BAKKALAUREATSARBEIT

Bacterial Artificial
Chromosome
Klonen mit unterschiedlichen
Klonierungsvektoren
von Tina Bernadette Angerer
13.09.2009

[14]

Martrikelnummer: 0520541
Studium: Bakkalaureat Molekulare Biowissenschaften
Studienkennzahl: 033 665
Fach: Praktikum Klonieren
Betreuer: Univ.-Prof.Dr.
Prof.Dr. Klaus Richter
Inhaltsverzeichnis

1 Warum Klonen? ................................................................................................... 2

2 Grundprinzip des Klonens .................................................................................... 2
3 Werkzeuge zum Klonen ....................................................................................... 3
3.1 Restriktionsenzyme ....................................................................................... 3
3.2 DNA-Ligasen ................................................................................................. 5
3.3 cDNA ............................................................................................................. 5
4 Vektoren............................................................................................................... 7
4.1 E. coli Plasmid Vektor.................................................................................... 7
4.2 Bakteriophage λ............................................................................................. 8
4.3 Cosmide ...................................................................................................... 10
4.4 YAC ............................................................................................................. 12
4.5 Weitere Vektoren ......................................................................................... 13
5 Bacterial Artificial Chromosome ......................................................................... 14
5.1 F-Plasmid .................................................................................................... 14
5.2 Entwicklung ................................................................................................. 15
5.3 Konstruktion des BAC Vektors .................................................................... 15
5.4 Klonieren mit BAC ....................................................................................... 16
6 BAC in der Forschung ........................................................................................ 18
6.1 Human Genome Project .............................................................................. 18
6.2 Virenforschung mit BAC .............................................................................. 19
6.3 BAC in der Neurologie ................................................................................. 21
7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 22

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1 Warum Klonen?
Die Nukleinsäuren DNA (Desoxyribonukleinsäure) und RNA (Ribonukleinsäure) sind
allen lebenden Organismen gemein. Die DNA in den Genen einer Person ist
verantwortlich für deren Wachstum, Differenzierung, Entwicklung und Reproduktion.
Die Gene codieren für Proteine und determinieren so die essentiellen Funktionen
jeder Zelle sowie die Charakteristika eines Zelltyps. Bei veränderten Funktionen die
auf Mutationen zurück zu führen sind, die über die DNA weitergegeben werden,
führen zu Erbkrankheiten, wie beispielsweise Sichelzellen Anämie. Mutationen in
somatischen Zellen, können ihre Funktion verändern und zu Krebs führen.[1]

Die Fähigkeit DNA Moleküle zu isolieren und zu klonen, brachte eine Revolution in
medizinischer Genetik und Molekularbiologie. Geklonte DNA Proben können dazu
verwendet werden um Mutationen und Polymorphismen, die mit Krankheiten
assoziiert sind zu detektieren. Sie sind auch nützlich bei der Erforschung
Gewebsspezifischer Gene und bei der Identifizierung von Faktoren, die die
Genexpression regulieren. DNA Sequenzierung kann die primäre Struktur eines
Proteins aufklären und hat bei vielen neue Erkenntnisse über deren Regulation,
Funktion und Evolution geliefert. Das Klonieren hat die Erforschung von Proteinen
ermöglicht, die mit klassischen biochemischen Methoden nicht zu untersuchen
gewesen wären, wegen ihres geringen Vorkommens oder ihrer Instabilität. [1]

2 Grundprinzip des Klonens

Um ein Gen auf molekularer Ebene auf
seine Struktur und Funktion hin zu
untersuchen, braucht man große Mengen
dieses Gens. Es gibt einige Techniken um
eine Vielzahl von identischen DNA
Molekülen zu erzeugen, die auch als
rekombinante DNA Technologie
bezeichnet werden. Als rekombinante
DNA bezeichnet man ein DNA Molekül,
das zusammengesetzt ist aus DNA
Abb. 2.1 Grundprinzip Klonen [3]

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Sequenzen, die aus unterschiedlichen Quellen stammen z.B.: Plasmid eines
Bakteriums + humanes DNA Fragment. Welche Methode man auch zum Klonen
verwendet, alle haben gewisse Grundprinzipien. Um ein DNA Fragment von
Interesse zu klonieren, muss es in einen Vektor eingefügt werden, der in eine
Wirtszelle eindringen kann. Nachdem ein einzelnes rekombinantes DNA Molekül,
Vektor + insert (eingefügtes DNA Fragment) in eine Zelle eingedrungen ist, wird der
Vektor dort mit samt dem insert repliziert was in weiterer Folge zu einer Vielzahl von
identischen DNA Molekülen, Klonen führt. (Abb.2.1)Die mögliche Größe des insert ist
vom Vektor abhängig. (Tabelle 1) [2]
Tabelle 1 Maximalgröße der inserts für verschiedene Vektoren [6]

Vektor DNA insert (kb)

Plasmid 20

λ phage 25

Cosmid 45

P1 phage 100

BAC (bacterial artificial chromosome) 300

YAC (yeast artificial chromosome) 1000

3 Werkzeuge zum Klonen

3.1 Restriktionsenzyme

Um zu klonierende DNA Fragmente zu erhalten, muss die DNA einer zu

untersuchenden Zelle in diskrete, kleine Stücke zerteilen werden, die die Gene der
Zelle beinhalten. Nur kurze DNA Fragmente können in einen Vektor eingefügt und
geklont werden. Zu diesem Zweck, werden die langen DNA Moleküle, aus denen
das Genom eines Organismus besteht in Fragmente zerteilt. Das übernehmen die
Restriktionsenzyme.(z.B.: EcoRI) [2]

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die von Bakterien hergestellt werden. Sie

erkennen typischerweise spezifische Regionen die zwischen 4 und 8 Basenpaare
(bp) lang sind, die so genannten restriction sites. An diesen Stellen schneidet das

