DEUTSCHE NORM Juli 2001

Untersuchung von Lebensmitteln

Nachweis von Salmonellen mittels D
Impedanz-Verfahren 10120
ICS 07.100.30

Analysis of foodstuffs —
Detection of Salmonella with impedance-method
Analyse pour produits alimentaires —
Recherche de Salmonella à base de la méthode
d’impédance

Vorwort
Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL),
Arbeitsausschuss „Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschließlich Schnellverfahren“,
erarbeitet.

1 Anwendungsbereich
Diese Norm legt ein Verfahren zum Nachweis von Salmonellen mittels Impedanzmessung fest.
ANMERKUNG Auf die Vorschriften des Bundesseuchengesetzes wird hingewiesen.

2 Normative Verweisungen
Diese Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikatio-
nen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publika-
tionen sind nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder
Überarbeitungen dieser Publikationen nur zu dieser Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung
eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen
Publikation (einschließlich Änderungen).
DIN 10115, Grundlagen des Nachweises und der Bestimmung von Mikroorganismen in Lebensmitteln
mittels Impedanz-Verfahren.
DIN 12339, Laborgeräte aus Glas — Petrischalen.
DIN 12680-1, Laborgeräte aus Glas — Messzylinder mit Strichteilung.
DIN 12695, Laborgeräte aus Glas — Messpipetten für teilweisen Ablauf, Klasse A und Klasse B.
DIN 58945-1, Brutschränke für mikrobiologische Zwecke — Begriffe, Anforderungen, Anwendung.
DIN EN 12824, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln — Horizontales Verfahren zum
Nachweis von Salmonellen (ISO 6579:1993 modifiziert); Deutsche Fassung EN 12824:1997.
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological
examinations.

Fortsetzung Seite 2 bis 12

Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)

im DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
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3 Begriffe
Für die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe:

3.1
Salmonellen
Mikroorganismen, die bei Wachstum und Vermehrung in flüssigen Anreicherungsmedien (Probenflüssig-
keiten) auf Grund ihrer spezifischen Stoffwechselaktivität Veränderungen von elektrischen Messgrößen
bewirken; sie bilden typische Kolonien auf festen, selektiven Nährböden und besitzen bei der Unter-
suchung nach diesem Verfahren die hier beschriebenen biochemischen und serologischen Eigenschaften

3.2
Nachweis von Salmonellen
Verfahren, mit dem die Anwesenheit oder Abwesenheit lebensfähiger Formen dieser Mikroorganismen in
einer untersuchten Probenmenge festgestellt wird
ANMERKUNG In dieser Norm wird die Anwesenheit von Salmonellen anhand eines auffälligen Kurvenverlaufs der
Messgrößen während der Inkubation der Probenflüssigkeit durch eine oder mehrere Kenngrößen angezeigt.

4 Kurzbeschreibung
4.1 Allgemeines
Die Untersuchung wird im Allgemeinen in mehreren aufeinander folgenden Schritten durchgeführt, da
Salmonellen im Probenmaterial in geringer Anzahl, subletal geschädigt oder gemeinsam mit einer
größeren Anzahl anderer Mikroorganismen vorkommen können.

4.2 Voranreicherung
Die Proben werden in einem nicht selektiven, flüssigen Nährmedium 16 h bis 20 h bei 37 °C bebrütet.

4.3 Anreicherung
Zwei Messzellen mit unterschiedlichen selektiven, flüssigen Nährmedien werden mit einer bestimmten
Menge des bebrüteten Voranreicherungsnährmediums beimpft. Die Probenflüssigkeiten werden in der
Bebrütungseinheit des Impedanzmesssystems mindestens 18 h bei 35 °C bis 37 °C bzw. 40 °C bis 42 °C
bebrütet.

4.4 Isolierung
Sind die Messergebnisse aus einer oder beiden Messzellen als verdächtig zu bewerten, werden jeweils
zwei feste, selektive Nährböden beimpft. Diese werden bei 37 °C für mindestens 18 h bebrütet. Danach
wird auf die Anwesenheit von Kolonien untersucht, die auf Grund ihres Aussehens salmonellenverdäch-
tig sind.
ANMERKUNG Die Agglutination verdächtiger Kolonien mit polyvalentem oder omnivalentem Salmonella-Antiserum
kann zur Vorprüfung durchgeführt werden.

4.5 Identifizierung
Die salmonellenverdächtigen Kolonien werden in Reinkulturen weitergezüchtet und auf ihre besonderen
serologischen und biochemischen Eigenschaften untersucht.

