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DEUTSCHE NORM Juni 2004

DIN 10118 {
ICS 07.100.30

Untersuchung von Lebensmitteln –


Nachweis von Verotoxin-bildenden Escherichia (E.) coli-Stämmen
(VTEC) in Lebensmitteln tierischer Herkunft
Analysis of foodstuffs –
Detection of verotoxine-forming Escherichia (E.) coli-strains (VTEC) in food derived from
animals
Analysis pour produits alimentaires –
Recherche d’embranchement d’Escherichia (E.) coli (VTEC) formant des verotoxines
dans des aliments qui dérivent d’animaux

Gesamtumfang 20 Seiten

Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN


DIN 10118:2004-06

Inhalt

Seite

Vorwort............................................................................................................................................................ 3
1 Anwendungsbereich......................................................................................................................... 3
2 Normative Verweisungen ................................................................................................................. 3
3 Begriffe............................................................................................................................................... 3
4 Kurzbeschreibung............................................................................................................................. 4
5 Chemikalien, Reagenzien und Nährböden ..................................................................................... 5
6 Geräte und Hilfsmittel..................................................................................................................... 14
7 Probenahme .................................................................................................................................... 16
8 Probenvorbereitung........................................................................................................................ 16
9 Durchführung .................................................................................................................................. 16
10 Bestätigung von VTEC ................................................................................................................... 18
11 Auswertung ..................................................................................................................................... 18
12 Untersuchungsbericht.................................................................................................................... 18
Anhang A (normativ) Ausstreichen der Probe für den VT-Kolonie-Immunoblot................................... 20
Literaturhinweise ......................................................................................................................................... 20

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DIN 10118:2004-06

Vorwort
Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), Arbeits-
ausschuss „Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschließlich Schnellverfahren", erarbeitet.

1 Anwendungsbereich
Diese Norm legt ein Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von Verotoxin-bildenden E.coli-Stämmen
(VTEC) in Lebensmitteln tierischen Ursprungs fest.

ANMERKUNG Für den Begriff „Verotoxin“ wird synonym auch „Shigatoxin“, für Verotoxin-bildende E.coli
entsprechend Shigatoxin-bildende E.coli (STEC) verwendet.

2 Normative Verweisungen
Diese Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen.
Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind
nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen
dieser Publikationen nur zu dieser Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind.
Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikationen
(einschließlich Änderungen).

DIN EN ISO 6887-1 Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln — Vorbereitung von
Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdünnungen und von Dezimalverdünnungen für
mikrobiologische Untersuchungen — Teil 1: Allgemeine Regeln für die Herstellung von Erstverdünnungen
und Dezimalverdünnungen (ISO 6887-1:1999); Deutsche Fassung EN ISO 6887-1:1999.

DIN EN ISO 6887-2 Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln — Vorbereitung von
Untersuchungsproben, von Erstverdünnungen und von Dezimalverdünnungen für mikrobiologische
Untersuchungen — Teil 2: Spezifische Regeln für die Vorbereitung von Fleisch und Fleischerzeugnissen
(ISO 6887-2:2003); Deutsche Fassung EN ISO 6887-2:2003.

DIN EN ISO 8261 Milch und Milchprodukte — Allgemeiner Leitfaden für die Vorbereitung von
Untersuchungsproben und die Herstellung von Anschüttelungen und Dezimalverdünnungen für
mikrobiologische Untersuchungen (ISO 8261:2001); Deutsche Fassung EN ISO 8261:2001.

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations.

ISO 7218 AMD1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological
examinations; Amendment 1.

3 Begriffe
Für die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe.

3.1
Verotoxin-bildende E.coli
Mikroorganismen, die Verotoxin(e) bilden und bei der Untersuchung nach diesem Verfahren die hier
beschriebenen immunchemischen und biochemischen Eigenschaften besitzen

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DIN 10118:2004-06

3.2
immunchemische Verfahren

3.2.1
immunologisches Testsystem
Testsystem, bei dem Antigene oder Antikörper an eine feste Phase gebunden sind. Der Nachweis
korrespondierender Antikörper oder Antigene erfolgt über eine Antigen-Antikörper-Reaktion, die direkt oder
über Folgereaktionen mittels enzym- oder anders markierter (z. B. über Gold- oder Latexpartikel) Antikörper
oder Antigene nachgewiesen wird

BEISPIEL Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) oder Enzyme-Immuno-Assay (EIA) oder


immunochromatographischer Assay

3.2.2
Verotoxin (VT)-Kolonie-Immunoblot
Verfahren, das aufgrund einer speziellen Doppelmembran-Technik nach Beimpfung, Inkubation und
Durchführung eines immunologischen Reaktionsschrittes mit anschließender Farbreaktion die Identifikation
und Isolierung der gesuchten Bakterienspezies über den Nachweis des gebildeten Toxins ermöglicht

4 Kurzbeschreibung
Der Nachweis und die Isolierung von VTEC erfordert mehrere, nachfolgend aufgeführte Arbeitsschritte.

4.1 Voranreicherung

Die Lebensmittelprobe wird als Schüttelkultur in modifizierte Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon mit


Novobiocin nach 5.2 für 6 h bei 37 °C bebrütet.

