Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches

harmonisation des démarches Part III. Examples of application

Partie III. Exemples d’application

Validation des procédures analytiques quantitatives :

harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
Commission SFSTP, P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu,
B. Boulanger, E. Chapuzet, N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dewé, M. Feinberg,
M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, L. Valat

Quantitative analytical procedures valida-

tion: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application

U ne démarche harmonisée pour la validation des

méthodes analytiques basée sur le profil d’exactitude
a été proposée par une commission SFSTP sur la
validation des méthodes analytiques. Cette troisième
et dernière partie illustre la méthodologie ainsi
que les aspects statistiques liés à son application
à partir d’exemples réels d’application tels que le
contrôle qualité de médicaments, la quantification
d’impureté dans des matières premières, la bio-
analyse ou encore la quantification de nutriments.
Afin de montrer son applicabilité à différents types
de méthodes, les exemples portent sur des méthodes
chromatographiques (LC-UV, LC-MS) mais aussi
spectrophotométrie ou encore ELISA.
A harmonized approach for the validation of
analytical methods based on accuracy profile was
introduced by a SFSTP commission on the validation
of analytical procedure. This third and last docu-
ment aims at illustrating this methodology and the
statistics used. Therefore the validation of real case
methods are proposed such as methods for the quality
control of drugs, for the quantitation of impurities in
drug substances, for bioanalysis or for the determi-
nation of nutriments. Furthermore, different types of
analytical methods are used in order to demonstrate
the applicability of the proposed approach to a wide
range of methods such as liquid chromatography
(LC-UV, LC-MS), spectrophotometry or ELISA.

Mots clefs : Validation analytique – Erreur totale – Risque Keys words: Analytical validation – Total error – Risk
– Profil d’exactitude – Chromatographie liquide – Spec- – Accuracy profile – Liquid chromatography – Spectro-
trophotométrie – ELISA. photometry – ELISA.

I I
Introduction
Cette publication forme la dernière partie d’un
triptyque destiné à décrire une nouvelle démarche
harmonisée et globale de validation interne (intra-
laboratoire) des procédures d’analyse. La première
partie avait pour but de présenter les aspects métho-
dologiques et conceptuels de cette démarche, dont le
point central est le profil d’exactitude, et d’en préciser
le vocabulaire, en particulier la typologie des plans
d’expériences applicables [1]. La deuxième partie
présentait les aspects statistiques et algorithmiques
de la démarche et fournissait au lecteur l’ensemble
des formules de calcul indispensables à la mise en
œuvre pratique [2].
Cette troisième partie présente une série d’appli-
cations déjà opérationnelles dans divers domaines :
le contrôle des médicaments, la quantification des
impuretés dans les matières premières, l’analyse bio-
logique et l’analyse des nutriments. Chaque exemple
a été choisi car il illustre une situation spécifique,
classiquement rencontrée par les analystes.
Introduction
This publication consists in the third part of a tril-
ogy intending to describe a new harmonized global
approach of analysis procedure internal validation
(intra-laboratory). The first part aimed at presenting
the methodological and conceptual aspects of this
approach, which central point is the accuracy profile,
and specifying its vocabulary, particularly the appli-
cable experimental designs typology. [1]. The second
part presents the statistical and algorithmic aspects
of the approach, and provides the reader with all the
computation formulas, indispensable for practical
implementation [2].
This third part presents a series of already opera-
tional applications in various fields: drugs control,
impurities quantification in raw materials, biological
analysis and food analysis. Each example has been
chosen because it illustrates a specific situation, clas-
sically faced by analysts.
All examples are presented in the same way. A
brief reminder of the procedure provides the type of

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 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
Le mode de présentation est le même pour tous les
exemples. Un rappel succinct de la procédure four-
nit le type de technique analytique employée et les
objectifs à atteindre. En général, une représentation
graphique des données d’étalonnage et de validation
illustre les données brutes et le type de plan d’expé-
rience appliqué. Puis, le profil d’exactitude fait l’objet
d’une autre figure et permet l’interprétation et la prise
de décision quant à la validation de la méthode. Les
données correspondantes de justesse, de fidélité,
d’exactitude ainsi que les limites haute et basse de
l’intervalle de tolérance sont finalement résumées
dans des tableaux. Lorsque cela s’est avéré nécessaire,
des limites de quantification ont été calculées. En
revanche, aucune limite de détection n’a été estimée,
même si la démarche proposée le permet [2].
Dans les cas où il a été nécessaire d’appliquer
un coefficient de correction en fonction du taux de
recouvrement, la droite de linéarité (ou de justesse)
permet de comprendre comment ce coefficient a été
obtenu et un second profil d’exactitude montre si la
méthode peut être validée après correction. En effet,
dans plusieurs cas il est apparu indispensable d’ap-
pliquer un coefficient de correction pour compenser
un taux de recouvrement (ou de récupération) trop
faible. Cette possibilité de déterminer un coefficient
de correction cohérent pour l’ensemble du domaine
d’application illustre la puissance de cette démarche.
Et il faut signaler, dès à présent, que le fait de corri-
ger les données augmente de façon tout à fait visible
l’incertitude des mesures. Ce qui est en parfait accord
avec la théorie métrologique du calcul d’incertitude.
Par ailleurs, on a pu montrer que l’incertitude des
mesures pouvait se déduire facilement de la largeur
de l’intervalle de tolérance. Le lecteur intéressé peut
se reporter aux travaux de Feinberg et al. [3].
L’objectif de cette publication est de fournir aux
analystes une série d’études de cas afin de mieux faire
comprendre en quoi la démarche harmonisée propo-
sée par la commission SFSTP représente une avancée
importante pour les laboratoires, quelles que soient
les procédures analytiques qu’ils ont à valider. Ce-
pendant, cette prétention à l’universalisme doit être
modérée en se rappelant la note 4 qui figure dans la
clause §5.4.5.3 de la norme ISO 17025 et qui indique
que « la validation est toujours un équilibre entre les
coûts, les risques et les possibilités techniques ». À
côté des outils statistiques présentés, pour efficaces
qu’ils soient dans le calcul des risques, les analystes
doivent toujours considérer les aspects pratiques et
économiques de la validation. Ainsi, même si un
document préconise de réaliser dix essais dans une
même journée, alors que les contraintes techniques
de la méthode ne le permettent pas, cela n’implique
pas que toute validation est impossible. À travers
quelques exemples, nous avons essayé de montrer
qu’il était toujours possible d’appliquer l’approche
globale, pour autant que le risque d’obtenir des ré-
sultats incorrects reste acceptable, même si il est plus
grand.
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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
analytical technique used, as well as the goals to be
achieved. In general, raw data and type of applied
experimental design are illustrated by a diagram
representing the calibration and validation data.
Then, the accuracy profile is illustrated in another
figure, and allows interpreting and decision making
regarding the method validation. Finally, the corre-
sponding trueness, precision, accuracy data, as well
as the higher and lower tolerance interval limits are
then summarized in figures. When necessary, quan-
tification limits have been computed. However, no
detection limit has been assessed even though it is
allowed by the proposed approach [2].
Whenever it has been necessary to apply a correc-
tion coefficient, due to a poor recovery rate, the lin-
earity (or trueness) straight line allows to understand
how this coefficient has been achieved and a second
accuracy profile shows whether the method can be
validated after correction. Actually, it appeared to be
indispensable, in various cases, to apply a correction
coefficient in order to compensate a too weak recov-
ery (or recuperation) rate. This possibility to deter-
mine a consistent correction coefficient for the whole
application range illustrates this approach potency.
Moreover, it should be mentioned, from now on,
that, correcting data increases, in a very visible way,
the uncertainty of measurements: which is perfectly
consistent with the metrological theory behind the
computation of uncertainty. In addition, it has been
demonstrated that the uncertainty of measurements
could easily deduce itself from the tolerance interval
width. Any interested reader can refer to the works
of Feinberg et al. [3].
This publication aims at providing the analysts
with a series of case studies with a view to helping
them better understand how the harmonized ap-
proach proposed by the SFSTP Commission rep-
resents an important advance for the laboratories,
whatever the analytical procedures they have to vali-
date. However, this ambition to universalism must be
moderated by remembering the note 4 posted in the
clause § 5.4.3 of the ISO 17025 standard, stipulating
that “validation is always a balance between costs,
risks and technical possibilities”. In addition to the
presented statistical tools, as efficient as they may be
in risk computing, the analysts must always consider
the validation economic and practical aspects. Thus,
even though a document recommends carrying out
10 trials in the same day, while the technical con-
straints of the method do not allow it, this does not
imply that any validation is impossible. Through
several examples, we have intended to demonstrate
that it was always possible to apply the global ap-
proach, as long as that the risk to achieve incorrect
results remains acceptable, even if greater.
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 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
II
Données STP Pharma Pratiques 1992
1. Objectif et contexte
Les données de cet exemple publié en 1992 ont
servi à illustrer la procédure de validation proposée à
l’époque [4]. Il était donc intéressant de les reprendre
et de leur appliquer la nouvelle méthodologie de
validation de 2003 qui débouche sur le profil d’exac-
titude [1] afin de comparer les conclusions obtenues
dans les deux cas. Cette comparaison concerne plus
particulièrement les résultats obtenus pour les critè-
res de justesse (nommée exactitude en 1992) et de
fidélité (répétabilité et fidélité intermédiaire).
Les résultats provenaient d’un département de
développement pharmaceutique et furent obtenus
lors de la validation d’une méthode HPLC pour la
détermination d’un principe actif dans une spécialité
pharmaceutique.
2. Plans d’expérience
En se référant aux protocoles proposés dans la
publication de 2003 [1], les essais réalisés et illustrés
dans l’article de 1992 se rapprochent du protocole V4
avec diverses particularités dont la principale est l’ab-
sence de répétitions pour les essais d’étalonnage.
Plan P1. Standards d’étalonnage sans la matrice
aussi appelés « échantillons principe actif seul » selon
la terminologie 1992 :
- cinq niveaux de concentration répartis de 60 à
140% de la valeur nominale du médicament sous
épreuve,
- trois séries réalisées dans des conditions de fidélité
intermédiaire, c’est-à-dire sur trois jours différents,
- ces mesures sont faites sans répétition.
Plan P2. Standards d’étalonnage avec la matrice
ou « échantillons forme reconstituée » selon la ter-
minologie 1992 :
- cinq niveaux de concentration répartis de 60 à
140%,
- trois séries dans des conditions de fidélité intermé-
diaire,
- ces mesures sont faites sans répétition.
Plan P3. Standards de validation dans la matrice :
- un seul niveau de concentration, à 100% de la
valeur nominale,
- trois séries dans des conditions de fidélité intermé-
diaire,
- six répétitions indépendantes par série.
Les plans d’expériences P1 et P2 étaient destinés
à vérifier la fonction de réponse, en particulier la li-
néarité selon la terminologie de 1992, l’absence d’un
éventuel effet de matrice et l’estimation du biais et le
plan P3 permettait d’estimer la fidélité. Compte tenu
de ces plans d’expérience, il faut souligner que le
calcul des composantes de la variance et de la fidélité
intermédiaire ne peuvent se faire qu’à la concentra-
tion nominale (100%) et non pas sur l’ensemble du
domaine de validation ; ce qui est d’ailleurs devenue
une exigence avec la publication ultérieure de ICH
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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
II
1992 STP Pharma Pratiques Data
1. Objective and background
The data of this example that was published in
1992 have been used to illustrate the validation
procedure proposed at that time [4].Thus, it was
interesting to revisit them in order to apply the new
2003 validation approach, that leads to the accuracy
profile [1], and compare the conclusions obtained
in both cases. This comparison concerns more par-
ticularly the results obtained for the trueness (named
accuracy in 1992) and precision criteria (repeatability
and intermediate precision).
The results were coming from a pharmaceutical
development department and have been achieved
during the validation of a HPLC method aiming at
determining an active ingredient within a pharma-
ceutical product.
2. Experimental designs
Referring to the protocols proposed in the 2003
publication [1], the trials carried out and illustrated
in the 1992 article get close to the V4 protocol with
various particularities, being the absence of repetition
for the calibration trials the most important of them.
Design P1. Calibration standards without matrix,
also called “samples of active ingredient alone” ac-
cording to the 1992 terminology:
- five concentration levels distributed from 60 to
140% of the tested medicine nominal value,
- three series carried out in intermediate precision
conditions, i.e. over three distinct days,
- these measurements are carried out without any
repetition.
Design P2. Calibration standards with matrix or
“samples under reconstituted shape”, according to
the 1992 terminology:
- five concentration levels distributed from 60 to
140%,
- three series carried out in intermediate precision
conditions,
- these measurements are carried out without any
repetition.
Design P3. Calibration standards without matrix:
- one single concentration level, at 100% of the
nominal value,
- three series carried out in intermediate precision
conditions,
- six independent repetitions by series.
The P1 and P2 designs were intended to check the
response function, particularly the linearity according
to the 1992 terminology, the absence of a possible
matrix effect and the bias assessment and the P3
design allowed to assess the precision. Taking into ac-
count these experimental designs, it must be outlined
that the computation of the variance of intermediate
precision can only be done at the nominal concentra-
tion (100%), and not on the whole validation range,
which, moreover, has become a requirement when
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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Q2A [5]. La figure 1 présente une vue globale de ces ICH Q2A [5] was later issued. Figure 1 presents a
plans d’expériences. global vision of these experimental designs.

Thousands
132000

Milliers
200

128000
180

160
Surface de pic
124000
Peak surface
95% 100% 105%
140

120

100

80

60
50% 70% 90% 110% 130% 150%

% teneur nominal
Nominal content %

Figure 1. Données SFSTP 1992. Illustration graphique du plan d’expérience. Les six (2 x 3) droites d’étalonnage sont indiquées sur le graphique.
Le zoom de la zone des 100% indique la disposition des données d’étalonnage et de validation en ce point.
Figure 1. 1992 SFSTP data. Experimental design graphical illustration. The six (2 x 3) calibration functions are indicated on the diagram. Zooming
on the 100% area indicates the calibration and validation data position.

3. Résultats 3. Results
À partir des données issues du plan d’expérience Two ways of exploiting data coming from P3
P3, deux modes d’exploitation des données ont été experimental design have been used. The first one
utilisés. Le premier consiste à n’utiliser qu’un seul consists in using only a single concentration level
niveau de concentration pour l’étalonnage, le second for the calibration, the second one is to keep all
est de garder les cinq niveaux. Cependant, du fait que the five levels. However, given that the validation
les standards de validation ne comportent qu’un seul standards only include a single concentration level,
niveau de concentration, les deux profils d’exactitude both accuracy profiles can only be drawn at that
ne peuvent être tracés qu’à ce seul niveau de con- 100% nominal value of the concentration level. The
centration de 100% de la valeur nominale. La limite acceptability limit has arbitrarily been set at ±3% and
d’acceptation a été fixée arbitrairement à ± 3% et la the probability for the future measurements to stand
probabilité que les futures mesures se situent dans inside the tolerance interval is 95%. Table I provides
l’intervalle de tolérance est de 95%. Le tableau I four- the various statistics illustrated on Figure 2.
nit les diverses statistiques qui sont illustrées dans la
figure 2.
Selon la méthodologie 1992, la fidélité de la mé- According to the 1992 methodology, the method
thode était jugée très bonne puisque le coefficient de precision was considered very good since the repeat-
variation (CV) de répétabilité était de 0,25% et celui ability relative standard deviation (RSD) was 0.25%

4%
Erreur relative (%)/Relative error (%)

2%

0%

-2 %

-4 %

1 2

Figure 2. Données SFSTP 1992. Profils d’exactitude obtenus à la concentration nominale en utilisant deux protocoles d’étalonnage hors matrice :
1) avec un seul niveau, 2) cinq niveaux (limites d’acceptation à ± 3%).
Figure 2. 1992 SFSTP Data. Accuracy profiles obtained at the nominal concentration by using two calibration protocols out of matrix: 1) with
a single level, 2) five levels (acceptability limits ± 3%).