5 Chemikalien und Nährmedien

5.1 Allgemeines
Chemikalien und Nährmedienbestandteile müssen für mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Trocken-
nährböden müssen nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet werden.
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Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgeräten destilliert oder entmineralisiert und mindestens
von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mikroor-
ganismen beeinflussen.
Für die Nachweisverfahren dürfen auch im Handel befindliche Nährmedien verwendet werden, sofern
ihre Zusammensetzung den in diesem Abschnitt genannten Rezepturen entspricht oder bei vergleichba-
rer Wirksamkeit nur geringfügig von diesen abweicht.

5.2 Nährmedien
5.2.1 Nährmedien für die Voranreicherung
Gepuffertes Peptonwasser
a) Zusammensetzung
– Pepton aus Casein (tryptisch verdaut): 10,0 g
– Natriumchlorid: 5,0 g
– di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat, Na2 HPO2 · 12 H2 O: 9,0 g
– Kaliumdihydrogenphosphat, KH2 PO4 : 1,5 g
– Wasser: 1 000 ml
b) Herstellung
Die Bestandteile werden durch Erhitzen gelöst. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterili-
sieren bei 7,2 ± 0,1 liegt, bezogen auf eine Temperatur von 20 °C.
Jeweils 225 ml dieser Lösung werden in 500-ml-Kolben übergeführt und 15 min bei …121 ± 1† °C sterilisiert.
Es dürfen andere wissenschaftlich erprobte Voranreicherungsnährmedien, auch unter Zusatz von Elektiv-
substanzen, verwendet werden. Elektivsubstanzen sollten schonender sterilisiert werden.

5.2.2 Nährmedien für die Anreicherung

5.2.2.1 Allgemeines
Die Nährmedien müssen an die Verhältnisse des Messprinzips angepasst sein. Da sich auch gleichartige
Nährmedien messsystembedingt in ihrer Rezeptur unterscheiden können, werden hier nur einige grund-
legende Medien beispielhaft aufgeführt. Die über die Festlegungen dieser Norm hinausgehenden Anga-
ben der Hersteller über die Zubereitung und Verwendung der Nährmedien sind strikt einzuhalten. Es
kann erforderlich sein, die Nährmedien auch in Abhängigkeit von der jeweiligen Matrix zu modifizieren.
Es empfiehlt sich, die Nährmedien nur in solchen Teilmengen abzufüllen, die dem täglichen Verbrauch
entsprechen.

5.2.2.2 Modifiziertes Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Impedanz-Medium nach

RAPPAPORT-VASSILIADIS (mod. RVI-Medium)
5.2.2.2.1 Grundnährmedium
a) Zusammensetzung
– Magnesiumchlorid-Hexahydrat, MgCl2 · 6 H2 O 40,0 g
– Natriumchlorid 2,0 g
– Pepton aus Fleisch (tryptisch verdaut) 5,0 g
– Hefeextrakt 3,0 g
– D(­)-Mannit 5,0 g
– Malachitgrün-oxalat 0,04 g
– Glycerophosphat-Natrium 1,56 g
– Wasser auf 1 000 ml
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b) Herstellung
Die Bestandteile oder das Trockennährmedium werden in Wasser gelöst. Der pH-Wert ist auf 6,5 ± 0,1
einzustellen, bezogen auf eine Temperatur von 20 °C. Das Nährmedium wird in Teilmengen von maximal
500 ml in Kolben abgefüllt und anschließend 10 min (Haltezeit) bei 80 °C im Wasserbad pasteurisiert
oder 10 min (Gesamtzeit) im Dampftopf erhitzt. Unmittelbar nach der Erhitzung werden die Kolben rasch
abgekühlt.
Das Nährmedium ist unter Kühlung (2 °C bis 8 °C) und lichtgeschützt etwa eine Woche haltbar.
ANMERKUNG Soll das Nährmedium länger aufbewahrt werden, empfiehlt es sich, die Erhitzung durch eine Steril-
filtration zu ersetzen.

5.2.2.2.2 Selenit-Lösung
a) Zusammensetzung
– Natriumhydrogenselenit, NaHSeO3 2,0 g
– Wasser auf 100 ml
b) Herstellung
Das Selenit wird im Wasser aufgelöst. Die Lösung wird steril filtriert.
ANMERKUNG Der Zusatz von Novobiocin-Lösung (5.2.2.2.3) an Stelle von Selenit-Lösung sollte bei Trockenpro-
dukten (z. B. Milchpulver und ähnliche Erzeugnisse, Gewürze) erfolgen, wenn mit einer gram-positiven Mikroflora,
insbesondere aeroben Sporenbildern, zu rechnen ist.

5.2.2.2.3 Novobiocin-Lösung
a) Zusammensetzung
– Novobiocin 0,2 g
– Ethanol 10 ml
– Wasser auf 100 ml
b) Herstellung
Das Novobiocin wird im Ethanol aufgelöst. Die Lösung wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und sterilisiert.

