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DIN EN ISO 7405:2013-12

Nationales Vorwort
Dieses Dokument (EN ISO 7405:2008 + A1:2013) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 106 „Dentistry“
(Sekretariat: SCC, Kanada) in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC55 „Zahnheilkunde“
(Sekretariat: DIN, Deutschland) erarbeitet.

Im DIN Deutsches Institut für Normung e. V. ist im Normenausschuss Dental hierfür der Arbeitsausschuss
NA 014-00-20 AA „Biologische und klinische Werkstoffprüfung“ zuständig.

Dieses Dokument enthält die Änderung 1, angenommen vom CEN am 2013-05-15.

Anfang und Ende der durch die Änderung eingefügten oder geänderten Texte sind jeweils durch Änderungs-
marken !" angegeben.

Für die im Abschnitt 2 zitierten Internationalen Normen wird im Folgenden auf die entsprechenden Deutschen
Normen hingewiesen:

ISO 1942 siehe DIN EN ISO 1942


ISO 6344-1 siehe DIN ISO 6344-1
ISO 10993-1 siehe DIN EN ISO 10993-1
ISO 10993-2 siehe DIN EN ISO 10993-2
ISO 10993-3 siehe DIN EN ISO 10993-3
ISO 10993-5 siehe DIN EN ISO 10993-5
ISO 10993-6 siehe DIN EN ISO 10993-6
ISO 10993-9 siehe DIN EN ISO 10993-9
ISO 10993-10 siehe DIN EN ISO 10993-10
ISO 10993-11 siehe DIN EN ISO 10993-11
ISO 10993-12 siehe DIN EN ISO 10993-12
ISO 14971 siehe DIN EN ISO 14971

Änderungen

Gegenüber DIN EN ISO 7405:2009-06 wurden folgende Änderungen vorgenommen:

a) Aufnahme einer Positivkontrolle in 6.1.5;

b) Änderung des französischen Titels;

c) Aufnahme eines Literaturhinweises [31] in das Literaturverzeichnis.

Frühere Ausgaben

DIN V 13930: 1987-05, 1990-09


DIN EN ISO 7405: 1998-01, 2009-06

2
DIN EN ISO 7405:2013-12

Nationaler Anhang NA
(informativ)

Literaturhinweise

DIN EN ISO 1942, Zahnheilkunde — Vokabular

DIN EN ISO 10993-1, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 1: Beurteilung und Prüfungen im
Rahmen eines Risikomanagementsystems

DIN EN ISO 10993-2, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 2: Tierschutzbestimmungen

DIN EN ISO 10993-3, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 3: Prüfungen auf Genotoxizität,
Karzinogenität und Reproduktionstoxizität

DIN EN ISO 10993-5, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 5: Prüfungen auf in-vitro-
Zytotoxizität

DIN EN ISO 10993-6, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 6: Prüfungen auf lokale Effekte
nach Implantation

DIN EN ISO 10993-9, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 9: Rahmen zur Identifizierung
und Quantifizierung von möglichen Abbauprodukten

DIN EN ISO 10993-10, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 10: Prüfungen auf Irritation und
Allergien vom verzögerten Typ

DIN EN ISO 10993-11, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 11: Prüfungen auf systemische
Toxizität

DIN EN ISO 10993-12, Biologische Beurteilung von Medizinprodukten — Teil 12: Probenvorbereitung und
Referenzmaterialien

DIN EN ISO 14971, Medizinprodukte — Anwendung des Risikomanagements auf Medizinprodukte

DIN ISO 6344-1, Schleifmittel auf Unterlagen — Korngrößenanalyse — Teil 1: Prüfung der Korngrößen-
verteilung

3
DIN EN ISO 7405:2013-12

— Leerseite —

4
EUROPÄISCHE NORM EN ISO 7405
Dezember 2008
EUROPEAN STANDARD
+ A1
NORME EUROPÉENNE Juli 2013

ICS 11.060.10; 11.100.99 Ersatz für EN ISO 7405:1997

Deutsche Fassung

Zahnheilkunde —
Beurteilung der Biokompatibilität von in der Zahnheilkunde
verwendeten Medizinprodukten
(ISO 7405:2008 + Amd 1:2013)

Dentistry — Art dentaire —


Evaluation of biocompatibility of medical devices Évaluation de la biocompatibilité des dispositifs
used in dentistry médicaux utilisés en art dentaire
(ISO 7405:2008 + Amd 1:2013) (ISO 7405:2008 + Amd 1:2013)

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 5. Dezember 2008 angenommen.