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Enzym durch beide DNA Stränge. Restriction sites sind üblicherweise kurze,
palindrome Sequenzen, damit die Sequenz auf jedem Strang, der in 5’-3’ Richtung
gelesen wird, erkannt und geschnitten werden kann. Für jedes Restriktionsenzym
produziert ein Bakterium auch ein Modifikationsenzym. Dieses modifiziert die
Bakterien-DNA indem es die DNA an einer oder zwei Basen, in oder nahe der
restriction site, methyliert um sie so vor dem Zerschneiden zu schützen. Restriktions-
und Modifikationsenzym bilden ein System, das die eigen-DNA schützt und jede,
eindringende fremd-DNA zerstört z.B.: Phagen-DNA oder DNA die während der
Transformation aufgenommen wird.( Abb.3.1) [2]

Die meisten Restriktionsenzyme schneiden so durch die DNA, dass auf beiden
Seiten komplementäre überhängende, einsträngige Enden, so genannte sticky ends
entstehen. Bei Raumtemperatur können sich die sticky ends auch wieder verbinden,
mit jedem DNA Fragment, das mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten
wurde. Manche Restriktionsenzyme schneiden auch gerade durch die DNA und
erzeugen so genannte blunt ends. [2]

Abb. 3.1 a)EcoRI restriction sites b) Modifikation durch Methylierung [2]

Da die Sequenzen der restriction sites so kurz sind, können sie zufällig verteilt auf
jeder DNA gefunden werden. Die Verteilung ist aber für jeden Organismus spezifisch,
daher erzeugt das Zerteilen mit einem Restriktionsenzym ein reproduzierbares Set
von Fragmenten. Einige hundert Restriktinosenzyme wurden aus Bakterien
gewonnen, was viele Möglichkeiten zum Fragmentieren eines Genoms bietet. [2]

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3.2 DNA-Ligasen

DNA Ligasen helfen dabei DNA Fragmente mit blunt oder sticky ends in einen
Vektor einzufügen. Während der normalen DNA Replikation entstehen auf dem so
genannten lagging strand, der diskontinuierlich verdoppelt wird, Okazaki Fragmente.
Dazwischen sind Löcher im neuen DNA Strang. DNA Ligasen helfen um die se
Löcher zu füllen. Beim Klonen sind sie dazu da, das insert mit dem Vektor zu
verknüpfen, indem sie beide Stränge kovalent in 3’- 5’ Richtung über
Phosphodiesterverbindungen verbinden. Der Bakteriophage T4 produziert eine
Ligase, die auch blunt ends miteinander verbinden kann. Aber die Verbindung blunt
ends ist im höchsten Maße ineffizient und man benötigt viel mehr DNA und Ligase.[2]

3.3 cDNA

DNA Fragmente zum Klonieren können entweder direkt aus eine Zelle gewonnen
werden oder über deren mRNA generiert werden. mRNA (messenger) enthält nur die
für Proteine codierenden Sequenzen, die Basenabfolge eines Gens ohne Introns.
Aus cDNA werden Sequenz-Banken generiert, die die Gesamtheit der exprimierten
Gene aus einem Zelltyp oder Organismus enthalten, eine so genannte cDNA-Bank.
mRNA besitzt einen Poly-A-Schwanz, wodurch sie aus einem Zellextrakt leicht von
anderen RNAs separiert werden kann. [2]

Eine Methode aus mRNA doppelsträngige cDNA zu machen ist an den Poly-A-
Schwanz der mRNA eine oligo dT Sequenz anzulagern. Diese dient als Primer für
das Enzym Reverse Transkripase.
Normalerweise wird RNA von DNA
transkribiert. Dieses Enzym ermöglicht den
umgekehrten Vorgang und erzeugt ein
mRNA/cDNA Hybrid. Mit RNase H werden
Löcher in der RNA verursacht und sie wird
teilweise abgebaut. Ein verbliebenes RNA
Stück, am 3’Ende des 1. cDNA Strangs, dient
als Primer für eine DNA Polymerase, die den
zweiten cDNA Strang synthetisiert. (Abb 3.2)
Dieses Rest-RNA-Stück wird während der Abb. 3.2 Herstellen von doppelsträngiger
cDNA [6]

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weiteren Klonierungsschritte oft degradiert und geht verloren. Dann fehlt ein
Sequenzteil außen am 5’Ende der originalen mRNA in der cDNA-Bank.[6]

Um den Verlust zu verhindern kann diese Methode angewandt werden: Vom

mRNA/cDNA Hybrid wird die mRNA mit einer Base entfernt, die die RNA hydrolysiert
aber nicht die DNA. Eine einzigarte DNA-Polymerase namens Terminal Transferase
kann ohne Template Nukleotide an das 3’Ende eines DNA Stranges hängen. Damit
wird die cDNA mit einer oligo-dG Sequenz verlängert. Daran wird ein oligo-dC Primer
gehängt. DNA-Polymerase generiert dann den zweiten cDNA Strang. So erstellt man
ein doppelsträngiges cDNA Molekül mit blunt ends. [2]

Mit Hilfe der DNA-Ligase des Bakteriophagen T4 werden linker an die cDNA
gehängt. Das sind kurze synthetische doppelsträngige DNA Moleküle, die restriction
sites für ein Restriktionsenzym enthalten. Da die Ligation an blunt ends nur schlecht
funktioniert wird mit einer sehr hohen Konzentration von Linkern gearbeitet. Danach
müssen die linker mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden und die cDNA
kann in einen Vektor eingefügt werden. Falls die
cDNA in ihrer Sequenz die restriction site für
dieses Enzym enthält, muss es mit dem
passenden Modifikationsenzym behandelt
werden, bevor die linker angebracht werden.
(Abb.3.3)[2]