5.2.2.2.4 Vollständiges Nährmedium

Herstellung
Zu 1 000 ml Grundnährmedium werden entweder 10 ml der Selenit-Lösung nach 5.2.2.2.2 oder 10 ml der
Novobiocin-Lösung nach 5.2.2.2.3 zugesetzt.

5.2.2.3 Modifiziertes Selenit-Cystin-Impedanz-Medium nach EASTER-GIBSON (mod. SCI-Medium)

5.2.2.3.1 Grundnährmedium
a) Zusammensetzung
– Pepton aus Fleisch (tryptisch verdaut) 5,0 g
– Dulcit 5,0 g
– Trimethylamin-N-oxid-Dihydrat (TMAO) 5,6 g
– Natriumhydrogenselenit, NaHSeO3 4,0 g
– di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, Na2 HPO4 · 2 H2 O 10,0 g
– Wasser auf 1 000 ml
b) Herstellung
Die Nährbodenbestandteile oder das Trockennährmedium werden in Wasser gelöst. Der Ansatz wird in
Teilmengen von maximal 500 ml in Kolben abgefüllt. Das Nährmedium darf kurzfristig auf maximal 60 °C
erwärmt werden und wird anschließend sofort abgekühlt.
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5.2.2.3.2 Cystin-Lösung
a) Zusammensetzung
– L-Cystin 0,5 g
– Natriumhydroxid-Lösung (NaOH, c = 1 mol=l) 1) 15,0 ml
– Wasser auf 100 ml
b) Herstellung
Das Cystin wird in der Natriumhydroxid-Lösung aufgelöst, die Lösung mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt
und sterilfiltriert.

5.2.2.3.3 Vollständiges Nährmedium

Herstellung
Zu 1 000 ml abgekühltem Grundnährmedium nach 5.2.2.3.1 werden 10 ml der Cystin-Lösung nach
5.2.2.3.2 zugesetzt. Falls notwendig, wird der pH-Wert auf 7,2 ± 0,2 eingestellt, bezogen auf eine Tempe-
ratur von 20 °C.
ANMERKUNG 1 Bei vorgesehener Lagerung (maximal eine Woche bei 2 °C bis 8 °C) sollte das vollständige
Nährmedium sterilfiltriert werden. Das Auftreten eines roten Bodensatzes zeigt an, dass das Nährmedium unbrauch-
bar geworden ist.
ANMERKUNG 2 Sofern im Trockennährmedium L-Cystin enthalten ist, erübrigt sich der separate Ansatz der
Cystin-Lösung. In diesem Fall wird die unter 5.2.2.3.2 aufgeführte Natriumhydroxid-Lösung dem Ansatz vor der
Erwärmung zugesetzt, weil sich das Cystin nur im schwach alkalischen Milieu löst.

5.2.2.4 Modifiziertes Selenit-Cystin-Impedanz-Medium nach OGDEN (mod. SCI-O-Medium)

5.2.2.4.1 Grundnährmedium
a) Zusammensetzung
– Lactalbumin-Hydrolysat 5,0 g
– D(+)-Glucose 10,0 g
– L-Lysin-Monohydrochlorid 10,0 g
– Natriumhydrogenselenit, NaHSeO3 4,0 g
– Wasser auf 1 000 ml
b) Herstellung
Die Bestandteile oder das Trockennährmedium werden in Wasser gelöst. Der Ansatz wird 10 min auf
60 °C erwärmt (darf jedoch nicht gekocht oder autoklaviert werden) und anschließend sofort abgekühlt.
ANMERKUNG Bei Überhitzung bildet sich ein orangeroter Niederschlag, der anzeigt, dass das Medium unbrauch-
bar geworden ist.

5.2.2.4.2 Cystin-Lösung
a) Zusammensetzung
– L-Cystin 0,1 g
– Natriumhydroxid-Lösung (NaOH, c = 1 mol=l)1) 15 ml
– Wasser auf 100 ml
b) Herstellung
Das Cystin wird in der Natriumhydroxid-Lösung aufgelöst, die Lösung mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt
und sterilfiltriert.

1) c Stoffmengenkonzentration
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5.2.2.4.3 Vollständiges Nährmedium

a) Herstellung
Zu 1 000 ml abgekühltem Grundnährmedium nach 5.2.2.4.1 werden 10 ml der Cystin-Lösung nach
5.2.2.4.2 zugesetzt. Der pH-Wert ist auf 7,2 ± 0,2 einzustellen, bezogen auf eine Temperatur von 20 °C.