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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Tableau I. Données SFSTP 1992 exprimées en mg. Les deux profils d’exactitude obtenus selon deux protocoles d’étalonnage à un ou cinq
niveaux.
Table I. 1992 SFSTP data expressed in mg. Both accuracy profiles obtained according to two calibration functions with one or five levels.
Critères de performance/Performance criteria Un seul niveau d’étalonnage à 100% Cinq niveaux d’étalonnage de 60 à 140%
One single calibration level at 100% Five calibration levels from 60 to 140%
Concentration (% de la teneur nominale) 100% 100%
Concentration (% of the nominal value)
Quantité théorique/Theoretical quantity 162.1 162.1
Limite basse de tolérance/Tolerance lower 161.8 161.7
limit
Limite haute de tolérance/Tolerance higher 165.1 165.2
limit
Limite basse relative de tolérance (%) -0.1766% -0.2433%
Relative tolerance lower limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 1.8440% 1.899%
Relative tolerance higher limit (%)
Écart-type de répétabilité 0.4134 0.4127
Repeatability standard deviation
Écart-type de fidélité intermédiaire 0.5972 0.6169
Intermediate precision standard deviation
CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%) 0.2551% 0.2546%
CV fidélité intermédiaire (%) 0.3685% 0.3806%
RSD intermediate precision (%)
Quantité prédite inverse 163.4 163.4
Inverse predicted quantity
Biais absolu/Absolute bias 1.351 1.342
Biais relatif (%)/Relative bias (%) 0.834% 0.828%
Recouvrement (%)/Recovery (%) 100.8% 100.8%
CV : coefficient de variation/RSD: relative standard deviation.

de fidélité intermédiaire de 0,37%. On peut rappeler
que ce calcul n’était possible qu’à la valeur nominale.
Cependant, la justesse ne semblait pas satisfaisante
dans la mesure où l’intervalle de confiance du taux
recouvrement moyen se situait entre 100,7% et
100,9% et ne contenait donc pas la valeur cible de
100%. Cette conclusion un peu ambiguë est déjà
largement discutée dans la référence [1].
Si on s’appuie sur la figure 2 obtenue en appli-
quant la démarche proposée en 2003, les deux profils
d’exactitude démontrent que la méthode pouvait
être déclarée valide, quelles que soient les données
d’étalonnage utilisées (un ou cinq niveaux de con-
centration) : en effet, dans les deux cas, l’intervalle
de tolérance est entièrement inclus dans les limites
d’acceptation. L’utilisation des données de 1992 reste
un peu artificielle car, à l’évidence, les plans d’expé-
rience employés ne correspondent pas à ceux qui sont
développés dans l’approche de 2003. Cependant, il
était intéressant de faire cet exercice pour montrer la
continuité entre les deux approches.
and the intermediate precision RSD 0.37%. It is to be
reminded that this computation was only possible at
the nominal value. However, trueness did not seem
to be satisfactory as the confidence interval of the
mean recovery yield was located between 100.7%
and 100.9% and thus did not include the 100% target
value. This little ambiguous conclusion is already
widely discussed in the reference [1].
If we base on Figure 2, obtained by applying the
approach proposed in 2003, both accuracy profiles
demonstrate that the method could have been de-
clared valid, whatever the used calibration data (one
or five concentration levels): actually, in both cases,
the tolerance interval is entirely included inside the
acceptability limits. Using the 1992 data remains a
little artificial because, obviously, the used experi-
mental designs do not match those developed in the
2003 approach. However it was interesting to do this
exercise in order to show the continuity between both
approaches.

III III
Détermination de substances actives Active substances determination by
par HPLC dans un comprimé HPLC (high performance liquid chro-
matography) within a tablet
1. Matériel et méthodes 1. Equipment and methods
Cet exemple porte sur le dosage, dans un com- This example concerns the determination, within
primé, de deux substances actives A et B aux doses a tablet, of two active substances, A and B, contain-

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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

de quelques mg/comprimé. Le dosage est effectué ing few mg/tablet. The determination is carried out
par couplage HPLC-UV et par étalonnage externe, by HPLC-UV coupling and by external calibration,
permettant ainsi de quantifier simultanément les thus allowing to simultaneously quantifying both
deux substances. Le mode opératoire consiste à substances. The operating procedure consists in
mettre en solution un comprimé dans un mélange dissolving a tablet into a mixed solution acetonitrile
acétonitrile-eau puis à filtrer cette solution avant - water, then filtrate this solution before injection.
injection. L’étalonnage est réalisé au moyen de deux Calibration is carried out with two independent solu-
solutions indépendantes des substances de référence tions of the active ingredients references subtances,
des principes actifs à la concentration nominale (ni- at the nominal concentration (level 100%).
veau 100%).

2. Plans d’expérience 2. Experimental designs

Le plan d’expérience de validation consiste en trois The validation design consists in three days, three
jours, trois niveaux et trois répétitions (3x3x3), soit levels and three repetitions (3 x 3 x 3), i.e. twenty
vingt-sept essais. Il s’agit d’un protocole de type V1. seven trials. It is question of a V1 protocol. The
Les niveaux de concentration choisis sont 70, 100 chosen concentration levels are 70, 100 and 130%
et 130% de la concentration nominale, de façon à of the nominal concentration, in order to cover a
couvrir une gamme de concentrations correspondant concentrations range corresponding to the regula-
au contrôle réglementaire d’uniformité de la teneur tory control of the tablet content uniformity, i.e. 75
du comprimé, soit 75 à 125% de la teneur nominale to 125% of the nominal content (or ± 25%). Regard-
(ou ± 25%). En ce qui concerne les données d’éta- ing calibration data, the calibration function consists
lonnage, le plan d’étalonnage consiste en un seul in a straight line with a single point, at 100%. This
point à 100%. Ce choix implique que la prédiction choice implies that the prediction of concentrations
des concentrations supérieures à 100% se fasse par higher than 100% are done by extrapolation. These
extrapolation. La figure 3 illustre ces données dans data relating to product A are illustrated in Figure 3;
le cas du composé A ; le composé B suit le même the compound B follows the same protocol.
protocole.
Ce graphique montre en outre que les solutions In addition, this diagram shows that the solutions
ont été préparées de façon indépendante, à partir de have been prepared independently, from independent
pesées indépendantes, puisque pour un même « ni- weightings; since for an identical “level”, we observe
veau » on voit que les réponses ne sont pas alignées that the responses are not vertically aligned. Let
verticalement. Rappelons que la démarche de valida- us remind that the proposed validation approach
tion proposée comprend une étape de réalignement includes a realignment step in order to compensate
pour compenser ces légères différences, lorsqu’elles these slight differences, when existing, in the refer-
existent, dans la concentration de référence [2]. ence concentrations [2].
Millions

3.0

2.5

2.0
Surface de Pic
Peak surface

9 4 9 5 9 6 97 98 9 9 1 00 10 1 1 0 2
1.5

1.0

0.5

0.0
0 20 40 60 80 100 120 140 160

% Concentration teneur nominale

Nominal content concentration %
Figure 3. Détermination du composé A. Les données collectées le jour 1, 2 ou 3 sont respectivement représentées par des carrés, des losanges
et des ronds. L’encart est un zoom de la partie centrale du graphique.
Figure 3. Compound A determination. Data collected day 1, day 2 or day 3 are represented by squares, triangles and circles, respectively. The
insert is a zoom on the diagram central part.

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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

3. Résultats
Le traitement de ces données, selon la procédure
décrite en [2], permet de construire le tableau II qui
contient l’ensemble des critères de performances pour
les deux analytes, à chaque niveau de concentration.
La plupart de ces critères sont exprimés en valeurs
absolues et en valeurs relatives. Ce sont ces valeurs
relatives qui permettent de construire le profil d’exac-
titude des figures 4 et 5.
Le profil d’exactitude pour le composé A, en pre-
nant comme limites d’acceptation ± 5%, permet de
conclure à la validité de la méthode, comme le montre
la figure 4. Rappelons que ces limites d’acceptation
ne doivent pas être confondues avec le niveau de
probabilité qui a servi au calcul du profil, c’est-à-dire
de l’intervalle de tolérance à 95%. On peut rappeler
que l’intervalle de tolérance est sensé contenir une
proportion attendue de 95% des futures mesures.
En revanche, pour la substance B on peut observer
qu’au-delà de 120% de la valeur nominale, l’intervalle
de tolérance ne s’inscrit plus dans les limites d’accep-
tation ± 5% comme le montre la figure 5. Une limite
de quantification supérieure peut alors être calculée
en prenant l’intersection entre la limite d’acceptation
et l’intervalle de tolérance : dans ce cas elle est égale
à 121% de la valeur nominale du produit. Par con-
séquent, on peut conclure que la méthode n’est pas
valide sur l’ensemble du domaine étudié mais répond
toutefois à son objectif entre 60 et 121%.
L’élargissement de l’intervalle de tolérance au-
delà de 100% peut raisonnablement s’interpréter en
fonction des choix faits pour le plan d’expérience
d’étalonnage. En effet, l’utilisation du seul niveau
3. Results
Processing these data, according to the procedure
described in [2], makes it possible to build up
Table II that contains all the performance criteria
for both analytes, at each concentration level. Most
of these criteria are expressed both in absolute and
relative value. The relative values allow to build up
Figures 4 and 5.
The accuracy profile for the compound A, if set-
ting a ±5% acceptability limit, allows to conclude
that the method is valid, as shown Figure 4. Let us
remind that these acceptability limits must not be
confounded with the likelihood level that was used
for the profile computation, i.e. the 95% tolerance in-
terval. To be reminded: an expected 95% proportion
of future measurements are supposed to be included
inside the tolerance interval.
On the contrary, it can be observed for sub-
stance B, that beyond 120% of the nominal value,
the tolerance interval is no longer inside the ± 5%
acceptability limits, as shown Figure 5. A higher
quantification limit can then be calculated, by taking
the intersection point between the acceptability limit
and the tolerance interval: in this case, it equals 121%
of the product nominal value. As a result, it can be
concluded that the method is not valid for the whole
studied range, but however achieves its objective,
between 60% and 121%.
The tolerance interval broadening beyond 100%
can reasonably be interpreted according to the
choices made for the calibration experimental design.
Actually, using the single 100% level forces to com-

Tableau II. Dosage : profils d’exactitude pour les deux molécules exprimés en% de la teneur nominale.
Table II. Determination: accuracy profiles for both molecules expressed in% of the nominal content .
Critères de performance/ Performance criteria Substance A Substance B
Niveau 1 Niveau 2 Niveau3 Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3
Level 1 Level 2 Level 3 Level 1 Level 2 Level 3
Concentration ajoutée (% de la teneur nominale) 68.21 97.27 127.6 70.47 100.5 131.5
Added concentration (% of the nominal content)
Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit 67.52 95.36 126.9 69.12 98.74 122.8
Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit (%) 68.83 98.97 129.8 71.37 101.7 137.8
Limite basse relative de tolérance (%) -1.02% -1.97% -0.58% -1.91% -1.70% -6.64%
Relative tolerance lower limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 0.90% 1.74% 1.69% 1.28% 1.27% 4.80%
Relative tolerance higher limit (%)
Écart-type de répétabilité 0.2670 0.6100 0.46 0.5933 0.3821 1.632
Repeatability standard deviation
Écart-type de fidélité intermédiaire 0.2670 0.6910 0.5933 0.46 0.512 2.414
Intermediary precision standard deviation
CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%) 0.39% 0.63% 0.46% 0.65% 0.38% 1.24%
CV fidélité intermédiaire (%) 0.39% 0.71% 0.46% 0.65% 0.51% 1.84%
RSD intermediary precision (%)
Concentration prédite inverse (%) 68.17 97.16 128.30 70.24 100.2 130.3
Inverse predicted quantity
Biais absolu/Absolute bias -0.004 -0.111 0.708 -0.2232 -0.2184 -1.207
Biais relatif (%)/Relative bias (%) -0.01% -0.11% -0.55% -0.32% -0.22% -0.92%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 99.94% 99.89% 100.60% 99.68% 99.78% 99.08%

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 93

01-hubert.indd 93 27/06/06 18:42:30

 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Erreur relative/Relative error (%) 10%

5%

0%
60 70 80 90 100 110 120 130 140

-5%

-10% % de la teneur nominale

nominal content %

Figure 4. Profil d’exactitude pour la substance A (limites d’acceptation à ± 5%).

Figure 4. Substance A accuracy profile (± 5% acceptability limits).

10%
Erreur relative (%)/Relative error (%)

5%

0%
60 70 80 90 100 110 120 130 140

-5%

-10%
% de la teneur nominale
nominal content %

Figure 5. Profil d’exactitude pour la substance B (limites d’acceptation à ± 5%).

Figure 5. Accuracy profile for substance B (±5% acceptability limits).

100% oblige à calculer les valeurs prédites en retour pute, by extrapolating, the inverse predicted values
par extrapolation pour les niveaux supérieurs. Or il for the higher levels. Yet, it is well known that this
bien connu que cette méthode a tendance à dégrader method tends to degrade the prediction quality [6].
la qualité des prédictions [6].
Une solution pour sortir de cette situation serait One solution to get out of this situation would
de choisir une probabilité de 90%, ce qui aurait pour be to choose a 90% probability, which would result
conséquence de rétrécir l’intervalle de tolérance mais in narrowing the tolerance interval, but also increas-
aussi d’augmenter le risque d’avoir en routine des ing the risk to have routine determinations beyond
dosages en dehors des limites d’acceptation. Une the acceptability limits. Another possibility with a
autre possibilité qui a un effet comparable, serait de comparable effect would consist in reporting every

94 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

01-hubert.indd 94 27/06/06 18:42:31

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
rapporter chaque résultat comme étant la moyenne
de deux résultats indépendants ou plus : dans ce cas
la variance de fidélité intermédiaire est diminuée.
Cet exemple de validation d’une méthode destinée
à contrôler la teneur d’un principe actif dans une
spécialité pharmaceutique, illustre bien la flexibilité
de la nouvelle démarche proposée. On peut à la limite
parler de « potentialité » du profil d’exactitude, au
sens où il intègre en un seul graphique un ensemble
de critères de performance tels que la variance, la
justesse, le risque associé et indirectement le nombre
de répétitions.
IV
Inf luence du protocole d’étalonnage
sur le prof i l d’exactitude
Détermination de l’hydrocortisone
par HPLC-UV dans une pommade
1. Matériel et méthodes
Dans le cadre du contrôle qualité d’une pommade
à 0,1% en hydrocortisone, une méthode de dosage a
été développée et validée. Le dosage est effectué par
couplage HPLC-UV. Le mode opératoire consiste à
extraire le principe actif et à le mettre en solution
dans la phase mobile. L’étalonnage est réalisé au
moyen d’une solution indépendante de la substance
de référence du principe actif. La gamme d’étalonnage
s’étale de 0.8 à 1.2 mg/g de pommade.
2. Plan d’expérience
En ce qui concerne le plan d’expérience (tableau III),
le protocole de type V4 a été appliqué en utilisant
trois niveaux de concentration et deux répétitions
par niveau pendant trois jours, soit au total dix-huit
essais (3 x 2 x 3). Les standards d’étalonnage ont été
réalisés avec et sans la matrice. En effet, au moment
de lancer la validation, aucune information n’était
disponible quant à l’existence d’un effet de matrice
et à la possibilité de quantifier le principe actif avec
un seul niveau d’étalonnage. Par conséquent, l’option
la plus sûre mais la plus lourde en termes de nombre
d’essais a été retenue. Les standards de validation
comportent trois niveaux et trois répétitions pendant
trois jours, soit vingt-sept essais. Tous les standards
de validation (neuf) sont indépendants, et ce chaque
jour.
3. Résultats
Le traitement des données issues des essais réalisés
selon le protocole V4 permet de construire différents
profils en appliquant plusieurs modèles d’étalonnage.
En effet, il est possible de calculer des modèles de
régression en utilisant les données d’étalonnage :
A) entre 80 et 120% de la concentration nominale ;
B) à 100% de cette concentration ; ou C) à 120%.
Et pour chaque cas, on peut utiliser les mesures en
présence ou en absence de la matrice. Au total, on
peut donc proposer six profils d’exactitude reposant
STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 95
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
result as being the mean between two independent
results or more: in this case, the intermediate preci-
sion variance is reduced.
This example of validation of a method aiming
at controlling the concentration of an active ingredi-
ent in a medicine illustrates well the new proposed
approach flexibility. We can almost speak of the
accuracy profile “potentiality”, in the sense that it
integrates in a single diagram a set of performance
criteria such as variance, accuracy, associated risk,
and indirectly the number of repetitions.
IV
Inf luence of the calibration
protocol on the accuracy profile
Hydrocortisone determination
by HPLC-UV in an ointment
1. Equipment and methods
As part of the quality control of an ointment at
0.1% hydrocortisone, a method has been developed
and validated. The determination is carried out by
HPLC-UV coupling. The operating procedure con-
sists in extracting the active ingredient and dissolving
it into the mobile phase. The calibration is carried out
with an independent standard of the active ingredient
reference substance. The calibration range extends
from 0.8 to 1.2 mg/g of ointment.
2. Experimental design
As far as the experimental design (Table III) is
concerned, a V4 protocol has been applied using
three concentration levels and two repetitions per
level during three days, i.e. eighteen trials in total
(3 x 2 x 3). The calibration standards were carried
out with and without matrix. Actually, at the time of
launching the validation, no information was avail-
able regarding the existence of a matrix effect and the
possibility to quantifying the active ingredient with a
single level of calibration. As a result, the safest but
heaviest option in terms of number of trials has been
kept. The calibration standards include three levels
and three repetitions during three days, i.e.twenty
seven trials. All the validation standards (nine) are
independent and this, every day.
3. Results
Processing collected data according to the V4 pro-
tocol makes it possible to build up different profiles
by applying different calibration models. Indeed, it
is possible to compute regression models by using
the calibration data: A) between 80 and 120% of the
nominal concentration; B) at 100% of this concentra-
tion; C) at 120%. And for each case, the measure-
ments can be used with or without matrix. In total,
we can thus propose six accuracy profiles based on six
calibration functions. In all the cases, the calibration
95
27/06/06 18:42:32
 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Tableau III. Détail du plan d’expérience utilisé pour le dosage de l’hydrocortisone.

