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DIN 10118 {
ICS 07.100.30
Gesamtumfang 20 Seiten
Inhalt
Seite
Vorwort............................................................................................................................................................ 3
1 Anwendungsbereich......................................................................................................................... 3
2 Normative Verweisungen ................................................................................................................. 3
3 Begriffe............................................................................................................................................... 3
4 Kurzbeschreibung............................................................................................................................. 4
5 Chemikalien, Reagenzien und Nährböden ..................................................................................... 5
6 Geräte und Hilfsmittel..................................................................................................................... 14
7 Probenahme .................................................................................................................................... 16
8 Probenvorbereitung........................................................................................................................ 16
9 Durchführung .................................................................................................................................. 16
10 Bestätigung von VTEC ................................................................................................................... 18
11 Auswertung ..................................................................................................................................... 18
12 Untersuchungsbericht.................................................................................................................... 18
Anhang A (normativ) Ausstreichen der Probe für den VT-Kolonie-Immunoblot................................... 20
Literaturhinweise ......................................................................................................................................... 20
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DIN 10118:2004-06
Vorwort
Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), Arbeits-
ausschuss Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschließlich Schnellverfahren", erarbeitet.
1 Anwendungsbereich
Diese Norm legt ein Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von Verotoxin-bildenden E.coli-Stämmen
(VTEC) in Lebensmitteln tierischen Ursprungs fest.
ANMERKUNG Für den Begriff Verotoxin wird synonym auch Shigatoxin, für Verotoxin-bildende E.coli
entsprechend Shigatoxin-bildende E.coli (STEC) verwendet.
2 Normative Verweisungen
Diese Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen.
Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind
nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen
dieser Publikationen nur zu dieser Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind.
Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikationen
(einschließlich Änderungen).
DIN EN ISO 6887-1 Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von
Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdünnungen und von Dezimalverdünnungen für
mikrobiologische Untersuchungen Teil 1: Allgemeine Regeln für die Herstellung von Erstverdünnungen
und Dezimalverdünnungen (ISO 6887-1:1999); Deutsche Fassung EN ISO 6887-1:1999.
DIN EN ISO 6887-2 Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von
Untersuchungsproben, von Erstverdünnungen und von Dezimalverdünnungen für mikrobiologische
Untersuchungen Teil 2: Spezifische Regeln für die Vorbereitung von Fleisch und Fleischerzeugnissen
(ISO 6887-2:2003); Deutsche Fassung EN ISO 6887-2:2003.
DIN EN ISO 8261 Milch und Milchprodukte Allgemeiner Leitfaden für die Vorbereitung von
Untersuchungsproben und die Herstellung von Anschüttelungen und Dezimalverdünnungen für
mikrobiologische Untersuchungen (ISO 8261:2001); Deutsche Fassung EN ISO 8261:2001.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examinations.
ISO 7218 AMD1, Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological
examinations; Amendment 1.
3 Begriffe
Für die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe.
3.1
Verotoxin-bildende E.coli
Mikroorganismen, die Verotoxin(e) bilden und bei der Untersuchung nach diesem Verfahren die hier
beschriebenen immunchemischen und biochemischen Eigenschaften besitzen
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DIN 10118:2004-06
3.2
immunchemische Verfahren
3.2.1
immunologisches Testsystem
Testsystem, bei dem Antigene oder Antikörper an eine feste Phase gebunden sind. Der Nachweis
korrespondierender Antikörper oder Antigene erfolgt über eine Antigen-Antikörper-Reaktion, die direkt oder
über Folgereaktionen mittels enzym- oder anders markierter (z. B. über Gold- oder Latexpartikel) Antikörper
oder Antigene nachgewiesen wird
3.2.2
Verotoxin (VT)-Kolonie-Immunoblot
Verfahren, das aufgrund einer speziellen Doppelmembran-Technik nach Beimpfung, Inkubation und
Durchführung eines immunologischen Reaktionsschrittes mit anschließender Farbreaktion die Identifikation
und Isolierung der gesuchten Bakterienspezies über den Nachweis des gebildeten Toxins ermöglicht
4 Kurzbeschreibung
Der Nachweis und die Isolierung von VTEC erfordert mehrere, nachfolgend aufgeführte Arbeitsschritte.