4.2 Anreicherung für gesteigerte Verotoxinexpression

Eine bestimmte Menge der Voranreicherungskultur wird in modifizierte Caseinpepton-Sojamehlpepton-


Bouillon mit Zusatz einer die Verotoxinexpression steigernden Substanz wie Mitomycin C, Carbadox oder
einer vergleichbar wirkenden Substanz (5.3) überführt und 16 h bis 18 h bei 37 °C angereichert.

WARNUNG — Carbadox und Mitomycin C sind gesundheitsschädlich. Bei der Behandlung von
Carbadox und Mitomycin C müssen geeignete Sicherheitsmaßnahmen angewendet werden.

4.3 Nachweis von Verotoxin(en)

Aus der Anreicherungskultur erfolgt der Nachweis von Verotoxinen mit Hilfe eines immunchemischen
Verfahrens, z. B. Enzyme-Immuno-Assay (EIA) oder Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA).

4.4 Isolierung

Bei einem nach 4.3 positiven Testergebnis werden die präsumtiven Verotoxin-bildenden E.coli mittels
Immunoblot-Verfahren isoliert. Dazu werden aus der aufbereiteten Voranreicherung (9.4.2) 0,1 ml auf
Syncase-Agar mit Enhancer (5.4.1) ausgestrichen und 18 h bei 37 °C bebrütet. Nach Durchführung eines
immunologischen Reaktionsschrittes mit anschließender Färbung werden bis zu 10 Kolonien mit positiver
Farbreaktion weitergehend untersucht.

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5 Chemikalien, Reagenzien und Nährböden


5.1 Allgemeines

Zur üblichen Laborpraxis siehe ISO 7218.

Die Nährbodenbestandteile und Chemikalien müssen für mikrobiologische und immunchemische Zwecke
geeignet sein. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, sollten eindeutig deklarierte Nährboden-
bestandteile und analysenreine Chemikalien oder Trockennährböden verwendet werden. Den Anwei-
sungen des Herstellers ist strikt zu folgen. Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgeräten
destilliert oder demineralisiert und mindestens von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestand-
teile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen.

ANMERKUNG Geeignete Fertignährmedien, Reagenzien oder Testkits sind im Fachhandel erhältlich und dürfen
eingesetzt werden, soweit sie in ihrer Zusammensetzung den beschriebenen Nährmedien, Reagenzien und Testkits
entsprechen oder nur geringfügig bei vergleichbarer Wirksamkeit von diesen abweichen.

5.2 Nährmedium für die Voranreicherung

5.2.1 Modifizierte Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon (modified Tryptic-Soy-Broth, mTSB) mit


Novobiocin

5.2.1.1 Grundmedium

5.2.1.1.1 Zusammensetzung

Casein, enzymatisch verdaut 17 g

Sojamehl, enzymatisch verdaut 3g

D(+)-Glucose 2,5 g

Natriumchlorid 5g

Dikaliumhydrogenphosphat 4g

Gallensalze 1,5 g

Wasser 1 000 ml

5.2.1.1.2 Herstellung

Die Bestandteile werden in der angegebenen Wassermenge gelöst und 15 min in einem Autoklaven (6.4)
bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterilisieren bei 7,3 ± 0,2
liegt, bezogen auf eine Temperatur von 25 °C.

Das Grundmedium ist luftdicht verschlossen bei 5 °C ± 3 °C für mindestens acht Wochen lagerungsfähig.

ANMERKUNG 1 Der pH-Wert sollte vor dem Sterilisieren auf 7,6 bis 7,7 eingestellt werden.

ANMERKUNG 2 Bei Fleisch und Fleischerzeugnissen kann auch Brillantgrün-Galle-Lactose-Bouillon (BRILA)


verwendet werden.

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5.2.1.2 Novobiocin-Supplement

5.2.1.2.1 Zusammensetzung

Novobiocin-Lösung, ρ = 10 mg/ml1)

5.2.1.2.2 Herstellung

Das Novobiocin wird in der in 5.2.1.2.1 angegebenen Konzentration in Wasser gelöst. Die Lösung wird
sterilfiltriert (6.30) und ist sofort nach Herstellung zu verwenden.

Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C oder -80 °C aufbewahrt werden. Nach dem Auftauen muss sie
sofort verwendet werden.