5.2.3 Nährboden für die Isolierung

5.2.3.1 Brillantgrün-Phenolrot-Agar nach Edel und Kampelmacher
5.2.3.1.1 Grundnährboden
a) Zusammensetzung
– Fleischextrakt 5,0 g
– Pepton aus Casein (tryptisch verdaut) 10,0 g
– Hefeextraktpulver 3,0 g
– di-Natriumhydrogenphosphat, Na2 HPO4 1,0 g
– Natriumdihydrogenphosphat, NaH2 PO4 0,6 g
– Agar, je nach Geliereigenschaften 12 g bis 18 g
– Wasser 900 ml
b) Herstellung
Die Bestandteile oder der Fertignährboden werden durch Erhitzen gelöst. Der pH-Wert ist so einzustel-
len, dass er nach dem Sterilisieren bei 7,0 ± 0,2 liegt, bezogen auf eine Temperatur von 45 °C. Der
Grundnährboden wird in Kulturröhrchen oder in Kolben mit einem Volumen von höchstens 500 ml über-
geführt und anschließend 15 min bei 121 °C sterilisiert.

5.2.3.1.2 Zucker-Phenolrot-Lösung
a) Zusammensetzung
– Lactose 10,0 g
– Saccharose 10,0 g
– Phenolrot 0,09 g
– Wasser auf 100 ml
b) Herstellung
Die Bestandteile werden in Wasser gelöst und im Wasserbad bei 70 °C 20 min erhitzt. Nach dem Abküh-
len auf 55 °C muss die Lösung sofort verwendet werden.

5.2.3.1.3 Brillantgrün-Lösung
a) Zusammensetzung
– Brillantgrün 0,5 g
– Wasser 100 ml
b) Herstellung
Das Brillantgrün wird in Wasser gelöst. Zur Selbststerilisation wird die Lösung mindestens einen Tag im
Dunkeln stehen gelassen.

5.2.3.1.4 Vollständiger Brillantgrün-Phenolrot-Agar

a) Zusammensetzung
– Grundnährboden nach 5.2.3.1.1 900 ml
– Zucker-Phenolrot-Lösung nach 5.2.3.1.2 100 ml
– Brillantgrün-Lösung nach 5.2.3.1.3 1 ml
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b) Herstellung
Unter aseptischen Bedingungen wird die Brillantgrün-Lösung zu der auf etwa 55 °C abgekühlten Zucker-
Phenolrot-Lösung hinzugefügt. Dieses Lösungsgemisch wird anschließend bei 50 °C bis 55 °C zum
Grundnährboden gegeben und damit vermischt.

5.2.3.1.5 Herstellen der Agarplatten

Teilmengen von etwa 15 ml des frisch zubereiteten, vollständigen Nährbodens nach 5.2.3.1.4 werden bei
etwa 45 °C in sterile Petrischalen übergeführt und zum Verfestigen stehen gelassen.
Unmittelbar vor der Verwendung werden die Platten bei 37 °C bis 55 °C getrocknet, ohne Deckel und mit
der Agaroberfläche nach unten.

5.2.3.2 Weiterer fester, selektiver Nährboden nach eigener Wahl

wie z. B. Bismut-Sulfit-Agar, Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar (XLD-Agar), Desoxycholat-Citrat-Agar,
Lackmus-Lactose-Agar nach Conradi-Drigalski, Bromkresolpurpur-Lactose-Agar, Wasserblau-Meta-
chromgelb-Agar nach Gaßner, MLCB-Agar, Rambach-Agar und XLT4 -Agar.
ANMERKUNG Zum Nachweis lactosepositiver Salmonellen (Subspezies IIIa und IIIb, atypisch Lactose fermentie-
rende Salmonellen anderer Subspezies) empfiehlt sich der Einsatz des Bismut-Sulfit-, des MLCB- bzw. des XLD-
Agars als weiterer selektiver Nährboden.

5.2.4 Nährböden, Nährmedien, Reagenzien und Lösungen für die Identifizierung

5.2.4.1 Nähragar
a) Zusammensetzung
– Fleischextraktpulver 3,0 g
– Pepton aus Casein (tryptisch verdaut) 5,0 g
– Agar, je nach Geliereigenschaften 12 g bis 18 g
– Wasser 1 000 ml
b) Herstellung
Die Bestandteile werden durch Erhitzen gelöst. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterili-
sieren bei 7,0 ± 0,2 liegt, bezogen auf eine Temperatur von 45 °C.
Der Nährboden wird in sterile Kulturröhrchen oder Kolben mit einem Volumen von höchstens 500 ml
übergeführt. Anschließend wird der Nährboden 15 min bei …121 ± 1† °C sterilisiert.
Zum Herstellen der Agarplatten werden 15 ml des geschmolzenen Nährbodens in sterile Petrischalen
übergeführt.
Unmittelbar vor der Verwendung werden die Platten bei 37 °C bis 55 °C getrocknet, ohne Deckel und mit
der Agaroberfläche nach unten.

