INMUNOHISTOQUÍMIC

A
Es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos mediante el empleo
de anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). La técnica, por la gran
especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer moléculas y
unirse a ellas, permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el
tejido. La inmensa mayoría de técnicas de inmunohistoquímica pueden aplicarse a
tejido fijado e incluido en parafina con buenos resultados,

La inmunohistoquímica se aplica en las siguientes

circunstancias
En la actualidad se ha logrado la automatización del método inmunohistoquímico con
anticuerpos mono y/o policlonales de calidad internacional. Esto permite una determinación
más segura y estandarizada,  en tiempos optimizados, con la consecuente mayor rapidez
para la obtención de los resultados.

La inmunohistoquímica se aplica en las siguientes circunstancias:

ASPECTOS TÉCNICOS DE LA
INMUNOHISTOQUÍMICA
La inmunohistoquímica permite el estudio de tejidos procedentes de biopsias,
autopsias y material citológico.

Existen diversos tipos de técnicas cuya indicación va a depender de:

 Anticuerpo a utilizar: Mono o policlonal.

 Material disponible: Fresco, congelado o fijado en formalina.
 Antígenos a estudiar: De superficie o membrana citoplasmáticos o nucleares.

La cuestión más importante va dirigida a la preservación del tejido y de los

antígenos.
 • 2. 1. Marcaje inmunohistoquímico
• 2. 2. Procesamiento en inmunohistoquímica
• 2. 3. Aplicaciones de la histoquímica

2.1MARCAJE INMUNOHISTOQUÍMICO
Encargado Para visualizar el lugar donde se produce la unión antígeno-anticuerpo
es necesario emplear un trazador o marcador. El marcaje inmunohistoquímico se
puede realizar con fluorocromos
(técnicas de inmunofluorescencia),
técnicas inmunoenzimáticas,
iones metálicos en forma coloidal (técnica de inmuno-oro) o isótopos radioactivos.

se une al anticuerpo y viceversa.

2.2.PROCESAMIENTO EN
INMUNOHISTOQUÍMICA
La técnica está basada en la reacción antígeno–anticuerpo y por ello el anticuerpo
primario que se utilice debe haber sido generado en una especie diferente a la que
se está estudiando.

I-Método Inmunohistoquímico Directo, en él, el anticuerpo específico contra la

sustancia que se quiere detectar está marcado con partículas detectables al
microscopio (ej.fluorescencia o peroxidasa) .

Ejemplo .

II-Método Inmunohistoquímico Indirecto, en él, la señal del anticuerpo se

amplía realizando sucesivas capas de anticuerpos o marcadores (como son
Peroxidasa/Anti-Peroxidasa (PAP), Complejo de Avidina Biotina peroxidasa
(ABC).

Ejemplo.

 Preparación de la muestra: En apartados anteriores está tratado este

punto ya que se habló de cómo preparar la muestra para alterar lo menos
posible la inmunoreactividad. Es por ello que se citarán los pasos dentro del
proceso sin mucho detalle:
 Fijación: Cada antígeno, dependiendo de su localización histológica y
anatómica, podrá fijar un producto de forma distinta.
 Descalcificación: Se decía que, habitualmente se utilizaban productos
fuertes con ácido nítrico, que hacen poco resistentes a los antígenos. Por
tanto, un procedimiento de elección para conservar mejor la
 Inclusión: El cambio del etanol por acetona y del tolueno o del xileno por
cloroformo o benzoato de metilo mejora notablemente la inmunotinción, ya
que aumenta la tinción específica y disminuye la de fondo.

Cortes y adhesivos: Sobre tejido congelado se obtendrán cortes de 4 a 6 micras que se secan al
aire a temperatura ambiente durante 2 horas, se fijan en acetona absoluta a 4ºC durante 5
minutos, y se vuelven a secar al aire otros 30 minutos; mientras que para cortes en parafina las
secciones serán menos gruesas, entre 2 y 4 micras, y se introducirán en una estufa durante un
mínimo de 20 minutos para que el corte de adhiera al portaobjetos.
  Previo a la inmunotinción.

Inmunoteñidores automáticos: Gracias a las nuevas tecnologías, se dispone de máquinas que

llevan a cabo la inmunotinción de manera automática. Esta modalidad, permite introducir los
portaobjetos con las secciones de tejido, previamente etiquetados y con códigos de barras para
su identificación a través de un lector, que permitirá aplicar sobre cada muestra el reactivo
correcto.

 Kits universales de inmunohistoquímica: Se denomina al conjunto de

reactivos utilizados en el proceso de inmunotinción. Hay kits para revelar
 Ac mono o policlonales y se utilizan de forma distinta en función al
procedimiento que vaya a utilizarse. Hay muchos laboratorios que están
utilizando el multilink (kit universal) cuya aplicación es indistinta a los Ac
empleados.

 Penetración de los reactivos. Detergentes: Los detergentes se utilizan
para aumentar la permeabilidad de las membranas y que así los Ac puedan
penetrar y así alcancen a los Ag a detectar. Estas sustancias son
particularmente rentables cuando se trabaja con células intactas de frotis,
improntas y monocapas de cultivos celulares o con cortes gruesos en
congelación o incluidos en parafina. Se habrá de tener muy en cuenta de qué
forma pueden incidir estos productos en el tejido a nivel inmunoreactivo.
 Bloqueo de la tinción de fondo: La tinción de fondo se trata de uno de
los principales problemas de la técnica inmunohistoquímica. Se define
como toda tinción que aparece allí donde no debería haberla. Existen dos
tipos de tinción de fondo:
 Bloqueo de la actividad enzimática endógena: Se trata de un método por
el que se consigue inhibir la actividad enzimática de la enzima que se va a
utilizar como marcador con el fin de que no reaccione con el sustrato por
afinidad (muchas de ellas se encuentran de forma endógena en los tejidos).
Si no se bloquea esta actividad, se induciría a error por la obtención de
falsos positivos.
El método más usado para este bloqueo es la incubación de las secciones
antes del proceso inmunológico, aplicando algún agente bloqueante
específico en cada caso.