4.1 Voranreicherung
WARNUNG Carbadox und Mitomycin C sind gesundheitsschädlich. Bei der Behandlung von
Carbadox und Mitomycin C müssen geeignete Sicherheitsmaßnahmen angewendet werden.
Aus der Anreicherungskultur erfolgt der Nachweis von Verotoxinen mit Hilfe eines immunchemischen
Verfahrens, z. B. Enzyme-Immuno-Assay (EIA) oder Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA).
4.4 Isolierung
Bei einem nach 4.3 positiven Testergebnis werden die präsumtiven Verotoxin-bildenden E.coli mittels
Immunoblot-Verfahren isoliert. Dazu werden aus der aufbereiteten Voranreicherung (9.4.2) 0,1 ml auf
Syncase-Agar mit Enhancer (5.4.1) ausgestrichen und 18 h bei 37 °C bebrütet. Nach Durchführung eines
immunologischen Reaktionsschrittes mit anschließender Färbung werden bis zu 10 Kolonien mit positiver
Farbreaktion weitergehend untersucht.
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Die Nährbodenbestandteile und Chemikalien müssen für mikrobiologische und immunchemische Zwecke
geeignet sein. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, sollten eindeutig deklarierte Nährboden-
bestandteile und analysenreine Chemikalien oder Trockennährböden verwendet werden. Den Anwei-
sungen des Herstellers ist strikt zu folgen. Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgeräten
destilliert oder demineralisiert und mindestens von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestand-
teile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen.
ANMERKUNG Geeignete Fertignährmedien, Reagenzien oder Testkits sind im Fachhandel erhältlich und dürfen
eingesetzt werden, soweit sie in ihrer Zusammensetzung den beschriebenen Nährmedien, Reagenzien und Testkits
entsprechen oder nur geringfügig bei vergleichbarer Wirksamkeit von diesen abweichen.
5.2.1.1 Grundmedium
5.2.1.1.1 Zusammensetzung
D(+)-Glucose 2,5 g
Natriumchlorid 5g
Dikaliumhydrogenphosphat 4g
Gallensalze 1,5 g
Wasser 1 000 ml
5.2.1.1.2 Herstellung
Die Bestandteile werden in der angegebenen Wassermenge gelöst und 15 min in einem Autoklaven (6.4)
bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterilisieren bei 7,3 ± 0,2
liegt, bezogen auf eine Temperatur von 25 °C.
Das Grundmedium ist luftdicht verschlossen bei 5 °C ± 3 °C für mindestens acht Wochen lagerungsfähig.
ANMERKUNG 1 Der pH-Wert sollte vor dem Sterilisieren auf 7,6 bis 7,7 eingestellt werden.
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5.2.1.2 Novobiocin-Supplement
5.2.1.2.1 Zusammensetzung
Novobiocin-Lösung, ρ = 10 mg/ml1)
5.2.1.2.2 Herstellung
Das Novobiocin wird in der in 5.2.1.2.1 angegebenen Konzentration in Wasser gelöst. Die Lösung wird
sterilfiltriert (6.30) und ist sofort nach Herstellung zu verwenden.
Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C oder -80 °C aufbewahrt werden. Nach dem Auftauen muss sie
sofort verwendet werden.
5.2.1.3.1 Zusammensetzung
Novobiocin-Lösung (5.2.1.2) 1 ml
5.2.1.3.2 Herstellung
Dem auf 45 °C bis 50 °C abgekühlten Grundmedium wird je Liter 1 ml Supplement (5.2.1.2) zugesetzt. Das
vollständige Nährmedium ist am Tage der Herstellung zu verwenden.
ANMERKUNG Novobiocin-Stammlösungen mit anderen Konzentrationen dürfen verwendet werden, sofern die
Endkonzentration des Novobiocins im gebrauchsfertigen Nährmedium nicht verändert wird.