Table III. Detail of the experimental design used for hydrocortisone determination.
Type de données/Type of data Niveau Concentration en Nombre de répétition Nombre d’essais pour les
Level hydrocortisone (mg/g) par jour trois jours de validation
Hydrocortisone Number of repetitions Number of trials for the
concentration (mg/g) per day three validation days
Standard d’étalonnage sans matrice SE1 0.8 2 6
Calibration standard without
SE2 1.0 2 6
matrix
SE3 1.2 2 6
Standard d’étalonnage avec matrice SE1 0.8 2 6
Calibration standard with matrix
SE2 1.0 2 6
SE3 1.2 2 6
Standard de validation avec matrice SV1 0.8 3 9
Validation standard with matrix
SV2 1.0 3 9
SV3 1.2 3 9
Total 63

sur six conditions d’étalonnage. Dans tous les cas le model that has been kept is the straight line.
modèle d’étalonnage retenu est la droite. Figure 6 gathers these diagrams and makes it pos-
La figure 6 rassemble ces graphiques et permet sible to select the one providing the most efficient
de sélectionner celui qui donne les résultats les plus results. Finally, it appears that the best adapted profile
performants. Finalement, il apparaît que le profil is the one consisting in calibrating only at the120%
le mieux adapté est celui qui consiste à étalonner à level, without matrix. Table IV includes all these
un seul niveau de 120% en absence de la matrice. methods performance criteria, at every concentration
Le tableau IV contient l’ensemble des critères de level, in the case where the calibration model is built
performance de cette méthode à chaque niveau de up with a single concentration level at 120% of the
concentration, dans le cas où le modèle d’étalonnage nominal value.
est construit avec un seul niveau de concentration à
120% de la valeur nominale. This example of validation of a classical method
Cet exemple de validation d’une méthode classi- intended to control an active ingredient concentration
que destinée à contrôler la teneur d’un principe actif in a medicine illustrates once again, the proposed
Tableau IV. Dosage de l’hydrocortisone en µg/g. Profil d’exactitude pour un étalonnage à 120%.
Table IV. Hydrocortisone determination expressed in µg/g. Accuracy profile for a calibration at 120%.
Critères de performance Hormone A
Performance criteria
Niveau 1/Level 1 Niveau 2/Level 2 Niveau 3/Level 3
Concentration ajoutée (%) 80 100 120
Added concentration (% of the
nominal content)
Limite basse de tolérance 797.8 964.7 1161.0
Tolerance lower limit
Limite haute de tolérance 812.9 1034 1234
Tolerance higher limit
Limite basse relative de tolérance (%) - 0.21% - 3.37% - 3.12%
Relative tolerance lower limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 1.73% 3.61% 2.94%
Relative tolerance higher limit (%)
Écart-type de répétabilité 1.865 0.982 1.658
Repeatability standard deviation
Écart-type de fidélité intermédiaire 1.804 7.124 7.588
Intermediate precision standard
deviation
CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%) 0.23% 0.09% 0.14%
CV fidélité intermédiaire (%) 0.33% 0.72% 0.65%
RSD intermediate precision (%)
Concentration prédite inverse (%) 799.1% 998.3% 1198.0%
Inverse predicted quantity
Biais absolu /Absolute bias 6.061 1.180 -1.099
Biais relatif (%)/Relative bias (%) 0.76% 0.12% 0.09%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 100.8% 100.1% 99.9%

96 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

01-hubert.indd 96 27/06/06 18:42:33

 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

10%
avec matrice/with matrix

Erreur relative (%)/Relative error (%)

sans matrice/without matrix

5%

0%
750 1000 1250

-5%

Etalonnage entre 80-120%/Calibration between 80-120%

-10%
Concentration µg/g

A)
10%
avec matrice/with matrix
Erreur relative (%)/Relative error (%)

sans matrice/without matrix

5%

0%
750 1000 1250

-5%

Etalonnage à 100%/Calibration at 100%

-10%
Concentration µg/g

B)

10%
avec matrice/with matrix
Erreur relative (%)/Relative error (%)

sans matrice/without matrix

5%

0%
750 1000 1250

-5 %

Etalonnage à 120%/Calibration at 120%

-1 0 %

Concentration µg/g
C)

Figure 6. Hydrocortisone dans la pommade. Profils d’exactitude pour un étalonnage avec et sans matrice à différents niveaux de concentration
(limites d’acceptation à ± 5%). A) Trois niveaux de concentration : 80, 100 et 120%. B) Un niveau à 100%. C) Un niveau à 120%.
Figure 6. Hydrocortisone in the ointment. Accuracy profiles for a calibration with and without matrix at different concentration levels (±5%
acceptability limits). A) Three concentration levels: 80, 100, 120%. B) One level at 100%. C) One level at 120%.

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 97

01-hubert.indd 97 27/06/06 18:42:34

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
dans une spécialité pharmaceutique illustre à nou-
veau la flexibilité de la démarche proposée. Il traduit
comment le mode opératoire peut être finalisé et la
procédure d’étalonnage choisie de façon à assurer des
performances optimales en routine.
V Pork plasma acrylamide
Détermination de l’acrylamide
par LC-MS dans le plasma de porc
1. Matériel et méthodes
L’acrylamide est un produit néoformé lors de la
cuisson de certains aliments. Il est issu de la réaction
de Maillard par combinaison d’un monosaccharide
(glucose) et de certains acides aminés comme l’as-
paragine. Si de nombreuses études documentent
la teneur en acrylamide dans les aliments peu
d’études ont permis d’en quantifier l’absorption
après ingestion. Une étude de pharmacocinétique,
réalisée chez le porc doit permettre de déterminer
la biodisponibilité de l’acrylamide. Au préalable une
méthode analytique est nécessaire pour quantifier
dans le plasma de porc les concentrations en acryla-
mide. La méthode retenue pour effectuer ce dosage
est une méthode HPLC associée à une détection par
spectrométrie de masse (LC-MS). La validation est
ensuite réalisée sur une gamme très étendue, allant
de 10 à 5000 mg/L, choisie par manque d’information
sur les taux plasmatiques observables après ingestion
d’aliments contenant de l’acrylamide.
L’absence de matériaux de référence nous a con-
duit à utiliser une méthode d’ajouts dosés en utili-
sant un plasma de porc témoin. Deux gammes ont
été préparées : une gamme d’étalonnage (standards
d’étalonnage) et une gamme d’ajouts dans du plasma
(standards de validation). La gamme d’étalonnage est
réalisée dans une solution d’acétate d’ammonium
0.01M ramenée à pH 6 avec de l’acide formique.
La préparation de l’échantillon consiste en un
prélèvement de 200 µL de plasma auxquels on ajoute
100 µL d’une solution saturée de ZnSO4, 1000 µL
d’acétonitrile puis 100 µL d’acrylamide D5 marqué
utilisé comme standard interne. Après agitation et
centrifugation le surnageant est évaporé. Le culot
est repris avec 200 µL d’acétate d’ammonium 0.01M
pH 6. Le volume d’injection est de 50 µL. Les con-
ditions analytiques utilisées sont un débit chroma-
tographique de 0.2 mL/min à travers une colonne
Hypercarb (5µ 50-2 mm) et une détection MS sur
l’ion moléculaire 72 de l’acrylamide. La réponse uti-
lisée est la surface du pic.
2. Plans d’expérience
Le plan d’expérience utilisé consiste en cinq jours,
six niveaux de concentrations et deux répétitions
(5 x 6 x 2), soit soixante essais pour les standards
d’étalonnage et de validation. Selon la typologie
proposée, c’est un plan de type V2 selon [1] avec
une modification du nombre de répétitions (deux au
lieu de trois) et du nombre de niveaux de concentra-
98 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 98
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
approach flexibility. It expresses how the operating
procedure can be finalised and the calibration pro-
cedure chosen in order to ensure optimum routine
performances.
V
determination by LC-MS
1. Equipment and methods
Acrylamide is a newly formed product when
certain foods are being cooked. It comes from the
Maillard reaction by combining a monosaccharide
(glucose), and some amino acid such as asparagine. If
the food acrylamide concentration is documented by
various studies, yet, few ones have allowed to quantify
acrylamide absorption after ingestion. A pharmaco-
kinetic study, carried out on pork, is likely to make it
possible to determine the acrylamide bioavailability.
Beforehand, an analytical method is necessary to
quantify the acrylamide concentrations within the
pork’s plasma. The selected method to carry out this
dosage is a HPLC method combined with a mass
spectrometry detector (LC-MS). Validation is then
carried out on a very broad range, extending from 10
to 5000 mg/L, chosen because information is lacking
on plasmatic levels observable after ingesting foods
containing acrylamide.
The lack of reference materials led us to use
spiked amounts on control pork plasma. Two sets of
standards were prepared: calibration standards and
spiked plasma samples (validation standards). The
calibration range is carried out in a 0.01 M ammonia
acetate solution, adjusted at pH 6 with formic acid.
The sample preparation consists in adding into
plasma 200 µL, saturated ZnSO4 solution 100 µL,
acetonitrile 1000 µL, then 100 µL of D5 labelled
acrylamide used as internal standard. After stirring
and centrifuging, the supernatant is evaporated. The
residue is processed again with ammonium acetate
200 µL, 0.001M, pH6. The injection volume is 50 µL.
The used analytic conditions are a 0.2-mL/min chro-
matographic injected through a Hypercarb column
(5µ 50-2mm) and MS detection on the acrylamide
72 molecular ion. The used response is the peak
surface.
2. Experimental designs
The used experimental design consists in five
days, six concentration levels and two repetitions
(5x6x2), i.e. sixty trials for calibration and validation
standards. According to the proposed typology, it is a
V2 protocol according to [1], with a modification of
the number of repetitions (two instead of three) and
of concentration levels (six instead of three). Figure 7
27/06/06 18:42:35
 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
tion (six au lieu de trois). La figure 7 illustre ce plan
d’expériences et l’ensemble des réponses obtenues
en fonction des concentrations introduites pour la
gamme d’étalonnage et pour la gamme de standards
de validation.
3. Résultats
Les données ont été traitées en trois étapes :
- l’analyse des données brutes et le tracé du profil
d’exactitude,
- une analyse pour déterminer le coefficient de
correction de l’effet de matrice à partir du taux de
recouvrement,
- le calcul des profils d’exactitude après correction
des concentrations.
3.1. Analyse des données brutes
Dans cet exemple, la fonction de réponse la plus
appropriée permettant de décrire la relation entre
les concentrations et la réponse est une régression
quadratique pondérée avec un facteur de pondéra-
tion de type 1/X où X représente la concentration
introduite.
La figure 8 présente le profil d’exactitude obtenu
en utilisant ce modèle de régression et un intervalle
de tolérance à 95%. Le graphique montre un décalage
entre le profil d’exactitude et les limites d’acceptation
qui ont été fixées à ± 25%. Ce décalage est dû à l’effet
matrice.
3.2. Calcul du coefficient de correction
Pour corriger cet effet de matrice, un coefficient
de correction a été calculé à partir de la pente de
l’équation de linéarité qui relie les concentrations
théoriques introduites et les concentrations retrou-
vées, calculées par étalonnage inverse. Le coefficient
de correction appliqué correspond à l’inverse de la
pente obtenue avec les standards de validation. La
figure 9 illustre ces calculs.
3.5
3.0
2.5
Surface de Pic
Peak surface
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 1000
Figure 7. Détermination de l’acrylamide (données brutes non corrigés en mg/L). Les résultats sont obtenus sur cinq jours, six niveaux et deux
répétitions par niveau. On peut déjà noter un effet matrice entre les standards d’étalonnage et les standards de validation dans le plasma.
Figure 7. Acrylamide determination (non corrected raw data in mg/L). The results are achieved over five days, six levels and two repetitions by
level. It can already be noticed a matrix effect between the calibration standards and the validation standards within the plasma.
STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 99
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
illustrates this experimental design as well as the
whole set of responses obtained for the calibration
standards and the spiked validation standards.
3. Results
The data have been processed in three steps:
- raw data analysing and accuracy profile drawing;
- analysis to determining the matrix correction coef-
ficient from the recovery yield,
- accuracy profiles computation after correcting the
concentrations.
3.1. Raw data analysis
In this example, the most adapted response func-
tion allowing to describe the relationship between
the concentrations and the response is a weighted
quadratic regression with a 1/X weighting factor,
where X represents the introduced concentration.
Figure 8 represents the accuracy profile achieved
by using this regression model and a 95% tolerance
interval. The diagram shows a gap between the ac-
curacy profile and the acceptability limits that have
been set at ±25%. This gap is due to the matrix ef-
fect.
3.2. Correction coefficient computation
In order to correct this matrix effect, a correction
coefficient has been computed from the linearity
equation slope linking the introduced theoretical
concentrations to the recovered concentrations,
computed by inverse prediction. The applied cor-
rection coefficient corresponds to the inverse of the
slope achieved with the validation standards. Figure 9
illustrates these computations.
2000 3000 4000 5000 6000
Concentration mg/L
99
27/06/06 18:42:37
 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

30%

20%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

0%
0 1000 2000 3000 4000 5000
- 10%

- 20%

- 30%

- 40%

- 50%

- 60%

Concentration mg/L
Figure 8. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Profil d’exactitude réalisé avec les données brutes et montrant que la méthode n’est
pas valide en l’état. Les résultats sont obtenus avec une régression quadratique pondérée pour modéliser la fonction de réponse (limites
d’acceptation à ±25%).
Figure 8. Acrylamide determination in mg/L. Accuracy profile carried out with the raw data and showing that the method is not valid as it is.
The results are obtained with a weighted quadratic regression in order to model the response function (acceptation limits at ± 25%).

6000

5000
Recovered (mg/L)
Retrouvée (mg/L)

4000

3000

2000

[Retrouvée] = 1.9829 + 0.686 [Ajoutée]

1000 [Recovered] 1.9829 + 0.686 [Added]

0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Ajoutée (mg/L)
Added (mg/L)
Figure 9. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Droite de régression entre les concentrations introduites et les concentrations prédites
en retour.
Figure 9. Acrylamide determination in mg/L Regression straight line between the introduced concentrations and the in return predicted
concentrations.

L’équation de la droite est : The equation of the straight line:

[Retrouvée] = 1,9829 + 0,686 x[Ajoutée] [Recovered]= 1.9829 + 0.686[Added]
Le coefficient de correction (Fc) à appliquer à The (Fc) correction coefficient to be applied to
la réponse instrumentale est donc de 1/0,686, soit the instrumental response is thus of 1/0.686, i.e.
1,457. 1.457.

