UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

LABORATORIO BIOQUIMICA

Práctica N 4. Oxidaciones biológicas

Elaborado por. Diana Marcela Ocampo

Departamento de Química

Fundamento

Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que aceleran la velocidad de reacción
hasta alcanzar un equilibrio. Constituyen el tipo de proteínas más numeroso y especializado
y, actúan como catalizadores de reacciones químicas específicas en los seres vivos o
sistemas biológicos. Muchas de las enzimas no trabajan solas, se organizan en secuencias,
también llamadas rutas metabólicas, y muchas de ellas tienen la capacidad de regular su
actividad enzimática.

Las enzimas se designan y clasifican de acuerdo con el tipo de reacción que catalizan, siendo
6 los grupos principales: 1. Oxidoreductasas, 2. Transferasas. 3. Hidrolasas. 4. Liasas. 5.
Isomerasas., 6. Ligasas. 7. Traslocasas

Las enzimas son sustancias que poseen una extraordinaria capacidad catalítica, tienen un
alto grado de especificidad por sus sustratos, aceleran reacciones químicas específicas y
funcionan en soluciones acuosas bajo condiciones suaves de temperatura y pH. Las
enzimas, actuando en secuencias organizadas, catalizan los cientos de reacciones que
ocurren en una vía metabólica mediante la cual un nutriente es degradado o biosintetizado
asegurando la supervivencia y proliferación celular. Algunas de las enzimas son reguladoras,
esto es, que pueden responder a varias señales metabólicas cambiando de acuerdo a éstas
su actividad catalítica. A través de la acción de las enzimas reguladoras, los sistemas
enzimáticos están altamente coordinados para formar un conjunto armónico entre las
diferentes actividades metabólicas y de esta manera sostener la vida.

Si la enzima es desnaturalizada o disociada en sus subunidades, en general, la actividad

catalítica se pierde. Por otra parte, las enzimas, al igual que otras proteínas, tienen un peso
molecular que oscila desde aproximadamente 12.000 hasta más de 1.000.000. Algunas
requieren cofactores que pueden ser uno o más iones metálicos como por ejemplo Fe 2+ ,
Mg2+, Mn2+,Zn2+ o bien una molécula orgánica o metaloorgánica llamada coenzima. A veces
ambos, es decir, una coenzima y uno o más iones metálicos para su actividad. Una molécula
de enzima catalíticamente activa con su coenzima y/o iones metálicos se llama holoenzima.
La proteína de esa enzima se llama apoenzima o apoproteína. La coenzima funciona como
un transportador transitorio de grupos funcionales específicos.

REGULACIÓN DE METABOLISMO VEGETAL

Normalmente, la maquinaria celular se mueve con el mayor ahorro posible de la energía y

esto es posible por la presencia de múltiples mecanismos de regulación que aseguran a la
célula la formación de cada producto que le sea necesario en un momento determinado. La
actividad de las enzimas reguladoras es modulada a través de varios tipos de moléculas
señales que generalmente son pequeños metabolitos o cofactores. Existen dos clases
principales de enzimas reguladoras:

1. las enzimas alostéricas que funcionan a través de la unión reversible y no covalente de

un metabolito regulador llamado modulador.
2. las enzimas reguladoras que funcionan por modificación covalente reversible. Ambas
clases de enzimas reguladoras tienden a tener varias subunidades y en algunos casos los
sitios reguladores y activos se encuentran en diferentes subunidades. Existen, por lo menos,
dos mecanismos adicionales de regulación de la actividad enzimática.
3. Algunas enzimas son activadas o inhibidas por proteínas de control que se les unen y
afectan su actividad.
4. Otras son activadas por ruptura proteolítica que, a diferencia de otros mecanismos, es
irreversible. Modulación de la actividad enzimática por pequeños metabolitos: Un
importante mecanismo de regulación de una vía metabólica por pequeños metabolitos es
la regulación por producto final. En una vía metabólica regulada por producto final en que
un metabolito A es convertido a través de varios pasos en el metabolito Y, por acción de las
enzimas E1, E2, E3, etc y, ocurrirá que el metabolito Y inhibirá a la enzima inicial de la vía
metabólica. La enzima E1 es conocida como enzima reguladora.

Reacción de carbamilación de la Enzima RUBISCO

Modulación redox de la actividad enzimática:

Se conoce un cierto número de enzimas vegetales que son activadas o inhibidas por su
estado de oxidación o al menos por la presencia de ciertos oxidantes o reductores en sus
soluciones. Para mayor claridad consideremos por una parte a aquellas enzimas que son
reguladas por un sistema compuesto por la ferredoxina y la tiorredoxina, que comprende
algunas enzimas de los cloroplastos, y por exclusión tenemos otro grupo cuyas enzimas son
sensibles a ciertos compuestos redox. Enzimas reguladas por el sistema ferredoxina-
tiorredocina: como ya se indicó estas enzimas están localizadas en el cloroplasto. El
estímulo básico regulador de esas enzimas proviene de la luz. La acción de la luz se efectúa
a nivel del fotosistema I. El flujo de electrones ocasionado por la luz pasará el aceptor P430
y de allí a la ferredoxina soluble. Por acción de la NADP-tiorredoxina reductasa, enzima cuya
estructura corresponde a una flavoproteína, el electrón de la ferredoxina es utilizado para
reducir la tiorredoxina. La tiorredoxina es una proteína de bajo peso molecular capaz de
transportar electrones. Contiene un grupo cisteina que sufre reducción reversible a la forma
de sulfhidrilo. Además de la reducción enzimática a nivel fisiológico, la ferredoxina puede
ser reducida químicamente por DTT (ditiotreitol). Finalmente hay una reducción de las
enzimas del grupo por la tiorredoxina. Las enzimas activadas por este sistema son: fructosa-
1, 6-bisfosfatas, sedoheptulosa-1, 7- bisfosfatasa, NAD-gliceraldehído, 3-fosfato
deshidrogenasa, ribulosa-5-fosfato quinasa que forman parte del ciclo del Calvin
(fotosíntesis). Además, este mecanismo también activa la NADP-malato deshidrogenasa y
la fenilalanina amonio liasa.

