Biología Molecular

Taller metodologías/CRISPR
Alex Buitrago Martínez. Código: 25131590

Ver el video de clonación disponible en el drive- Para el caso particular que

nos interesa, no queremos tener una colección de fragmentos clonado sino
clonar en un plásmido el gen que codifica para las Cas9.

¿Cómo podría desarrollar esta estrategia? ¿Cuáles de los pasos mostrados en

el video realizarían y cuáles no?

R: Para llevar a cabo la estrategia es importante aislar primero el gen que codifica
para la cas9, y para ello se pueden utilizar PCR; puesto que a diferencia de lo que
se observa en el video y lo que se explica en el libro, no necesitamos el resto del
genoma. Luego se pone el gen amplificado en el plásmido. Para ello se usa un
plásmido de expresión, y se lleva a cabo el procedimiento normal, es decir, el uso
de enzimas de restricción para generar el corte en el plásmido y luego lograr la
unión del gen de la cas9 a éste. Finalmente, se ponen en medio de cultivo para
inducir su multiplicación y por lo tanto la multiplicación del gen. De ésta manera es
posible clonar el gen y lograr su expresión y posterior extracción.

Esta es la actividad principal: ​Tecnología CRISPR

- Usando la información que ha visto, construir una tabla con cada paso
del sistema CRISPR-Cas9:

Paso Resumen

Targeting En este paso, previamente se ha diseñado un ARN guía que se

unirá al objetivo, el cual es un segmento específico del ADN (un
gen de interés por ejemplo) y cuya secuencias son
complementarias.

Binding En este paso la cas9 usa el ARN guía para detectar el objetivo
y unirse a él, mediante el reconocimiento de la PAM. Si la
secuencia es totalmente complementaria, ambas secuencias se
unirán mediante emparejamiento de bases.

Cleaving Una vez se da el emparejamiento entre el ARN guía y el ADN

objetivo, se da la activación de la capacidad Exonucleasa de la
 cas9, que le permite cortar la doble cadena gracias a la
existencia de dos sitios activos para el clivaje. El corte ocurre
normalmente 3 nucleótidos adelante de la secuencia PAM.

DNA repair Una vez se rompe el ADN, la célula tiene la capacidad de

reparar el daño, ya sea por unión de extremos no homólogos o
dirigida por homología. El primero es el más rápido, pero más
propenso a errores y mutaciones, pues no usa ninguna
plantilla; El segundo, al usar un molde, puede llevar a cabo
reparaciones más “confiables”. La correcta manipulación de
ambos procesos permite la edición génica.

- Desarrolle el taller del archivo “CRISPR modelo en papel estudiantes.pdf”.

- Pregunta 1a. Escriba la secuencia guía del ARN 1 que se une al ADN, y la
secuencia complementaria del ADN 1 a la que se une. Etiquete los extremos
5' y 3' de ambas cadenas.

R:​ RNA 1 Guía: 5’ CCCACAGCCAUCCCCCAGCU 3’

DNA 1 Objetivo: 3’ GGGTGTCGGTAGGGGGTCGA 5’

 - Pregunta 1b. ​Compara las secuencias del modelo que acabas de hacer con
tu respuesta a la pregunta 1a. ¿Cómo cambió la secuencia del gen debido a
CRISPR-Cas9? ¿Dónde se hizo este cambio (en el ARN, en una cadena de
ADN, o en ambas cadenas de ADN)?

R: El gen presentó un aumento en la longitud de la secuencia, debido a que hubo

una adición de nucleótidos en la región donde se realizó el corte por parte de la
Cas9, esto como consecuencia del proceso de NHEJ. El cambio se dio en ambas
cadenas de la secuencia de ADN, pues es una DSB, es decir, corta ambas cadenas.

- Pregunta 1c. ​¿Cómo podría este cambio inactivar, o "noquear", un gen?

R: ​Al modificar la secuencia del gen en el ADN, puede que la proteína no se

traduzca. Por otra parte, si se traduce, puede presentar diferentes problemas
dependiendo de qué tan severo sea el daño, por ejemplo un mal plegamiento (que
juega un papel importante en la función) o una modificación en los sitios activos de
la proteína, lo que por supuesto evita que lleve a cabo su actividad o función , o que
estas no se realicen de forma adecuada.

- Pregunta 2a.​ Escriba la secuencia de ARN 2 guía que se une al ADN, y la

secuencia de ADN 2 complementaria a la que se une. Etiqueta los extremos
5' y 3' de ambas cadenas.