3.3. Calcul du profil d’exactitude après 3.3. Accuracy profile computation

correction after correction

Un nouveau calcul du profil d’exactitude est réa- A new accuracy profile computation is carried out
lisé en tenant compte du coefficient de correction. La taking the correction coefficient into account. The
correction est effectuée sur les réponses des données correction is carried out on the validation data re-
de validation. La figure 10 montre ce nouveau profil sponses. Figure 10 shows this new accuracy profile.
d’exactitude.
Comme l’illustre le profil d’exactitude obtenu après As illustrated by the accuracy profile obtained
application du coefficient de correction, la méthode after applying the correction coefficient, the method
n’est valide que sur une partie du domaine étudié. is only valid on a part of the studied application
En effet, la borne inférieure du profil d’exactitude est range. In effect, the accuracy profile lower limit is
au delà de la limite d’acceptation fixée à ± 25% pour beyond the acceptability limit set at ± 25%, for the

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 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

30%

20%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

10%

0%
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
-10%

-20%

-30%

-40%
Concentration (mg/L)

Figure 10. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Profil d’exactitude réalisé avec les données corrigées. Les résultats sont obtenus avec une
régression quadratique pondérée (type 1/X) pour modéliser la fonction de réponse (limites d’acceptation à ± 25%).
Figure 10. Acrylamide determination in mg/L. Accuracy profile carried out with corrected data. The results are obtained with a weighted
quadratic regression (1/X type) to model the response function (acceptability limits ±25%).

le niveau de concentration égal à 10 mg/L. Le calcul concentration level equal to 10 mg/L. The lower and
des limites de quantification inférieure et supérieure higher quantification limits computation respectively
donne respectivement 14.05 mg/L et 5000 mg/L. Cette gives 14.05 mg/L and 5000 mg/L. Thus, this method
méthode reste donc correctement adaptée à l’objectif remains correctly fitted to the objective that has been
que l’on s’est fixé car les LOQ sont compatibles avec defined, because the LOQs are compatible with the
les teneurs classiquement rencontrées. concentrations usually met.
Le tableau V résume pour l’ensemble des niveaux de Table V summarizes the results obtained for the
concentrations les résultats obtenus. whole set of concentration levels.
Cette étude démontre que, dans la mesure où on This study demonstrated that, as far as a weighted
utilise un modèle de régression quadratique pondérée, quadratic regression model is used, the method is
la méthode est parfaitement valide pour l’intervalle de perfectly valid for an application range set between
dosage qui s’établit entre 14,05 et 5000 µg/mL. Il est 14.05 and 5000 µg/mL. It is also shown that the matrix
également montré que l’effet matrice est systématique effect is systematic and that, in order to correct it, a
et que pour le corriger il faut appliquer un coefficient 1.457 correction coefficient must be applied. It is then
de correction de 1,457. On constate alors que la zone noted that the area included in the tolerance interval

Tableau V. Détermination de l’acrylamide en mg/L. Profil d’exactitude après correction des données brutes.
Table V. Acrylamide determination in mg/L. Accuracy profile after raw data correction.
Critères de performance Niveau 1 Niveau 2 Niveau3 Niveau 4 Niveau 5 Niveau 6
Performance criteria Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5 Level 6
Concentration ajoutée/Added concentration 10 20 50 500 1000 5000
Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit 6.98 16.52 44.93 192.5 894.8 4482
Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit 12.26 24.16 60.07 223 1145 5515
Limite basse relative de tolérance (%) -30.18% -17.40% -10.14% -3.77% -10.52% -10.35%
Relative tolerance lower limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 22.59% 20.82% 20.15% 11.50% 14.48% 10.30%
Relative tolerance higher limit (%)
Écart-type de répétabilité 0.608 0.428 1.624 5.784 32.26 136.7
Repeatability standard deviation
Écart-type de fidélité intermédiaire 0.992 1.313 2.813 6.318 48.01 199.2
Intermediate precision standard deviation
CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%) 6.08% 2.14% 3.25% 2.89% 3.23% 2.73%
CV fidélité intermédiaire (%) 9.92% 6.57% 5.63% 3.16% 4.80% 3.98%
RSD intermediate precision (%)
Concentration prédite inverse 9.62 20.34 52.5 207.7 1020 4999
Reverse predicted quantity
Biais absolu/Absolute bias -0.3796 0.3418 2.501 7.731 19.78 -1.354
Biais relatif (%)/Relative bias (%) -3.796% 1.709% 5.002% 3.866% 1.978% -0.028%
Recouvrement (%)/Recovery (%) 96.2% 101.7% 105.0% 103.9% 102.0% 100.0%

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 101

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 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

comprise dans l’intervalle de tolérance est plus large is broader after correction. This uncertainty increase
après correction. Cette augmentation de l’incertitude is expected given the correction factor application.
est attendue vu l’application du facteur de correction.

VI
Détermination de la vitamine B3 par
HPLC-Fluorimétrie dans le lait
1. Matériel et méthodes
La détermination de la vitamine B3 (aussi appelée
vitamine PP ou niacine) dans les aliments requiert la
mesure de ses deux formes chimiques : l’acide nico-
tinique et la nicotinamide. La concentration totale est
alors exprimée en faisant la somme des deux valeurs
obtenues. Le tableau VI indique les teneurs maximales
et minimales auxquelles on trouve la vitamine B3 dans
les aliments. L’étude présentée ici porte sur le lait dont
les teneurs varient entre 0,6 et 1,0 mg/L selon la nature
du produit. Du fait des traitements thermiques ou des
autorisations de supplémentation accordées, les pro-
duits du marché se situent plutôt entre 0,4 et 2,0 mg/L.
Afin de couvrir un domaine d’application raisonnable,
la validation a été étendue entre 0,2 et 4,0 mg/L.
La méthode officielle de dosage AOAC 94-413
(1990) repose sur une technique microbiologique
délicate et d’incertitude élevée de 15%. Le but de
cette validation est de vérifier si la méthode HPLC
[7] est acceptable comme méthode alternative. C’est
pourquoi les limites d’acceptabilité ont été fixées à
± 20%, ce qui est bien en deçà des performances
classiques de la méthode de référence qui se situent
plutôt autour de ± 40%.
La méthode HPLC consiste en une extraction
de l’acide nicotinique et du nicotinamide par une
hydrolyse HCl 0,1 M à 100°C pendant 1 h, suivie
VI
Milk Vitamin B3 determination by
HPLC-Fluorimetry
1. Equipment and methods
Vitamin B3 (also called vitamin PP or niacin)
determination in food is based on two chemical
forms: nicotinic acid and nicotinamide. The total
concentration is then expressed by adding the two
obtained values. Table VI indicates the maximum
and minimum vitamin B3 contents potentially found
in food. The study herein presented concerns milk
which concentrations vary between 0.6 and 1.0 mg/L,
according to the product nature. Due to thermal treat-
ments or authorized supplementation, the marketed
products rather stand between 0.4 and 2 mg/L. In
order to cover a reasonable application field, valida-
tion has been extended between 0.2 and 4.0 mg/L.
The official AOAC 94-413 (1990) determination
method is based upon a delicate, high uncertainty,
(15%) microbiological technique. This validation
study aims at checking whether HPLC [7] is accept-
able as an alternative method. This is the reason why
the acceptability limits have been set at ±20%, which
is clearly inferior to the reference method classic
performances which stand rather around ±40%.
HPLC method consists in a 1-h extraction of
nicotinic acid and nicotinamide by a HC1 0.1 M at
100°C hydrolysis, followed by an elution on a 60 RP

Tableau VI. Teneurs usuelles en vitamine B3 des grandes familles d’aliments exprimées en mg/kg ou mg/L.
Table VI. Large food families usual Vitamin B3 contents expressed in mg/kg or mg/L

Famille d’aliments/Food family Minimum Maximum

Abats/Variety meat 20.0 155.0
Boulangerie et viennoiserie/Bakery and rolls 10.0 34.0
Céréales et pâtes/Cereals and pasta 1.0 57.0
Céréales pour petit déjeuner/Cereals for breakfast 41.0 176.0
Charcuterie et salaison/Assorted cooked meats and salted meats 2.5 102.0
Fromages/Cheese 0.6 24.0
Fruits/Fruits 1.0 32.0
Graines oléagineuses et châtaignes/Oilseeds and chestnuts 2.0 150.0
Légumes/Vegetables 1.0 65.0
Légumes secs/Dry vegetables 1.0 30.0
Oeufs et dérivés/Eggs and derivatives 0.7 0.9
Pâtisserie et biscuits/Pastries and biscuits 1.0 18.0
Poissons et batraciens/Fishes and batrachians 2.1 140.0
Pommes de terre et apparentés/Potatoes and related products 6.0 40.0
Produits laitiers et desserts lactés 0.6 10.0
Dairy products and desserts containing milk
Viandes/Meats 26.0 90.0
Volailles et gibiers/Poultry and game 29.0 92.0

102 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

01-hubert.indd 102 27/06/06 18:42:43

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
d’une élution sur colonne Lichrospher 60 RP Se-
lect B (5 µm, diamètre 4 mm, longueur 250 mm)
par un tampon phosphate 0,07 mol/L contenant du
peroxyde d’hydrogène 0,075 mol/L et du sulfate de
cuivre 5,10-6 mol/L. Une dérivation photochimique
post-colonne est réalisée à l’aide d’une lampe UV,
éliminant la raie d’absorption à 254 nm, et permet
d’obtenir des dérivés détectables par spectrofluorimé-
trie à 380 nm après excitation à 322 nm. La quanti-
fication des deux espèces chimiques est obtenue par
étalonnage externe.
Dans la mesure où la validation du dosage du
nicotinamide ne présente aucun problème, nous ne
parlerons que de l’acide nicotinique pour lequel on
observe un effet de matrice tout à fait significatif.
2. Plans d’expérience
Le même plan d’expérience a été utilisé pour
l’étalonnage et la validation ; il consiste en vingt-sept
essais réalisés à trois niveaux sur trois jours et trois
répétitions (3 x 3 x 3). C’est donc un plan de type V4
selon [1] auquel on a ajouté un niveau supplémentaire
aux standards d’étalonnage : 3 x 3 x 3 au lieu de trois
jours x deux répétitions x deux niveaux. Ce choix
est motivé, d’une part, par un nombre total d’essais
économiquement acceptable, d’autre part, par le mode
opératoire de la méthode qui préconise trois niveaux
de concentration au minimum pour l’étalonnage.
Étant donné qu’il n’existe pas de matériau de
référence adapté, on a décidé de réaliser des séries
de droites d’ajouts sur deux échantillons de lait. La
figure 11 illustre, à partir de données expérimentales,
le plan d’expérience complet, la variabilité inter-jours
et l’effet de matrice.
On retrouve trois séries de données :
- les standards d’étalonnage (Etalon) obtenus par
mise en solution d’acide nicotinique pur dans de
l’eau distillée,
300
Etalon 1
Etalon 2
Etalon 3
Lait A1
Lait A2
250 Lait A3
Lait B1
Lait B2
Lait B3
200
Hauteur (UA)
Height (UA)
150
100
50
0
0.0 0.5 1.0
Figure 11. Acide nicotinique (données brutes non corrigées en mg/L). Le Jour 1 est représenté par un carré, le jour 2 par un cercle et le jour 3
par un losange. Les différentes droites d’ajouts sur les laits A et B illustrent l’effet de matrice.
Figure 11. Nicotinic acid (non-corrected raw data in mg/L). Day 1 is represented by squares, day 2 by circles, and day 3 by diamonds. The spiked
standards on milks A and B illustrate the matrix effect.
STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 103
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
Select B (5 µm, 4 mm diameter, 250 mm length)
Lichrospher column, with a 0.07-mol/L phosphate
buffer, containing 0.075 mol/L hydrogen peroxide
and 5.10-6 mol/L copper sulphate. A post-column
photochemical derivation is carried out with a UV
lamp, eliminating the absorption line at 254 nm, and
allowing to obtain detectable derivatives by spec-
trofluometry at 380 nm after excitation at 322 nm.
Both chemical species quantification is obtained by
external calibration.
As nicotinamide determination validation does
not present any difficulty, we shall only speak about
nicotinic acid, for which a highly significant matrix
effect is observed.
2. Experimental design
The same experimental design has been used for
both calibration and validation; it consisted in twenty
seven trials carried out at three levels over three days
and three repetitions (3x3x3). Thus it is a V4 protocol
according to [1], to which an additional level has been
added to the calibration standards: 3x3x3 instead of
three days x two repetitions x two levels. This choice
is motivated, on the one hand, by an economically
acceptable total number of trials, and, on the other
hand, by the operating procedure that recommends
a minimum of three concentration levels for calibra-
tion.
Given that adapted reference material does not
exist, it has been decided to carry spiked standards
on two milk samples. Figure 11 illustrates, from ex-
perimental data, the complete experimental design,
the inter-days variability and the matrix effect.
Three series of data are recovered:
- calibration standards obtained by dissolving pure
nicotinic acid into distilled water,
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Concentration mg/L
103
27/06/06 18:42:45
 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

- les standards d’étalonnage par ajouts dosés dans la - spiked calibration standards into the Milk A ma-
matrice Lait A, trix,
- les standards de validation par ajouts dosés dans la - spiked validation standards into the Milk B ma-
matrice Lait B. trix.

3. Résultats 3. Results
Les données ont été traitées en deux étapes : The data were processed in two steps:
- le calcul du coefficient de correction de l’effet de - computation of the matrix effect correction coef-
matrice à partir du taux de recouvrement, ficient, from the Recovery yield,
- le calcul des profils d’exactitude. - accuracy profiles computation.
En appliquant la procédure proposée, on a calculé By applying the proposed procedure, the values
les valeurs retrouvées pour le lait A par prédiction in- for milk A, calculated by inverse prediction, have
verse, en utilisant l’ensemble des données d’étalonnage. been computed, using the whole calibration data set.
La figure 12 illustre les vingt-sept valeurs obtenues Figure 12 illustrates the twenty seven values obtained
pour cette matrice. Il apparaît clairement qu’elles ne for this matrix. It clearly appears that they do not fit
s’alignent pas sur la droite de linéarité, illustrée par la to the linearity straight line, illustrated by the first
première bissectrice, et qu’il y a un effet de matrice. bisecting line, and that there is a matrix effect.
On a alors calculé la droite selon la méthode des The straight line was then computed according
moindres carrés et on obtient (entre parenthèses to the least squares method, and we obtain:
figurent les écarts-types des coefficients) : [Recovered] = 0.018 + 0.518 [Added]
[Retrouvée] = 0.018 + 0.518 [Ajoutée]
Si on calcule les intervalles de confiance des coeffi- Computing the coefficients confidence inter-
cients : vals:
Ordonnée Pente Coefficient Ordinate at Slope Correction
à l’origine de correction the origin coefficient
Limite inférieure -0.045 0.493 2.028 Lower limit -0.045 0.493 2.028
Limite supérieure 0.082 0.542 1.845 Higher limit 0.082 0.542 1.845
Comme la valeur 0 fait partie de l’intervalle de As the 0 value is part of the confidence interval
confiance de l’ordonnée à l’origine, on a décidé de of the ordinate at the origin, it has been decided to
la considérer comme nulle ; cette démarche est ap- consider it as non signifcant. This approach is ap-
plicable dans ce cas car nous sommes près du zéro, plicable in this case, because we are close to zero. It
elle serait risquée si la gamme d’étalonnage était très would be risky if the calibration range was very far
éloignée de la valeur zéro. Par contre pour la pente, from the zero value. Conversely, as for the slope the
la valeur 0,5 appartient à l’intervalle et par simplifi- 0.5 value belongs to the interval and, to simplify, it
cation, on a donc décidé d’appliquer un coefficient has been decided to apply a correction coefficient Fc =
de correction Fc = 2,0 sur toutes les données prédites 2.0 to all the data predicted by inverse calibration for
par étalonnage inverse pour le lait B. milk B.
Ces données corrigées ont alors servi à calculer These corrected data have then been used to
le profil d’exactitude de la figure 13 ; les statistiques compute the Figure 13 accuracy profile; the statistics
calculées comme il est décrit par ailleurs sont repor- calculated as described elsewhere are reported in
tées dans le tableau VII. Table VII.