Normalmente se considera que el ciclo de Calvin está situado en lo que se denomina la fase
oscura de la fotosíntesis, sin embargo, algunas enzimas del ciclo prácticamente no son
funcionales en la oscuridad, por tanto, la diferenciación tradicional entre fase oscura y
luminosa de la fotosíntesis carece de validez. Mecanismo de desactivación enzimática en la
oscuridad: no habría un único mecanismo de desactivación de este grupo de enzimas. Se
pueden clasificar en tres tipos considerando sus mecanismos de desactivación. El primer
tipo, a los que pertenece la fructosa-1, 6-bisfosfata, la ribulosa-5-fosfato quinasa y la
fenilalanina amonio liasa, es desactivado por un oxidante soluble como el glutatión oxidado
(GSSG) o por el ácido dehidroascórbico. En el segundo tipo tendríamos, únicamente, la
NADP-malato deshidrogenasa, que requeriría un oxidante ligado a membranas. Las enzimas
del tercer grupo, tales como NADP-gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, no poseen
mecanismos conocidos de desactivación. Tanto la desactivación de las enzimas activadas
por tiorredoxina, como su activación se hacen a una velocidad menor a la de la catálisis, es
decir, se trataría de enzimas histeréticas.
 Modulación redox de la actividad enzimática

Compartimentalización por membranas:

El metabolismo vegetal se muestra regulado por la existencia de compartimentos en un

grado muy superior al del organismo animal. Es bien conocida la ocurrencia de la
fotosíntesis en el cloroplasto de los vegetales, un órganulo celular y como tal previsto de
membranas. La biosíntesis de ácidos grasos es exclusivamente cloroplastídica y la
biosíntesis de estos compuestos en tejidos no verdes parecería, también, efectuarse en
plástidos. Otras enzimas que se encuentran en los plástidos son las enzimas sintetizantes
de los terpenos y las de varios pigmentos, así como las enzimas que llevan al N de los
nitratos a nivel de los aminoácidos. Se acepta que los cloroplastos contienen las enzimas
del ciclo reductor de las pentosas fosfato, pero debemos considerara que hay enzimas
citosólicas que catalizan reacciones similares a las del ciclo en la glicólisis y en la vía oxidativa
de las pentosas fosfato. Por ejemplo, se han descripto las siguientes enzimas localizadas
tanto en citosol como en cloroplastos: ribosa-5-fosfoisomerasa, fosfoglicerato quinasa,
fructosa-1, 6-difosfato aldolasa y triofosfato isomerasa. Las enzimas homólogas de ambos
compartimentos son isoenzimas (es decir enzimas con la misma función catalítica pero con
diferencias menores o mayores en la estructura, que pueden conferirles diferentes
propiedades físicas, cinéticas o reguladoras). Sin embargo las propiedades físicas y cinéticas
de estas isoenzimas están muy próximas. Un caso particular es la compartimentalización de
ciertas enzimas en vacuolas. Entre ellas parece particularmente importante la presencia de
toda o casi toda la invertasa ácida soluble en la vacuola (la invertasa es la enzima que
hidroliza la sacarosa a glucosa y fructosa). Merece destacarse que los azúcares de reserva
más importantes en las plantas superiores son el almidón y la sacarosa y que es en forma
de sacarosa como se transporta la mayor parte del fotosintato en las plantas superiores. Se
han hecho ensayos con un derivado fluorado de la sacarosa, la 1-fluorosacarosa, que no es
atacado por las invertasas pero si por la sacarosa sintetasa (la sacarosa sintetasa, en una
reacción reversible, es capaz de convertir la sacarosa y el UDP en UDPG y fructosa), enzima
que lo convierte en UDPG y fructosa fluorada. Suministrando este compuesto marcado con
14C a tejidos de vegetales superiores la marcación no se distribuye a ningún metabolito.
Esto parece confirmar que la degradación de la sacarosa se hace, en los vegetales
superiores, por la intervención de la invertasa. Ya se había demostrado que algunos tejidos
de la caña de azúcar en los que no se detectó la presencia de sacarosa sintetasa pero sí de
invertasa, son capaces de metabolizar la sacarosa. Por otra parte se demostró que en las
vacuolas de las plantas superiores hay, también sacarosa. Por tanto debe existir un
mecanismo que, dentro del compartimento, impida la rotura ilimitada de sacarosa. Hay,
además, isoenzimas de la invertasa localizadas en la pared celular, las que actuarían en el
transporte de la sacarosa.