Die Änderung A1 modifiziert die Europäische Norm EN ISO 7405:2008. Sie wurde vom CEN am 15. Mai 2013 angenommen.

Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen
dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen
dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN-CENELEC oder bei jedem CEN-
Mitglied auf Anfrage erhältlich.

Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache,
die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-
Zentrum des CEN-CENELEC mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, der ehemaligen jugoslawischen
Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta,
den Niederlanden, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der
Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG


EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brüssel


DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Inhalt
Seite

Vorwort ................................................................................................................................................................3
Vorwort der Änderung A1 ..................................................................................................................................4
Einleitung .............................................................................................................................................................5
1 Anwendungsbereich .............................................................................................................................6
2 Normative Verweisungen ......................................................................................................................6
3 Begriffe ....................................................................................................................................................7
4 Einteilung der Medizinprodukte ...........................................................................................................8
4.1 Einteilung nach der Art des Körperkontaktes ....................................................................................8
4.2 Einteilung nach der Kontaktdauer .......................................................................................................8
5 Prozess der biologischen Beurteilung ................................................................................................9
5.1 Allgemeines ............................................................................................................................................9
5.2 Auswahl der Prüfungen und Gesamtbeurteilung ...............................................................................9
5.3 Auswahl der Prüfverfahren ................................................................................................................ 10
5.4 Typen von Prüfungen ......................................................................................................................... 10
5.5 Erneute Beurteilung der Biokompatibilität ...................................................................................... 11
6 Spezielle Prüfverfahren für zahnärztliche Werkstoffe .................................................................... 11
6.1 Empfehlungen zur Probenherstellung.............................................................................................. 11
6.2 Agardiffusionsprüfung ....................................................................................................................... 13
6.3 Filterdiffusionsprüfung ...................................................................................................................... 16
6.4 Pulpa- und Dentin-Anwendungsprüfung ......................................................................................... 19
6.5 Pulpaüberkappungsprüfung .............................................................................................................. 24
6.6 Endodontische Anwendungsprüfung............................................................................................... 26
Anhang A (informativ) Prüfungen, die bei der Beurteilung der Biokompatibilität von in der
Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukten in Erwägung gezogen werden müssen ........... 30
Anhang B (informativ) Dentin-Barriere-Zytotoxizitätsprüfung .................................................................. 31
B.1 Ziel ........................................................................................................................................................ 31
B.2 Geräte und Materialien ....................................................................................................................... 31
B.3 Durchführung der Prüfung ................................................................................................................ 34
B.4 Kontrollen ............................................................................................................................................ 36
B.5 Beurteilung der Ergebnisse ............................................................................................................... 37
B.6 Prüfbericht ........................................................................................................................................... 38
Anhang C (informativ) Akute Toxizitätsprüfung .......................................................................................... 39
Literaturhinweise ............................................................................................................................................. 40

2
DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Vorwort
Dieses Dokument (EN ISO 7405:2008) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 106 „Dentistry“ in
Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 055 „Zahnheilkunde“ erarbeitet, dessen Sekretariat
vom DIN gehalten wird.

Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Dezember 2009, und etwaige entgegenstehende
nationale Normen müssen bis Dezember 2009 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN [und/oder CENELEC] sind nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen
Patentrechte zu identifizieren.

Dieses Dokument ersetzt EN ISO 7405:1997.

Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden


Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland,
Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta,
Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien,
Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Königreich und Zypern.