Der Vorteil von cDNA-Banken besteht darin, dass

sie nur die kodierenden Abschnitte des Genoms
enthalten. Die Gene höherer Eukaryoten verfügen
meist über sehr große Introns, weswegen ein Gen
oft auf mehrere Vektoren verteilt werden muss um
geklont zu werden. Auch ist es schwer die nicht-
essentiellen Regionen des Genoms von den
Protein-codierenden zu unterscheiden. Ein Gen
aus cDNA ist wesentlich kompakter als sein
Pendant auf dem Chromosom, kann also eher in
einem Vektor untergebracht werden.[2]

Abb. 3.3 Vorbereiten der cDNA zum einfügen in

den Vektor [2]

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4 Vektoren
4.1 E. coli Plasmid Vektor

Plasmide sind ringförmige, doppelsträngige DNA Moleküle die in der Natur in

Bakterien und niederen Eukaryoten vorkommen, neben der chromosomalen DNA.
Sie stehen mit der Zelle in symbiotischer oder parasitärerer Beziehung und werden
bei jeder Zellteilung verdoppelt und an die Tochterzellen weitergeben, was den
Fortbestand des Plasmids sichert. [2]

Das am häufigsten verwendete Plasmid zum

Klonen ist ein Plasmid des Bakteriums E. coli,
das den colE1 origin of replication trägt. Es
wurde von Forschern zum Zwecke des Klonens
optimiert, zum Beispiel durch das
Herausschneiden dafür unnötiger Sequenzen.
Das modifizierte Plasmid ist zwischen 1,2 – 3 kb
(kilo Basenpaare lang) und enthält 3 wesentliche
Regionen: ORI (origin) der Startpunkt der
Replikation, ein Selektionsmarker (z.B.: ampr)
üblicherweise ein Resistenzgen gegen
Antibiotika und eine Region (Polylinker), in die
das zu klonierende DNA stück eingefügt werden
kann.

ORI ist eine spezifische DNA Sequenz, die 50-

100 bp lang ist. Wenn die DNA Replikation
erstmal an ORI initiiert wurde, läuft sie über das
ganze DNA Molekül weiter, unabhängig von den
nachfolgenden Sequenzen. Darum kann jedes
beliebige DNA Fragment in einem Vektor
vervielfältigt werden. [2]

DNA-Fragmente bis zu 20 kb können in einen

Abb. 4.1 Klonen mit E. coli Plasmid
Plasmidvektor eingefügt werden. Zu diesem Vektor [2]

Zweck schneidet man das Plasmid im Bereich des Polylinkers auf. Ein Polylinker ist
eine synthetische Sequenz, die restriction sites für viele Restriktionsenzyme enthält,

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die sonst nirgends auf dem Plasmid zu finden sind. Das Plasmid muss mit dem
gleichen Restriktionsenzym geschnitten werden, wie das DNA-Fragment. So haben
Fragment und Plasmid komplementäre sticky ends und mit Hilfe von DNA-Ligasen
werden Stücke mit passender Länge eingefügt.[2]

Damit ein Plasmid in eine Zelle eindringen kann, muss die Zelle erst kompetent
gemacht werden. Dies kann erreicht werden durch eine Behandlung mit eiskaltem
CaCl2 und anschließendem kurzen Erhitzen.[4] Wenn die rekombinanten Plasmide
mit kompetenten E. coli Zellen vermengt werden, nimmt ein kleiner Teil der Zellen ein
Plasmid auf, das nennt man Transformation. Normalerweise wird eine aus 1000
Zellen transformiert. Diese Zellen können leicht von den anderen selektiert werden,
indem man sie auf einem antibiotikahältigem Medium wachsen lässt, zum Beispiel
Medium mit Ampicillin. Die Bakterienzellen ohne Plasmid sterben ab, transformierte
Zellen können dank ampr überleben.[2] Dieses Gen kodiert für ein Enzym namens β-
Lactamase, das Ampicillin hydrolysiert und damit inaktiviert.[5]

Eine Zelle nimmt ein einzelnes Plasmid auf. Dieses wird bei der Zellteilung
gemeinsam mit der chromosomalen DNA verdoppelt, an die Tochterzellen
weitergegeben und auch innerhalb der Zelle vermehrt. So entstehen auf dem
Medium Kolonien, die alle Kopien des selben Plasmids enthalten da sie aus einer
einzigen Zelle gewachsen sind. Das eingefügte DNA Fragment wird gemeinsam mit
dem Plasmid repliziert. Auf diese Art und Weise wird die zu untersuchende Sequenz
geklont. (Abb. 4.1)[2]

4.2 Bakteriophage λ

Bakteriophagen sind Viren, die

Bakterien infizieren und sich
vermehren indem sie diese zerstören.
Ein Phage besteht im Wesentlichen
aus einem Kopfteil, der darin
enthaltenen DNA und einem
Schwanzteil samt Injektionsapparat.
Der Schwanzteil dockt an der

Oberfläche der Zelle an und injiziert die Abb. 4.2 Lytischer und lysogener Lebenszyklus des λ-
Phagen [2]

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Phagen-DNA in das Bakterium. Die DNA kann auf 2 Arten mit der Zelle interagieren,
sie kann den lytischen oder den lysogenen Zyklus beschreiten. Beim lysogenen
Zyklus wird das Phagengenom in das des Bakteriums integriert und an die
Tochterzellen weitergegeben. Es kann passieren, dass die Phagen-DNA wieder
ausgeschnitten wird und dann in den lytischen Zyklus eingeht. Die Phagen-DNA
benutzt die Replikationsmaschinerie der Wirtszelle um sich selbst zu vervielfältigen
und exprimiert seine Proteine, aus denen neue Phagen gebaut werden. Bei der
Replikation der Phagen-DNA entstehen lange Moleküle, in denen das Phagen-
Genom viele Male hintereinander gereiht ist, durch die COS-Region getrennt. Diese
DNA-Polymere werden Konkatemere genannt. Nachdem einige 100 Kopien erstellt
wurden, wird die Wirtszelle zerstört und die neuen Phagen frei gelassen um weitere
Bakterien zu infizieren. (Abb. 4.2) Für das Klonen ist der lytische Zyklus von
Bedeutung. [6]