5.2.1.3 Vollständiges Nährmedium

5.2.1.3.1 Zusammensetzung

Grundmedium (5.2.1.1) 1000 ml

Novobiocin-Lösung (5.2.1.2) 1 ml

5.2.1.3.2 Herstellung

Dem auf 45 °C bis 50 °C abgekühlten Grundmedium wird je Liter 1 ml Supplement (5.2.1.2) zugesetzt. Das
vollständige Nährmedium ist am Tage der Herstellung zu verwenden.

ANMERKUNG Novobiocin-Stammlösungen mit anderen Konzentrationen dürfen verwendet werden, sofern die
Endkonzentration des Novobiocins im gebrauchsfertigen Nährmedium nicht verändert wird.

5.3 Nährmedium für die Anreicherung


5.3.1 modifizierte Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon (modified Tryptic-Soy-Broth, mTSB)
mit Enhancer-Zusatz

5.3.1.1 Grundmedium

Als Grundmedium wird mTSB nach 5.2.1.1 verwendet.

5.3.1.2 Supplement (Enhancer)

5.3.1.2.1 Zusammensetzung

— Mitomycin C-Lösung, ρ = 0,02 mg/ml1)


oder

— Carbadox-Lösung, ρ = 1,0 mg/ml1)

1) ρ Massenkonzentration

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5.3.1.2.2 Herstellung der Mitomycin-C-Lösung (Mitomycin-Stammlösung)

Das Mitomycin C wird in der in 5.3.1.2.1 angegebenen Konzentration in sterilem Wasser gelöst. Die
Stammlösung kann portioniert bis zu sechs Monate bei mindestens –20 °C gelagert werden.

Aufgetaute Mitomycin-Stammlösung muss sofort verwendet werden.

5.3.1.2.3 Herstellung der Carbadox-Lösung

Das Carbadox wird in der in 5.3.1.2.1 angegebenen Konzentration in Natriumhydroxyd,


c(NaOH) = 0,1 mol/l2), gelöst. Die Lösung kann bei 2 °C bis 8 °C bzw. bei –20 °C bis zu sechs Monate
aufbewahrt werden.

5.3.1.2.4 Andere Supplemente (Enhancer)

Andere vergleichbar wirksame Enhancer können verwendet werden, wenn deren Wirkung auf die
Verotoxinexpression nachgewiesen worden ist.

5.3.1.3 Vollständiges Nährmedium

5.3.1.3.1 Zusammensetzung

Grundmedium (5.3.1.1) 1000 ml

Mitomycin-Stammlösung (5.3.1.2.2) 2,5 ml

oder

Grundmedium (5.3.1.1) 1000 ml

Carbadox-Lösung (5.3.1.2.3) 1 ml

5.3.1.3.2 Herstellung

2,5 ml Mitomycin-Stammlösung (5.3.1.2.2) oder 1 ml Carbadox-Lösung (5.3.1.2.3) werden zu 1000 ml


sterilem Grundmedium gegeben.

Das Medium wird in 4-ml-Anteilen in Polypropylenröhrchen oder ähnlich großen Gefäßen (6.20) steril
abgefüllt.

ANMERKUNG Das vollständige Nährmedium kann bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C bis zu acht Wochen
aufbewahrt werden.

5.4 Nährmedien für die Isolierung

5.4.1 Syncase-Agar mit Enhancer-Zusatz

5.4.1.1 Grundmedium

2) c Stoffmengenkonzentration

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5.4.1.1.1 Zusammensetzung

Caseinhydrolysat, säurehydrolysiert 10 g

Ammoniumchlorid (NH4Cl) 1,17 g

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) 5g

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 × 12 H2O) 12,61 g

Salzlösung, bestehend aus Magnesiumsulfat (MgSO4), ω = 5 %3)


und Manganchlorid (MnCl2), ω = 0,5 %3) in Schwefelsäure (H2SO4), c = 0,5 mol/l2) 1 ml
hochgereinigter Agar, z. B. Noble Agar 15 g

Wasser 1 000 ml

5.4.1.1.2 Herstellung

Die Bestandteile werden in der angegebenen Wassermenge gelöst und 15 min in einem Autklaven (6.4) bei
121 °C ± 1 °C sterilisiert. Nach Abkühlen auf 25 °C muss das Nährmedium einen pH-Wert von 8,0 ± 0,1
haben. Zur Einstellung des pH-Wertes sind etwa 50 ml NaOH, c(NaOH) = 1 mol/l2), oder entsprechende
Mengen anderer Konzentrationen erforderlich.

Das Grundmedium kann bei 5 °C ± 3 °C bis zu acht Wochen gelagert werden.

5.4.1.2 Supplemente

5.4.1.2.1 L-Tryptophan/Nikotinsäure-Lösung

5.4.1.2.1.1 Zusammensetzung

L-Tryptophan 0,4 g

Nikotinsäure 0,2 g

Wasser 100 ml

5.4.1.2.1.2 Herstellung

Die Bestandteile werden in der angegebenen Wassermenge gelöst und sterilfiltriert (6.30). Die Lösung
kann luftdicht verschlossen und dunkel bis zu vier Wochen bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C
aufbewahrt werden.