4.5

4.0
Calculée / Calculated (mg/L)

3.5

3.0

2.5
y = 0.518x + 0.018
2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

Ajoutée / Added (mg/L)

Figure 12. Acide nicotinique en mg/L. Droite de linéarité obtenue sur les données brutes du lait A avant correction. Le coefficient de correction
de l’effet de matrice correspond à l’inverse de la pente de la droite.
Figure 12. Nicotinic acid in mg/L. Linearity straight line obtained on milk A raw data before correction. The matrix effect correction coefficient
corresponds to the inverse of the slope.

104 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

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 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

25%

20%

15%

Erreur relative (%)/Relative error (%) 10%

5%

0%
0 .0 1 .0 2 .0 3 .0 4 .0 5 .0
-5 %

-1 0 %

-1 5 %

-2 0 %

-2 5 %

C o nce ntra tio n (m g/L )

Figure 13. Acide nicotinique en mg/L. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 20%).
Figure 13. Nicotinic acid in mg/L. Accuracy profile (±20% acceptability limits) .

Tableau VII. Acide nicotinique en mg/L. Profil d’exactitude après correction par un coefficient déduit du taux de recouvrement.
Table VII. Nicotinic acid in mg/L. Accuracy profile after correction by a coefficient deduced from the recovery yield.
Critères de performance/Performance criteria Niveau 1/Level 1 Niveau 2/Level 2 Niveau 3/Level 3
Concentration ajoutée/Added concentration 0.2 2.0 4.0
Limite basse de tolérance/Tolerance lower limit 0.161 1.796 3.709
Limite haute de tolérance/Tolerance higher limit 0.233 2.157 4.268
Limite basse relative de tolérance (%) -19.57% -10.19% -7.26%
Relative tolerance lower limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 16.72% 7.86% 6.69%
Relative tolerance higher limit (%)
Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation 0.0148 0.0559 0.1141
Écart-type de fidélité intermédiaire 0.0148 0.0668 0.1141
Intermediary precision standard deviation
CV répétabilité (%)/RSD repeatability (%) 7.42% 2.80% 2.85%
CV fidélité intermédiaire (%)/RSD intermediate precision (%) 7.42% 3.34% 2.85%
Concentration prédite inverse/Inverse predicted quantity 0.197 1.977 3.988
Biais absolu/Absolute bias 0.003 -0.023 -0.012
Biais relatif (%)/Relative bias (%) -1.43% -1.16% -0.29%
Recouvrement (%)/Recovering (%) 98.58% 98.84% 99.71%

Le profil d’exactitude de la figure 13 montre que la The Figure 13 accuracy profile shows that the
méthode peut être validée sur la totalité du domaine method can be validated on the whole 0.2 to 4.0 mg/L
de concentrations 0,2 à 4,0 mg/L pour une limite concentration range, and for a ±20% acceptability
d’acceptation de ±20%. limit.
Les critères de performances de la méthode HPLC The herein studied HPLC method Figure of
- objet de l’étude - sont présentés dans le tableau VIII merit are presented in Table VIII, and compared to
et comparés à ceux de la méthode microbiologique, the microbiological method so called “the reference
dite de référence. method”.
Les résultats montrent que les valeurs obtenues The results show that the values obtained are
sont meilleures pour la méthode HPLC, en termes better for the HPLC method in terms of lower quan-
de limite de quantification inférieure et d’incertitude tification limit and uncertainty [7, 3]. Nevertheless,
[7, 3]. Néanmoins l’incertitude pour le niveau le the uncertainty for the application range lowest level
plus bas du domaine d’application est un peu plus is a little higher than for the reference method, but
élevée que pour la méthode de référence mais reste remains comparable.
comparable.
Plusieurs résultats acquis lors de cette étude de Several results obtained at the time of this vali-
validation nous ont amené à modifier le mode opé- dation study have led us to amend the operating
ratoire : procedure:
- le profil d’exactitude a été obtenu avec un modèle - the accuracy profile has been obtained with a linear

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 105

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 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
Tableau VIII. Vitamine B3 en mg/L. Comparaison des critères de performance de la méthode HPLC et de la méthode microbiologique
Tableau VIII. Vitamin B3 in mg/L. HPLC and microbiological methods performance criteria comparison.
Critères/Criteria
Limite de détection/Detection limit
Limite de quantification inférieure/Lower quantification limit
Limite de quantification supérieure/Higher quantification limit
Incertitude (%) à 0.2 mg/L
Uncertainty (%) at 2.0 mg/L
4.0 mg/L
linéaire passant par 0 et le niveau de concentration
le plus élevé. Par conséquent, en routine, l’étape
d’étalonnage est simplifiée et ne comporte plus qu’un
niveau de concentration à 4,0 mg/L,
- un coefficient de correction de 2,0 est systémati-
quement appliqué aux réponses mesurées.
À partir des données de la figure 12, il aurait été
possible de calculer un profil d’exactitude en utilisant
les ajouts sur le lait A comme mesures d’étalonnage
puis celles sur le lait B comme mesures de validation.
Le profil obtenu est alors tout à fait comparable et
ne nécessite pas l’application d’un coefficient de cor-
rection. Cependant, si cette approche est tout à fait
complémentaire, elle correspond moins aux pratiques
de l’analyse de routine et exigerait surtout de disposer
en permanence d’un échantillon de référence blanc.
Étant donné la nature dégradable du lait, le choix
de cette autre méthode d’étalonnage compliquerait
fortement la procédure.
VII
Détermination d’une protéine
de biomarquage d’une maladie
neurologique par un test ELISA
1. Objectifs et moyens
Un test ELISA de type « sandwich » a été développé
afin de quantifier avec exactitude une protéine pressen-
tie comme biomarqueur et utilisée pour un projet de
recherche thérapeutique sur une maladie neurologique.
Le test ELISA consiste en l’incubation d’échantillons
sur des plaques enduites d’anticorps spécifiques pour
la capture de la protéine d’intérêt. Cette phase est suive
d’une détection immunologique de la liaison spécifique
de la protéine par un enzyme conjugué et une mesure
par densité optique du produit coloré.
Afin de valider ce test, les standards d’étalonnage et
les standards de validation ont été préparés dans des
matrices appropriées à partir de solution stock de la
protéine par des dilutions en série [8].
2. Plans d’expérience
Cette procédure a été exécutée sur quatre séries
indépendantes, avec deux plaques par essai sur quatre
jours. Tous les essais – que ce soit pour les standards
d’étalonnage ou de validation – ont été conduits en
triple.
106 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 106
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
Méthode HPLC Méthode microbiologique
HPLC method Microbiological method
0.2 n.d.
0.2 0.4
0.4 n.d.
15.6% 15%
7.2% 15%
6.0% 15%
model running through 0 and the highest concentra-
tion level. Consequently, in routine, the calibration
step is simplified and only includes one concentration
level at 4.0 mg/L,
- a 2.0 correction coefficient is systematically applied
to the observed responses.
From Figure 12 data, it would have been possible
to compute an accuracy profile by using the spiked
milk A samples, as calibration measures, then on
milk B as validation measures. The obtained profile
is then absolutely comparable and does not require a
correction coefficient to be applied. However, if this
approach is fully complementary, it less corresponds
to the routine analysis practices and would, above
all, demands to permanently have a blank reference
sample. Given the milk degradable nature, choosing
this other calibration method would strongly com-
plicate the procedure.
VII
Determination of a neurological disease
biomarker protein by a ELISA test
1. Goals and means
A “sandwich” type ELISA test has been developed
in order to exactly quantify a protein likely to be a
biomarker and used for a neurological disease-related
therapeutic project. ELISA test consists in incubating
samples on plates coated with specific antibodies with
a view to capturing the protein of interest. This phase
is followed by an immunologic detection of the protein
specific linkage by a conjugated enzyme and a measure-
ment of the coloured product by optical densitometry.
In order to validate this test, the calibration standards
and the validation standards were prepared in appro-
priate matrixes, from protein stock solutions, by serial
dilution [8].
2. Experimental designs
This procedure has been carried out on four in-
dependent series, with two plates by trial, over four
days. All the trials – either for calibration or validation
standards – have been conducted in triple.
27/06/06 18:42:49
 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

3. Résultats 3. Results
Une régression logistique à quatre paramètres A four-parameter logistic regression (4PL) has
(4PL) a été ajustée sur les données (par essai et par been adjusted on the data (by trial and by plate) by
plaque) par la méthode de maximum de vraisem- the maximum of likelihood method, by using, as
blance en utilisant comme pondération une fonction weighting, an exponential function of the observed
exponentielle des niveaux observés (POM, power of levels (POM, power of the mean).
the mean).
δ −α δ −α
Y =α + Y =α +
 γ β  γ β
1+   1+  
X X

δ, α, γ et β sont respectivement l’asymptote haute,
l’asymptote basse, la concentration correspondant
au point d’inflexion de la courbe et la pente en ce
point. Graphiquement, pour une série de mesures
réalisées sur quatre jours, les courbes d’étalonnage
se présentent comme à la figure 14.
Les concentrations estimées des échantillons de
validation ont été calculées en inversant la fonction
de réponse, c’est-à-dire :
γˆ i
x ijk,calc =
 δˆ − αˆ  βˆ
 i i
−1
 y ijk − αˆ i 
Connaissant la teneur théorique de ces échan-
tillons par dilution, la justesse, la fidélité et l’intervalle
de tolérance ont été calculés pour chaque niveau de
concentration (tableau IX). Le profil d’exactitude est
représenté en figure 15.
L’intervalle de tolérance à 95% est compris dans
les limites d’acceptation de ± 30% à tous les niveaux
de concentration, excepté aux niveaux inférieurs à
28 ng/mL (figure 15). La limite de quantification est
estimée à 24 ng/mL. En dessous de cette limite, par
définition, la méthode n’offre plus de garantie suffi-
sante.
Sur la base de ces expériences de validation nous
pouvons conclure que les garanties sont suffisantes.
En effet, la méthode fournira des résultats à moins de
30% de la vraie valeur dans au moins 95% des cas
lorsque la concentration se situe entre 24 ng/mL et
450 ng/mL.
4 .0
δ, α, γ and β are respectively the higher asymptote,
the lower asymptote, the concentration correspond-
ing to the curve inflexion point and the slope in this
point. Graphically, for a series of measurements car-
ried out on four days, the calibration curves appear
like in Figure 14.
The validation samples estimated concentrations
have been computed by inversing the response func-
tion, i.e.:
γˆ i
1 x ijk,calc = 1
i  δˆ − αˆ  βˆi
 i i
−1
 y ijk − αˆ i 
Knowing the samples theoretical contents by
dilution, trueness, precision, and tolerance interval
have been computed for each concentration level
(Table IX). The accuracy profile is represented in
Figure 15.
The 95% tolerance interval is included inside
the ± 30% acceptability limits, at every concentra-
tion level, except at the levels lower than 28 mg/mL
(Figure 15). The quantification limit is estimated at
24 ng/mL. Below this limit, by definition, the method
does no longer offer sufficient guarantee.
On the basis of these validation experiments,
we can conclude that the guarantees are sufficient.
Actually, the method will provide results at less than
±30% of the real value, in at least 95% of the cases,
when the concentration stands between 24 ng/mL
and 450 ng/mL

3 .5 J o u r 4/Day 4
J o u r 2/Day 2
J o u r 3/Day 3
3 .0 J o u r 1/Day 1

2 .5
Absorbance

2 .0

1 .5

1 .0

0 .5

0 .0
0 100 200 300 400 500 600 700 800

C o n c e n tra tio n n g /m L

Figure 14. Dosage ELISA en ng/mL. Ajustement du modèle logistique à quatre paramètres pour des série de données d’étalonnage collectées
sur les quatre jours de l’étude.
Figure 14. ELISA dosage in ng/mL. Adjustment of a four-parameter logistic model for series of calibration data collected during the four-day
study.

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 107

01-hubert.indd 107 27/06/06 18:42:52

 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

120%

80%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

40%

0%
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

-4 0 %

-8 0 %

C o n ce n tra tio n (n g /m L )

Figure 15. Dosage ELISA d’une protéine de biomarquage. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 30%).
Figure 15. ELISA determination of a biomarker protein. Accuracy profile (± 30% acceptability limits).

Tableau IX. Dosage ELISA en ng/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude pour les échantillons de validation et de la fidélité pour les
échantillons inconnus.
Table IX. ELISA dosage in ng/mL. Computation results of accuracy profile for validation samples and precision for unknown samples..
Critères de performance Echantillons de validation/Validation sample
Performance criteria
Concentration théorique 3.5 7 14.1 28 56 113 225 450
Theoretical concentration
Limite basse de tolérance 1.179 4.395 10.67 22.7 47.64 96.3 207.7 335.9
Tolerance lower limit
Limite haute de tolérance 6.859 11.97 19.28 35.82 68 136.9 270.6 555.3
Tolerance higher limit
Limite basse relative de tolérance (%) -66.33% -37.22% -24.3% -18.64% -14.93% -14.78% -7.678% -25.35%
Relative tolerance lower limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 95.97% 71.05% 36.75% 27.93% 21.42% 21.16% 20.27% 23.41%
Relative tolerance higher limit (%)
Écart-type de répétabilité 1.344 1.193 1.899 1.187 1.774 3.606 9.106 23.33
Repeatability standard deviation
Écart-type de Fidélité intermédiaire 1.344 1.588 2.004 2.304 3.556 7.127 12.82 40.55
Intermediate precision standard deviation
CV de répétabilité (%) 38.41% 17.04% 13.47% 4.238% 3.168% 3.191% 4.047% 5.185%
RSD repeatability (%)
CV de fidélité intermédiaire (%) 38.41% 22.69% 14.21% 8.229% 6.349% 6.307% 5.696% 9.01%
RSD intermediate precision (%)
Concentration moyenne prédite 4.019 8.184 14.98 29.3 57.82 116.6 239.2 445.6
Inverse predicted quantity
Biais absolu /Absolute bias 0.5187 1.184 0.8777 1.301 1.818 3.607 14.16 -4.367
Biais relatif (%)/Relative bias (%) 14.82% 16.91% 6.225% 4.647% 3.246% 3.192% 6.294% -0.970%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 114.8% 116.9% 106.2% 104.6% 103.2% 103.2% 106.3% 99.03%

VIII VIII
Détermination d’impuretés par Impurities determination by HPLC-UV
HPLC-UV dans une préparation in a pharmaceutical product
pharmaceutique
1. Objectifs et méthodes 1. Goals and methods
Dans le cadre d’un contrôle qualité en vue d’une As part of a quality control aiming at releasing a
libération de lot, une méthode a été développée batch, a method has been developed with a view to
pour déterminer le niveau d’impuretés dans deux determining the impurities level in two pharmaceu-
formes pharmaceutiques, ayant différents niveaux tical preparations, having different concentration
de dosage du principe actif. Cette méthode repose levels of active ingredient. This method is based upon
sur la chromatographie liquide à haute performance reversed phase high performance liquid chromatog-