Die Größe und Komplexität des Genoms des

λ-Phagen, bereiteten zunächst einige
Probleme für die Verwendung als Vektor. Das
größte Hindernis ist das Vorkommen vieler
restriction sites für verschiedene
Restriktionsenzyme verteilt im Genom. Doch
Forscher waren dazu in der Lage Derivate des
λ-Phagen zu konstruieren, die restriction sites
nur in den nicht essentiellen Regionen des
Genoms enthalten oder nur eine oder zwei für
beispielsweise EcoRI. Diese Derivate müssen
aber immer noch vollkommen infektiös sein.
Ein weiteres Problem war das Verpacken des
Genoms in den Phagenkopf. Ein Genom, das
effizient verpackt werden kann und

Abb. 4.3 Einfügen von Fremd-DNA in einen lebensfähige Phagen produziert muss
Phagen [2]
mindestens 38 kb und maximal 53 kb lang
sein, es darf also von der Größe des Wild-Typ λ-Genoms nicht viel abweichen. Um
möglichst viel Platz für inserts zu schaffen, musste man das Phagen-Genom
minimieren doch wenn man all jene Sequenzen, die für das lytische Wachstum des

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Phagen nicht von Nöten sind, entfernt, umfasst das übriggebliebene Genom weniger
als 38 kb. Dadurch wird das Einfügen neuer DNA (auch fremd DNA) essentiell für
lebensfähige Phagen. (Abb. 4.3) Dieser Umstand ist sogar von Vorteil, da er für eine
Positiv-Selektion rekombinanter Phagen sorgt. [7]

Als Vektor ist der λ-Phage tausendfach effizienter als das E. coli Plasmid, da die
Injektion der DNA durch einen Virus viel erfolgreicher ist als die Transformation und
mehr Klonkolonien auf einer einzelnen Kulturschale wachsen und detektiert werden.
Bis zu 25 kb lange DNA Fragmente werden in ein Phagen-Genom eingebaut mit Hilfe
der Proteine Nu1 und A wird die rekombinante DNA in einen vorgefertigten
Phagenkopf in vitro verpackt. Nur an gefüllte Köpfe werden ebenfalls vorgefertigte
Phagen-Schwänze gehängt, was zu infektiösen Phagen führt. Die Phagen werden
zusammen mit Bakterien ausplattiert wo jeweils ein einzelner Phage eine Zelle
infiziert. Dort findet dann lytisches Wachstum statt. Das Phagen Genom repliziert
sich selbst, mit samt dem fremd-DNA insert und exprimiert die Phagenproteine.
Wenn die Zelle lysiert, infizieren die neu synthetisierten Phagen die Nachbarzellen
und replizieren weiter. Dadurch entstehen auf dem Rasen Löcher, sogenannte
plaques, die Unmengen von Klonen eines eingefügten DNA-Fragments enthalten.

4.3 Cosmide

Cosmide sind Plasmide die die COS Regionen des λ-Phagen enthalten. Bei den
Untersuchungen über die Verpackungsmechanismen der λ-Phagen, fand man
folgendes heraus: monomere, zirkuläre DNA wird nicht verpackt. Nur konkatamere
DNA-Moleküle deren COS-Regionen zwischen 23-33 Megadaltons auseinander
liegen werden verpackt. Konkatemere sind DNA-Polymere, bei denen die gleiche
Sequenz (λ-Phagen Genom) öfter hintereinander liegt. Neben den COS-Regionen
ist nur noch eine sehr kleine Regionen für das Verpacken nötig. Der Rest des
Genoms kann durch fremd-DNA ersetzt werden, ohne das Verpacken zu
beeinflussen. Um die Mindestlänge zum Verpacken zu erreichen, müssen inserts
eingefügt werden, die sich im Größenbereichs des λ-Phagen Genoms befinden
(zwischen 35 und 45 kb). Durch Verpacken erhält man infektiöse Phagenpartikel.
Plasmide dieser Größe werden nur selten durch Transformation aufgenommen. [8]

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Ein Cosmid wird hergestellt, indem die COS
Region des λ-Phagen in ein sehr kleines E. Coli
Plasmid eingefügt wird. Der gesamte Vektor ist
in etwa 5 kb lang. Wie andere Plasmide auch,
enthält das Cosmid die Regionen ORI, einen
Polylinker und ein Antibiotikaresistenz-Gen.
DNA-inserts werden mit Hilfe von
Restriktionsenzymen in das Cosmid im Bereich
des Polylinkers eingebaut. Wenn die
Konzentration der fremd-DNA hoch genug ist,
wird während der Ligation ein langes DNA-
Molekül generiert, das viele Fragmente der
fremd-DNA enthält, abgetrennt durch die 5kb
lange Cosmid-DNA. Diese langen Moleküle
entsprechen den Konkatemeren, die während
der Replikation des λ-Phagen in der Wirtszelle
entstehen und können in vitro in Phagen
verpackt werden. (Abb. 4.4) [6]

Wie normales Phagen-Genom wird ein Cosmid

von passender Länge dann in einen Phagenkopf Abb. 4.4 Verpacken von Cosmiden in
Phagen [2]
verpackt und ein Phagenschwanz wird
angehängt. Die Phagen sind infektiös. Sie werden auf einem Bakterienrasen
ausgestrichen und injizieren ihre DNA in die Zellen. Da keine Phagenproteine auf
dem Cosmid vorhanden sind, ist kein lytisches Wachstum möglich. Stattdessen
schließt sich die Cosmid-DNA zu einem Ring, das wie ein normales Plasmid repliziert
wird und bei der Zellteilung an die Tochterzellen weiter gegeben. Die gewachsenen
Kolonien können dann auf einem Antibiotikamedium ausselektiert werden. [6]