2) c Stoffmengenkonzentration
3) ω Massenanteil

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5.4.1.2.2 Glucose-Lösung

5.4.1.2.2.1 Zusammensetzung

Glucose 50 g

Wasser 100 ml

5.4.1.2.2.2 Herstellung

Die Glucose wird in Wasser gelöst und 15 min in einem Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert. Die
Lösung kann luftdicht verschlossen und dunkel bis zu sechs Monate bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C
aufbewahrt werden.

5.4.1.2.3 Enhancer-Lösung

nach 5.3.1.2

5.4.1.3 Vollständiges Nährmedium

5.4.1.3.1 Zusammensetzung

Grundmedium (5.4.1.1) 1000 ml

L-Tryptophan/Nikotinsäure-Lösung (5.4.1.2.1) 10 ml

Glucose-Lösung (5.4.1.2.2) 4 ml

Mitomycin-Stammlösung (5.3.1.2) oder 1,25 ml

Carbadox-Lösung (5.3.1.2) 1 ml

5.4.1.3.2 Herstellung

Das Grundmedium wird auf etwa 50 °C abgekühlt. Unmittelbar vor der Herstellung werden zum
Grundmedium die L-Tryptophan/Nikotinsäure-Lösung, Glucose-Lösung und die Mitomycin-Stammlösung
oder alternativ die Carbadox-Lösung gegeben.

Im vollständigen Nährmedium beträgt die Endkonzentration der Mitomycin-C-Lösung 25 ng/ml oder


alternativ der Carbadox-Lösung 1 µg/ml.

ANMERKUNG Andere Enhancer dürfen verwendet werden, sofern ihre Eignung zur Steigerung der Verotoxin-
expression nachgewiesen ist.

Das vollständige Nährmedium wird gemischt und in 18-ml- bis 22-ml-Anteilen in Petrischalen übergeführt.
Das Medium wird zum Verfestigen stehengelassen. Die fertig hergestellten Platten können dunkel bei
5 °C ± 3 °C bis zu acht Wochen aufbewahrt werden.

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5.5 Verotoxinnachweissystem

5.5.1 immunologisches Testsystem, z. B. EIA oder alternativ ELISA

5.5.2 Reagenzien für den VT-Kolonie-Immunoblot

5.5.2.1 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

5.5.2.1.1 Zusammensetzung

NaCl 5g

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 × 2 H2O) 1,011 g

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 × H2O) 0,136 g

Wasser 1 000 ml

5.5.2.1.2 Herstellung

Die Salze werden in der angegebenen Menge Wasser gelöst. Die fertige Lösung wird 15 min in einem
Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert. Sie ist dann bis zu 12 Wochen bei einer Temperatur von
5 °C ± 3 °C haltbar.

5.5.2.2 PBS/Tween-Lösung

5.5.2.2.1 Zusammensetzung

®
Tween 20 4) 0,5 ml

PBS (5.5.2.1) 1 000 ml

5.5.2.2.2 Herstellung
®4)
Die angegebene Menge Tween 20 wird in der angegebenen Menge PBS gelöst und gründlich
homogenisiert. Die fertige Lösung ist mindestens acht Wochen bei einer Temperatur von 5 °C ± 3 °C
haltbar.

5.5.2.3 Blocklösung

5.5.2.3.1 Zusammensetzung

Magermilchpulver 0,6 g

PBS/Tween (5.5.2.2) 100 ml

®
4) Tween 20 ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung
der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch DIN.

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5.5.2.3.2 Herstellung

Die angegebene Menge Magermilchpulver wird in der angegebenen Menge PBS/Tween gelöst. Die Lösung
ist maximal 24 h vor Gebrauch herzustellen und bei 5 °C ± 3 °C zu lagern.

5.5.2.4 Puffer zum Nachweis alkalischer Phosphatase (AP-Puffer)

5.5.2.4.1 Zusammensetzung

Natriumchlorid 5,844 g

Magnesiumchlorid (MgCl2 × 6 H2O) 1,016 g

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 12,11 g

Wasser 1 000 ml

5.5.2.4.2 Herstellung

Die angegebenen Salze werden in der angegebenen Menge Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung
beträgt 9,5 ± 0,2. Die fertige Lösung ist bis zu acht Wochen bei 5 °C ± 3 °C haltbar.

Bei eventuellen Trübungen ist die Lösung zu filtrieren.

5.5.2.5 Farbreagenz

5.5.2.5.1 Zusammensetzung

5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) 1,65 mg

4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) 3,30 mg

AP-Puffer (5.5.2.4) 10 ml

5.5.2.5.2 Herstellung

BCIP und NBT werden maximal 1 h vor Verwendung in dem AP-Puffer gelöst. Das fertige Substrat ist
dunkel zu stellen.