108 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

01-hubert.indd 108 27/06/06 18:42:53

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
phase inverse, couplée à un détecteur UV travaillant
à une longueur d’onde de 269 nm. Les impuretés
sont détectées sur base de leur temps de rétention.
La préparation des échantillons s’effectue comme
suit. 20 mg de principe actif sont extraits d’un broyat
de 20 comprimés et dissout dans 20 mL de méthanol.
La phase mobile composée d’acétonitrile, d’acétate
d’ammonium et d’acide acétique glacial est alors ajou-
tée. Le volume d’injection est de 40 µL. L’objectif de
cette phase de validation est de donner des garanties
que dans 95% des cas, le résultat est à moins de 10%
de la vraie valeur. Cette validation doit également
permettre d’estimer la limite de quantification de la
méthode.
2. Plans d’expérience
Différentes sources de variation ont été consi-
dérées pour cette validation: l’opérateur, l’équipe-
ment et le jour. En considérant deux niveaux pour
chaque facteur, le plan factoriel complet compte
huit combinaisons. Un plan factoriel partiel moins
contraignant a été sélectionné et il est décrit dans la
tableau X. Pour chaque série, on a préparé des stan-
dards d’étalonnage, des standards de validation. Les
standards d’étalonnage ont été préparés hors matrice, à
quatre niveaux de concentration : 0,05% (100 ng/mL),
0,50% (1000 ng/mL), 1,25% (2500 ng/mL) et 2%
(4000 ng/mL) avec deux préparations indépendantes
par niveau de concentration.
N’ayant ni les impuretés ni les excipients à notre
disposition, les standards de validation ont été pré-
parés à partir du principe actif seul à cinq niveaux
de concentration : 0,01% (20 ng/mL), 0,05%, 0,25%
(500 ng/mL), 0,50% et 1,25% avec trois préparations
indépendantes par niveau de concentration.
Dans le cadre de cette étude, il a été supposé que
les impuretés ont une réponse similaire à celle du
principe actif, des échantillons ont été préparés à
partir des formes pharmaceutiques pour simuler un
niveau d’impureté de 0,5% (par rapport à la quan-
tité théorique de substance active) qu’auraient des
échantillons inconnus. Ces préparations consistaient
à broyer un nombre fixé de comprimés, d’en extraire
une quantité déterminée et de la diluer pour obtenir
le niveau de concentration requis. Cet exemple a été
réalisé dans un but plus didactique que pratique car
l’approche décrite ne correspond pas à celle qui est
recommandée pour la validation de méthodes desti-
nées à quantifier des impuretés.
Tableau X. Dosage d’impuretés. Facteurs de variation et niveaux pris en compte.
Table X. Impurities determination. Factors and levels used.
Série/Series Jour/Day
1 1
2 1
3 2
4 2
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01-hubert.indd 109
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
raphy, coupled with a UV detector working at a 259
nm wavelength. Impurities are detected according to
their retention time.
Sample preparation is carried out as follows:
20 mg of active ingredient are extracted from a 20
tablet crushed residue and then dissolved in metha-
nol 20 mL. Then, the mobile phase, composed of
acetonitrile, ammonium acetate and glacial acetic
acid, is added. The injection volume is 40 µL. This
validation study aims at guaranteeing that, in 95%
of the cases, the result is at less than ±10% of the
true value. Moreover, this validation has to make it
possible to assess the quantification method limits.
2. Experimental designs
Different uncertainty sources have been consid-
ered for this validation: the operator, the equipment,
and the day. Considering two levels for each factor,
the full factorial design includes eight combinations.
A fractional factorial design has been selected and is
described in Table X. For each series, calibration and
validation standards have been prepared. Calibration
standards have been prepared out of the matrix, at
four concentration levels: 0.05% (100 ng/mL), 0.50%
(1000 ng/mL), 1.25% (2500 ng/mL) and 2.00%
(4000 ng/mL), with two independent preparations
at each concentration level.
As neither impurities nor excipient were avail-
able as pure product, the validation standards have
been prepared from the active ingredient alone, at
five concentration levels: 0.01% (20 ng/mL), 0.05%,
0.25% (500 ng/mL), 0.50% and 1.25%, with three
independent preparations for each concentration
level.
As part of this study, impurities were supposed to
have a similar response as the active ingredient one:
samples have been prepared from the pharmaceuti-
cal presentations with a view to simulating a 0.50%
impurity level (compared to the active substance
theoretical quantity) that could be found in unknown
samples Sample preparations consisted in crushing
tablets, extracting a determined quantity to be diluted
in order to get the required concentration level. This
example has been carried out in a more pedagogi-
cal than practical purpose. Actually, the described
approach does not correspond to the guidance to
validate methods intended to quantify impurities.
Opérateur/Operator Équipement/Equipment
1 1
2 2
1 2
2 1
109
27/06/06 18:42:54
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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

3. Résultats
Parmi les différents modèles testés, c’est la régres-
sion linéaire passant par zéro qui a donné des résultats
en accord avec les objectifs. Ce type de modèle de
régression a donc été ajusté à chaque série, en con-
sidérant un seul niveau de concentration à 2%.
Les concentrations estimées des échantillons de
validation ont été calculées en divisant simplement
le signal par l’estimation de la pente de la droite de
régression de la série. Connaissant la concentration
théorique de ces échantillons, la justesse, la fidélité
et l’intervalle de tolérance ont été calculés pour cha-
que niveau de concentration (tableau XI). Le profil
d’exactitude est représenté en figure 16.
L’intervalle de tolérance est compris dans les
limites d’acceptation ± 10% à tous les niveaux de
concentration excepté 0,01%. La limite de quantifi-
cation est estimée à 97 ng/mL (figure 16), c’est-à-dire
légèrement sous 0,05%.
La validation donne suffisamment de garantie sur
la méthode et montre qu’elle fournira des résultats à
moins de 10% de la vraie valeur dans au moins 95%
des cas lorsque la concentration se situe entre 97 et
2500 ng/mL.
3. Results
Among the various tested models, linear regres-
sion, running through zero, is the one that has pro-
vided results complying with the objectives. This type
of regression model has, consequently, been adjusted
for every series, considering a single concentration
level at 2%.
The estimated concentrations of validation stan-
dards have been computed by simply dividing the
signal by the estimated slope of the series regres-
sion straight line. Knowing the sample theoretical
concentrations, trueness, precision and tolerance
interval have been computed for each concentration
level (Table XI). The accuracy profile is represented
in Figure 16.
The tolerance interval is included within the
± 10% acceptability limits, at all the concentration
levels, except 0.01%. The limit of quantification is
estimated at 97 ng/mL (Figure 16), i.e. a little lower
than 0.05%.
Validation gives enough guarantees that the
method will provide results at ± 10% of the true value
in at least 95% of the cases, when the concentration
stands between 97 and 2500 ng/mL.

IX IX
Détermination du phosphate Plasma Phosphate Determination
dans un plasma par by Spectrophotometry in the Visible
spectrophotométrie dans le visible Light
1. Objectifs et méthodes 1. Goals and Methods

Le dihydrogénophosphate de sodium est ajouté à Sodium dihydrogen phosphate is added into

Tableau XI. Dosage d’impuretés en ng/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude pour les standards de validation.
Table XI. Impurities determination in ng/mL. Accuracy profile calculation results for validation standards.

Critères de performance/Performance criteria Échantillons de validation/Validation samples

Teneur en impuretés/Content of Impurities 0.01% 0.05% 0.25% 0.50% 1.25%
Concentration nominale/Nominal concentration 20 100 500 1000 2500
Concentration moyenne introduite 20.15 100.8 503.6 1008 2519
Mean introduced concentration
Limite basse de tolérance/Lower tolerance limit 14.39 98.05 490.7 979.1 2431
Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit 39.26 106.5 524.5 1028 2530
Limite basse relative de tolérance (%) -28.58% -2.705% -2.556% -2.840% 3.521%
Relative lower tolerance limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 94.81% 5.659% 4.159% 2.027% 0.4171%
Relative higher tolerance limit (%)
Écart-type de répétabilité 4.644 1.546 6.713 7.764 18.74
Repeatability standard deviation
Écart-type de Fidélité intermédiaire 5.214 1.758 6.713 9.803 20.87
Intermediate precision standard deviation
CV de répétabilité (%)/Repeatability CV (%) 23.04% 1.534% 1.333% 0.770% 0.744%
CV de fidélité intermédiaire (%) 25.87% 1.745% 1.333% 0.973% 0.828%
Intermediate precision CV (%)
Concentration moyenne prédite 26.83 102.3 507.6 1004 2480
Predicted mean concentration
Biais absolu/Absolute bias 6.674 1.488 4.036 -4.098 -39.10
Biais relatif (%)/Relative bias (%) 33.12% 1.477% 0.8015% -0.4067% -1.552%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 133.1% 101.5% 100.8% 99.59% 98.45%

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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

60

40

Erreur relative (%)/Relative error (%) 20

-2 0

-4 0
0 500 1000 1500 2000 2500

C o n c e n tra tio n (n g /m L )

Figure 16. Dosage d’impuretés en ng/mL. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 10%).
Figure 16. Impurities determination ng/mL. Accuracy profile (acceptability limits ± 10%).

certains plasmas à usage thérapeutique dans le but de some therapeutic plasma with a view to keeping
les maintenir à pH neutre et de stabiliser les facteurs de them at neutral pH and stabilizing the coagulation
coagulation. La teneur en phosphate doit cependant factors. However, phosphate concentration must
rester de l’ordre de 5 mMol/L afin d’éviter une hyper- stay at around 5 mMol/L, in order to avoid any
phosphatémie. La méthode de dosage par spectropho- hyperphosphatemia. Thus, the herein developed
tométrie dans le visible développée ici a donc pour determination method by spectrophotometry in the
but de permettre ce contrôle. La mesure est réalisée à visible light aims at making it possible this control.
710 nm sur un complexe phosphomolybdique réduit The measurement is performed at 710 mm, on a stan-
par le chlorure stanneux. Les protéines sont préala- nous chloride reduced phosphomolybdic complex.
blement éliminées par précipitation à l’aide d’acide Proteins are previously eliminated by trichloracetic
trichloracétique et centrifugation. La gamme d’étalon- acid precipitation and centrifugation. The calibration
nage est comprise entre 0.28 et 0.70 µMol/mL. range extends from 0.28 to 0.70 µMol/mL.

2. Plans d’expérience 2. Experimental designs

Il s’agit d’un protocole de type V4 sur trois jours. It is question of a V4 protocol over three days.
Les standards d’étalonnage comportent quatre ni- Calibration standards include four levels and two
veaux et deux répétitions, respectivement avec et repetitions, respectively with and without matrix, or
sans matrice, soit quarante-huit essais. Les standards fourty eight trials. The validation standards include
de validation comportent trois niveaux et trois répé- three levels and three repetitions, or twenty seven
titions, soit vingt-sept essais (tableau XII). Toutes les trials (Table XII). All the calibration (12) and valida-
standards d’étalonnage (12) et de validation (9) sont tion (9) standards are independent.
indépendants.
Les réponses obtenues en densité optique (DO) Responses expressed in optical density units (OD),
en fonction de la concentration pour les standards according to the concentration, for the calibration
d’étalonnage sont présentées sur la figure 17. On peut standards are presented in Figure 17. No matrix effect
observer qu’il n’y a pratiquement aucune influence de is virtually observable and the regression equations
la matrice et que les équations de régression obtenues calculated for every data set are very close. In addi-
pour chaque ensemble de données sont très proches. tion, it can also be observed that the responses are
Par ailleurs, on peut aussi observer que les réponses not perfectly aligned. This is due to the differences
ne sont pas parfaitement alignées. Ceci est dû à des between the concentration levels, as the spiking and
différences dans les niveaux de concentrations car les standard solutions are obtained through accurate
ajouts ou les solutions étalons sont obtenus par pesées weighing (independent samples). A data realigning
exactes (échantillons indépendants). Une étape de step through linear interpolation makes it possible
réalignement des données par interpolation linéaire to compensate these slight differences.
permet de compenser ces légères différences.

3. Résultats 3. Results
La fonction de réponse la mieux adaptée est The best adapted response function is the linear
la régression linéaire pondérée avec un facteur de regression weighted by the 1/X weighting factor. The
pondération de 1/X. Les concentrations estimées concentrations predicted by the weighted linear in-

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 111

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harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Tableau XII. Phosphate dans le plasma. Organisation des essais utilisés pour la procédure de validation.
Table XII. Plasma phosphate. Organization of the trials used for the validation procedure.
Niveau Quantité de Na2HPO4 , 2H2O Nombre de répétition Nombre d’essais pour
Level (nMol/L) par jour les 3 jours de validation
Na2HP04 , 2H2O quantity Daily repetition number Number of trials for
(nMol/L) the validation 3 days
Standard d’étalonnage sans T1 280 2 6
matrice
T2 420 2 6
Calibration standard
without matrix T3 560 2 6
T4 700 2 6
Standard d’étalonnage avec A1 280 2 6
matrice
A2 420 2 6
Calibration standard with
matrix A3 560 2 6
A4 700 2 6
Standard de validation avec Bas/Low 280 3 9
matrice
Médian/Medium 420 3 3
Validation standard with
matrix Haut/High 560 3 9
Total 75

0 .5 0
Densité optique / Optical density

0 .4 5

0 .4 0

0 .3 5

0 .3 0
Sans matrice/Without matrix
Avec matrice/With matrix
Étalonnage sans matrice y = 0.4821x + 0.1233
0 .2 5 Calibration without matrix
Étalonnage avec matrice y = 0.4824x + 0.1214
Calibration with matrix
0 .2 0
0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8

µMol/L phosphate

Figure 17. Phosphate dans le plasma en µMol/L. Standards d’étalonnage en présence et en absence de la matrice.
Figure 17. Plasma phosphate in µMol/L. Calibration standards with and without matrix.

par la fonction inverse du modèle linéaire pondéré, verse function, from the validation standards, show
à partir des standards de validation, montrent qu’il there is a slight matrix effect. Actually, the linearity
existe un léger effet de matrice. En effet, les équations equations values, between introduced concentration
de linéarité entre la concentration introduite T et la T and recovered concentration R are respectively:
concentration retrouvée R valent respectivement : - calibration without the matrix: R = 0.9589 x T +
- étalonnage sans la matrice : R = 0,9589 x T + 5.901,
5,901, - calibration with the matrix: R = 0.9671 x T +
- étalonnage avec la matrice : R = 0,9671 x T + 5.359.
5,359.
Cependant, on a décidé de ne pas appliquer de However, it has been decided not to apply this
coefficient de correction, car cela se révèle inutile correction coefficient, for it proved to be useless, as
comme le montrent les figures 18 et 19. showed in Figures 18 and 19.
Par ailleurs, dans la mesure où on a à disposition In addition, as a data set is available consisting
un jeu de données consistant à réaliser l’étalonnage in carrying out the calibration in the matrix, and no
dans la matrice et non plus dans l’eau, on a pu cal- longer in water, it has been possible to compute a
culer un deuxième profil d’exactitude illustré par la second accuracy profile illustrated by Figure 19.
figure 19.
Les données ainsi estimées ont été traitées avec Data estimated in this way have been processed
des limites d’acceptation de ±15% et un intervalle de with a ±15% acceptability limits and a 90% tolerance

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 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

20%

15%

Erreur relative (%)/Relative error (%) 10%

5%

0%
250 300 350 400 450 500 550 600
-5 %

-1 0 %

-1 5 %

-2 0 %

C o n ce n tra tio n (n M o l/L P h o sp h a te )

Figure 18. Phosphate dans le plasma en nMol/L. Profil d’exactitude pour un étalonnage sans matrice (limites d’acceptation à ± 15%).
Figure 18. Plasma phosphate in nMol/L. Accuracy profile for a calibration without matrix. (acceptability limits ± 15%).

20%

15%

10%
Erreur relative (%)/Relative error (%)

5%

0%
250 300 350 400 450 500 550 600
-5 %

-1 0 %

-1 5 %

-2 0 %

-2 5 %

C o n c e n tra tio n (n M o l/L )

Figure 19. Phosphate dans le plasma. Profil d’exactitude pour un étalonnage dans la matrice (limites d’acceptation à ± 15%).
Figure 19. Plasma phosphate. Accuracy profile for a calibration in the matrix, (acceptability limits ± 15%).