Métodos utilizados en el estudio de la inducción enzimática en plantas:

Los estudios de inducción en plantas están largamente basado en análisis genéticos,

tecnología de muy difícil aplicación a los vegetales superiores. Por esta razón el enfoque de
esta cuestión en plantas superiores debe hacerse utilizando otras tecnologías. Cuando la
actividad de una enzima en un tejido u órgano vegetal aumenta rápidamente como
respuesta a un metabolito se agrega, al proceso, inhibidores de las síntesis proteíca capaces
de actuar a diferentes niveles en el proceso biosintético de las proteínas. De este modo se
procura establecer si el cambio de la actividad en cuestión es debido a la síntesis, de novo,
o si se debe a la formación de enzima a partir de proteína preexistente. Es necesario conocer
el efecto del inhibidor empleado sobre la actividad in vitro de la enzima en estudio a fin de
asegurar de que cualquier registro de disminución de la enzima no sea causado por
fenómenos de inhibición de la actividad enzimática del tejido. Este método ha brindado
resultados positivos hasta el presente. Algunos autores utilizaron el estudio comparado
simultáneo de varias enzimas que se estén sintetizando (actividad en aumento) al mismo
tiempo en el tejido, observando, en todas ellas el efecto de los inhibidores de la síntesis
proteíca y de los probables metabolitos inductores. Según los resultados que se obtengan
es posible inferir cual es la base de los fenómenos observados. La mejor recomendación
que se puede dar para estos y otros tipos de estudios es la de aplicar más de un tipo de
tecnología, cuando esto es posible, para el análisis del problema, y ver si no es posible,
además para mayor rigor, la aplicación de métodos propios.

Principales inhibidores de la síntesis proteica utilizados para el estudio de inducción

represión en plantas: Ya indicamos que la síntesis de proteínas puede ser inhibida a
diferentes niveles. Así tenemos los inhibidores de las síntesis del RNA, entre los que se
utilizaron la actinomicina D y la 6-metilpurina. Como inhibidores de la traducción del código
también se utilizaron la cicloheximida (actidiona), que inhibe la formación de la unión
peptídica y afecta la iniciación de las cadenas polipeptídicas en sistemas libres de células de
embriones de trigo. Las cicloheximida sólo actúan en eucariotas, pero no en procariotas. La
puromicina también ha sido empleada en la inhibición de la síntesis proteíca en tejidos
vegetales y en sistemas libres de células. La puromicina interrumpe la elongación de la
cadena polipeptídica provocando la liberación de un derivado covalente
peptidilpuromicina. Se ha comunicado un efecto represor de la biosíntesis de la invertasa
ácida soluble (vacuolar) de tallos de caña de azúcar por la glucosa y la fructosa. Esta
interpretación está basada en que la velocidad máxima de pérdida de actividad invertásica
en presencia de glucosa fue la misma que en presencia de inhibidores generales de la
biosíntesis de proteínas. Además, la síntesis de peroxidasa no fue inhibida por la glucosa y
por tanto, la glucosa no parece alterar los niveles de sutratos, ribosomas ni enzimas
requeridos para la biosíntesis de proteínas.

Regulación por proteínas: Un ejemplo típico de la regulación enzimática por proteínas,

tomado de la literatura, es el de la invertasa ácida soluble de tubérculos de Solanum
tuberosum (papa). Esta encima está regulada por un inhibidor proteico, el que ha sido
purificado, primero por Pressey (1967) y luego por varios otros investigadores. El peso
molecular del inhibidor es de 17.000, es decir que se trata de una proteína relativamente
pequeña. El producto purificado actúa como un inhibidor no-competitivo irreversible,
llegando a suprimir completamente la actividad de la invertasa a cualquier pH. Sin embargo,
esta capacidad inhibitoria es máxima a pH 4,5 pero a medida que nos alejamos de este pH,
tanto hacia valores superiores como inferiores, las concentraciones de inhibidor capaces de
producir la inhibición total va aumentando.

Fosfoenoloxidasas

Dentro del conjunto de enzimas oxidoreductasas en vegetales se destacan las

polifenoloxidasas (PPOs) principalmente porque los frutos en su proceso de postcosecha
incrementan el nivel de sustancias de naturaleza fenólica, lo cual trasciende en su
maduración y conservación.
Las polifenoloxidasas conocidas también como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol
oxigeno oxireductasa (E.C. 1.14.18.1), cataliza la oxidación difenoles en presencia de
oxigeno molécular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente
en plantas. La localización de la enzima en las células de las plantas depende de la especie
y estado de madurez. La distribución de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales
puede ser diferente ya que la proporción de enzimas solubles varía con la madurez. Dentro
de su papel en la naturaleza, la PPO es participe en la cadena de respiración de plantas como
una de las oxidasas terminales. Mucho más importante es el papel que juega en la
resistencia a infecciones microbiológicas o virales en las plantas en un clima adverso.
Participa indirectamente en la biosíntesis de auxinas. Por lo que jugar un papel importante
en la regulación del crecimiento de las plantas junto con la enzima degradante de la auxina
(POD). También participan en el fenómeno denominado pardeamiento enzimático, el cual
es consecuencia indirecta del la acción de la PPO en alimentos procesados.

Otra característica del inhibidor es que, cuando se utiliza a concentraciones moderadas

como efector de la invertasa ácida soluble de papa, la actividad invertásica exhibe dos
óptimos de pH, uno a 5,5-6 y otro mayor por debajo de pH 3. Sin embargo se demostró (Isla
y col., 1991) que el inhibidor proteico de la invertasa ácida soluble de S. tuberosum es una
lectina, las que por definición pueden unirse, específicamente, a ciertos azucares, estén o
no libres en la solución, o bien a secuencias glicosídicas particulares para cada tipo de
lectina. Como las invertasas son glicoproteínas cualquier lectina capaz de reconocer los
azúcares o secuencias de azúcares de sus cadenas glicosídicas pueden unirse a la invertasa,
y por ende provocar cambios en las propiedades de la enzima. Por esta razón podría ser
completamente casual y no fisiológico el efecto inhibitorio producido sobre la invertasa.
Estudios posteriores (Isla y col. 1992) mostraron que el inhibidor proteico de los tubérculos
de papa se localiza en la pared celular, mientras que la invertasa ácida soluble se encuentra
en la vacuola junto con su sustrato, la sacarosa. En consecuencia, es prácticamente
improbable que el inhibidor proteico sea un inhibidor fisiológico, in vivo, de la invertasa
ácida soluble. Sin embargo, la pared celular de los tubérculos de papa contiene otra
invertasa, la que nunca fue tomada en cuenta para la teoría de una posible función
fisiológica del inhibidor. Esta invertasa de pared también es inhibida por el inhibidor
proteico y por consiguiente, en tanto no se tengan más datos, no puede excluirse que esta
enzima sea un posible blanco fisiológico del inhibidor. Este inhibidor de papa actúa sobre
otras invertasas de hojas, pero hay también invertasas que nos inhibidas como puede verse
en la tabla anterior. Además, se han encontrado inhibidores proteicos para las invertasas
de batata, remolacha común y azucarera y maíz.

