verfahren


Die Meßzellen besitzen zwei getrennte Abteile. Jener Teil, der das Elektrodensystem enthält, wird mit der
Reaktionslösung befüllt und muß nicht dampfsterilisierbar sein. Der Teil der Meßzelle, der mit der Probenflüssigkeit
befüllt wird, muß dampfsterilisierbar bzw. als Einmalprodukt steril verpackt sein. Beide Teile müssen so angeordnet
sein, daß ein Gasaustausch zwischen Probenflüssigkeit und Reaktionslösung möglich ist.

7.4 Impedanzmeßeinrichtung
Einrichtung zur Bestimmung der elektrischen Meßgrößen nach bekannten – auch in anderen Bereichen üblichen –
Prinzipien. Sie ist meist in die Bebrütungseinheit integriert.

7.5 Auswerteeinheit mit Rechner, Drucker und entsprechender Software


Die Software übernimmt die Steuerung des gesamten Meßablaufes inklusive der Auswertung. Vom Anwender
müssen verschiedene Untersuchungsparameter eingegeben werden können, wie Meßdauer, Meßintervall, die
Darstellungsart am Bildschirm, die zur Auswertung verwendeten elektrischen Meßgrößen, das Klassifizierungssystem
(z. B. Schwellenwerte), der Kalibrationszusammenhang und ähnliches. Ein Eintrag einer Probenkennung bzw.
Dokumentation ist gleichfalls nötig.
Seite 5
DIN 10115 : 1999-04

8 Durchführung
Die Probenflüssigkeit nach 3.3 wird in die Meßzellen nach 7.3 eingefüllt. Die vorbereiteten Meßzellen werden an die
vorgesehenen Meßplätze angeschlossen und bebrütet. Die Messung wird gestartet und die im Verlauf der
vorgesehenen Bebrütungszeit auftretenden Meßwertänderungen in der Probenflüssigkeit oder in der Reaktions-
lösung (siehe 3.4) vom Gerät aufgezeichnet. Art und Volumen des Nährmediums, Inokulationsmenge,
Bebrütungsbedingungen, Meßintervalle und Auswertemodus richten sich nach der Fragestellung der mikro-
biologischen Bestimmung und dem Impedanzmeßsystem. Eine nur das sterile Nährmedium enthaltende Meßzelle
ist als Leerwert regelmäßig mitzuführen.

9 Auswertung
9.1 Allgemeines
Als Grundlage für die Auswertung werden die durch mikrobiell bedingte Änderungen der Meßgrößen (siehe
Abschnitte 4 und 5) entstehenden Kurvenverläufe herangezogen. Als maßgebliche Größen können beispielsweise
die Kenngrößen (siehe 9.2) zugrundegelegt werden.

9.2 Kenngrößen der registrierten Kurvenverläufe


9.2.1 Allgemeines
Eine oder mehrere der nach 5.1 festgelegten Meßgrößen werden während einer, dem jeweiligen Anwendungsfall
entsprechenden Bebrütungsdauer registriert. Die sich ergebenden Kurvenverläufe, z. B. Z(t), Y(t), C(t), weisen
charakteristische Verläufe auf, von denen einzelne Merkmale ausgewertet werden.

9.2.2 Schwellenwert
Der Schwellenwert ist ein vorgebbarer Wert für die Änderung der Meßgröße.

9.2.3 Detektionszeit
Die Detektionszeit ist die Zeit vom Beginn der Untersuchung bis zum Erreichen bestimmter Kurvenmerkmale.
Gebräuchlich ist z. B. die Bestimmung der Zeit bis zum Erreichen eines vorgegebenen Schwellenwertes oder bis
sich zwei (oder mehrere) aufeinanderfolgende Werte der Meßgröße um einen bestimmten, dem Anwendungsfall
angepaßten Wert, unterscheiden. Es kann aber auch beispielsweise die Zeit bis zum Erreichen des Wendepunktes
der Wachstumskurve bestimmt werden.

9.2.4 Andere Kurvenmerkmale


Grundsätzlich können auch andere Kurvenmerkmale, wie z. B. die Steigung des Kurvenverlaufes während der
logarithmischen Wachstumsphase oder Minima und Maxima des Kurvenverlaufes zur Auswertung herangezogen
werden.