Anerkennungsnotiz

Der Text von ISO 7405:2008 wurde vom CEN als EN ISO 7405:2008 ohne irgendeine Abänderung
genehmigt.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Vorwort der Änderung A1


Dieses Dokument (EN ISO 7405:2008/A1:2013) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 106 „Dentistry“ in
Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 055 „Zahnheilkunde“ erarbeitet, dessen Sekretariat
vom DIN gehalten wird.

Diese Änderung zur Europäische Norm EN ISO 7405:2008 muss den Status einer nationalen Norm erhalten,
entweder durch Veröffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Januar 2014, und
etwaige entgegenstehende nationale Normen müssen bis Januar 2014 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN [und/oder CENELEC] sind nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen
Patentrechte zu identifizieren.

Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden


Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, die
ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island,
Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal,
Rumänien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Türkei, Ungarn,
Vereinigtes Königreich und Zypern.

Anerkennungsnotiz

Der Text von ISO 7405:2008/Amd.1:2013 wurde vom CEN als EN ISO 7405:2008/A1 ohne irgendeine
Abänderung genehmigt.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Einleitung
Diese Internationale Norm betrifft die Bewertung der Biokompatibilität von in der Zahnheilkunde verwendeten
Medizinprodukten. Sie ist zusammen mit der Normenreihe ISO 10993 anzuwenden. Diese Internationale
Norm enthält spezielle Prüfungen, über die in der Zahnheilkunde viele Erfahrungen vorliegen und die die
speziellen Bedürfnisse der Zahnheilkunde anerkennen.

Es wurden nur die Prüfverfahren einbezogen, von denen die Mitglieder des Komitees der Ansicht waren, dass
veröffentlichte Daten in ausreichendem Maße einbezogen wurden. Bei der Empfehlung von Prüfverfahren
wurde der Notwendigkeit des minimalen Einsatzes von Versuchstieren hohe Priorität eingeräumt. Es ist von
wesentlicher Bedeutung, dass die Entscheidung zur Durchführung von Prüfungen unter Einbeziehung von
Tieren ausschließlich nach einer vollständigen und sorgfältigen Überprüfung der Aussage erfolgt, dass ein
ähnliches Ergebnis durch andere Prüfungen nicht erreicht werden kann. Um die für die Prüfungen
erforderliche Anzahl von Tieren auf einem absoluten Minimum zu halten und dabei die angegebene
Zielstellung zu erreichen kann es angemessen sein, mehr als eine Prüfung an dem gleichen Tier zur gleichen
Zeit durchzuführen, z. B. Pulpa- und Dentin-Anwendungsprüfung und Pulpaüberkappungsprüfung. Dennoch
sind diese Prüfungen in Übereinstimmung mit ISO 10993-2 sowohl auf effiziente als auch humane Weise
durchzuführen. Immer wenn Tierversuche durchgeführt werden, sind diese Prüfungen einfühlsam und in
Übereinstimmung mit den für jede Prüfung beschriebenen normierten Verfahren vorzunehmen.

Diese vorliegende Internationale Norm beschreibt keine speziellen Prüfverfahren für berufsbedingte Risiken.

Die Anhänge B und C wurden aufgenommen, um die Entwicklung von In-vitro- und Ex-vivo-Prüfverfahren zu
fördern, damit der Einsatz von Versuchstieren bei der Beurteilung der Biokompatibilität von in der
Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukten weiter verringert werden kann.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

1 Anwendungsbereich
Diese Internationale Norm legt Prüfverfahren zur Beurteilung der biologischen Wirkungen von in der
Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukten fest. Enthalten sind auch Prüfungen von pharmakologischen
Stoffen, die ein integraler Bestandteil des zu prüfenden Medizinproduktes sind.

Diese Internationale Norm gilt nicht für die Prüfung von Materialien und Produkten, die weder direkt noch
indirekt mit dem Körper des Patienten in Kontakt kommen.

2 Normative Verweisungen
Die folgenden zitierten Dokumente sind für die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten
Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte
Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschließlich aller Änderungen).