Para la mayoría de las especies frutales cuyo destino es el consumo en fresco, la calidad se
basa en sus características intrínsecas, organolépticas y aspecto externo, sobre todo, en la
forma, tamaño, color y ausencia de lesiones. El tamaño final que adquiere el fruto, la
ausencia de magulladuras y de mancha púrpura, como desorden fisiológico, son aspectos
valorados por el consumidor y, por tanto, son problemas importantes a los que se enfrentan
los cultivadores en todo el mundo. Cualquiera de estos daños, cambian la textura o el color
del tejido, debido a la destrucción de los compartimentos celulares del fruto, que permiten
que los sustratos de naturaleza fenólica sean accesibles a la enzima polifenol oxidasa, dando
lugar a polímeros oscuros (Sellés et al., 2007, Martínez et al., 2013). En general, todos los
tipos de daños pueden resultar de una inapropiada manipulación o inadecuado embalaje.
En el caso específico de pardeamiento por impacto, la incidencia de la severidad dependerá
de la altura en que el fruto se deja caer y del tipo de superficie de impacto (Crisoto et al.,
1993, 1996). Cualquier daño mecánico puede incrementar la tasa de respiración y
producción de etileno lo que conlleva a una aceleración en la maduración, ablandamiento,
pérdida de agua y deterioro general de los frutos (Crisoto et al., 1993). Además, el daño por
impacto causa heridas superficiales en el fruto lo que facilita la entrada de microorganismos
y el desarrollo de putrefacciones (Crisoto et al., 1996, Mishra y Gautam, 2013).

Las reacciones de oxidación que provocan el pardeamiento de frutos y vegetales son de

origen enzimático y están catalizadas principalmente por la enzima PPO, siendo su actividad
particularmente alta en aquellos frutos y vegetales que contienen niveles altos de
compuestos polifenólicos (Amiot et al., 1992), que va en detrimento del perfil nutricional
del alimento (Vaughn y Duke, 1984; Mayer y Harel, 1991). Dado el impacto negativo de las
PPOs en la industria alimenticia, se han realizado un gran número de publicaciones, sin
embargo, su función en muchos vegetales no ha sido totalmente resuelta (Lee y Whitaker,
1995). Estas reacciones modifican las características organolépticas y nutricionales del
alimento, depreciando su calidad (McEvily et al., 1992; Friedman, 1996; Matheis y Whitaker,
1984; Sánchez-Ferrer et al., 1995). La importancia de la PPO en el sector agroalimentario,
ha atraído la atención de muchos investigadores desde los años sesenta hasta nuestros días,
como se recoge en una revisión amplia sobre PPO (Mayer, 2006).

En las plantas existe una gran cantidad y diversidad estructural de compuestos fenólicos
pertenecientes a diversas familias como ácidos fenólicos, cumarinas, lignanos, ligninas y
flavonoides (Lee y Whitaker, 1995; Tomás-Barberán y Espín, 2001). Estos compuestos
desempeñan funciones importantes en las plantas, siendo las más relevantes las de
protección frente a radiación ultravioleta y frente a condiciones de estrés biótico gracias a
las propiedades antimicrobianas de los propios compuestos fenólicos y mediante el sellado
de heridas por lignificación (Hermann, 1976; Ke y Salveit, 1988; Macheix et al., 1991). La
composición de fenoles en los tejidos vegetales varía considerablemente según la especie
de que se trate, grado de madurez de los frutos y manejo post-cosecha de los mismos
(Tomás-Barberán y Espín, 2001).

Además, para una misma especie el contenido de fenoles es dependiente de la variedad

(Ding et al., 1998b; Ding et al., 2001). En algunos frutos los niveles de fenoles aumentan a
lo largo del desarrollo, alcanzándose los niveles más altos durante la recolección (Casado et
al., 2003), mientras que para diferentes variedades el contenido de fenoles decrece hasta
alcanzar el mínimo en el momento del cambio de color del fruto (envero) y después
aumenta progresivamente alcanzando el máximo en la recolección. Sin embargo, las
fluctuaciones en los niveles de fenoles suelen ser pequeños durante la maduración
independientemente de algunas variedades (Ding et al., 1998b; Ding et al., 2001). En la
degradación oxidativa de estos compuestos fenólicos, participan dos enzimas que son muy
relevantes en términos de calidad de frutos y vegetales, por la formación de melaninas que
oscurecen los frutos. Estas enzimas son la polifenol oxidasa (PPO) y la peroxidasa (POD). A
pesar de que las PODs están ampliamente distribuidas en el reino vegetal, su papel en el
pardeamiento enzimático de frutos y vegetales esta todavía bajo discusión, debido a que el
nivel de H2O2 interno en las plantas limita la actividad peroxidasa. Se ha propuesto que la
PPO puede actuar como promotor de la POD puesto que en las reacciones de oxidación de
compuestos fenólicos se genera H2O2 (Richard-Forget y Gauillard, 1997; Subramanian et al.,
1999).