5.2.4.2 Halbfester Agar

a) Zusammensetzung
– Fleischextraktpulver 3,0 g
– Pepton aus Casein (tryptisch verdaut) 5,0 g
– Agar, je nach Geliereigenschaften 4 g bis 9 g
– Wasser 1 000 ml
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b) Herstellung
Die Bestandteile werden durch Erhitzen gelöst. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterili-
sieren bei 7,0 ± 0,2 liegt, bezogen auf eine Temperatur von 45 °C.
Der Nährboden wird in Kolben mit einem Volumen von höchstens 500 ml übergeführt und anschließend
15 min bei …121 ± 1† °C sterilisiert.
Teilmengen von etwa 15 ml des frisch hergestellten vollständigen Nährbodens werden in sterile Petri-
schalen übergeführt. Die Platten dürfen nicht getrocknet werden.

5.2.4.3 Physiologische Kochsalzlösung

a) Zusammensetzung
– Natriumchlorid 8,5 g
– Wasser 1 000 ml
b) Herstellung
Das Natriumchlorid wird durch Erhitzen gelöst. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterili-
sieren bei 7,0 ± 0,2 liegt, bezogen auf eine Temperatur von 20 °C. Es werden so große Teilmengen dieser
Lösung in Kolben oder andere geeignete Gefäße übergeführt, dass diese nach dem Sterilisieren etwa
90 ml bis 100 ml enthalten.
Die Lösung wird 15 min bei …121 ± 1† °C sterilisiert.

5.3 Antiseren
Die verwendeten diagnostischen Salmonella-Antiseren einschließlich der omni- und polyvalenten Sal-
monella-Antiseren müssen amtlich geprüft sein. Bei jedem Serum sind die Anweisungen des Herstellers
zu beachten.

6 Geräte
6.1 Allgemeines
Alle Glasgeräte müssen vor der Verwendung sorgfältig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgeräte
müssen steril sein.
Zusätzlich zu den Geräten nach ISO 7218:1996 und dem in DIN 10115 aufgeführten Impedanzmess-
system werden folgende Geräte benötigt:

6.2 Mischgeräte für die Voranreicherung

6.3 Zerkleinerungs- oder Mixgerät, sterilisierbar

6.3.1 Mixgerät, das mit Drehzahlen zwischen 8 000 min­ 1 und 45 000 min­ 1 arbeitet, ausgestattet mit
Glas- oder Metallgefäßen geeigneter Größe. Die Mixgefäße müssen mit einem Deckel verschließbar
und sterilisierbar sein.
6.3.2 Beutelwalkmischer

6.4 Trocknungskammer, Wärmeschrank oder Brutschrank zum Trocknen der Agarplatten bei
…50 ± 5† °C.

6.5 Brutschrank oder Wasserbad zum Bebrüten der beimpften, flüssigen Nährmedien, der Platten
und der Kulturröhrchen, einstellbar auf …37 ± 1† °C, z. B. Brutschrank nach DIN 58945-1.

6.6 Wasserbäder zum Erwärmen und Kühlen der Lösungen und Nährmedien auf geeignete Tempera-
turen.

6.7 Kulturröhrchen und Kolben zum Sterilisieren und Aufbewahren der Nährmedien.
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6.8 Messzylinder mit unterschiedlichem Volumen zum Herstellen und Abfüllen der Nährmedien, z. B.
Messzylinder nach DIN 12680-1.

6.9 100-ml-Messkolben zum Herstellen der Lösungen

6.10 10-ml-Messpipetten, z. B. Pipette nach DIN 12695

6.11 1-ml-Messpipetten, z. B. Pipette nach DIN 12695

6.12 Petrischalen, Durchmesser etwa 90 mm, z. B. nach DIN 12339

6.13 Sterilfiltrationsgerät, Porenweite der Filter 0,22 µm

7 Probenahme
Es ist von steril entnommenen Stichproben auszugehen.

8 Durchführung
8.1 Vorbereitung der Proben
Die Probenbehältnisse werden unmittelbar vor der Untersuchung geöffnet, und der Inhalt wird gründlich
durchmischt oder zerkleinert.
Von jeder gründlich durchmischten Stichprobe werden — soweit verfügbar und keine anderen Vorgaben
entgegenstehen — mindestens 25 g bzw. 25 ml zur Untersuchung entnommen und durch Umrühren oder
Schütteln gründlich vermischt.
Wenn mehr als eine 25-g-Einzelprobe einer Partie untersucht werden soll und erwiesen ist, dass für das
zu untersuchende Lebensmittel das Zusammenfügen mehrerer Einzelproben keine Auswirkungen auf
das Ergebnis hat, dürfen Einzelproben zu einer Sammelprobe zusammengefügt werden, um den Unter-
suchungsaufwand zu verringern.
BEISPIEL Wenn zehn Einzelproben zu je 25 g untersucht werden sollen, werden die zehn Einzelproben zu einer
Sammelprobe von 250 g zusammengefügt und anschließend 2,25 l Voranreicherungsmedium zugegeben. Alternativ
dürfen auch nach getrennter Voranreicherung von zehn Einzelproben jeweils 10 ml zu einer Sammelprobe zusammen-
gefügt werden. Aus diesem Ansatz von 100 ml werden dann die Nährmedien für die selektive Anreicherung beimpft.