ISO 1942, Dentistry — Vocabulary

ISO 6344-1, Coated abrasives — Grain size analysis — Part 1: Grain size distribution test

ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing within a risk
management process

ISO 10993-2, Biological evaluation of medical devices — Part 2: Animal welfare requirements

ISO 10993-3, Biological evaluation of medical devices — Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and
reproductive toxicity

ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity

ISO 10993-6, Biological evaluation of medical devices — Part 6: Tests for local effects after implantation

ISO 10993-10 1), Biological evaluation of medical devices — Part 10: Tests for irritation and skin sensitization

ISO 10993-11, Biological evaluation of medical devices — Part 11: Tests for systemic toxicity

ISO 10993-12:2007, Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference
materials

ISO 14971, Medical devices — Application of risk management to medical devices

1) Wird veröffentlicht.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

3 Begriffe
Für die Anwendung dieses Dokuments gelten die Begriffe nach ISO 1942, ISO 10993-1, ISO 10993-12 und die
folgenden Begriffe.

3.1
Medizinprodukt
alle Instrumente, Apparate, Vorrichtungen, Software, Stoffe oder anderen Gegenstände, die einzeln oder
miteinander verbunden verwendet werden, zusammen mit allem Zubehör, einschließlich der Software, die für
die vom Hersteller vorgesehene medizinische Anwendung am Menschen für folgende Zwecke erforderlich ist:

Erkennung, Verhütung, Überwachung, Behandlung oder Linderung von Krankheiten;


Erkennung, Überwachung, Behandlung, Linderung oder Kompensierung einer Verletzung oder
Behinderung;
Untersuchung, Ersetzung oder Veränderung des anatomischen Aufbaus oder eines physiologischen
Vorgangs;
Empfängnisregelung,

und deren bestimmungsgemäße Hauptwirkung im oder am menschlichen Körper weder durch


pharmakologische oder immunologische Mittel noch metabolisch erreicht wird, deren Wirkungsweise aber durch
solche Mittel unterstützt werden kann

3.2
zahnärztlicher Werkstoff
Werkstoff und/oder Substanz oder Verbindung von Werkstoffen und/oder Substanzen, die speziell für die
Anwendung in der zahnärztliche Praxis und/oder zugehöriger Verfahren zusammengesetzt und hergestellt
wurde

3.3
Endprodukt
Medizinprodukt im „gebrauchsfähigen“ Zustand
ANMERKUNG Viele zahnärztliche Werkstoffe werden in einem frisch angemischten Zustand verwendet, und eine
Beurteilung der Werkstoffe sollte sowohl im frisch angemischten als auch im festem Zustand in Betracht gezogen werden.

3.4
Positivkontrolle
Positivkontrollmaterial
jeder gut charakterisierte Werkstoff und/oder Substanz, der (die) durch Beurteilung mithilfe eines spezifischen
Prüfverfahrens die Eignung des Prüfsystems demonstriert, eine reproduzierbare, entsprechend positive oder
reaktive Wirkung in dem Prüfsystem hervorzurufen

3.5
Negativkontrolle
Negativkontrollmaterial
jeder gut charakterisierte Werkstoff und/oder Substanz, der (die) durch Beurteilung mithilfe eines spezifischen
Prüfverfahrens die Eignung des Prüfsystems demonstriert, eine reproduzierbare, entsprechend negative oder
nicht-reaktive oder minimale Reaktion in dem Prüfsystem hervorzurufen
ANMERKUNG In der Praxis schließen Negativkontrollen Blindbestimmungen, Bindemittel/Lösemittel und Referenz-
werkstoffe ein.

3.6
Referenzmaterial
Material mit einem oder mehreren Eigenschaftswerten, die ausreichend reproduzierbar und gut festgelegt sind,
um die Anwendung des Werkstoffs oder der Substanz zur Kalibrierung eines Geräts, die Bewertung eines
Messverfahrens oder die Zuordnung von Werten zu dem Werkstoff zu ermöglichen
ANMERKUNG Für die Zwecke dieses Dokuments ist ein Referenzmaterial jeder gut charakterisierte Werkstoff oder jede
Substanz, die bei einer Prüfung mithilfe des beschriebenen Verfahrens die Eignung des Verfahrens demonstriert, eine
reproduzierbare, vorhersagbare Reaktion hervorzurufen. Die Reaktion kann negativ oder positiv sein.