5.3.1.1 Grundmedium
5.3.1.2.1 Zusammensetzung
1) ρ Massenkonzentration
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Das Mitomycin C wird in der in 5.3.1.2.1 angegebenen Konzentration in sterilem Wasser gelöst. Die
Stammlösung kann portioniert bis zu sechs Monate bei mindestens 20 °C gelagert werden.
Andere vergleichbar wirksame Enhancer können verwendet werden, wenn deren Wirkung auf die
Verotoxinexpression nachgewiesen worden ist.
5.3.1.3.1 Zusammensetzung
oder
Carbadox-Lösung (5.3.1.2.3) 1 ml
5.3.1.3.2 Herstellung
Das Medium wird in 4-ml-Anteilen in Polypropylenröhrchen oder ähnlich großen Gefäßen (6.20) steril
abgefüllt.
ANMERKUNG Das vollständige Nährmedium kann bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C bis zu acht Wochen
aufbewahrt werden.
5.4.1.1 Grundmedium
2) c Stoffmengenkonzentration
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5.4.1.1.1 Zusammensetzung
Caseinhydrolysat, säurehydrolysiert 10 g
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) 5g
Wasser 1 000 ml
5.4.1.1.2 Herstellung
Die Bestandteile werden in der angegebenen Wassermenge gelöst und 15 min in einem Autklaven (6.4) bei
121 °C ± 1 °C sterilisiert. Nach Abkühlen auf 25 °C muss das Nährmedium einen pH-Wert von 8,0 ± 0,1
haben. Zur Einstellung des pH-Wertes sind etwa 50 ml NaOH, c(NaOH) = 1 mol/l2), oder entsprechende
Mengen anderer Konzentrationen erforderlich.
5.4.1.2 Supplemente
5.4.1.2.1 L-Tryptophan/Nikotinsäure-Lösung
5.4.1.2.1.1 Zusammensetzung
L-Tryptophan 0,4 g
Nikotinsäure 0,2 g
Wasser 100 ml
5.4.1.2.1.2 Herstellung
Die Bestandteile werden in der angegebenen Wassermenge gelöst und sterilfiltriert (6.30). Die Lösung
kann luftdicht verschlossen und dunkel bis zu vier Wochen bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C
aufbewahrt werden.
2) c Stoffmengenkonzentration
3) ω Massenanteil
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5.4.1.2.2 Glucose-Lösung
5.4.1.2.2.1 Zusammensetzung
Glucose 50 g
Wasser 100 ml
5.4.1.2.2.2 Herstellung
Die Glucose wird in Wasser gelöst und 15 min in einem Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert. Die
Lösung kann luftdicht verschlossen und dunkel bis zu sechs Monate bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C
aufbewahrt werden.
5.4.1.2.3 Enhancer-Lösung
nach 5.3.1.2
5.4.1.3.1 Zusammensetzung
L-Tryptophan/Nikotinsäure-Lösung (5.4.1.2.1) 10 ml
Glucose-Lösung (5.4.1.2.2) 4 ml
Carbadox-Lösung (5.3.1.2) 1 ml
5.4.1.3.2 Herstellung
Das Grundmedium wird auf etwa 50 °C abgekühlt. Unmittelbar vor der Herstellung werden zum
Grundmedium die L-Tryptophan/Nikotinsäure-Lösung, Glucose-Lösung und die Mitomycin-Stammlösung
oder alternativ die Carbadox-Lösung gegeben.
ANMERKUNG Andere Enhancer dürfen verwendet werden, sofern ihre Eignung zur Steigerung der Verotoxin-
expression nachgewiesen ist.
Das vollständige Nährmedium wird gemischt und in 18-ml- bis 22-ml-Anteilen in Petrischalen übergeführt.
Das Medium wird zum Verfestigen stehengelassen. Die fertig hergestellten Platten können dunkel bei
5 °C ± 3 °C bis zu acht Wochen aufbewahrt werden.