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4.4 YAC

YACs (Yeast Artificial Chromosome)

sind künstlich generierte
Hefechromosomen die mit Hilfe von
Saccharomyces cerevisiae (Hefe)
vervielfältigt werden. Das Klonen mit
Eukaryoten-Zellen bietet einige
Vorteile gegenüber dem Klonen mit
Bakterienzellen. Manche Eukaryoten-
DNA-Sequenzen, besonders jene mit
vielen Sequenzwiederholungen, sind
in Bakterienzellen schwierig bis
unmöglich zu vermehren, da sie
diese Art von DNA Organisation Abb. 4.5 Einfügen eines DNA-inserts in ein YAC [9]

nicht besitzen. In Hefezellen gelingt dies allerdings. Der größte Vorteil, den das
Klonen mit YACs bietet, ist die enorme Größe der inserts, die möglich ist. [9]

Chromosomen besitzen drei wichtige Regionen: das Centromer, die Telomere und
ARS. Das Centromer verbindet die die Schwesterchromatiden (2 gleiche Arme eines
Chromosoms) miteinander und es spielt eine wichtige Rolle bei der Zellteilung. Als
Telomere werden die Enden der Chromosomen-Arme bezeichnet. Sie beschützen
das Chromosom vor Nuklease-Attacken. Autonomous replicating sequences (ARS)
fungieren auf dem Chromosom als spezifische Replikations-Startpunkte (ORI) und
sind nötig für die autonome Replikation. [9]

Die künstlichen Chromosomen werden während der Zellteilung fast perfekt an die
Tochterzellen weitergegeben. Ein YAC beinhaltet neben diesen 3 Regionen noch 1
oder 2 Selektionsmarker und zumindest eine restriction site in die fremd-DNA
eingefügt werden kann. All diese Komponenten zusammen, ergeben ein DNA-
Molekül, das zwischen 10 – 15 kb lang ist. Natürliche Hefe Chromosomen haben
eine Länge von 230 bis zu 1700 kb. Mit Hilfe von YACs können also Fragment im
Megabasen-Bereich geklont werden. (Abb.4.5) Unglücklicherweise gibt es bei so
großen inserts häufig Stabilitätsprobleme. Die geklonte DNA wird in der Zelle neu
organisiert, was ihre Sequenz verändert. Um ein YAC in eine Hefezelle einzubringen,
muss dessen Zellwand entfernt werden, was sie osmotisch sehr Instabil werden lässt

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und selbst dann werden nur wenige Zellen transformiert. Auch macht es das lange
lineare YAC Molekül schwer, die klonierte DNA in reiner Form wiederzugewinnen.
Aus diesen Gründen wurde nach der Entwicklung des YAC noch nach weiteren
Vektoren geforscht, die zwar nicht so große inserts aufnehmen können aber um ein
vielfaches stabiler sind. [2,3,9]

4.5 Weitere Vektoren

P1-Vektor

Das P1-Klonierungssystem funktioniert im Prinzip wie das Klonieren mit dem λ-

Phagen-Vektor mit dem Unterschied, dass in den Kopf des Bakteriophagen P1 ein
Genom mit einem insert von bis zu 125 kb Verpackt werden kann. [3]

PAC

P1-derived Artificial Chromosome basiert auf dem P1-Phagen und dem F-Plasmid
(5.1↓) ähnlich dem BAC. Dieser Vektor kann inserts bis zu 300 kb tragen. [3]

Fosmide

Dieser Vektor besitzt den F-Plasmid ORI und die λ-Phagen COS-Regionen. Das
System ist ähnlich dem Cosmid-Vektor, aber es existieren weniger Kopien pro Zelle.
Das gewährt mehr Stabilität für die inserts. [3]

MAC

Das Mammalian Artificial Chromosome ist ein künstlich generiertes Chromosom, das
Telomere, ein Centromer und ORI eines Säugetierchromosoms besitzt. Es basiert
auf Säugetier-Satelliten-DNA und kann große DNA-Fragmente tragen. Dieses
Chromosom muss nicht in eine Wirtszelle aufgenommen werden um lange stabil zu
bestehen. [17]

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5 Bacterial Artificial Chromosome
Um das Human Genome Project (Entschlüsselung des gesamten Menschlichen
Genoms) zu verwirklich, musste man hochauflösende „Landkarten“ jedes
menschlichen Chromosoms erstellen. Das würde die Isolierung von kurzen DNA-
Fragmenten für die direkte Sequenzierung und andere Manipulationen erlauben. Zu
diesem Zwecke wurde das YAC-System entwickelt. Doch obwohl YACs inserts von
bis zu 1 mb und mehr tragen können, brachten sie, wie oben schon erwähnt, einige
Probleme mit sich, die es schwer machen würden eine menschliche Genom-Karte zu
erstellen. Auch waren die Hefezellen vielen Molekular Biologen nicht so vertraut wie
andere Organismen, zum Beispiel E. coli. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen,
wurde ein bakterielles Klonierungssystem entwickelt, das auf dem ausgiebig
erforschten E. coli F-Factor basiert, einem zirkulären supercoiled (mehrfach verdreht)
Plasmid das in der Zelle in nur wenigen Kopien vorliegt. Aus diesem Grund, wurde
das Bacterial Artifical Chromosome (BAC) generiert. [10]