7
DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

4 Einteilung der Medizinprodukte

4.1 Einteilung nach der Art des Körperkontaktes

4.1.1 Allgemeines

Für die Zwecke des vorliegenden Dokuments wird die Einteilung von in der Zahnheilkunde verwendeten
Medizinprodukten aus ISO 10993-1 abgeleitet. Wenn ein Produkt oder ein Material in mehr als eine Kategorie
eingeteilt werden kann, so gelten die strengeren Prüfanforderungen. Bei Mehrfachexpositionen müssen für
die Entscheidung, in welche Kategorie ein Produkt eingeteilt werden soll, mögliche kumulative Wirkungen
unter Berücksichtigung der Dauer, über die diese Expositionen vorkommen, in Betracht gezogen werden.

ANMERKUNG In diesem Kontext schließt die Benennung Zahnheilkunde die Mund-Kiefer-Gesichtsumgebung ein.

4.1.2 Medizinprodukte ohne Kontakt zu Körperoberflächen

Diese Medizinprodukte kommen mit dem Körper des Patienten nicht in Berührung, weder direkt noch indirekt
und sind in ISO 10993-1 nicht enthalten.

4.1.3 Medizinprodukte mit Kontakt zu Körperoberflächen

Dazu gehören Medizinprodukte, die die Oberfläche der gesunden oder verletzten oder sonst wie kompromit-
tierten Haut bzw. Mundschleimhaut berühren, und solche Medizinprodukte, die mit den Außenflächen der
Zahnhartsubstanz, einschließlich Schmelz, Dentin und Zement, in Berührung kommen.

ANMERKUNG Dentin und Zement werden als Oberflächen betrachtet, z. B. nach einer Gingivarezession.

4.1.4 Medizinprodukte, die von außen mit dem Körperinneren in Kontakt kommen

Dazu gehören Medizinprodukte, die in die Mundschleimhaut, die Zahnhartsubstanz, das Pulpagewebe oder
den Knochen oder einer Kombination dieser Gewebe eindringen bzw. damit in Kontakt kommen und die dem
Mundmilieu ausgesetzt sind.

ANMERKUNG Diese Gruppe enthält auch alle Arten von Unterfüllungs- oder Basiswerkstoffen, die unter einer
Restauration verwendet werden.

4.1.5 Implantate, die in der Zahnheilkunde verwendet werden

Dazu gehören Medizinprodukte einschließlich der Dentalimplantate und sonstige zahnärztliche Medizin-
produkte, die teilweise oder vollständig in einem oder mehreren der folgenden Gewebe eingesetzt sind:

a) das Weichgewebe, z. B. subperiostale Implantate und subdermale Implantate;

b) den Knochen, z. B. enossale Implantate und Knochenersatz;

c) das Pulpa-Dentin-System des Zahnes, z. B. endodontische Werkstoffe; oder

d) in eine Kombination dieser Gewebe, z. B. transdentale Implantate.

4.2 Einteilung nach der Kontaktdauer

4.2.1 Allgemeines

Für die Zwecke des vorliegenden Dokuments werden die in der Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukte
entsprechend der Kontaktdauer nach ISO 10993-1 und wie in 4.2.2 bis 4.2.4 aufgelistet eingeteilt.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

4.2.2 Produkte im kurzzeitigem Kontakt

Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder wiederholte Anwendung oder Kontaktdauer wahr-
scheinlich bis zu 24 h beträgt.

4.2.3 Produkte im längerem Kontakt

Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder wiederholte Anwendung oder Kontaktdauer


wahrscheinlich über 24 h, aber nicht länger als 30 d dauert.

4.2.4 Produkte im Dauerkontakt

Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder wiederholte Anwendung oder Kontaktdauer über 30 Tage
beträgt.

ANMERKUNG 1 Die Definition von „Dauerkontakt“ soll in dieser Bedeutung ausschließlich nur in diesem Dokument
verwendet werden. Sie stimmt mit der Definition in ISO 10993-1 überein.