El estado antioxidante de diferentes frutos y vegetales puede decrecer por la oxidación

directa de estos en presencia de PPO y POD (Jiménez et al., 1998; Jiménez y García Carmona,
1999). Sin embargo, la principal enzima responsable del pardeamiento enzimático es la PPO,
aunque no debe ser excluido un posible efecto sinérgico entre PPO y POD (Tomás- Barberán
y Espín, 2001). La prevención y control del pardeamiento enzimático, requiere un
conocimiento bioquímico del tipo de sustratos fenólicos presentes en cada planta, del nivel
de compuestos reductores, el nivel de accesibilidad del O 2, la naturaleza de los diferentes
compuestos oxidables y la polimerización y degradación de las o-quinonas. Además, es
necesario conocer el nivel de PPO y los sustratos disponibles a lo largo de los diferentes
estados de desarrollo de la planta y sobre todo, es importante distinguir entre el
pardeamiento enzimático y el no enzimático (figura 1) (Lee y Whitaker, 1995).

El pardeamiento no enzimático consiste en la condensación de un grupo aldehído o cetona

de un azúcar con un grupo amino libre para formar una base de Schiff, la cual se reorganiza
para formar una cetamina estable (producto de Amadori) y finalmente se degradan a
productos reactivos que contienen grupos carbonilo. Estos grupos pueden reaccionar con
grupos amino dando lugar a polímeros oscuros. Esta reacción que tiene lugar al calentar
mezclas de aminoácidos y carbohidratos (Walker y Mckersie, 1993) se ha descrito en uva
(Cheynier y Ricardo da Silva, 1991) y manzana (Oleszek et al., 1989; Richard-Forget et al.,
1992a). Entre las diferentes técnicas para controlar el pardeamiento y mantener la calidad
de frutos y vegetales, una de las más usadas es la aplicación de inhibidores químicos, los
cuales consiguen inactivar los mecanismos no deseados. La actividad de esta clase de
inhibidores implica una interacción directa con la enzima o reaccionan preferiblemente con
el producto que conduce por reacción no enzimática a la formación de pigmentos oscuros.
Distribución y localización de PPOs Las polifenol oxidasa (PPOs), son metaloenzimas
ampliamente distribuidas en la escala filogenética, encontrándose tanto en organismos
procariotas como en eucariotas. Se trata de una enzima detectada en algas, briófitos,
pteridófitos, gimnospermas y angiospermas (Mayer y Harel, 1979). La polifenol oxidasa se
ha descrito en diversos tejidos de plantas como raíces (Pérez-Gilabert et al., 2001; Gandía-
Herrero et al., 2004), semillas (Paul y Gowda, 2000), hojas (Robinson y Dry, 1992; Sánchez
Ferrer et al., 1993; Chazarra et al., 1996; Mazzafera y Robinson, 2000; Chazarra et al., 2001;
Shi et al., 2002) y frutos (Fraignier et al., 1995; Murata et al., 1992; Ding et al., 1998a;
Serradell et al., 2000; Casado et al., 2005, Sellés et al., 2006; 2007). Estudios clásicos de PPO
localizan a la enzima en la fracción soluble de las células o fuertemente unida a membranas
subcelulares (Mayer y Harel, 1979). Sin embargo, esta asignación de localización se debe en
algunos casos al método de extracción utilizado. A pesar de los posibles artefactos la
mayoría de las polifenol oxidasas vegetales se encuentran asociadas a membranas,
principalmente a los tilacoides del cloroplasto (Tolbert, 1973). El tipo de unión a la
membrana depende del tejido y del estado de desarrollo de la planta. Aunque las PPOs se
han localizado en los tilacoides (Golbeck y Cammarata, 1981; Chazarra et al., 1996), no son
proteínas intrínsecas de membrana. A pesar de que en el tabaco (Hofer, 1964) se libera
simplemente por fuerza iónica débil, para la mayoría de los tejidos hacen falta tratamientos
más enérgicos para su solubilización: detergentes como Tritón X-100, (Harel y Mayer, 1971),
Tritón X-114 (Sánchez-Ferrer et al., 1989), enzimas proteolíticas (Mayer, 1966), etc. Algunos
tratamientos pueden alterar la estructura y la conformación de la enzima provocando el
paso de su forma inactiva o latente a su forma activa (Kenten, 1958), si bien la recuperación
de la enzima nativa latente es posible mediante el uso de detergentes no iónicos suaves
(Sánchez-Ferrer et al,, 1994). Esta solubilización también tiene lugar en condiciones
naturales, como son la maduración de las frutas y el envejecimiento de los tejidos (Harel et
al., 1966; Kidron et al., 1978). Diversas evidencias apuntan hacia la localización concreta de
las PPOs de plantas superiores en las membranas tilacoidales (Mayer, 1987; Vaughn et al.,
1988; Kowalski et al., 1992), aunque existen trabajos que describen la existencia de algunas
PPOs vegetales en forma soluble en el lumen de los tilacoides (Sommer et al., 1994; Murata
et al., 1997). Varios trabajos en los que se utilizan frutos como fuente de PPO (Casado et al.,
2005; Ding et al., 1998a; Gandía-Herrero et al., 2005a y b; Sellés et al. 2006), han descrito
la presencia de actividad PPO en fracciones particuladas y solubles del mismo tejido,
mostrando propiedades cinéticas diferentes, que comprometen la localización exclusiva de
la proteína en los plastos. Técnicas de inmunodetección con oro coloidal han permitido
demostrar la localización de PPO en aquellos tejidos con escasa o nula presencia de
cloroplastos en células del parénquima denominadas idioblastos, que además acumulan
cantidades elevadas de fenoles (Thipyapong y Steffens, 1997). Las PPOs vegetales son
proteínas codificadas por el núcleo en forma de precursor (Lax et al., 1984; Kowalski et al.,
1990). El análisis de las secuencias de aminoácidos a partir de cDNA de PPO de tomate
(Newman et al., 1993; Hunt et al., 1993), haba (Cary et al., 1992) y espinaca (Hind et al.,
1995) muestran que la enzima PPO presenta un doble péptido señal de transporte al
estroma y tilacoides (Keegstra y Froehlich, 1999, Keegstra y Cline, 1999). Estudios realizados
por Sommer et al. (1994) con cloroplastos aislados, demuestran que el proceso de
translocación por transporte al cloroplasto de los polipéptidos de PPO de tomate (67 kDa)
resultantes de la traducción en el citosol se lleva a cabo en dos pasos. Un primer paso
implica la translocación por transporte hacia el estroma, produciéndose la eliminación del
péptido de tránsito N-terminal y proporcionando un intermediario de 62 kDa y
posteriormente un segundo paso de translocación por transporte a los tilacoides por un
proceso dependiente de ATP, que genera una proteína madura de 59 kDa. En este tránsito
el péptido señal se elimina por una peptidasa cloroplastídica (Koussevitzky et al., 1998). Así
mismo, Koussevitzky et al. (2004) demostraron que el pretratamiento con metil jasmonato
(MeJA) de plantas de tomate incrementa considerablemente la eficiencia de la
translocación por transporte de la polifenol oxidasa precursora (pPPO) del plástido al
tilacoide. Estos autores muestran un incremento en el nivel de la polifenol oxidasa madura
(mPPO) en la fracción del tilacoide después de las 8-16 h del tratamiento. Además este
aumento en el nivel de mPPO parece ser específico del tratamiento con MeJA para las
plantas de tomate, debido a que otros tratamientos que incrementan la expresión de genes
de PPO como daños mecánicos o exposición de las plantas a etileno durante 48 horas
(Thipyapong y Steffens, 1997), no muestran ningún efecto en la translocación por
transporte del pPPO hacia el tilacoide. Esta eficiencia observada en el transporte de pPPO
para las plantas de tomate, se ha descrito para otras plantas de la misma familia como el
tabaco, mientras que el tratamiento con plantas leguminosas como el guisante, no afectó
al transporte de los dos precursores de PPO (Koussevitzky et al., 2004). La translocación de
PPO está fuertemente inhibida por la presencia de pequeñas concentraciones de Cu 2+, lo
que sugiere que la proteína ha de transportarse en su forma desplegada y además, indica
que el dominio de unión a cobre tiene una fuerte avidez por este metal (Sommer et al.,
1994). A pesar de esta unión del sitio activo por el cobre, los procesos de homogenización
y extracción de tejidos para realizar los estudios de actividad de PPO en vegetales pueden
provocar la pérdida de este metal de su lugar correspondiente en la enzima, induciendo la
pérdida de actividad que a veces se puede recuperar mediante incubación con sales de
cobre (Mari et al., 1998; Casado et al., 2005). Nielsen et al. (1996) descubrieron que no hay
péptido de tránsito N-terminal en tirosinasas de hongos, lo cual es coherente con la
ausencia de compartimentos plastídicos en estos organismos. Así pues, las tirosinasas de
hongos se encuentran localizadas en el citosol (Wickers et al., 1995).