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5.5 Verotoxinnachweissystem
5.5.2.1.1 Zusammensetzung
NaCl 5g
Wasser 1 000 ml
5.5.2.1.2 Herstellung
Die Salze werden in der angegebenen Menge Wasser gelöst. Die fertige Lösung wird 15 min in einem
Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert. Sie ist dann bis zu 12 Wochen bei einer Temperatur von
5 °C ± 3 °C haltbar.
5.5.2.2 PBS/Tween-Lösung
5.5.2.2.1 Zusammensetzung
®
Tween 20 4) 0,5 ml
5.5.2.2.2 Herstellung
®4)
Die angegebene Menge Tween 20 wird in der angegebenen Menge PBS gelöst und gründlich
homogenisiert. Die fertige Lösung ist mindestens acht Wochen bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C
haltbar.
5.5.2.3 Blocklösung
5.5.2.3.1 Zusammensetzung
Magermilchpulver 0,6 g
®
4) Tween 20 ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung
der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch DIN.
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5.5.2.3.2 Herstellung
Die angegebene Menge Magermilchpulver wird in der angegebenen Menge PBS/Tween gelöst. Die Lösung
ist maximal 24 h vor Gebrauch herzustellen und bei 5 °C ± 3 °C zu lagern.
5.5.2.4.1 Zusammensetzung
Natriumchlorid 5,844 g
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 12,11 g
Wasser 1 000 ml
5.5.2.4.2 Herstellung
Die angegebenen Salze werden in der angegebenen Menge Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung
beträgt 9,5 ± 0,2. Die fertige Lösung ist bis zu acht Wochen bei 5 °C ± 3 °C haltbar.
5.5.2.5 Farbreagenz
5.5.2.5.1 Zusammensetzung
AP-Puffer (5.5.2.4) 10 ml
5.5.2.5.2 Herstellung
BCIP und NBT werden maximal 1 h vor Verwendung in dem AP-Puffer gelöst. Das fertige Substrat ist
dunkel zu stellen.
ANMERKUNG 1 Es empfiehlt sich, für beide Substanzen Stammlösungen (0,5 g NBT/10 ml Dimethylformamid (DMF),
ω = 70 %3) und 0,5 g BCIP/10 ml Wasser) zu verwenden. Die Stammlösungen sind bei 5 °C ± 3 °C im Dunkeln zu
lagern.
3) ω Massenanteil
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5.5.2.6 Stopplösung
5.5.2.6.1 Zusammensetzung
EDTA-Na2 7,44 g
5.5.2.6.2 Herstellung
7,44 g EDTA-Na2 werden in 1000 ml PBS gelöst. Die Lösung ist bis zu acht Wochen bei Raumtemperatur
haltbar.
5.5.2.8 Konjugat
5.5.2.9 Referenzstämme
E.coli ATCC 700376 (Referenzstamm für VT 1)
E.coli ATCC 700377 (Referenzstamm für VT 2)
E.coli ATCC 25922 (VT-negativ)
5.6 Nähragar
5.6.1 Zusammensetzung
Fleischextrakt 3,0 g
tierisches und
pflanzliches Gewebe,
enzymatisch verdaut 5,0 g
Wasser 1000 ml
a je nach Geliereigenschaften
5.6.2 Herstellung
Die Bestandteile oder das vollständige Trockenmedium werden in Wasser, falls erforderlich, unter
Erwärmen, gelöst. Der pH-Wert wird, falls erforderlich, so eingestellt, dass er bei 25 °C nach dem
Sterilisieren pH = 7,0 ± 0,2 beträgt.
Das Medium wird in Kolben oder Flaschen (6.31) geeigneter Kapazität gegeben.
Das Medium wird 15 min in einem Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert.
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Etwa 15 ml des geschmolzenen und auf 44 °C bis 47 °C (6.10) abgekühlten Mediums (5.6.2) werden in
Petrischalen übergeführt und zum Verfestigen stehengelassen.
Direkt vor der Verwendung werden die Agarplatten getrocknet, vorzugsweise ohne Deckel und mit der
Agaroberfläche nach unten. Die Trocknung erfolgt im Brutschrank bei einer Temperatur zwischen 25 °C
und 50 °C (6.7), bis die Wassertröpfchen von der Oberfläche des Mediums verschwunden sind. Eine
weitere Trocknung darf nicht erfolgen. Die Agarplatten können auch in einer Sicherheitswerkbank mit
Laminarströmung für 30 min mit halb offenem Deckel oder über Nacht mit aufliegendem Deckel getrocknet
werden.