ANMERKUNG 1 Es empfiehlt sich, für beide Substanzen Stammlösungen (0,5 g NBT/10 ml Dimethylformamid (DMF),
ω = 70 %3) und 0,5 g BCIP/10 ml Wasser) zu verwenden. Die Stammlösungen sind bei 5 °C ± 3 °C im Dunkeln zu
lagern.

ANMERKUNG 2 Im Handel erhältliche fertige Stammlösungen können verwendet werden.

3) ω Massenanteil

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5.5.2.6 Stopplösung

5.5.2.6.1 Zusammensetzung

EDTA-Na2 7,44 g

PBS (5.5.2.1) 1 000 ml

5.5.2.6.2 Herstellung

7,44 g EDTA-Na2 werden in 1000 ml PBS gelöst. Die Lösung ist bis zu acht Wochen bei Raumtemperatur
haltbar.

5.5.2.7 monoklonale Antikörper

Es sind monoklonale Antikörper gegen VT 1 und VT 2 zu verwenden.

5.5.2.8 Konjugat

anti-Maus-IgG1 von der Ziege, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, affinitätschromatographisch


gereinigt.

5.5.2.9 Referenzstämme
 E.coli ATCC 700376 (Referenzstamm für VT 1)
 E.coli ATCC 700377 (Referenzstamm für VT 2)
 E.coli ATCC 25922 (VT-negativ)

5.6 Nähragar
5.6.1 Zusammensetzung

Fleischextrakt 3,0 g

tierisches und
pflanzliches Gewebe,
enzymatisch verdaut 5,0 g

Agar 9,0 g bis 18,0 ga

Wasser 1000 ml

a je nach Geliereigenschaften

5.6.2 Herstellung

Die Bestandteile oder das vollständige Trockenmedium werden in Wasser, falls erforderlich, unter
Erwärmen, gelöst. Der pH-Wert wird, falls erforderlich, so eingestellt, dass er bei 25 °C nach dem
Sterilisieren pH = 7,0 ± 0,2 beträgt.

Das Medium wird in Kolben oder Flaschen (6.31) geeigneter Kapazität gegeben.

Das Medium wird 15 min in einem Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert.

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5.6.3 Herstellung der Nähragarplatten

Etwa 15 ml des geschmolzenen und auf 44 °C bis 47 °C (6.10) abgekühlten Mediums (5.6.2) werden in
Petrischalen übergeführt und zum Verfestigen stehengelassen.

Direkt vor der Verwendung werden die Agarplatten getrocknet, vorzugsweise ohne Deckel und mit der
Agaroberfläche nach unten. Die Trocknung erfolgt im Brutschrank bei einer Temperatur zwischen 25 °C
und 50 °C (6.7), bis die Wassertröpfchen von der Oberfläche des Mediums verschwunden sind. Eine
weitere Trocknung darf nicht erfolgen. Die Agarplatten können auch in einer Sicherheitswerkbank mit
Laminarströmung für 30 min mit halb offenem Deckel oder über Nacht mit aufliegendem Deckel getrocknet
werden.

Wenn die Agarplatten nicht unmittelbar nach der Herstellung verwendet werden, dürfen sie ungetrocknet im
Dunkeln in einer Plastiktüte oder einem anderen Feuchtigkeit zurückhaltenden Behältnis im Kühlschrank
bei 5 °C ± 3 °C bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden.

5.7 Trypton/Tryptophanmedium

5.7.1 Zusammensetzung

Caseinpepton,
enzymatisch verdaut
(Trypton) 10,0 g

Natriumchlorid 5,0 g

DL-Tryptophan 1,0 g

Wasser 1 000 ml

5.7.2 Herstellung

Die Bestandteile werden in Wasser gelöst, falls erforderlich unter Aufkochen. Der pH-Wert wird so
eingestellt (6.8), dass er bei 25 °C nach dem Sterilisieren pH = 7,5 ± 0,2 beträgt.

Das Medium wird in 5-ml-Teilmengen in geeignete Kulturröhrchen oder Flaschen (6.31) gegeben.

Das Medium wird 15 min in einem Autoklaven (6.4) bei 121 °C ± 1 °C sterilisiert.

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5.8 Indol-Reagenz nach Kovác's

5.8.1 Zusammensetzung

4-Dimethylaminobenzaldehyd 5,0 g

2-Methylbutan-1-ol oder Pentan-1-ol 75 ml

Salzsäure, ρ20(HCI) = 1,18 g/ml bis 25 ml


1,19 g/ml1)

5.8.2 Herstellung

4-Dimethylaminobenzaldehyd wird in Alkohol gelöst, falls erforderlich unter mäßigem Erwärmen im


Wasserbad (6.10) bei 47 °C ± 2 °C.

Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wird die Salzsäure hinzugefügt.

Das Reagenz wird lichtgeschützt in einer braunen Glasflasche bei 5 °C ± 3 °C aufbewahrt.

Das Reagenz muss hellgelb bis hellbraun gefärbt sein und darf keinen Niederschlag aufweisen.

6 Geräte und Hilfsmittel

6.1 Allgemeines

Alle Glasgeräte, Kunststoffgeräte und Hilfsmittel müssen vor Verwendung sorgfältig gereinigt und steril
sein.

6.2 Analysenwaage

6.3 Oberschalige Waage, Fehlergrenzen 0,05 g

6.4 Dampf-Sterilisator (Autoklav), regelbar auf 121 °C ± 1 °C

6.5 Gerät zur Trockensterilisation (Wärmeschrank), regelbar auf mindestens 180 °C

6.6 Beutel-Walkmischer und sterile Kunststoffbeutel mit oder ohne Filter

6.7 Brutschrank, regelbar zwischen 25 °C und 50 °C

6.8 pH-Messgerät, mit Vorrichtung zur Temperaturkompensation und pH-Messkette

6.9 Lupe, etwa 3 Dioptrien

1) ρ Massenkonzentration

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6.10 Wasserbad, regelbar auf 50 °C ± 2 °C und auf 44 °C bis 47 °C

6.11 Magnetrührer und entsprechende Magnetstäbe

6.12 Schüttelinkubator, 37 °C ± 1 °C; 100 min-1 Umdrehungen

6.13 Schüttelinkubator, 37 °C ± 1 °C; 160 min-1 bis 180 min-1 Umdrehungen

6.14 Reagenzglasschüttler

6.15 Auslaufmesspipetten, Nennvolumen 1 ml, 5 ml und 10 ml

6.16 Micropipetten, Nennvolumen 10 µl bis 250 µl und Pipettenspitzen

6.17 Messzylinder, Nennvolumen 25 ml, 250 ml, 1 000 ml

6.18 Messer, Pinzetten

6.19 Petrischalen aus Glas oder Kunststoff, Durchmesser zwischen 90 mm und 100 mm

6.20 Polypropylenröhrchen, Nennvolumen 50 ml, oder ähnlich große Gefäße

6.21 Flachpinzette

6.22 Nitrocellulose-Membranen (NC-Membranen), 0,45 µm, 82 mm Durchmesser, gerastert

6.23 Celluloseacetat-Membranen (CA-Membranen), 0,45 µm, 82 mm Durchmesser, gerastert

6.24 Glasflaschen, Nennvolumen 100 ml, 500 ml, 1 000 ml

6.25 Erlenmeyer-Kolben, Nennvolumen 500 ml

6.26 Impfösen, geeignet zur Aufnahme von etwa 1 µl

6.27 Polypropylen-Röhrchen, konisch zulaufend, 1,5 ml

6.28 Sterile Einmalspritzen, 5 ml, und sterile Spritzenvorsatzfilter, Porengröße 0,2 µm

6.29 Drigalski-Spatel

6.30 Sterilfilter, 0,2 µm

6.31 Kulturröhrchen, Kolben oder Flaschen, von geeignetem Nennvolumen zur Herstellung von
Verdünnungen und vollständigen Medien

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7 Probenahme
Es ist wichtig, dass das Untersuchungslabor eine repräsentative Probe erhält, die während des Transports
oder der Lagerung nicht beschädigt oder verändert wird. Ein Teil der Probe sollte für eventuelle
Nachuntersuchungen tiefgekühlt gelagert werden.

Die Probenahme wird nicht in dieser Norm festgelegt. Liegt keine spezifische Norm für die Probenahme
des betreffenden Produktes vor, wird den beteiligten Vertragspartnern empfohlen, diesbezüglich eine
Vereinbarung zu treffen.

8 Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung erfolgt nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2 oder DIN EN ISO 8261.

9 Durchführung

9.1 Einwaage und Erstverdünnung

Siehe DIN EN ISO 6887-1 und die für die Untersuchungsprobe geeignete Norm DIN EN ISO 6887-2 oder
DIN EN ISO 8261.

9.2 Voranreicherung

25 g der nach Abschnitt 8 und 9.1 vorbereiteten Probe werden unter sterilen Bedingungen zu 225 ml
modifizierter Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon mit Zusatz von Novobiocin (5.2.1.3), jeweils
vortemperiert auf 37 °C, hinzugefügt, in sterilen Kunststoffbeuteln im Beutel-Walkmischgerät (6.6) für zwei
min bei mittlerer Geschwindigkeit homogenisiert und in einem Erlenmeyerkolben (6.25) 6 h im
Schüttelinkubator bei 37 °C und 100 min-1 Umdrehungen (6.12) inkubiert.