Inhidibores de PPOs (Fosfofoenoloxidasas)

Entre los diversos tipos de inhibidores de PPOs se destacan cuatro grupos: sulfitos, agentes
antioxidantes o reductores, acidulantes y compuestos quelantes. Los sulfitos son los
compuestos más efectivos en prevenir el pardeamiento enzimático (Sapers, 1993). Aunque
el mecanismo de actuación de los sulfitos para prevenir el pardeamiento no está claro,
pueden provocar una inhibición directa de la enzima, como se ha observado en la inhibición
de PPO de fresa por metabisulfito de sodio (Wesche-Ebeling y Montgomery, 1983), pueden
interaccionar con los intermedios evitando que estos participen en la formación de
pigmentos (Sayavedra-Soto y Montgomery, 1986) o pueden actuar como agentes
reductores convirtiendo a las quinonas en difenoles (Valero et al., 1988). A pesar de su
efectividad en la prevención de la calidad de frutos y vegetales, estos compuestos están
sujetos a restricciones debido a que provocan efectos adversos en la salud en personas
sensibles. Entre los antioxidantes, se han empleado compuestos fenólicos sintéticos como
butilhidroxitolueno (BHT) y butilhidroxianisol (BHA), ampliamente empleados en
alimentación para proteger el sabor y color de los alimentos y algunos compuestos fenólicos
naturales como tocoferol, derivados del ácido cinámico y flavonoides como la quercetina y
el kaemferol (Ashie et al., 1996). Una de las mejores alternativas al uso de los sulfitos es el
ácido ascórbico (Wang et al., 2013), este compuesto es altamente efectivo en la inhibición
del pardeamiento por su habilidad de reducir las quinonas producidas por la PPO a los
fenoles antes de que la reacción de formación de pigmentos tenga lugar. Sin embargo, el
ácido ascórbico es muy reactivo y se oxida rápidamente a ácido dehidroascórbico (DHAA),
pudiendo reaccionar con otros compuestos que conllevan a cambios en la calidad de los
frutos. A veces se utiliza en combinación con acidulantes, siendo el más utilizado el ácido
cítrico debido a su presencia natural en tejidos. Otros inhibidores son los compuestos
sulfhidrilos como mercaptoetanol, ditiotreitol y tiourea por su habilidad como agentes
reductores, sin embargo, las concentraciones necesarias para prevenir el deterioro del fruto
no son permitidas en alimentación. La cisteína se ha mostrado como un inhibidor fuerte de
PPO en banana y manzana, siendo incluso más efectivo que el metabisulfito (Ashie et al.,
1996; Richard-Forget et al., 1992b; Valero et al., 1988), sin embargo, la concentración
necesaria para alcanzar altos niveles de inhibición tiene efectos negativos en el sabor de los
frutos. Además se han empleado agentes frutos (manzana) y vegetales (champiñón y
berenjena) crudos y procesados (Billaud et al., 2005).