Wenn die Agarplatten nicht unmittelbar nach der Herstellung verwendet werden, dürfen sie ungetrocknet im
Dunkeln in einer Plastiktüte oder einem anderen Feuchtigkeit zurückhaltenden Behältnis im Kühlschrank
bei 5 °C ± 3 °C bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden.
5.7 Trypton/Tryptophanmedium
5.7.1 Zusammensetzung
Caseinpepton,
enzymatisch verdaut
(Trypton) 10,0 g
Natriumchlorid 5,0 g
DL-Tryptophan 1,0 g
Wasser 1 000 ml
5.7.2 Herstellung
Die Bestandteile werden in Wasser gelöst, falls erforderlich unter Aufkochen. Der pH-Wert wird so
eingestellt (6.8), dass er bei 25 °C nach dem Sterilisieren pH = 7,5 ± 0,2 beträgt.
Das Medium wird in 5-ml-Teilmengen in geeignete Kulturröhrchen oder Flaschen (6.31) gegeben.
Das Medium wird 15 min in einem Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert.
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5.8.1 Zusammensetzung
4-Dimethylaminobenzaldehyd 5,0 g
5.8.2 Herstellung
Das Reagenz muss hellgelb bis hellbraun gefärbt sein und darf keinen Niederschlag aufweisen.
6.1 Allgemeines
Alle Glasgeräte, Kunststoffgeräte und Hilfsmittel müssen vor Verwendung sorgfältig gereinigt und steril
sein.
6.2 Analysenwaage
1) ρ Massenkonzentration
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6.14 Reagenzglasschüttler
6.19 Petrischalen aus Glas oder Kunststoff, Durchmesser zwischen 90 mm und 100 mm
6.21 Flachpinzette
6.29 Drigalski-Spatel
6.31 Kulturröhrchen, Kolben oder Flaschen, von geeignetem Nennvolumen zur Herstellung von
Verdünnungen und vollständigen Medien
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7 Probenahme
Es ist wichtig, dass das Untersuchungslabor eine repräsentative Probe erhält, die während des Transports
oder der Lagerung nicht beschädigt oder verändert wird. Ein Teil der Probe sollte für eventuelle
Nachuntersuchungen tiefgekühlt gelagert werden.
Die Probenahme wird nicht in dieser Norm festgelegt. Liegt keine spezifische Norm für die Probenahme
des betreffenden Produktes vor, wird den beteiligten Vertragspartnern empfohlen, diesbezüglich eine
Vereinbarung zu treffen.
8 Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung erfolgt nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2 oder DIN EN ISO 8261.
9 Durchführung
Siehe DIN EN ISO 6887-1 und die für die Untersuchungsprobe geeignete Norm DIN EN ISO 6887-2 oder
DIN EN ISO 8261.
9.2 Voranreicherung
25 g der nach Abschnitt 8 und 9.1 vorbereiteten Probe werden unter sterilen Bedingungen zu 225 ml
modifizierter Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon mit Zusatz von Novobiocin (5.2.1.3), jeweils
vortemperiert auf 37 °C, hinzugefügt, in sterilen Kunststoffbeuteln im Beutel-Walkmischgerät (6.6) für zwei
min bei mittlerer Geschwindigkeit homogenisiert und in einem Erlenmeyerkolben (6.25) 6 h im
Schüttelinkubator bei 37 °C und 100 min-1 Umdrehungen (6.12) inkubiert.
9.3 Verotoxinnachweis
9.3.1 Anreicherung
1 ml der Voranreicherungskultur (9.2) werden unter sterilen Bedingungen zu 4 ml mTSB mit Zusatz von
Mitomycin C oder eines anderen Enhancers (5.3) gegeben und in einem kleinen Polypropylenröhrchen
1 -1
(6.20) 16 h bis 18 h im Schüttelinkubator (6.13) bei 37 °C und 160 min bis 180 min bewegt.