9.3 Qualitativer Nachweis


9.3.1 Nachweis bestimmter Mikroorganismen
9.3.1.1 Durchführung
Für einen qualitativen Nachweis bestimmter Mikroorganismen oder Mikroorganismengruppen werden elektive oder
selektive Nährmedien eingesetzt, die sich für diese jeweils typischen Kurvenverläufe der Meßgrößen ergeben. Dabei
sind auch Mehrfachansätze mit unterschiedlichen Nährmedien möglich.

9.3.1.2 Bewertung
Die Anwesenheit eines gesuchten Mikroorganismus oder einer Mikroorganismengruppe wird jeweils anhand eines
auffälligen Kurvenverlaufs der Meßgrößen während der Inkubation der Probenflüssigkeit (siehe 3.3) oder der
Reaktionslösung (siehe 3.4) durch eine oder mehrere Kenngrößen nach 9.2 angezeigt. Ein solches Meßergebnis
wird als verdächtig gewertet. Aus den entsprechenden Meßzellen sind Subkulturen herzustellen. Verdächtige
Kolonien sind zu isolieren und zu identifizieren. Werden vorgegebene Kenngrößen (z. B. Schwellenwert) im
Vergleich zu mitgeführten Positivkontrollen nicht erreicht, ist der Nachweis negativ.

9.3.2 Prüfung auf Sterilität


Bei der Prüfung auf Sterilität dürfen keine Änderungen der Meßgrößen während einer festgelegten Bebrütungsdauer
im jeweiligen Nährmedium auftreten.
Seite 6
DIN 10115 : 1999-04

9.4 Quantitative Bestimmung


9.4.1 Zusammenhang zwischen Impedanz-Verfahren und Referenzverfahren
Für eine quantitative Auswertung ist anhand einer ausreichenden Anzahl von Proben die Erstellung eines
Zusammenhanges mit kulturellen Keimzahlbestimmungen nach standardisierten Verfahren erforderlich, z. B. durch
Paralleluntersuchungen. Dieser Zusammenhang kann im einfachsten Fall eine lineare Korrelation mit einer der in 9.2
festgelegten Kenngrößen und z. B. dem Plattengußverfahren sein. Es sind aber auch besser approximierende
Zusammenhänge wie z. B. quadratische oder hyperbolische Regressionen sowie mathematische Algorithmen – u. U.
auch von mehreren Kenngrößen – möglich.
Die sich daraus ergebende Beziehung "Keimzahl mittels Impedanz-Verfahren" und "Keimzahl mittels
Referenzverfahren" ist statistisch auszuwerten (z. B. Berechnung von Korrelationskoeffizient, Standardfehler der
Schätzung, Vertrauensbereich) und zu dokumentieren. Entscheidungsregeln sind zu erstellen.
ANMERKUNG: Zur statistischen Auswertung sollte DIN ISO 5725 Anwendung finden.
Die für diese Bestimmung zu treffende Auswahl von Nährmedien richtet sich nach den zu erfassenden
Mikroorganismen der jeweiligen Lebensmittelgruppen, wobei eine Auswertung im allgemeinen produktbezogen
erfolgen muß. Dabei sind unterschiedliche Milieubedingungen, die die Bestimmung der Mikroorganismen
beeinflussen können, zu berücksichtigen.

9.4.2 Berechnung der Keimzahl


Die Keimzahl [Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) je Gramm oder Milliliter eines Lebensmittels] wird über
die erfaßten Kenngrößen nach 9.2 und unter Zugrundelegung der in 9.4.1 beschriebenen Zusammenhänge ermittelt.
Die Angabe erfolgt unter Berücksichtigung des festgelegten Vertrauensbereichs in Abhängigkeit von der Anzahl der
für die Ermittlung der statistischen Beziehung eingesetzten Stichproben (Stichprobenumfang).

10 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf die Norm mindestens anzugeben:
a) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;
b) Art und Datum der Probenahme;
c) Angaben zum Transport der Probe;
d) Angaben zur Lagerung der Probe;
e) Eingangs- und Untersuchungsdatum;
f) Untersuchungsergebnis;
g) gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Norm.