9.3 Verotoxinnachweis

9.3.1 Anreicherung

1 ml der Voranreicherungskultur (9.2) werden unter sterilen Bedingungen zu 4 ml mTSB mit Zusatz von
Mitomycin C oder eines anderen Enhancers (5.3) gegeben und in einem kleinen Polypropylenröhrchen
–1 -1
(6.20) 16 h bis 18 h im Schüttelinkubator (6.13) bei 37 °C und 160 min bis 180 min bewegt.

9.3.2 Phänotypischer Verotoxin-Nachweis mit dem immunologischen Testsystem

Aus der nach 9.3.1 hergestellten Anreicherungskultur wird nach Vorschrift des verwendeten
immunologischen Testsystems (5.5.1) ein entsprechendes Volumen entnommen und im Test eingesetzt.
Wird die untersuchte Anreicherungskultur mit dem immunologischen Testsystem als Verotoxin-positiv
beurteilt, sind die Isolierung (9.4) und Bestätigung (Abschnitt 10) der VTEC vorzunehmen. Reagiert die
Anreicherungskultur im immunologischen Testsystem Verotoxin-negativ, ist die untersuchte
Lebensmittelprobe als Verotoxin-negativ zu bewerten.

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9.4 Isolierung von VTEC

9.4.1 Allgemeines

Die Isolierung potentieller VTEC erfolgt über den Nachweis der Verotoxin-Bildung im Immunoblot-Verfahren
mit anschließender Identifizierung als E.coli.

9.4.2 Vorbereitung der Proben

Zur Untersuchung dient in der Regel die Voranreicherungskultur nach 9.2. Zur Entfernung von
Begleitprotein und Fett werden 1 ml Voranreicherungskultur 3 min bei 10 000 min-1 zentrifugiert. Der
Überstand wird vorsichtig entfernt. Mit einem Wattetupfer wird gegebenenfalls das am Gefäßrand
befindliche Fett entfernt. Danach werden 1 ml PBS (5.5.2.1) zugegeben, und das Sediment wird gründlich
resuspendiert. Die Probe kann sofort eingesetzt oder 24 h bei einer Temperatur von 4 °C bis zum Vorliegen
des Ergebnisses des Verotoxin-Nachweises nach 9.3.2 zwischengelagert werden.

9.4.3 Bakterienkultivierung

Auf den Syncase-Agar mit Enhancer-Supplement (5.4.1) werden eine NC–Membran (6.22) und darüber
deckungsgleich im Raster eine CA-Membran (6.23) luftblasenfrei durch Andrücken mit sterilem Drigalski-
Spatel (6.29) aufgelegt. Die CA-Membran muss vor dem Auflegen beschriftet und eventuell mit
Markierungen versehen werden. 0,1 ml der Voranreicherungskultur nach 9.2 werden auf die obere
Membran aufgetragen und mit einer sterilen Glaspipette wie im Anhang A, Bild A.1 dargestellt, verteilt.

Die Referenzstämme (5.5.2.9) werden auf einem separaten Membranabschnitt punktförmig aufgebracht.
Die Agarplatten-Membran-Kombination wird 18 h bei 37 °C inkubiert.

9.4.4 Durchführung des Verotoxin (VT)-Kolonie-Immunoblot („Blot“)

Die CA-Membran mit den gewachsenen Kolonien (9.4.3) wird abgehoben und die darunterliegende NC-
Membran vom Agar abgenommen. Anschließend wird die CA-Membran wieder auf den Agar gelegt. Alle
nachfolgenden Schritte des Blots erfolgen bei Raumtemperatur unter Schütteln in einer Petrischale. Von
allen Lösungen sind je Petrischale etwa 10 ml erforderlich. Nach drei Waschschritten für je 3 min mit
PBS/Tween-Lösung (5.5.2.2) wird die NC-Membran 1 h mit Blocklösung (5.5.2.3) behandelt. Es folgt eine
Inkubation von 90 min mit einem Gemisch monoklonaler Antikörper (5.5.2.7).

Nach 4-maligem Waschen mit PBS/Tween-Lösung (5.5.2.2) für je 3 min wird die Membran mit dem
Konjugat (5.5.2.8) für 60 min inkubiert.

Die Membran wird erneut fünf mal mit PBS/Tween-Lösung (5.5.2.2) gewaschen. Anschließend wird das
Farbreagenz (5.5.2.5) zugegeben, und es erfolgt eine Farbreaktion für 5 min bis 10 min. Die Reaktion wird
durch Zugabe von Stopplösung (5.5.2.6) nach weiteren 30 min Inkubation beendet. Die Membran wird über
Nacht auf einer Glasplatte luftgetrocknet. Sie kann zur Dokumentation dunkel gelagert werden.