Aus der nach 9.3.1 hergestellten Anreicherungskultur wird nach Vorschrift des verwendeten
immunologischen Testsystems (5.5.1) ein entsprechendes Volumen entnommen und im Test eingesetzt.
Wird die untersuchte Anreicherungskultur mit dem immunologischen Testsystem als Verotoxin-positiv
beurteilt, sind die Isolierung (9.4) und Bestätigung (Abschnitt 10) der VTEC vorzunehmen. Reagiert die
Anreicherungskultur im immunologischen Testsystem Verotoxin-negativ, ist die untersuchte
Lebensmittelprobe als Verotoxin-negativ zu bewerten.
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9.4.1 Allgemeines
Die Isolierung potentieller VTEC erfolgt über den Nachweis der Verotoxin-Bildung im Immunoblot-Verfahren
mit anschließender Identifizierung als E.coli.
Zur Untersuchung dient in der Regel die Voranreicherungskultur nach 9.2. Zur Entfernung von
Begleitprotein und Fett werden 1 ml Voranreicherungskultur 3 min bei 10 000 min-1 zentrifugiert. Der
Überstand wird vorsichtig entfernt. Mit einem Wattetupfer wird gegebenenfalls das am Gefäßrand
befindliche Fett entfernt. Danach werden 1 ml PBS (5.5.2.1) zugegeben, und das Sediment wird gründlich
resuspendiert. Die Probe kann sofort eingesetzt oder 24 h bei einer Temperatur von 4 °C bis zum Vorliegen
des Ergebnisses des Verotoxin-Nachweises nach 9.3.2 zwischengelagert werden.
9.4.3 Bakterienkultivierung
Auf den Syncase-Agar mit Enhancer-Supplement (5.4.1) werden eine NCMembran (6.22) und darüber
deckungsgleich im Raster eine CA-Membran (6.23) luftblasenfrei durch Andrücken mit sterilem Drigalski-
Spatel (6.29) aufgelegt. Die CA-Membran muss vor dem Auflegen beschriftet und eventuell mit
Markierungen versehen werden. 0,1 ml der Voranreicherungskultur nach 9.2 werden auf die obere
Membran aufgetragen und mit einer sterilen Glaspipette wie im Anhang A, Bild A.1 dargestellt, verteilt.
Die Referenzstämme (5.5.2.9) werden auf einem separaten Membranabschnitt punktförmig aufgebracht.
Die Agarplatten-Membran-Kombination wird 18 h bei 37 °C inkubiert.
Die CA-Membran mit den gewachsenen Kolonien (9.4.3) wird abgehoben und die darunterliegende NC-
Membran vom Agar abgenommen. Anschließend wird die CA-Membran wieder auf den Agar gelegt. Alle
nachfolgenden Schritte des Blots erfolgen bei Raumtemperatur unter Schütteln in einer Petrischale. Von
allen Lösungen sind je Petrischale etwa 10 ml erforderlich. Nach drei Waschschritten für je 3 min mit
PBS/Tween-Lösung (5.5.2.2) wird die NC-Membran 1 h mit Blocklösung (5.5.2.3) behandelt. Es folgt eine
Inkubation von 90 min mit einem Gemisch monoklonaler Antikörper (5.5.2.7).
Nach 4-maligem Waschen mit PBS/Tween-Lösung (5.5.2.2) für je 3 min wird die Membran mit dem
Konjugat (5.5.2.8) für 60 min inkubiert.
Die Membran wird erneut fünf mal mit PBS/Tween-Lösung (5.5.2.2) gewaschen. Anschließend wird das
Farbreagenz (5.5.2.5) zugegeben, und es erfolgt eine Farbreaktion für 5 min bis 10 min. Die Reaktion wird
durch Zugabe von Stopplösung (5.5.2.6) nach weiteren 30 min Inkubation beendet. Die Membran wird über
Nacht auf einer Glasplatte luftgetrocknet. Sie kann zur Dokumentation dunkel gelagert werden.