Tableau XIII. Phosphate dans le plasma en nMol/L. Résultats des calculs du profil d’exactitude.
Table XIII. Plasma phosphate in nMol/L. Accuracy profile results.
Niveau/Level Bas/Low Médian/Medium Haut/High
Concentration moyenne introduite/Mean introduced concentration 281.6 421.9 562.3
Limite basse de tolérance/Lower tolerance limit 232.7 387.9 529.9
Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit 322.1 427.1 563.1
Limite basse relative de tolérance (%)/Relative lower tolerance limit (%) -17.37 -8.054 -5.749
Limite haute relative de tolérance (%)/Relative higher tolerance limit (%) 14.40 1.234 0.1551
Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation 8.627 9.946 8.427
Écart-type de fidélité intermédiaire/Intermediate precision standard deviation 16.66 9.946 8.427
CV de répétabilité (%)/Repeatability RSD (%) 3.064% 2.358% 1.499%
CV de fidélité intermédiaire (%)/Intermediate precision RSD (%) 5.915% 2.358% 1.499%
Concentration prédite inverse/Predicted mean concentration 277.4 407.5 546.5
Biais absolu/Absolute bias -4.192 -14.39 -15.75
Biais relatif (%)/Relative bias (%) -1.489% -3.410% -2.797%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 98.51% 96.59% 97.20%

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 113

01-hubert.indd 113 27/06/06 18:42:59

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
tolérance à 90%. L’examen des profils d’exactitude
(figure 18 et figure 19) conduit aux observations sui-
vantes :
- il est préférable d’utiliser des standards d’étalonnage
sans matrice,
- dans ces conditions, le profil d’exactitude montre
une forte augmentation de la dispersion des mesures
au niveau bas (vers 300 nMol/L).
Les résultats des calculs du profil d’exactitude avec
un étalonnage sans la matrice sont regroupés dans le
tableau XIII.
La validation montre que la méthode proposée
donnera des résultats à moins de 15% [9] de la valeur
vraie dans au moins 90% des cas quand la concentra-
tion est comprise entre 320 et 560 nMol/L. Le taux
de recouvrement étant supérieur à 96%, il n’a pas été
jugé nécessaire d’appliquer un coefficient de correction
avec les limites d’acceptation choisies.
Les performances de la méthode pourraient être
nettement améliorées en adaptant la procédure opé-
ratoire de façon à obtenir un domaine de travail situé
au-delà de 400 nMol/L.
X X
Dosage du R-timolol et des autres
impuretés dans des échantillons
de maléate de (S)-timolol
1. Objectifs et moyens
Le maléate de (S)-timolol est susceptible de
contenir comme impureté principale l’énantiomère
R-timolol dont la présence ne doit pas dépasser
1,0% (15 µg/mL) selon la Pharmacopée européenne.
D’autres impuretés peuvent aussi être présentes mais
leur concentration ne doit pas dépasser 0,4%. L’ob-
jectif de la méthode est de contrôler par HPLC-UV
la pureté de la matière première maléate de (S)-timo-
lol.
Les échantillons sont préparés et dilués dans du
2-propanol. Les standards d’étalonnage sont obte-
nus par dilution d’une solution mère de R-timolol.
Cependant, pour obtenir les standards de validation,
les dilutions de la solution mère de R-timolol sont
faites de manière à contenir du maléate de timolol à
raison de 1,5 mg/mL dans les solutions finales.
La gamme d’étalonnage va de 1,5 à 24 µg/mL.
2. Plans d’expérience
Concernant le plan d’expérience (tableau XIV), un
protocole de type V2 a été appliqué en utilisant quatre
niveaux et trois répétitions pendant trois jours, soit au
total trente-six essais. Les standards de validation com-
portent cinq niveaux et trois répétitions pendant trois
jours, soit quarante-cinq essais.
Toutes les standards d’étalonnage (12) et de vali-
dation (15) sont indépendants, c’est-à-dire préparés
séparément afin qu’une erreur éventuelle ne se ré-
percute pas sur l’ensemble des valeurs de référence
(tableau XIV).
114 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 114
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
interval. Examining accuracy profiles (Figure 18 and
Figure 19) leads to the following observations:
- using calibration standards without matrix is pref-
erable,
- under these conditions, the accuracy profile shows
a high increase of the measurement dispersion at the
lower level (at about 300 nMol/L).
The results of the accuracy profile computed with
no-matrix calibration conditions are brought together
in Table XIII.
Validation shows that the results given by the
proposed method are less than 15% under the true
value [9] in at least 90% of the cases, when the con-
centration is included between 320 and 560 nMol/L.
Recovery yield is higher than 96%, thus it was de-
cided as unnecessary to apply a correction coefficient
within the selected acceptability limits.
Method performances could clearly be im-
proved by adapting the operating procedure with a
view to achieving a working range located beyond
400 nMol/L.
R-timolol and other impurities de-
termination within (S) -timolol ma-
leate samples
1. Goals and means
(S)-timolol maleate is likely to contain, as main
impurity, the R- timolol enantiomers, which must
not exceed 1.0% (15 µg/mL), according to the Euro-
pean Pharmacopoeia. Other impurities may equally
be present, however, their concentrations must not
exceed 0.4%.The method aims at controlling, by
HPLC-UV, the (S)-timolol raw materials purity.
Samples are prepared and diluted in 2-propanol.
Calibration standards are obtained by diluting a R-
timolol mother solution .However, in order to obtain
validation standards, the dilutions of the R-timolol
mother solutions are made in such a way that they
contain 1.5 mg/mL of timolol maleate in the end
solutions.
The calibration range extends from 1.5 to
24 µg/mL.
2. Experimental designs
A V2 experimental design (Table XIV) has been
applied, using four levels and three repetitions dur-
ing three days, or in total thirty six trials. Validation
standards include five levels and three replicates
during three days, or fourty five trials.
All calibration standards (12) and validation stan-
dards (15) are independent, i.e. separately prepared
in order to prevent any possible error to propagate
over all reference values (Table XIV).
27/06/06 18:42:59
 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Tableau XIV. Détail du plan d’expérience utilisé pour le (S)-timolol.

Table XIV. Details of the experimental design used for (S)-timolol.
Type de données Niveau Concentration du R- Nombre de répétition par jour Nombre d’essais pour
Type of data Level timolol (µg/mL) Daily repetition number les 3 jours de validation
R-timolol concentration Trials number for the
(µg/mL) validation 3 days
Standard d’étalonnage sans T1 1.5 3 9
matrice
T2 3.0 3 9
Calibration standards
without matrix T3 12.0 3 9
T4 24.0 3 9

Standard de validation avec V1 1.5 3 9

matrice
V2 3.0 3 9
Validation standards with
matrix V3 6.0 3 9
V4 12.0 3 9
V5 24.0 3 9
Total 81

3. Résultats
Les trente-six données d’étalonnage ont permis
de calculer trois modèles (un par jour) : la fonction
de réponse la mieux adaptée est la régression li-
néaire pondérée (1/X2). Ensuite, ces modèles ont été
appliqués aux standards de validation pour obtenir
les concentrations calculées en retour. Afin d’illustre
l’absence de tout effet de matrice et la bonne linéarité
de la méthode, les concentrations ajoutées et celles
calculées sont représentées par la graphe de linéarité
de la figure 20.
Les données expérimentales ont été traitées avec
des limites d’acceptation de ± 10% et un intervalle
de tolérance de 95%. L’examen du profil d’exactitude
(figure 21) conduit aux observations suivantes :
- en utilisant les standards d’étalonnage sans matrice,
le profil d’exactitude montre un élargissement de
l’intervalle de tolérance plus important en dessous de
12 µg/mL et moins important au dessus de ce niveau
de concentration, intervalle toujours compris dans
les limites d’acceptation de 10%,
30
Recovered concentration (mg/L)
Concentration retrouvée (mg/L)
3. Results
The thirty six calibration data were used to com-
pute three models (one every day): the best adapted
response function is the weighted linear regression
(1/X2). Then these models have been applied to the
validation standards in order to calculate the inverse
predicted concentrations. In order to illustrate the
absence of any matrix effect and the good method
linearity, the added concentrations and the recov-
ered ones are represented by the Figure 20 linearity
graph.
The experimental data have been processed with
a ± 10% acceptability limits and a 95% tolerance
interval. Examining the accuracy profile (Figure 21)
leads to the following observations:
- when using calibration standards without matrix,
the accuracy profile shows that the width of the
tolerance interval is the smallest at 12 µg/mL and
large below and above this concentration level, while
this interval is still included within the acceptability
interval of 10%,

25 R = 0.989T + 0.072

20

15

10

0
0 5 10 15 20 25 30

Concentration introduite (mg/L)

Introduced concentration (mg/L)
Figure 20. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol. Droite de linéarité obtenue après étalonnage selon une régression
linéaire pondérée indiquant un taux de recouvrement excellent.
Figure 20. R-timolol in samples of (S)-timolol maleate. Linearity straight line achieved after calibration according to a weighted linear regression
indicating an excellent recovery rate.

STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006 115

01-hubert.indd 115 27/06/06 18:43:01

 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

15%

10%

Erreur relative (%)/Relative error (%)

5%

0%
0 5 10 15 20 25 30

-5 %

-1 0 %

-1 5 %

C o n ce n tra tio n (µ g / m L )

Figure 21. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol exprimé en µg/mL. Profil d’exactitude (limites d’acceptation à ± 10%).
Figure 21. R-timolol in samples of (S) timolol maleate. Expressed in µg / mL. Accuracy profile (± 10%acceptability limits).

Tableau XV. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol exprimé en µg/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude.
Table XV. Concentration of R-timolol in (S)-timolol maleate in µg/mL. Results of the accuracy profile.

Critères de performance Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4 Niveau 5

Performance criteria Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5
Concentration moyenne introduite/Mean introduced concentration 1.513 3.027 6.053 12.11 24.21
Limite basse de tolérance/Mean introduced concentration 1.448 2.885 5.545 11.91 23.04
Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit 1.610 3.269 6.575 12.31 24.96
Limite basse relative de tolérance (%)/Relative lower tolerance limit (%) -4.350% -4.685% -8.404% -1.630% -4.830%
Limite haute relative de tolérance (%)/Relative higher tolerance limit (%) 6.365% 8.005% 8.617% 1.707% 3.077%
Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation 0.02096 0.03685 0.07222 0.06972 0.2099
Écart-type de fidélité intermédiaire 0.02791 0.05873 0.1406 0.07795 0.3085
Intermediate precision standard deviation
CV de répétabilité (%)/precision/Repeatability RSD (%) 1.385% 1.217% 1.193% 0.576% 0.867%
CV de fidélité intermédiaire (%)/Intermediate precision RSD (%) 1.845% 1.940% 2.323% 0.644% 1.274%
Concentration prédite inverse/Predicted mean concentration 1.529 3.077 6.060 12.11 20.00
Biais absolu/Absolute bias 0.01525 0.05023 0.00643 0.00462 -0.2122
Biais relatif (%)/Relative bias 1.007% 1.660% 0.106% 0.038% -0.876%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 101.0% 101.7% 100.1% 100.0% 99.12%

15%

10%
Erreur relative (%)/Relative error (%)

5%

0%
0 5 10 15 20 25 30

-5 %

-1 0 %

-1 5 %

C o n c e n tra tio n (µ g /m L )

Figure 22. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol. Profil d’exactitude (standard d’étalonnage à 12 µg/mL). Limites d’acceptation
à ± 10%.
Figure 22. R-timolol in (S) timolol maleate samples. Accuracy profile (calibration standard at 12µg/mL). Acceptability limits at ± 10%.

116 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

01-hubert.indd 116 27/06/06 18:43:03

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
- on observe aussi un biais positif pour les niveaux 1
et 2, et négatif pour le niveau 5. Dans tous les cas le
biais observé n’excède cependant pas 2%.
Les résultats des calculs du profil d’exactitude qui
ont servi à réaliser la figure 21 sont regroupés dans le
tableau XV.
En voyant les résultats de la validation, on peut
conclure que la méthode développée donnera des
résultats à moins de 10% de la valeur vraie dans
au moins 95% de cas et ce, dans toute la gamme
de concentration sélectionnée. De plus, le taux de
recouvrement est supérieur à 99% (figure 21).
Toutefois comme la Pharmacopée européenne
préconise le plus souvent l’utilisation d’un étalonnage
à un seul niveau de concentration pour la recherche
des impuretés, nous avons testé ce que devenait
le profil d’exactitude de la figure 21 si l’étalonnage
était réalisé avec le seul niveau de concentration de
12 µg/mL. Ce niveau de concentration est en effet
celui qui est le plus proche de la limite d’impureté
tolérée de 15 µg/mL (1%). Le profil correspondant
est illustré dans la figure 22.
À l’examen de la figure 22, nous pouvons constater
que, quel que soit le protocole d’étalonnage retenu,
il n’y a pas de différence quant à l’aptitude de la mé-
thode à fournir des résultats quantitatifs correctes
puisque les limites du profil d’exactitude (limites
inférieure et supérieure) sont toujours comprises
entre les limites d’acceptation de ± 10% fixées a
priori. Toutefois, nous constatons que le biais de la
méthode augmente significativement (± 5%) pour les
concentrations les plus basses et n’est pas altéré pour
les niveaux à 12 et 24 µg/mL.
L’ensemble de ces résultats est donc acceptable et
ce d’autant plus que, comme nous l’avons déjà signa-
lé, la limite admise par la Pharmacopée européenne
pour le R-timolol dans le maléate de (S)-timolol a été
fixée à 15 µg/mL.
Les résultats correspondant à ce dernier profil sont
présentés dans le tableau XVI.
XI
Conclusions
La démarche de validation harmonisée développée
par la commission SFSTP a déjà connu un grand
nombre d’applications. Nous en avons présenté ici
une sélection choisie en fonction de diverses situa-
tions auxquelles sont confrontées quotidiennement
les analystes. Elles permettent de tirer un certain
nombre d’enseignements.
1. D’une façon très globale, si on prend la défini-
tion de la validation telle que la fournit la norme ISO
17025, à savoir que « la validation est la confirmation
par examen et l’apport de preuves effectives du fait
que les prescriptions particulières en vue d’une utili-
sation prévue déterminée sont remplies », la nouvelle
démarche proposée suit très exactement cette défi-
nition. En effet, on doit : 1) partir d’une exposition
claire des objectifs à atteindre en termes de limites
d’acceptation, 2) collecter les preuves effectives grâce
à un plan d’expériences, et finalement 3) les examiner
STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006
01-hubert.indd 117
Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
- a positive bias is also observable for levels 1 and 2,
and a negative one for level 5. However, in all cases,
observed bias does not exceed 2%.
The results of the computation used to build the
accuracy profile in Figure 21 are shown in Table XV.
It can be concluded, from the validation results,
that the results provided by the developed method
will be less than 10% under the true value, in at least
95% of the cases, within all the selected concentration
range. In addition, the recovery yield is higher than
99% (Figure 21).
Whereas, the use of a single concentration level
calibration for the determination of impurities is
mostly recommended by the European Pharmaco-
poeia, we tested what the Figure 21 accuracy profile
was becoming should the calibration be carried out
only with the 12 µg/mL level. Actually, this con-
centration level is the closest one to the impurity
tolerated limit of 15 µg/mL (1%). The corresponding
profile is illustrated Figure 22.
When examining Figure 22, we can observe that,
whatever the selected calibration model, there is no
difference as for the method capability to provide
with fair quantitative results, given that the accuracy
profile limits (lower limits and higher limits), are
always included between the ± 10% acceptability
limits set a priori. However, we observe that the bias
increases significantly (± 5%) for the lowest concen-
trations and does not change for the levels included
between 12 to 24 µg/mL.
Thus, these results as a whole are acceptable,
especially because, as already reported, the limit
accepted by the European Pharmacopoeia for R-
timolol included in (S)-timolol maleate has been set
at 15 µg/mL.
The results corresponding to this profile are pre-
sented in Table XVI.
XI
Conclusions
The harmonized validation approach developed
by an SFSTP commission has already been given a lot
of applications. Herein, we have presented a selection
of these, chosen according to different situations any
analyst is facing every day. Several conclusions can be
drawn from these studies.
1. Globally speaking, should we consider the vali-
dation definition as provided by ISO 17024 standard,
i.e. “validation is the confirmation, by examination
and effective evidence, that the particular prescrip-
tions regarding a foreseen, determined utilization are
respected”, the new proposed approach very exactly
matches this definition. Actually, we must: 1) start
by clearly setting out the objectives to be fulfilled in
terms of acceptability limits, 2) collect the effective
evidences, thanks to various experimental designs
and, finally, 3) examine data in order to statistically
117
27/06/06 18:43:03
 Validation des procédures analytiques quantitatives : Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
harmonisation des démarches Part III. Examples of application
Partie III. Exemples d’application