La presencia de PPO se ha podido determinar y caracterizar empleando hojas y frutos de

numerosas especies vegetales como fuente enzimática, según esta caracterizacion, los
niveles de PPO varían dependiendo de la especie, cultivar, estadio de maduración y estadio
fenológico. En tejidos vegetales intactos las PPOs y sus sustratos fenólicos permanecen en
compartimentos separados (cloroplastos y vacuolas), por lo que no tiene lugar ninguna
reacción. La desorganización de la integridad de las células sucede como consecuencia de
daños mecánicos o de forma natural durante procesos de senescencia, provocando una
ruptura celular y una puesta en contacto de PPO y fenoles dando lugar a reacciones de
pardeamiento enzimático observadas en frutos maduros, tejidos dañados, procesados y en
tejidos afectados por fisiopatías. El conocimiento de las PPOs en frutos y vegetales, es un
paso fundamental en la investigación, puesto que permitirá mejorar la calidad y apariencia
de los frutos y vegetales frescos y procesados, reduciendo las pérdidas económicas que
supone su efecto en la industria agroalimentaria.

Hidrolasas vegetales

Dentro del grupo de las enzimas hidrolasas en los vegetales están involucradas en procesos
metabólicos vitales para el crecimiento, desarrollo y mantenimiento de los mismos. Muchas
de estas enzimas, entre ellas proteasas, pectinasas, xilanasas, esterasas,
poligalacturonidasas, celulasas, son de gran interés industrial por la variedad de procesos
en que pueden ser aplicadas. La mayoría de estas enzimas se encuentran presentes en el
látex de muchas especies. El látex es una de las características más salientes de las familias
Asclepiadaceae, Apocynaceae, Euphorbiaceae y Moraceae (Rajesh et al., 2005). El látex es
el fluido lechoso contenido en la o las células de los tubos laticíferos. Está compuesto por
una suspensión/solución de una mezcla compleja de diferentes sustancias: enzimas,
terpenos, alcaloides, vitaminas, glúcidos, lípidos y aminoácidos libres y se han detectado
componentes subcelulares, tales como núcleo, mitocondrias, ribosomas y vacuolas. La
presencia de látex ha sido reportada en al menos 12000 especies de plantas pertenecientes
a 900 géneros diferentes. Las enzimas detectadas en látex, tales como proteasas y
quitinasas, sugieren un rol en el mecanismo de defensa de las plantas contra patógenos,
parásitos y herbívoros (Freitas et al., 2007). Las pectinasas son enzimas que digieren la
pectina, sustancia presente en las paredes de las células vegetales y en la lámina media
(péctica) y se emplean en el procesamiento de alimentos vegetales. La pectina es un
polisacárido constituido principalmente por la unión de muchas moléculas de ácido
galacturónico parcialmente metoxilado. En los extractos comerciales de pectinasas usados
para la fabricación de jugos de fruta coexisten tres enzimas: pectinliasa, poligalacturonasa
y pectinmetilesterasa.

Las quitinasas catalizan la hidrólisis de quitina, un biopolímero de N-acetil D-glucosamina.

Los patrones de expresión de quitinasas en estudios in vitro (Meins & Ahl, 1989), de
inhibición del crecimiento fúngico por quitinasas (Schlumbaum et al., 1986) y la mayor
resistencia de plantas transgénicas a hongos patógenos (Broglie et al., 1991) son
consistentes con la hipótesis de que las quitinasas constituyen un importante componente
de los sistemas de defensa de las plantas. Consecuentemente, las quitinasas vegetales son
objeto de intensas investigaciones que podrían finalmente conducir a cultivos resistentes a
enfermedades y disminuir el uso de pesticidas ecológicamente nocivos.

Procedimiento
Esta práctica abarca tres procedimientos para determinación de la cinética enzimática y
construir de una curva.

Durante el desarrollo de esta práctica reconoceremos la importancia de las enzimas en la

degradación de H2O2 y polifenoloxidasas y determinaremos los parámetros enzimáticos de
Km y Vmax

Primera parte:

1. Mezclar 10g de levadura, 400mL de agua destilada y 2mL de jabón líquido (Después de
licuar guardar tapado que exista el mínimo contacto con el aíre y la luz).
2. Mezclar una papa licuada, 400mL de agua destilada y 2mL de jabón líquido. (Después
de licuar guardar tapado que exista el mínimo contacto con el aíre y la luz)
 3. Marcar dos tubos de ensayo, en el tubo 1 agregar 2mL de la solución de levadura y
en el tubo 2 agregar 2mL de la solución de papa. (Si no tenemos tubos de ensayo usar
vasos de vidrio o copas de aguardiente).
4. A cada tubo añadir 1 gota de peróxido de hidrogeno (H 2O2) al 30% (Lo podemos
medir usando un gotero o un pitillo, el peróxido lo podemos conseguir en una farmacia)

5. Agitar los tubos de ensayo y observar que empieza a formarse espuma (si no estamos
trabajando sobre tubos podemos agitar ayudados por un pitillo o una cuchara o
cuchillo desechables)
6. Anotar el tiempo transcurrido (en segundos) hasta que termina la formación de
espuma:

NOTA: Cuando la espuma deja de formarse el sustrato se ha agotado

Ahora analicemos

a) La altura de la espuma formada (en milímetros) sobre el tiempo (en segundos) durante
el cual se forma la espuma equivale a la velocidad de la reacción. Calcular la velocidad de
reacción para cada uno:

b) En la reacción que acabas de realizar plantea cual es el sustrato y cuál es el producto o

los productos formados?
_________________________________________________________________________
c) Cual es la función del jabón en el ensayo:
_______________________________________________________

Segunda parte:

Vamos a elaborar una curva semicuantitativa para el peróxido

1. Tomar seis tubos de ensayo (si no tengo tubos sobre copas aguardienteras o vasos de
vidrio o frascos de compota) y numerarlos de 1 a 6.
2. Añadir en cada tubo de ensayo 2 mL de solución de levadura (La solución de levadura
se prepara mezclando 2 g de levadura en 100mL de agua previamente hervida y reposada)
3. Añadir a cada tubo 2 gotas de H2O2 al 1, 2, 4, 8, 15 y 30% respectivamente (para
preparar las diluciones del peróxido partimos del más concentrado y por dilución del 50%
preparamos las otras), mezclar y medir la altura de la espuma (en milímetros) formada
en cada tubo durante 5 segundos y consignar los resultados en la siguiente tabla:
 Tubo de ensayo o recipiente 1 2 3 4 5 6
Solución de Levadura en mL 2 2 2 2 2 2
2 gotas de H2O2 al: 1% 2% 4% 8% 15% 30%
Altura de la espuma en mm
Velocidad mm/seg*
* 5 segundos

Tercera parte:

1. Tomar seis tubos de ensayo y numerarlos de 7 a 12.

2. Añadir en cada tubo de ensayo 2mL de solución de papa.
3. Añadir a cada tubo 2 gotas de H2O2 al 1, 2, 4, 8, 15 y 30% respectivamente, mezclar y
medir la altura de la espuma (en milímetros) formada en cada tubo durante 5 segundos y
consignar los resultados en la siguiente tabla:

Tubo de ensayo 7 8 9 10 11 12
Solución de papa en mL 2 2 2 2 2 2
2 gotas de H2O2 al: 1% 2% 4% 8% 16% 30%
Altura de la espuma en mm
Velocidad mm/seg*
* 5 segundos

Cuarta parte:

1. En una hoja milimetrada realizar un grafico que represente la variación de la altura de la

espuma (velocidad) en función del porcentaje de H2O2 (para levadura y papa
respectivamente). Identificar la variable dependiente e independiente antes de realizar el
grafico y ubicarlas en los ejes adecuadamente.

Cálculos y preguntas:
a) De las graficas deducir los valores de Km para la levadura y la papa, y compararlos.

b) Que indican los valores de Km?

_______________________________________________________________
_________________________________________________________________________
__________________
c) Cuales serian las unidades del Km para el presente ensayo?
________________________________________
d) De las graficas deducir los valores de Velocidad máxima para la levadura y la papa, y
compararlos.
e) Que indican los valores de velocidad máxima?
_________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
f) Cuales serian las unidades de la velocidad máxima para el presente ensayo?
___________________________

Quinta parte

Efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima de polifenoloxidasas

Un incremento de 10C duplicaría la velocidad de reacción química. Cada enzima tiene una
temperatura a la cual trabaja mejor. Para los vegetales esta temperatura es
aproximadamente 50C, por enzimas de esta temperatura la velocidad de reacción decrece
ya que el medio es menos favorable para la enzima. A 80C las enzimas son destruidas.

1. Preparación de los extractos tome un pedazo de plátano verde y uno de plátano

maduro sin cáscara del mismo tamaño; en recipiente aparte píquelos y tritúrelos
con 50 mL de usa solución diluida de limpiavidrios al 50%. Luego filtrar a través de
un algodón, obteniendo de esta manera el extracto enzimático crudo.

2. Deje reposar los tubos 5min a diferentes temperaturas así:

A y A” 0°C (Baño de hielo)
B y B” 20°C (temperatura ambiente)
C y C” 50°C (baño de agua tibia)
D y D” 80°C (baño de agua caliente)

3. Pasados los 5 min ordene los tubos de acuerdo con el color del más claro al más
oscuro y anote la secuencia.

Más claro _____ ______ ______ _____ más oscuro

¿Crees que un color oscuro indica que la enzima es más activa que en un color claro?
______________________________________________________________

¿Cuál temperatura parece ser más optima para la enzima?

______________________________________________________________
Referencias
Waladkhani AR, Clemens MR. Effect of Dietary Phytochemical son Cancer Development. En:
Watson RR editor. Vegetables, Fruits, and Herbs in Health Promotion. Boca Raton FL: CRC
Press; 2001. p. 1.1-1.11

Ramirez EC, Withaker JR. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong, editores.
Polyphenol Oxidase: Handbook of Food Enzymology. Nueva York: Marcel Dekker Inc; 2003.
p. 509-523

Friedman M, Bautista F. Inhibition of polyphenol oxidase by Thiols in the absence and

presence of potato tissue suspensions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1995; 43:
69-76.

Yang C P, Fujita S, Ashrafuzzaman MD, Nakamura N, Hayashi N, Purification and

Characterization of Polyphenol Oxidase from Banana (Musa sapientium L.) pulp. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 2000; 48: 2732-2735.

Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000. Benjamin

Cummings.

Harvey D. MODERN ANALYTICAL CHEMISTRY. 2000. McGraw-Hill.

Holme D. &Peck H. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 1998. Prentice-Hall. Nelson

D. & Cox M. LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. FourthEdition. 2004.
W.H.Freeman.