8.2 Voranreicherung
Die nach 8.1 vorbereiteten Proben werden mit der neunfachen Menge des auf etwa 37 °C erwärmten
Nährmediums für die Voranreicherung nach 5.2.1 gründlich vermischt und — falls erforderlich — zusätz-
lich mit einem Mischgerät nach 6.2 unter sterilen Bedingungen homogenisiert.
Die Proben werden nach Erreichen einer Temperatur von 37 °C 16 h bis 20 h bebrütet.
Es ist sicherzustellen, dass der pH-Wert vor Ende der Bebrütungsdauer nicht unter 4,5 absinkt. In einem
solchen Falle oder wenn die Begleitflora das Salmonellenwachstum beeinflusst, ist die Voranreicherung
frühestens nach 6 h zu beenden und nach 8.3 weiterzuverfahren.
ANMERKUNG Bei besonders schwer löslichen Proben, wie z. B. Casein, kann ein ständiges Rühren notwendig
sein. Bei Produkten mit einer erfahrungsgemäß größeren Anzahl anderer Mikroorganismen, wie z. B. Frischfleisch
und Hackfleisch, kann eine mindestens sechsstündige Voranreicherung ausreichend sein.

8.3 Anreicherung
8.3.1 Allgemeines
In Abhängigkeit vom Messprinzip werden zwei der unter 5.2.2 genannten Nährmedien für die Anreiche-
rung parallel eingesetzt. Die beiden Nährmedien sind nach Möglichkeit so auszuwählen, dass sie sich
auf Grund ihrer Selektivität und/oder Bebrütungsbedingungen und/oder Anwachsraten in ihrem Wir-
kungsspektrum ergänzen. Die Bebrütung sollte bei den Anreicherungsmedien nach 5.2.2.3 und 5.2.2.4
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in dem Temperaturbereich 35 °C bis 37 °C und bei dem Anreicherungsmedium nach 5.2.2.2 in dem Tem-
peraturbereich 40 °C bis 42 °C über jeweils mindestens 18 h erfolgen.
ANMERKUNG Es empfiehlt sich, zumindest beim Einsatz neu hergestellter Nährmedienchargen, als Positivkon-
trolle jeweils eine Messzelle mit Anreicherungsmedium, das mit einer bekannten Salmonella-Serovar beimpft wurde,
mitzuführen. In Abhängigkeit vom eingesetzten Messsystem und der dazugehörigen Software empfiehlt sich auch,
eine mit dem gleichen Volumen destilliertes Wasser oder Glycerin oder einer Wasser-Glycerin-Mischung im Verhält-
nis 1 : 1 beschickte Messzelle zur Kontrolle der Temperaturkonstanz mitzuführen.

8.3.2 Durchführung
Aus dem bebrüteten Nährmedium nach 8.2 werden Messzellen, welche die in 5.2.2 genannten Nähr-
medien für die Anreicherung enthalten, beimpft. Das Beimpfungsverhältnis dieser Probenflüssigkeit
(Volumen des vorzulegenden Anreicherungsnährmediums und Volumen der hinzuzufügenden Voran-
reicherung) richtet sich nach dem vorliegenden Impedanzmesssystem.
Die Messzellen werden verschlossen und zur Inkubation in die Bebrütungseinheit verbracht. Die
Bebrütungsbedingungen sind von der Art des verwendeten Anreicherungsmediums abhängig.
Als Negativkontrolle (Leerwert) wird jeweils eine Messzelle mit unbeimpftem Anreicherungsmedium bei
der entsprechenden Temperatur mitgeführt.
Vor Beginn der Messung werden die für die jeweilige Impedanzmesseinrichtung spezifischen Einstellun-
gen (z. B. Messdauer, Messintervall, Schwellenwert) am Rechner vorgenommen. Danach können die
Messungen nach den Vorgaben des Systemherstellers gestartet und die Daten zur Identifizierung der
Proben (z. B. Probennummer, Probenart, Messplatznummer in der jeweiligen Bebrütungseinheit) in den
Rechner eingegeben werden.