Desenmascaramiento antigénico o recuperación antigénica: Los tejidos llegan casi todos al

laboratorio fijados en formalina e incluidos en parafina. Las estructuras tridimensionales de
las proteínas tisulares se alteran en grado variable durante este proceso

 Coloraciones de contraste: A fin de reconocer mejor los tejidos se

emplean coloraciones (cromógenos) para diferir las áreas tisulares
inmunoteñidas de las que no lo han sido. En el apartado de tinciones
generales están descritas.

Controles: Los controles se realizan para asegurarse que no hayan falsos negativos o positivos
Protocolo estandar:
1-Fijación del tejido o las células con paraformaldehido (PFA) 4% durante unas
horas.

2-Crioprotección del tejido en sacarosa al 30% en tampón fosfato (PB) 0,1M a

4ªC toda la noche (este paso sólo se realizará en el caso de secciones de
criostato).

3-Secciones de 10 a 25 mm de grosor.

4-Inmunoreacción: Para eliminar la actividad de las peroxidasas endógenas, el

tejido se preincuba en una solución de 0,3% H 202 in metanol durante 20 min (este
paso no es necesario en el caso de técnicas de inmunofluorescencia).
a) Lavar 2x10 min en tampón fosfato salino (PBS) 0,1M a pH 7,4 conteniendo
0,25% Triton (PBST).
b)-Preincubar durante 30 min con PBST conteniendo 1% de suero de albumina
bovina (BSA) a fin de reducir el marcaje inespecífico.
c)-Incubar durante una noche a 4ºC con el anticuerpo primario (específico
contra la sustancia que queremos detectar) (los anticuerpos siempre se diluirán en
la solución PBST-BSA).
d)-Lavar las secciones con PBST 2x10min.
e)- Incubar las secciones durante 1hora en el anticuerpo secundario (biotinilado,
unido a peroxidasa o a fluorescencia) a temperatura ambiente.
f)-Lavar 2x10 min con PBS.
g)-Incubar las secciones en el complejo ABC durante 1 hora a temperatura
ambiente.
h)-Lavar 1x10 min en PBST.
i)-Lavar 1x10min con tampón Tris-HCl 0,1M pH. 7,2.
j)-Incubar las secciones en una solución de 3,3´-diaminobezidina
tetrahydrochloride (DAB) al 0,05% en tampón Tris-HCl conteniendo 0,025% de
H202 durante 5 a 10 min.
5-Controles -Omisión del anticuerpo en cada uno de los pasos.

-Sustitución del anticuerpo primario por suero inmune.

-Pre-incubación del antígeno con el anticuerpo primario diluido a la

concentración a la que se usa en la reacción.

Todos los experimentos control tienen que dar como resultado la eliminación del
marcaje.

*La duración de las incubaciones y lavados dependerá del grosor del corte entre
otros factores.

Método Inmunohistoquímico Directo (protocolo estándar de 1 a 4 omitiendo

los pasos e-h)

Método Inmunohistoquímico Indirecto (protocolo estándar de 1 a 4)

2.3 APLICACIONES DE LA
HISTOQUÍMICA
No cabe duda que la posibilidad que ofrece esta técnica de localizar componentes
tisulares in situ, contribuye a un importante avance en el conocimiento
fisiopatológico siendo especialmente útil en el campo de la oncología (para la
clasificación de algunas neoplasias con alto grado de anaplasia o de metástasis de
origen incierto). También se utiliza para el estudio del rechazo de trasplantes de
órganos, enfermedades autoinmunes y alérgicas.

El espectro de anticuerpos utilizados hoy día (comercializados), van en

crecimiento. Aquí podemos ver algunos:

Ejemplos de marcadores inmunohistoquímicos

Anticuerpo Células/antígenos detectados
CD1a Célula de Langerhans
CD4 Linfocito T de auxilio
 CD8 Linfocito T citotóxico
CD30 Célula de Reed-Sternberg
CD45 Leucocitos
CD68 Macrófagos
S100 Células de Schwann
HMB-45 Melanocitos
AE1 Citoqueratinas de bajo peso
molecular
AE3 Citoqueratinas de alto peso
molecular
DESMINA Células musculares
GFAP Glía
CEA Antígeno carcino-embrionario
AFP Alfa-fetoproteína
REN Receptores nucleares de estrógenos
VIM Sarcomas

Referencias[editar]
1. ↑ Segovia S M, Enz, N, Alsina Ál, Valdovinos B. M. (2016). «Uso y aplicaciones de la
inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-ghrelina para el estudio de la pulpa dentaria». Rev.
Fac. Med. UNNE (Univ.Nac.Nordeste. Facultad de Medicina.). vol. XXXVI (Nº 3): 81-88.
2. ↑ Malliaras K, Zhang Y, Seinfeld J, GalangG, TseliouE, Cheng K, SunB, Aminzadeh M,
Marbán E. (2013 ). «Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie
therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart». EMBO Molecular
Medicine 5: 191-209. doi:10.1002/emmm.201201737.