Tableau XVI. R-timolol dans des échantillons de maléate de (S)-timolol exprimé en µg/mL. Résultats des calculs du profil d’exactitude
(étalonnage à 12 µg/mL).
Table XVI. R-timolol in (S)-timolol maleate samples expressed in µg/Ml. Accuracy profile computing results (calibration at 12 µg/mL).
Critères de performance Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4 Niveau 5
Performance criteria Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5
Concentration moyenne introduite 1.513 3.027 6.053 12.11 24.21
Mean introduced concentration
Limite basse de tolérance/Lower tolerance limit 1.551 2.983 5.712 11.92 23.30
Limite haute de tolérance/Higher tolerance limit 1.640 3.283 6.478 12.29 24.52
Limite basse relative de tolérance (%) 2.481% -1.430% -5.637% -1.528% -3.772%
Relative lower tolerance limit (%)
Limite haute relative de tolérance (%) 8.401% 8.468% 7.013% 1.488% 1.269%
Relative higher tolerance limit (%)
Écart-type de répétabilité/Repeatability standard deviation 0.01831 0.03651 0.07183 0.06905 0.20870
Écart-type de fidélité intermédiaire 0.00000 0.03468 0.09119 0.02309 0.10740
Intermediate precision standard deviation
CV de répétabilité (%)/Repeatability RSD (%) 1.210% 1.206% 1.187% 0.5703% 0.8620%
CV de fidélité intermédiaire (%)/Intermediate precision RSD (%) 1.210% 1.664% 1.918% 0.6013% 0.9694%
Concentration prédite inverse/Predicted mean concentration 1.596 3.133 6.095 12.10 23.91
Biais absolu/Absolute bias 0.08235 0.1065 0.04165 -0.00237 -0.3029
Biais relatif (%)/Relative bias (%) 5.441% 3.519% 0.6881% -0.0196% -1.251%
Recouvrement (%)/Recovery yield (%) 105.4% 103.5% 100.7% 99.98% 98.75%

statistiquement et graphiquement pour confirmer ou
infirmer la validité.
2. Le mode de calcul du profil niveau par niveau
permet de couvrir une très large gamme dynamique
de concentrations. L’approche est donc applicable à
des méthodes dont le domaine d’application peut
comprendre plusieurs décades. On peut alors valider
des méthodes dont les mesures dont les variances
ne sont pas homogènes en fonction du niveau de
concentration. Ce point est important car pour beau-
coup d’autres démarches, l’hypothèse d’homogénéité
des variances dans tout le domaine d’application est
indispensable. On peut rappeler que cette dépen-
dance entre la concentration et l’incertitude est un
phénomène général clairement mis en évidence et
modélisé par Horwitz [10].
3. On peut utiliser des modèles d’étalonnage variés
et même non linéaires, comme une courbe logistique
à quatre paramètres. En effet, selon cette approche,
l’hypothèse de linéarité de la fonction d’étalonnage
peut être totalement abandonnée pour conduire la
validation. En outre, on peut aussi employer des
techniques de régression pondérée qui permettent là
encore de traiter des données dont les variances ne
sont pas homogènes. De même, on a pu voir comment
sélectionner le meilleur modèle de régression dans
le cas d’un exemple très classique de contrôle d’une
substance entre 80 et 120% de sa valeur nominale.
4. La démarche proposée étant globale, on peut
enfin régler les conflits entre la justesse et la fidélité.
Les approches classiques de validation vont générale-
ment traiter séparément la justesse et la fidélité. On
peut alors déboucher sur des conclusions ambiguës si
seulement l’un de ces deux critères est satisfaisant. La
méthode du profil d’exactitude permet de représenter
simultanément, sur un même graphique, ces deux
critères (ou des combinaisons de ces critères). En cela,
cette approche est beaucoup plus flexible et en accord
and graphically confirm or refute validity of the
method.
2. Computation of figures of merit level by level
for establishing the profile makes it possible to cover
a very wide concentration range. Thus, the approach
is applicable to methods which scope of application
may include several decades. Then it is possible to
validate methods which variances are not homog-
enous according to the concentration level. This
point is very important because, for many other ap-
proaches, the variances homogeneity hypothesis over
the whole application field is indispensable. It can be
reminded that this dependency between concentra-
tion and uncertainty is a general phenomenon, which
evidence has clearly been showed and modelled by
Horwitz. [10]
3. Different and even non-linear calibration mod-
els, like a four-parameter logistic function, may be
used. Actually, according to this approach, the cali-
bration function linearity hypothesis can totally be
dropped when conducting the validation. In addition,
weighted regression techniques may be used, making
it possible, here again, to process data which vari-
ances are not homogenous. Similarly, we could see
how to select the best regression model, in the case of
the very classical example of controlling a substance
between 80 and 120% of its nominal value.
4. Conflicts between trueness and precision can
be simply settled. Classic validation approaches are
generally addressing separately trueness and preci-
sion. This can then lead to ambiguous conclusions,
should only one of these two criteria be satisfactory.
The accuracy profile method makes it possible to
simultaneously represent, on a same graph, both
criteria (or combinations of these criteria). For this
reason, this approach is much more flexible and com-
plies with the uncertainty and accuracy definitions

118 STP PHARMA PRATIQUES - volume 16 - N° 2 - mars/avril 2006

01-hubert.indd 118 27/06/06 18:43:04

 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
avec les définitions de l’incertitude et de l’exactitude
qui doivent toujours combiner justesse et fidélité.
5. Classiquement les démarches de validation
consistent à tester la conformité d’un critère de per-
formance par rapport à une valeur de référence. Au
plan statistique cela revient à tester l’hypothèse nulle
sur ces seuls paramètres. En revanche, l’approche
proposée, prend directement les résultats tels qu’ils
seront fournis aux demandeurs ; ceci correspond
enfin aux exigences des nouveaux référentiels d’assu-
rance qualité qui mettent l’accent sur la « satisfaction
du client ». Le profil d’exactitude consiste à fixer la
proportion attendue minimum de futurs résultats se
situant entre les limites d’acceptation fixées a priori.
Mais une démarche complémentaire serait possible
consistant à calculer sur ces bases statistiques le ris-
que client. Rappelons que ce risque peut se traduire
comme la probabilité d’avoir un résultat, en dehors
des limites d’acceptation.
6. Dans deux des exemples présentés, on a vu
qu’il était possible de calculer un coefficient de cor-
rection qui peut être assimilé à l’inverse d’un taux de
recouvrement. Cette question a suscité de nombreux
débats, surtout dans le domaine de l’analyse environ-
nementale, pour savoir s’il faut ou non corriger les
mesures dans le cas où le taux de recouvrement est
très différent de 100%. La réponse apportée par la
méthode du profil d’exactitude est sans ambiguïté : le
taux de recouvrement peut et doit être pris en compte.
En outre, on a pu démontrer expérimentalement que
cette prise en compte entraîne une augmentation de
l’incertitude ; ce qui est parfaitement en accord avec
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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
that always must combine trueness and precision.
5. Typically, validation approaches consist in
testing the conformity of performance criteria with
reference values. Statistically speaking, this means
testing the null hypothesis only on these parameters.
Conversely, the proposed approach directly takes the
results in the way they will be provided to end-users:
this better corresponds to the new quality insur-
ance guidelines requirements that put emphasis on
“customer satisfaction”. Accuracy profile consists in
setting the minimum expected proportion of future
results between the a priori acceptability limits.
However, a complementary approach consisting in
computing on these statistical bases the client risk
could be possible. Let us remind that this risk can
be expressed as the possibility to get a result out of
the acceptability limits.
6. It stands out from two of the presented ex-
amples that it was possible to calculate a correction
coefficient that can possibly be deduced from the
inverse of an averaged recovery rate. This point gave
rise to many discussions, especially in the field of
environmental analysis, in order to know whether
measurements have or not to be corrected, when the
recovery rate is very different from 100%. The answer
provided by the accuracy profile is unambiguous:
recovery yield may and must be taken into account.
In addition, it has been possible to experimentally
demonstrate that, taking this into account leads to
increasing uncertainty: which is perfectly in harmony
119
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 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
les recommandations des métrologues. Bien sûr, cette
méthode soulève un certain nombre de questions.
Dans les exemples, le coefficient de correction le plus
élevé était de 2, ce qui sous-entend que le taux de
recouvrement n’était que de 50%. On peut se poser
des questions sur la « qualité » d’une méthode si le
taux de recouvrement n’était que de 5 ou 10%. De
toute façon, il est vraisemblable que dans de telles
situations, le profil d’exactitude s’élargira à un point
tel qu’on conclura à la non validité de la méthode.
En dépit des nombreuses réponses pratiques
qu’apporte la méthode du profil d’exactitude, cer-
taines restent en suspens. Par exemple, dans quelle
mesure s’applique-t-elle aux comptages microbiolo-
giques très répandus en chimie agroalimentaire ou en
biologie clinique. Par ailleurs, une exigence classique
pour les laboratoires accrédités est de valider une mé-
thode alternative par rapport à une méthode dite de
« référence ». Dans ce cas, les calculs devront prendre
en compte le fait que la valeur théorique est connue
avec une incertitude. Il est donc nécessaire de réaliser
un certain nombre d’applications complémentaires
pour mieux affirmer l’« universalité » de la méthode
du profil d’exactitude.
Enfin, pour conclure, il nous semble indispensable
de rappeler que la validation doit toujours intervenir
après le développement de la méthode. Si on essaie
de conduire les essais avec une méthode encore mal
connue, on risque d’avoir de sérieuses déconvenues ;
on pourrait alors conclure à son inefficacité.
Remerciements
Les résultats sur la détermination de l’acrylamide dans le
plasma ont été obtenus grâce au concours de Jean-Michel
Delmas, assistant ingénieur dans l’Unité de Pharmacociné-
tique-Pharmacodynamie de l’Agence française de sécurité
sanitaire des aliments à Fougères. Les résultats sur l’acide
nicotinique ont été obtenus grâce au concours de Jinadevi
Redon et Hugues Biaudet de la Société scientifique d’hygiène
alimentaire à Longjumeau et ceux sur le dosage des impu-
retés dans une préparation pharmaceutique grâce à Élodie
Londiche de la société Elli Lilly. Les résultats sur le dosage
des phosphates dans le plasma ont été obtenus grâce au
concours de Sandrine Coué et Ghislaine Griffon (Afssaps,
Unité Physicochimie, Saint-Denis). Les résultats sur le dosage
du R-timolol ont été obtenus grâce au concours de Roland
Marini Djang’eing’à du Laboratoire de Chimie analytique de
l’Université de Liège (Belgique) et ceux du dosage de l’hydro-
cortisone dans une pommade avec la collaboration de Gaëlle
Martin du service d’Analyse des médicaments de l’Université
de Liège (Belgique).
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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
with metrologists’ recommendations. Obviously, this
method gives rise to a number of questions. In the
examples, the highest correction coefficient was 2,
which suggests that the recovery yield was only 50%.
The “quality” of a method may possibly be question-
able, should the recovery yield be only 5 to 10%.
Anyway, in such situations, the accuracy profile will
likely enlarge to such a point that the method will
be considered as non valid.
In spite of the numerous practical answers pro-
vided by the accuracy profile method, some of them
are still pending. For example, to which extent does
it apply to microbiological countings that are highly
used in food hygiene or clinical biology. In addition,
validating an alternative method by comparing it to
a so called “reference” method is a classical demand
for accredited laboratories. In this case, the fact that
the theoretical value is known with uncertainty must
also be taken into account in the computations. It is
thus necessary to carry out a number of further ap-
plications with a view to better asserting the accuracy
profile method universality.
Finally, it seems to be indispensable to remind that
validation must always intervene after the method
development. Trying to carry out trials with a method
still badly known, may probably lead to serious dis-
appointments and could then lead to conclude to its
inefficiency.
Acknowledgments
Plasma acrylamide determination results have been achieved
thanks to the assistance of Jean-Michel Delmas, assistant
engineer, French Food Safety Agency, Pharmacokinetics
- Pharmacodynamics Unit, Fougères. Nicotinic acid related
determinations have been achieved thanks to the assistance
of Jinadevi Redon and Hugues Biaudet, Société d’Hygiène Ali-
mentaire et d’Analyse, Longjumeau France, and the determi-
nations of impurities in a pharmaceutical preparation have
been achieved thanks to Elodie Londiche, Elli Lily Company.
Plasma phosphates determinations have been achieved
thanks to Sandrine Coue and Ghislaine Griffon assistance
(French Health Products Safety Agency - Afssaps- Physico-
Chemistry Unit, Saint-Denis). The R-timolol determinations
have been achieved thanks to the assistance of Roland Marini
Djang’eing, Analytical Chemistry Laboratory, University of
Liège (Belgium) and those related to hydrocortisone in an
onguent with the collaboration of Gaëlle Martin, Pharma-
ceutical Analytical Chemistry Department, University of
Liège, Belgium.
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 Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches
Partie III. Exemples d’application
Références/References
1/ Commission SFSTP. P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger,
E. Chapuzet, P. Chiap, N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dewe, M.
Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, C. Nivet,
L. Valat. Validation des procédures analytiques quantitatives.
Harmonisation des démarches Partie I, STP Pharma Pratiques
(2003) 13(3), 101-138.
2/ Commission SFSTP. P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger,
E. Chapuzet, P. Chiap, N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dewe, M.
Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier, G. Muzard, C. Nivet,
L. Valat. Validation des procédures analytiques quantitatives.
Harmonisation des démarches Partie II : aspects statistiques,
STP Pharma Pratiques, 16, 1, 30-60, 2006.
3/ Feinberg M., Boulanger B., Dewé W. & Hubert P. New advances
in method validation and measurement uncertainty aimed
at improving the quality of chemical data Anal Bioanal Chem
(2004) 380, 502-514.
4/ Guide de validation analytique. Rapport d’une commission
SFSTP, STP Pharma Pratiques (1992) 2 (4) 227-239.
5/ ICH Q2A. Téléchargeable à partir de http://www.ich.org.
6/ Hunter JS. Current practices in regression J of the AOAC (1981)
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7/ Lahély S., Bergantzlé M., Hasselmann C., Fluorimetric de-
termination of niacin in foods by high-performance liquid
chromatography with post-column derivatization Food Chem.
(1999) 65, 129-133.
8/ da Silva A, Quagliato EM & Lucio Rossi C. A quantitative
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the immuno-
diagnosis of neurocysticercosis using a purified fraction from
Taenia solium cysticerci Diagn. Microb. and Infect. Disease (2000)
37(2), 87-92.
9/ Guidance for Industry : Bioanalytical Methods Validation
for Human Studies (Draft guidance), U.S. Department of Health
and Human Services, Food and Drug Administration, Center for
Drug Evaluation and Research (CDER), December 1998.
10/ Horwitz W., & Albert R. Standardization of Analytical Pro-
cedures Anal. Proc. (1987) 24, 49-55.
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Quantitative analytical procedures validation: harmonization of the approaches
Part III. Examples of application
Adresse des auteurs/Authors’ addresses
■ P. Hubert, Laboratoire de Chimie analytique, Institut de
Pharmacie, Université de Liège, CHU, B36, B-4000 Liège 1,
Belgique,.
■ J.J. Nguyen-Huu, Sanofi-Aventis, quai Jules Guesde, B.P. 14,
F-94403 Vitry sur Seine, France.
■ B. Boulanger, W. Dewé, Eli Lilly, European Early Phase
Statistics, rue Granbompré, 11, B-1348 Mont-Saint-Guibert,
Belgique.
■ E. Chapuzet, N. Mercier, Qualilab, rue de la Bergeresse, F-
45160 Olivet, France.
■ N. Cohen, Expanscience, rue des quatre Filles. BP 25034,
F-28231 Epernon, France.
■ P.A. Compagnon, Agence Française de Sécurité Sanitaire
des Produits de Santé (Afssaps), boulevard Anatole France,
Les Portes de Pleyel, F-93285 Saint Denis, France.
■ M. Feinberg, Met@risk, Institut National de la Recherche
Agronomique (Inra), rue Claude Bernard, F-75231 Paris,
France.
■ M. Laurentie, LERMDV, Agence Française de Sécurité Sani-
taire des Aliments (Afssa), BP 90203, F-35032 Fougères Cedex,
France.
■ G. Muzard, Merck-Theramex, avenue Prince Héréditaire
Albert, F-98007 Monaco, France.
■ L. Valat, Viatris-Manufacturing, avenue J.F. Kennedy, BP 100,
F-33701 Mérignac, France.
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