ANMERKUNG 2 Für mehrfachen Kontakt mit dem Medizinprodukt sollten bei der Entscheidung über die Einteilung
eines Produktes in eine Kategorie der mögliche kumulative Effekt und der Zeitraum berücksichtigt werden, in dem diese
Kontakte erfolgen.

5 Prozess der biologischen Beurteilung

5.1 Allgemeines

Alle in der Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukte müssen innerhalb des Risikomanagementprozesses


einem strukturierten biologischen Beurteilungsprogramm unterzogen werden (siehe ISO 10993-1). Eine
Anleitung zur Umsetzung dieses Programms wird in ISO 14971 und ISO 10993-1 gegeben. Das biologische
Beurteilungsprogramm muss einen Überblick über die Datensätze zu den biologischen Eigenschaften der in
der Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukte enthalten. Sofern dieser Teil des biologischen Beurteilungs-
programms aufzeigt, dass ein Datensatz oder mehrere Datensätze unvollständig sind und deshalb weitere
Prüfungen erforderlich werden, sollten die Prüfungen aus den in der Normenreihe ISO 10993 oder den in der
vorliegenden Internationalen Norm oder in beiden beschriebenen Verfahren ausgewählt werden. Falls
Prüfungen ausgewählt wurden, die in diesen Internationalen Normen nicht enthalten sind, muss eine Aussage
darüber getroffen werden, dass die in den Internationalen Normen beschriebenen Prüfungen in Erwägung
gezogen wurden. Diese Aussage muss eine Begründung für die Auswahl der anderer Prüfungen enthalten.

Bei Kombinationsprodukten sollte das Endprodukt in Übereinstimmung mit diesem Dokument und in
Zusammenhang mit möglichen anwendbaren Normen beurteilt werden.

ANMERKUNG 1 In diesem Kontext sind Kombinationsprodukte zahnärztliche Medizinprodukte jeder Art, die als
integraler Bestandteil eine Substanz enthalten oder dazu vorgesehen sind, eine zu enthalten, die:
a) bei getrennter Anwendung ein Arzneimittel oder ein biologisches Präparat sein würde; und
b) dazu neigt, im Körper des Patienten die Wirkung des Medizinproduktes zu unterstützen.
Ein Beispiel dafür ist ein Knochenfüllungsmaterial/Augmentationsmaterial mit einem Wachstumsfaktor (d. h. ein biolo-
gisches Produkt).

ANMERKUNG 2 Bei Kombinationsprodukten, bei denen das Medizinprodukt und pharmakologische Bestandteile
getrennt verpackt sind, kann es aufschlussreich sein, die Produktkomponente allein zu prüfen.

5.2 Auswahl der Prüfungen und Gesamtbeurteilung

Die Auswahl der Prüfungen und die Gesamtbeurteilung der Ergebnisse muss von einem Experten
vorgenommen werden, der über entsprechende chemische, physikalische und biologische Daten über das
Medizinprodukt verfügt und der die vorgesehenen Anwendungsbedingungen kennt.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

5.3 Auswahl der Prüfverfahren

Bei der Auswahl der Prüfverfahren müssen folgende Punkte beachtet werden:

a) die beabsichtigte Anwendung des Materials;

b) das bzw. die Gewebe, mit dem/denen das Material möglicherweise in Kontakt kommt (kommen);

c) die Kontaktdauer.

Sofern eine ausgewählte Prüfung in den Internationalen Normen nicht enthalten ist, muss für jedes
Medizinprodukt im Prüfbericht eine Begründung für die Auswahl dieses Prüfverfahrens aufgenommen werden.
Sofern in den Normen mehr als ein Prüfverfahren in der gleichen Kategorie empfohlen wird, sollte die
Auswahl einer Prüfung aus den anderen Verfahren begründet werden.