5.1 F-Plasmid

Die Konjugation ist der Prozess bei dem DNA von einem Bakterium auf ein anderes
übertragen wird, üblicherweise über eine mating bridge (Verbindung zwischen den
Bakterien) für die man einen engen Kontakt zwischen Donor und Akzeptorzelle
benötigt. Der F-Pilus (fertility), ein extrazelluläres Filament, das mit Hilfe der Transfer-
Region einer Plasmid-tragenden Donorzelle gebildet wird, verbindet sich mit einer
oder mehr Empfänger-Zellen und bildet ein mating Paar oder gleich ein Aggregat.
Wenn die Brücke stabil ist, löst sich
ein DNA-Strang des F-Plasmids (F-
Faktor) (~100 kb) ab und wandert in
die neue Zelle. Dort schließt sich die
DNA wieder zu einem Ring und in
Donor und Akzeptorzelle wird der
2.DNA-Strang synthetisiert. (Abb.5.1)
Das F-Plasmid wird seit mehr als 60
Abb. 5.1 Weitergabe des F-Faktor mittels Zellteilung, oder
Jahren untersucht und wurde dazu durch Übertragung mittels F-Pilus [14]

benutzt viele Techniken in der Genetik

zu entwickeln. [11]

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5.2 Entwicklung

Die Entwickler des BAC-Klonierungssystems verfolgten 3 Hauptziele: 1. Ein stabiles

Klonierungssystem für Bakterien, das leicht manipuliert werden kann für die
Kartierung und die Analyse des Genoms. 2. Das System sollte ein großes insert
tragen, das als Substrat für die Sequenzierung dienen kann. Andere Vektoren wie
Cosmide oder P1 hatten nur eine Kapazität von 45 bzw. 100 kb. 3. Das System sollte
auch nachdem das Human Genom Project vollendet und viele andere Genome
sequenziert worden sind, noch einen nützliches Werkzeug sein. [10]

Das BAC-System basiert auf dem E. coli F-Faktor wegen der Fülle an Informationen
die man über seine Genetik und molekular Biologie besitzt. Vor einiger Zeit wurde
der F-Faktor dazu benutzt um Genregulation zu untersuchen und für
Mutationsanalysen in E. coli. Die Replikation des F-Faktors wird streng kontrolliert
von den Regulationsmechanismen der E. coli Zelle. Daher existieren nur wenige
Kopien pro Zelle. Das gewährleistet die Stabilität von DNA-inserts und reduziert das
Potenzial für Rekombination zwischen den DNA-Fragmenten, die der Vektor trägt.
Inserts in Vektoren, von denen eine Zelle viele Kopien beinhaltet (z.B. Cosmide),
rearrangieren sich oft ungewollt. Die strukturelle Stabilität des F-Faktors erlaubt das
Einfügen von komplexen genomischen DNA inserts und diese können in hohem
Maße stabil in E. coli Zellen aufbewahrt werden. [10]

5.3 Konstruktion des BAC Vektors

Die Basis für das BAC war das Plasmid
pMBO131. Dieses Plasmid ist ein F-Faktor
basierendes, prokaryotisches Replikon, das F-
Faktor ORIs besitzt, oriS und repE, ein
Chloramphenicol-Resistenz-Gen und die Gene
parA und parB (partitioning). [12] Eine
synthetische 97 bp Oligonukleotid-Sequenz, die
die Promotoren T7/SP6 beinhaltet, die restriction
sites für die Enzyme HindIII und BamHI und sites
für rare-cutter Enzyme (Not I, Eag I, Xma I,

SmaI, Bgl I, Sfi I) wurden in die SalI Sequenz Abb 5.2 Dis Organisation des BAC Vektor pBAC108L [13]

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15
des Plasmids eingefügt. Schnittstellen für rare-cutter Enzyme sind im Genom nur
selten zu finden. Ein 400 bp SacI Fragment des Bakteriophagen-λ, auf dem sich die
cosN-site befindet, wurden in die SacI Sequenz des Plasmids eingefügt und ein 42
bp Oligonukleotid, das die loxP-site des Bakteriophagen P1 enthält, in die ClaI-site.
Das resultierende Plasmid tragt den Namen pBAC108L. (Abb 5.2+Deckblatt)Ein BAC
ohne insert ist etwa 7 kb lang. [13]

Die regulatorischen Gene des F-Plasmids oriS, repE, parA und parB, sorgen nicht
nur für dessen Replikation, sondern auch dafür, das eine Zelle nicht zu viele Kopien
besitzt. oriS und repE sorgen für die unidirektionale (in eine Richtung) Replikation
des Plasmids während parA und parB dafür zuständig sind, dass nur eine oder 2
Kopien in einer E. coli Zelle vorkommen, was von Vorteil ist für die Stabilität des
inserts. Die cloning-site, in die das Fremd-DNA-insert eingefügt wird, wird von den
Promotoren flankiert um RNA-Proben für chromosome walking zu erstellen und zur
Sequenzierung der DNA an der Vektor-insert Verbindung. Mit cosN hat man eine
fixe Position für die spezifische Teilung durch die Phage-λ-Terminase. LoxP erfüllt
einen ähnlichen Zweck. Das P1 Cre Protein katalysiert die Aufspaltungsreaktion
wenn loxP vorhanden ist. Diese beiden Regionen ermöglichen es sehr einfach Klone
mit Enden zu generieren die in einem geordneten Array angeordnet werden und für
restriction-site-mapping benutzt werden können. [13]

5.4 Klonieren mit BAC

Die inserts, die ein BAC aufnehmen kann sind um einiges größer als bei anderen
Bakterien-Vektoren. Um passende inserts zu erhalten, wird die DNA der zu
untersuchenden Zelle mit einem Restriktionsenzym (zB. HindIII) partiell verdaut und
die so entstandenen Fragmente mittels Gel-Elektrophorese nach der Größe
aufgetrennt. Fragmente von 100 bis 300 kb (oder größer) werden aus dem Gel
isoliert und in die Vektoren eingebaut. [13] Das Isolieren ohne die DNA-Fragmente zu
zerstören, ermöglichen die Enzyme Agarase und eine Temperatur-sensitive Alkaline
Phosphatase. Agarase bricht die Agarose-Matrix auf und die Phosphatase
dephoshoriliert die einzufügende DNA und kann im Gegensatz zu anderen
Phosphatasen leicht durch Temperaturerhöhung wieder inaktiviert werden.[10]

Das rekombinante BAC-Molekül ist aufgrund der Größe sehr viel schwerer zu
transformieren als andere Bakterienvektoren und nur wenige Bakterienstämme (zB.