8.4 Auswertung der Messergebnisse

Die Auswertung der Messergebnisse ist vom jeweiligen Messprinzip abhängig und erfolgt rechner-
gestützt. Als Grundlage werden die durch mikrobiell bedingte Änderungen der Messgrößen entstehen-
den Kurvenverläufe herangezogen.
Die auszuwertenden Kenngrößen (z. B. Schwellenwert, Detektionszeit, Steigung der Kurve während der
logarithmischen Wachstumsphase der Kultur, Minima oder Maxima der Kurve) zeigen an, ob ein für die
Anwesenheit von Salmonellen in der Probenflüssigkeit auffälliger Kurvenverlauf vorliegt. Ist dies nach
Ablauf der eingestellten Messdauer (Ende der Bebrütung) der Fall, wird die entsprechende Probe als
verdächtig eingestuft. Die Kultur nach 8.5 wird subkultiviert, um eventuell vorhandene Salmonellen zu
isolieren.
Werden vorgegebene Kenngrößen im Verlauf der Impedanzkurve nach Abschluss der Messung nicht
erreicht, ist der Salmonellennachweis negativ.

8.5 Isolierung
8.5.1 Aus den Messzellen mit den nach 8.4 als verdächtig eingestuften Proben wird Probenflüssigkeit
fraktioniert auf Brillantgrün-Phenolrot-Agar nach 5.2.3.1 ausgestrichen.
Zusätzlich kann ein weiterer fester, selektiver Nährboden nach 5.2.3.2 beimpft werden.

8.5.2 Die beimpften Platten werden 18 h bis 24 h bei 37 °C bebrütet.

8.5.3 Danach werden die Platten auf salmonellaverdächtige Kolonien untersucht. Falls nur leichter
Bewuchs bzw. keine salmonellaverdächtigen Kolonien festgestellt werden, sollten die Platten nochmals
nach 8.5.2 bebrütet und anschließend erneut auf salmonellaverdächtige Kolonien untersucht werden.
Auf Brillantgrün-Phenolrot-Agar (5.2.3.1) erscheinen lactose-negative Salmonellen als blassrosa Kolo-
nien mit rotem Hof.

8.6 Identifizierung
8.6.1 Allgemeines
Die Vorprüfung verdächtiger Kolonien auf ihre Zugehörigkeit zur Gattung der Salmonellen wird mit amt-
lich geprüften omni- oder polyvalenten Salmonella-Antiseren vorgenommen.
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Zur Überprüfung des biochemischen Verhaltens von Reinkulturen salmonellaverdächtiger Kolonien

können an Stelle der in DIN EN 12824 verwendeten Verfahren auch im Handel erhältliche Schnelltests
verwendet werden, sofern es sich um wissenschaftlich erprobte Verfahren handelt. Es können sowohl
Schnelltests zur Durchführung enzymatischer Sofortreaktionen als auch Testsysteme eingesetzt werden,
die zuvor beimpft und anschließend bebrütet werden müssen.
Zur Identifizierung salmonellaverdächtiger Isolate dürfen auch molekularbiologische Schnelltests ver-
wendet werden.

8.6.2 Auswahl der Kolonien für die Identifizierung

Agglutinierende Kolonien werden auf einem vorgetrockneten Nähragar nach 5.2.4.1 so ausgestrichen,
dass sich gut isolierte Einzelkolonien entwickeln können.
Auch nur schwach oder untypisch agglutinierte verdächtige Kolonien sind auf einem vorgetrockneten
Nähragar nach 5.2.4.1 entsprechend zu subkultivieren.
Die beimpften Platten werden bei 37 °C 18 h bis 24 h bebrütet. Für den biochemischen und serologischen
Nachweis werden ausschließlich Einzelkolonien verwendet.

8.6.3 Biochemische Identifizierung

Mit den nach 8.6.2 aus einer salmonellaverdächtigen Reinkultur erhaltenen Einzelkolonien bzw. mit einer
daraus hergestellten Suspension (Verwendung der physiologischen Kochsalzlösung nach 5.2.4.3) wird
das biochemische Verhalten überprüft. Sofern enzymatische Schnelltests oder ein handelsübliches Test-
system zur Identifizierung von Salmonellen (siehe 8.6.1) verwendet werden, ist nach den Vorschriften
des Herstellers zu verfahren.