9.4.5 Auswertung des VT-Kolonie-Immunoblots und Isolierung verdächtiger Kolonien

Der VT-Kolonie-Immunoblot nach 9.4.4 ist auswertbar, wenn die positiven Referenzstämme durch einen
deutlich sichtbaren rotvioletten Fleck auf der NC-Membran angezeigt werden. Der Verotoxin-negative
Referenzstamm darf nicht angefärbt sein. Die rotvioletten Punkte auf der NC-Membran sind gebundenes
Verotoxin. Sie werden mit Hilfe des Rasters oder durch Einsatz eines geeigneten Ausmessverfahrens den
darüber befindlichen VTEC-Kolonien auf der CA-Membran zugeordnet. Von diesen positiven
Einzelkolonien werden 10 Kolonien subkultiviert. Bei weniger als 10 positiven Einzelkolonien werden alle,
die isoliert werden können, subkultiviert.

Wenn bei zu hohem Keimgehalt Rasenwachstum auftritt und kein Einzelkoloniewachstum erreicht wird,
aber bei der Auswertung des Immunoblots Farbreaktionen erkennbar sind, ist entweder aus dem Verotoxin-

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positiven Bereich ein Verdünnungsausstrich anzulegen oder die Kultivierung der Probe auf dem Syncase-
Agar (5.4.1) in entsprechender Vorverdünnung zu wiederholen. Bei einem negativen Ergebnis des VT-
Kolonie-Immunoblots aus der Voranreicherungskultur ist der Versuch mit einer geeigneten Vorverdünnung
der Anreicherungskultur (9.3.1) zu wiederholen.

10 Bestätigung von VTEC

10.1 Auswahl der Kolonien

Die im VT-Kolonie-Immunoblot positiven Kolonien werden als präsumtiv VTEC-positiv betrachtet. Sie
müssen als Reinkultur angezüchtet und als E.coli bestätigt werden.

Zur Bestätigung werden 10 von den nach 9.4.5 positiven Kolonien so auf der Oberfläche vorgetrockneter
Nähragarplatten (5.6.3) ausgestrichen, dass sich gut voneinander abgesetzte einzelne Kolonien entwickeln
können.

Die beimpften Agarplatten werden im Brutschrank (6.7) bei 37 °C 18 h bis zu 24 h bebrütet.

Für die nachfolgend in 10.2 und 10.3 beschriebenen Untersuchungen werden ausschließlich Reinkulturen
von den Nähragarplatten verwendet.

10.2 Biochemische Bestätigung: Indolbildung

Ein Röhrchen mit Trypton/Tryptophanmedium (5.7) wird mit einer Kolonie von einer Reinkultur des
Nähragars (10.1) beimpft.

Das Röhrchen wird im Brutschrank (6.7) 24 h bei 37 °C bebrütet.

1 ml Kovác's Reagenz (5.8) wird in das Röhrchen gegeben, das 10 min bei Raumtemperatur
stehengelassen wird.

Die Bildung einer roten Farbe zeigt eine positive Reaktion an. Eine gelb/braune Färbung zeigt eine
negative Reaktion.

10.3 Prüfung auf Verotoxinbildung

Die Prüfung auf Verotoxinbildung darf mit einem immunologischen Testsystem, siehe 3.2.1, erfolgen. Wenn
der Hersteller/Vertreiber kein spezielles Anzüchtungsverfahren vorschreibt, werden die nach 10.2 als E.coli
-1
bestätigten Isolate in 5 ml mTSB unter Zusatz eines Enhancers (5.3) im Schüttelinkubator bei 160 min bis
-1
180 min für 16 h bis 18 h bei 37 °C angezüchtet. Die Auswertung richtet sich nach den Angaben des
jeweiligen Herstellers/Vertreibers des verwendeten Testsystems (3.2.1).

ANMERKUNG Alternativ kann eine Untersuchung auf Verotoxin-Gene (vtx) erfolgen [1].

11 Auswertung
Wenn das Isolat biochemisch als E.coli bestätigt und die Verotoxinbildung oder das Verotoxin-Bildungs-
vermögen nachgewiesen wurde, ist dieses als VTEC zu bewerten.

12 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Norm mindestens anzugeben:

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a) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;

b) Art und Datum der Probennahme;

c) Art des Transports;

d) Art der Lagerung;

e) Eingangsdatum der Probe;

f) Untersuchungsdatum und das erhaltene Untersuchungsergebnis;

g) Begründung, falls von dieser Vorschrift abgewichen worden ist.

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Anhang A
(normativ)

Ausstreichen der Probe für den VT-Kolonie-Immunoblot

Bild A.1 — Ausstreichen der Probe für den VT-Kolonie-Immunoblot

Literaturhinweise

[1] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG L 07.18-1, Untersuchung von
Hackfleisch – Nachweis, Isolierung und Charakterisierung Verotoxin-bildender Escherichia coli
(VTEC) in Hackfleisch mittels PCR und DNA-Hybridisierungstechnik, Abschnitt 8.1.

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