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DH10B oderr DH5) , können ein insert, größer als 100 kb überhaupt aufnehmen. Mit
M
Hilfe der Elektroporation erhält man 10^6 transformierte Zellen pro µg DNA. Dabei
werden Zellen und DNA einem kurzen, starken, elektrischem Puls ausgesetzt,
ausgesetzt
wodurch kurzzeitig Poren entstehen,
en durch diese die DNA von dem Feld getrieben
wird. Für die Transformation großer DNA Moleküle scheint ein kurzer Puls mit hoher
Spannung, gefolgt von einer längeren Periode mit niedrigerer Spannung, die lange
Molekülen Zeit
eit zum Eindringen lässt, am besten geeignet zu sein. Bei lediglich einem
kurzem Puls mit hoher Spannung werden vor allem BACs mit nur kleinen oder ohne
inserts transformiert.[15]

Das BAC wird wie ein normales Plasmid bei der Zellteilung repliziert und an die
Tochterzellen weitergegeben.
ben. Dadurch und durch die
d Tatsache,, das nur wenige
Kopien pro Zelle vorhanden
handen sind, kann man nur wenig DNA in einer Kolonie
erwarten. Dafür aber bietet das BAC-System hohe Stabilität. [13]

Um die transformierten Zellen von den Zellen ohne Plasmid zu selektieren,

sele ist das
Antibiotika-Resistenzgen
Resistenzgen vorhanden,
vorhanden, das nur die transformierten Zellen auf einem
antibiotikahältigem Medium wachsen lässt. Für eine zusätzliche Unterscheidung
zwischen Plasmiden mit und ohne insert wurden
n die Kolonien auf Nylon-Gewebe
Nylon
übertragen und mit beispielsweise
pielsweise radioaktiv markierter humaner Gesamt-DNA
Gesamt (bei
humanen inserts)hybridisiert.[13]
)hybridisiert.[13] Um sich diesen Schritt zu sparen, wurden die BAC-
Vektoren pBeloBAC und später pIndigoBAC entwickelt, die in der cloning-site ein
lacZ Gen tragen. [10, 16]

LacZ ist ein Gen, das in E. coli für das Enzym β-

Galactosidase codiert.
rt. Dieses Enzym spaltet
das Reagenz namens X-gal
gal (5-bromo-4-chloro-
(5
3-indolyl-β-d-galactopyranoside)
galactopyranoside). Dabei entsteht
ein blaues Produkt. Das lacZ-Gen
lacZ enthält einige
restriction-sites in die ein DNA
DNA-Fragment
eingefügt werden kann. Das insert verhindert
die Expression von β-Galactosidase.
Galactosidase. Wenn
transformierte Zellen auf einem X-gal
X hältigem
Medium wachsen, sind Zellko
Zellkolonien mit
rekombinanten Vektoren weis, Kolonien ohne
Abb 5.3 Blau-Weis
Weis Test auf inserts. (Bild aus
inserts blau. (Abb 5.3) [3] dem Praktikum Klonieren)

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Für weitere Analysen wird die DNA aus den Zellen extrahiert, mit NotI verdaut und
am Agarose-Gel aufgetrennt. Auf dem Gel sollte bei jeder Kolonie eine Bande bei
~6,7 kb zu sehen sein, die Bande für den Vektor ohne insert und Banden
unterschiedlicher Länge für die insert DNA. Die strukturelle Stabilität des BAC sorgt
dafür, dass auch nach längerem Wachstum und oftmaligem Replizieren des Vektors,
die inserts stabil bleiben. Wenn man eine Kolonie inkubiert und wachsen lässt
(täglich frisches Medium) sind auch am 5 Tag des Wachstums (in etwa 100
Generationen) so gut wie keine Unterschiede zur ersten entnommen Probe
festzustellen. Bei Experimenten mit Cosmiden zeigte sich schon nach kürzerer
Inkubationszeit, das sich bis zu 40% der DNA rearrangiert hat. [13]

6 BAC in der Forschung

Aufgrund der vielen Vorteile, die das BAC Klonierungssystem bietet, kam es in der
Forschung schon oft zur Anwendung. Hier einige Verwendungsgebiete mit kurz
angeführten (aktuellen) Beispielen:

6.1 Human Genome Project

Tabelle 2 Theoretische Anzahl an Klonen die nötig wären um mit den unterschiedlichen Vektoren mit 95
bzw. 99% Wahrscheinlichkeit das gesamte menschliche Genom abzudecken. [3]

Vektor Insert (kb) P = 95% P = 99%

λ replacement 18 532 500 820 000

Cosmid, fosmid 40 240 000 370 000

P1 125 77 000 118 000

BAC, PAC 300 32 000 50 000

YAC 600 16 000 24 500

Mega-YAC 1400 6850 10 500

Im Jahr 2001 wurden 2 wichtige Arbeiten über die vollständige Sequenzierung des
menschlichen Gnoms veröffentlicht. Das International Human Genome Sequencing
Consortium (IHGSC) berichtete in Nature über seine Methoden und Erfolge und die