RNA 2 Guía: 5’ -GGGUGGAGUUUGUGAAGUAU- 3’

DNA 2 Objetivo: 3’ -CCCACCTCAAACACTTCATA- 5’

- Pregunta 2b. ​ Compara las secuencias del modelo que acabas de hacer con tu
respuesta a la pregunta 2a. ¿Cómo cambió la secuencia del gen mutante MYBPC3
debido a CRISPR-Cas9?
R: ​Con respecto a la secuencia inicial, tras la acción de las Cas9, la secuencia de ADN
presenta una variación en cuanto a la longitud, sin embargo es por una razón diferente a la
anterior. Aquí lo que ocurre es que se usa un ADN donor que funciona como plantilla para
arreglar el ADN mediante reparación homóloga (HDR); En este caso el ADN sí contiene los
4 nucleótidos que se habían perdido.

- Pregunta 2c. ​¿Cómo podría este cambio afectar al gen mutante MYBPC3?

R: ​Lo que sucede es que se logra eliminar la mutación y por lo tanto su efecto en los
seres humanos, puesto que se logra restaurar la versión silvestre del gen que no
posee la deleción, a partir del molde que suministra el “ADN donor”.

- Preguntas adicionales

3. Describa brevemente una situación en la que un científico querría "noquear" un

gen.

R: ​Normalmente se emplea para observar la función que llevan a cabo las proteínas
en distintos procesos. Por ejemplo durante el proceso de fagocitosis llevado a cabo
por diferentes células, están involucradas algunas proteínas, y mediante
silenciamiento de los genes que los codifican se ha logrado determinar la relevancia
de su papel en este proceso.

4. Describa brevemente una situación en la que un científico querría editar una

secuencia o añadir una nueva secuencia para un gen ("knock in" un gen).

R: ​Podrían hacerse con el fin de alterar la secuencia del gen y hacer inservible la
proteína. Sin embargo, podría ser también empleado con el fin de modificar la
estructura o la composición de aminoácidos de los sitios activos y mejorar su
capacidad para llevar a cabo ciertas funciones.
5. CRISPR-Cas9 ha sido descrito como tijeras para ADN con un GPS programable,
o dispositivo de búsqueda. Use lo que ha aprendido de su modelo para explicar esta
analogía.

R: ​La analogía es muy acertada porque, básicamente, así funciona el complejo. La

función de la Cas9 es cortar en un sitio, actúa como una tijera. Sin embargo, no
puede cortar en cualquier lado, y para ello requiere del ARN guía, el cual le permite
posicionarse dentro de la inmensa hebra de ADN para cortar en el sitio adecuado,
es como su sistema de posicionamiento dentro de la larga secuencia.

- Piense en el modelo de papel bidimensional que construyó y el modelo

tridimensional que vio en Click & Learn, responda las siguientes
preguntas.

1. ¿Cuál es una limitación del modelo de papel en comparación con el modelo Click
& Learn?

R: ​Quizás la imposibilidad de detallar la estructura tridimensional de todos los

elementos involucrados y como están ensamblados cada uno de ellos en cada
etapa de la reparación.

2. ¿Cuál es una limitación del modelo Click & Learn en comparación con el modelo
en papel?

R: ​Podría ser más por la parte interactiva, pues no es posible que las personas
puedan hacer alguna actividad más allá de navegar dentro de la página. Podría
aprovecharse mejor el hecho de que en un computador pueden disponerse de más
herramientas para permitir, por ejemplo, que uno pueda realizar paso a paso el
proceso y poder interiorizar y entender mejor quizás todos los procedimientos,
aprovechando mejor el hecho de que se puede acceder a una vista 3D, lo cual no es
posible en el modelo de papel, pero que sí ofrece la posibilidad de que uno pueda
hacer cada cosa posible dentro del modelo.

4. ¿Cuál es una limitación de ambos modelos en comparación con el estudio del

proceso en una celda real?

R: El hecho de que en ninguno de los dos es posible ver de forma detallada cómo
se da el proceso de reparación de ADN, tanto de forma homóloga como no
homóloga. Si bien se observa dónde se da el corte y dónde se hace la reparación,
así como el resultado final, no es posible detallar de manera un poco más precisa
todo el proceso, especialmente en lo relacionado con la HDR, como se empalma el
ADN molde y los cambios en la disposición espacial que requiere el ADN para poder
llevar a cabo toda la reparación.