Der VT-Kolonie-Immunoblot nach 9.4.4 ist auswertbar, wenn die positiven Referenzstämme durch einen
deutlich sichtbaren rotvioletten Fleck auf der NC-Membran angezeigt werden. Der Verotoxin-negative
Referenzstamm darf nicht angefärbt sein. Die rotvioletten Punkte auf der NC-Membran sind gebundenes
Verotoxin. Sie werden mit Hilfe des Rasters oder durch Einsatz eines geeigneten Ausmessverfahrens den
darüber befindlichen VTEC-Kolonien auf der CA-Membran zugeordnet. Von diesen positiven
Einzelkolonien werden 10 Kolonien subkultiviert. Bei weniger als 10 positiven Einzelkolonien werden alle,
die isoliert werden können, subkultiviert.
Wenn bei zu hohem Keimgehalt Rasenwachstum auftritt und kein Einzelkoloniewachstum erreicht wird,
aber bei der Auswertung des Immunoblots Farbreaktionen erkennbar sind, ist entweder aus dem Verotoxin-
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positiven Bereich ein Verdünnungsausstrich anzulegen oder die Kultivierung der Probe auf dem Syncase-
Agar (5.4.1) in entsprechender Vorverdünnung zu wiederholen. Bei einem negativen Ergebnis des VT-
Kolonie-Immunoblots aus der Voranreicherungskultur ist der Versuch mit einer geeigneten Vorverdünnung
der Anreicherungskultur (9.3.1) zu wiederholen.
Die im VT-Kolonie-Immunoblot positiven Kolonien werden als präsumtiv VTEC-positiv betrachtet. Sie
müssen als Reinkultur angezüchtet und als E.coli bestätigt werden.
Zur Bestätigung werden 10 von den nach 9.4.5 positiven Kolonien so auf der Oberfläche vorgetrockneter
Nähragarplatten (5.6.3) ausgestrichen, dass sich gut voneinander abgesetzte einzelne Kolonien entwickeln
können.
Für die nachfolgend in 10.2 und 10.3 beschriebenen Untersuchungen werden ausschließlich Reinkulturen
von den Nähragarplatten verwendet.
Ein Röhrchen mit Trypton/Tryptophanmedium (5.7) wird mit einer Kolonie von einer Reinkultur des
Nähragars (10.1) beimpft.
1 ml Kovác's Reagenz (5.8) wird in das Röhrchen gegeben, das 10 min bei Raumtemperatur
stehengelassen wird.
Die Bildung einer roten Farbe zeigt eine positive Reaktion an. Eine gelb/braune Färbung zeigt eine
negative Reaktion.
Die Prüfung auf Verotoxinbildung darf mit einem immunologischen Testsystem, siehe 3.2.1, erfolgen. Wenn
der Hersteller/Vertreiber kein spezielles Anzüchtungsverfahren vorschreibt, werden die nach 10.2 als E.coli
-1
bestätigten Isolate in 5 ml mTSB unter Zusatz eines Enhancers (5.3) im Schüttelinkubator bei 160 min bis
-1
180 min für 16 h bis 18 h bei 37 °C angezüchtet. Die Auswertung richtet sich nach den Angaben des
jeweiligen Herstellers/Vertreibers des verwendeten Testsystems (3.2.1).
ANMERKUNG Alternativ kann eine Untersuchung auf Verotoxin-Gene (vtx) erfolgen [1].
11 Auswertung
Wenn das Isolat biochemisch als E.coli bestätigt und die Verotoxinbildung oder das Verotoxin-Bildungs-
vermögen nachgewiesen wurde, ist dieses als VTEC zu bewerten.
12 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Norm mindestens anzugeben:
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Anhang A
(normativ)
Literaturhinweise
[1] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG L 07.18-1, Untersuchung von
Hackfleisch Nachweis, Isolierung und Charakterisierung Verotoxin-bildender Escherichia coli
(VTEC) in Hackfleisch mittels PCR und DNA-Hybridisierungstechnik, Abschnitt 8.1.
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