8.6.4 Serologische Identifizierung

8.6.4.1 Allgemeines
Geprüft werden salmonellaverdächtige Kolonien nach 8.6.2 auf Selbstagglutination in physiologischer
Kochsalzlösung sowie auf Anwesenheit von Salmonella-Antigenen durch die Agglutination mit amtlich
geprüften Salmonella-Faktoren-Seren nach dem folgenden Verfahren:

8.6.4.2 Entfernen der selbstagglutinierenden Stämme

Ein Tropfen physiologischer Kochsalzlösung nach 5.2.4.3 wird auf einen sorgfältig gereinigten Objektträ-
ger gebracht. In diesem Tropfen wird ein Teil einer Einzelkolonie nach 8.6.2 dispergiert, sodass eine
homogene und trübe Suspension entsteht.
Der Objektträger wird 30 s bis 60 s vorsichtig bewegt. Die Reaktionen werden gegen einen dunklen Hin-
tergrund vorzugsweise mit Hilfe eines Vergrößerungsglases beobachtet.
Die Stämme werden als selbstagglutinierend angesehen, wenn die Bakterien zu mehr oder weniger
deutlichen Einheiten zusammengeklumpt sind.
Die serologische Identifizierung dieser selbstagglutinierenden Stämme mit den in 8.6.4.3 bis 8.6.4.5
beschriebenen Verfahren ist unmöglich.

8.6.4.3 Prüfung des O-Antigens

Es sind reine, nicht selbstagglutinierende Kolonien zu verwenden.
Die Untersuchung wird wie in 8.6.4.2 beschrieben durchgeführt. An Stelle der physiologischen Koch-
salzlösung ist jedoch Anti-O-Serum nach 5.3 zu verwenden.

8.6.4.4 Prüfung des H-Antigens

Der halbfeste Nähragar nach 5.2.4.2 wird mit einer reinen, nicht selbstagglutinierenden Kolonie beimpft
und anschließend bei 37 °C mindestens 18 h bebrütet.
Mit dieser Kultur wird die Untersuchung wie in 8.6.4.2 beschrieben durchgeführt. An Stelle der physiolo-
gischen Kochsalzlösung ist jedoch ein Tropfen Anti-H-Serum zu verwenden.
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DIN 10120:2001-07

8.6.4.5 Bewertung der Agglutination

Falls Agglutinationen auftreten, werden die Reaktionen als positiv angesehen.

9 Auswertung
9.1 Auswertungsschema
Die Auswertung der biochemischen und serologischen Reaktionen (siehe 8.6.3 und 8.6.4) erfolgt nach
Tabelle 1.
Tabelle 1

Biochemische Selbstagglu- Serologische

Interpretation
Reaktionen tination Reaktionen
Stämme sind wahr-
Typisch Nein O-, Vi- oder H-antigenpositiv
scheinlich Salmonellen
Typisch Nein Alle Reaktionen sind negativ
Es kann sich um
Typisch Ja Nicht untersucht (siehe 8.6.4.2)
Salmonellen handeln
Keine typischen Reaktionen Nein O-, Vi- oder H-antigenpositiv
Stämme werden nicht als
Keine typischen Reaktionen Nein Alle Reaktionen sind negativ
Salmonellen angesehen

9.2 Endgültige Bestätigung

Isolate, die beim Nachweis von Salmonellen als Salmonellen angesehen werden oder bei denen es sich
um Salmonellen handeln kann, müssen zur endgültigen Bestätigung einem anerkannten Referenzlabo-
ratorium 2) übergeben werden.
Stämme, die auf Grund der typischen biochemischen Reaktionen, der positiven serologischen Reaktionen
nach DIN EN 12824:1998-02, 9.5.3, und einer vollständigen Identifizierung nach dem Kauffmann-White-
Schema als Salmonellen erkannt wurden, müssen nicht, können aber an das Referenzlaboratorium
gesandt werden.

10 Untersuchungsbericht
10.1 Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Norm mindestens anzugeben:
a) Art, Bezeichnung und Menge der Probe;
b) Art und Datum der Probenahme;
c) Stichprobenumfang (Anzahl der untersuchten Einzel- und Sammelproben);
d) Angaben zum zweiten festen, selektiven Nährboden, gegebenenfalls Name und Anschrift des Refe-
renzlaboratoriums, das bei der Identifizierung der Stämme mitgewirkt hat;
e) gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Norm;
f) gegebenenfalls Angaben zur vorzeitigen Beendigung der Voranreicherung;
g) Untersuchungsdatum.

10.2 Die Untersuchungsergebnisse werden unter Angabe der Bezugsgröße wie folgt formuliert:
– „Keine Salmonellen isoliert“ oder
– „Salmonellen aus … Einzelproben isoliert (Angabe der Nummern der positiven Proben). Die nachge-
wiesenen Salmonellen gehören zu folgenden Serovaren: …“/„Die serologische Differenzierung der
nachgewiesenen Salmonellen ist noch nicht abgeschlossen; das endgültige Differenzierungsergebnis
wird später mitgeteilt.“ (Nichtzutreffendes streichen).

2) Zuständiges Referenzlaboratorium für Salmonellen im Lebensmittelbereich: Nationales Referenzlaboratorium für

Salmonellen (NRL-Salm) am Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz (BgVV), Diedersdorfer Weg 1,
12277 Berlin