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US Firma Celera publizierte in Science. IHGSC benutzte eine Methode namens
hierarchical shotgun (HS) assembly. Hierbei wird das Genom zuerst in Sammlung
aus überlappenden Sequenzen aufgeteilt. Diese werden weiter zerteilt und in
Vektoren eingefügt, kloniert und eine bestimmte Anzahl der Klone sequenziert. Der
Vorteil dieser Methode ist, dass die mögliche Position der erhaltenen Sequenz
eingeschränkt ist und die Wahrscheinlichkeit erhöht, das gesamte Genom
abzudecken, aber der Arbeitsaufwand ist größer als beim Whole Genome shotgun-
Sequenzieren (Celera). Das
gesamte Genom wird
zerteilt, kloniert und per
Zufall wird eine bestimmte
Anzahl dieser Klone
sequenziert (Abb.6.1). Die
Anzahl aller sequenzierten
Klone wird so gewählt, dass
sie das gesamte Genom

mehrmals abdecken, im Fall Abb . 6.1 Schematische Darstellung HS und WGS [18]

von Celera 5,3 mal. [18,19]

Von beiden Projekten wurden BACs als Klonierungsvektoren verwendet, wegen den
bereits beschrieben Vorteilen dieses Klonierungssystems. Celera erstelle hierzu von
den DNA-Spendern Banken von DNA-Fragmenten in 3 Größenkategorien 2kb, 10 kb
und 50 kb die mit Hilfe von BAC-end-sequencing und bioinformatischen Methoden
zusammengefügt wurden. IHGSC fügte der GeneBank als menschliches
Gesamtgenom die Sequenzen von 33.000 BAC-Klonen hinzu. Auch wenn alle von
Celera erstellten Klone, das Genom 39 mal abdeckten, lieferte die Klon für Klon
Sequenzierung des Konsortiums ein vollständigeres Ergebnis. [20]

6.2 Virenforschung mit BAC

Varicella Zoster Virus (VZV) ist ein humaner alpha-Herpesvirus, den viele Menschen
in sich tragen (90% US-Bev.) Eine Infektion während der Kindheit führt zu
Windpocken. Der Krankheitsverlauf ist milde. Für einen Erwachsenen kann es zu
einer ersthaften Krankheit werden. Das Genom von VZV ist 125 kb lang und besitzt

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zumindest 70 einzigartige offene Leseramen (ORFs), Regionen zwischen einem
Start und einem Stop-Codon, also potenzielle Gene. Die meisten dieser ORFs sind
noch nicht untersucht. [3, 21]

VZV kann in nur wenigen Wirtszellen untersucht werden und ist in vitro hochgradig
Zell- assoziiert, was Mutationsstudien sehr schwierig macht. Um dieses Problem zu
lösen wurde das gesamte VZV-Genom in ein BAC eingefügt und geklont. Zusätzlich
wurde in das VZV-BAC ein Luziferase-Gen eingefügt um einen Luziferase-
exprimierenden VZV zu generieren, um die Detektion zu erleichtern. Damit können
VZV ORF Deletations-Mutanten erzeugt und untersucht werden.[21]

Auf dem VZV-BAC wird ein bestimmter ORF durch ein Kanamycin Resistenzgen
ersetzt und die erwartete Deletions-Mutante entsteht. Kanr dient der positiv-Selektion
der rekombinanten Mutanten. Der Vektor wird in humane Melanomzellen transfiziert
und erzeugt Plaques, indem das Virusgenom reaktiviert wird. Wenn einer dieser ORF
essentiell ist für die virale Replikation, würden bei dieser Mutante keine Plaques
entstehen. So erhält man erste Hinweise auf die Funktion eines ORFs.(Abb.6.2) [21]

Abb 6.3 Schematische Darstellung der Untersuchung eines ORF. Zur leichteren Detektion der
Transfizierten Zellen wird auf BAC das Green Flourescent Protein exprimiert.[21]

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Das BAC erleichtert die Untersuchung dieses und auch anderer Viren, erheblich!

zB des Bovinen Herpesvirus: „A resource for dissection of the interactions between

BoHV-4 and host endometrial cells was generated by cloning the genome of BoHV-4
as a BAC.” ([22]Gaetano Donofrio*1, 2009)

6.3 BAC in der Neurologie

BAC Transgene Mäuse

BAC transgene Mäuse werden erzeugt

indem man die klonierte, linearisierte DNA
eines BAC, das ein bestimmtes insert trägt
in die Vorkerne befruchteter Oozyten
injiziert. Diese werden
pseudoschwangeren Empfängerweibchen
eingesetzt, die die transgenen Mäuse
dann austragen. Diese Mäuse geben ihr
verändertes Erbgut auch an ihre
Nachkommen weiter. (Abb.6.3)[23]

So können humane Gene des zentralen

Nervensystems in das Genom einer Maus Abb 6.3 Herstellung transgener Mäuse [2]

integriert und untersucht werden, wovon

man sich ein besseres Verständnis ihrer Funktion und ihres Phänotyps erhofft. [24]

Ein Beispiel ist die Untersuchung des Brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
Dieses Protein ist wichtig bei der Entwicklung des adulten Nervensystems und spielt
bei einigen Krankheiten eine Rolle. In Nagetieren wurde dieser Faktor in vivo schon
umfassend studiert. Die Erforschung des humanen BDNF beschränkte sich auf post
mortem Studien. Die Entwicklung transgener Mäuse hat diesen Umstand jedoch
verbessert: „Bacterial artificial chromosome (BAC) transgenic mice harboring the
human BDNF gene and its regulatory flanking sequences constitute a useful tool for
studying human BDNF gene regulation and for identification of therapeutic
compounds modulating BDNF expression.” ([25]Indrek Koppel, 2009)

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7 Literaturverzeichnis

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[25]Indrek Koppel, T. A.-P. BMC Neurosci.; 10: 68. (2009)

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