5.4 Typen von Prüfungen

Entsprechend der Einteilung des Medizinproduktes sind die in Tabelle A.1 zusammengefassten, zur
Anwendung angegebenen Prüfungen zu berücksichtigen. Diese Tabelle gibt an, welche Typen von
Prüfverfahren in Erwägung gezogen werden müssen. Dies bedeutet jedoch nicht, dass es erforderlich ist,
diese Prüfungen durchzuführen. Die Entscheidung, ein in Tabelle A.1 angegebenes Prüfverfahren nicht
durchzuführen, ist im Prüfbericht für jedes Medizinprodukt zu begründen. Die aufgelisteten Typen von
Prüfungen stellen einen Rahmen für die Beurteilung der Biokompatibilität von in der Zahnheilkunde
verwendeten Medizinprodukten dar. Für die meisten Typen von Prüfungen werden bestimmte Verfahren
angegeben, obwohl für einzelne Medizinprodukte andere, in den Internationalen Normen nicht enthaltene
Methoden geeigneter sein können.

Zweckmäßigerweise werden die Prüfungen in drei Gruppen eingeteilt.

a) Gruppe I

Diese Gruppe umfasst In-vitro-Prüfungen auf Zytotoxizität. Eine allgemeine Anleitung für In-vitro-Prüfungen
auf Zytotoxizität wird in ISO 10993-5 gegeben und ist zu befolgen. Genaue Prüfprotokolle für die Agar- oder
Agarosediffusionsprüfung und die Filterdiffusionsprüfung, die für zahnärztliche Werkstoffe geeignet sind, sind
in dieser Internationalen Norm enthalten. Die Verfahren zur In-vitro-Prüfung auf Zytotoxizität beinhalten:

1) die Agardiffusionsprüfung (siehe 6.2);

2) die Filterdiffusionsprüfung (siehe 6.3);

3) Prüfungen bei direktem Kontakt oder Verfahren zur Prüfung von Extrakten nach ISO 10993-5;

4) die Dentin-Barriere-Zytotoxizitätsprüfung (siehe Anhang B);

5) das Zahnscheibenmodell.

ANMERKUNG 1 Die Reihenfolge dieser Auflistung ist willkürlich gewählt und bedeutet keine Bevorzugung eines
Prüfverfahrens.

ANMERKUNG 2 Die Auflistung bedeutet nicht, dass alle aufgeführten Zytotoxizitätsprüfungen für jedes zu bewertende
Medizinprodukt durchgeführt werden müssen.

ANMERKUNG 3 Die Anwendung der Dentin-Barriere-Prüfung wird unterstützt, und eine Beschreibung dieser Prüfung
ist in Anhang B enthalten. Ein anderes Vorgehen ist das Zahnscheibenmodell. Verweisungen auf diese Prüfung sind in
den Literaturhinweisen enthalten.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

b) Gruppe II

Diese Gruppe umfasst Prüfungen nach der Normenreihe ISO 10993, und bestimmte Prüfverfahren, falls
geeignet, werden angegeben:

1) akute systemische Toxizität – orale Applikation – nach ISO 10993-11;

2) akute systemische Toxizität – Applikation durch Inhalation – nach ISO 10993-11;

3) subakute und subchronische systemische Toxizität – orale Applikation – nach ISO 10993-11;

4) Hautreizung und intrakutane Reaktivität nach ISO 10993-10;

5) verzögerte Hypersensibilität nach ISO 10993-10;

6) Genotoxizität nach ISO 10993-3;

7) lokale Effekte nach Implantation nach ISO 10993-6.

ANMERKUNG 1 Um die Anwendung der neuesten Ausgabe eines verwiesenen Dokuments zuzulassen, ist nur ein
undatierter Verweis möglich. Eine Angabe des entsprechenden Abschnitts und Unterabschnitts ist nur bei datierten
Verweisungen möglich. Deshalb wird der Anwender dieser Internationalen Norm aufgefordert, die verwiesenen
Dokumente auf die entsprechenden Abschnittsnummern hin zu überprüfen.

ANMERKUNG 2 Angaben zur Prüfung auf akute Toxizität werden in Anhang C gegeben.

ANMERKUNG 3 Bei der Beurteilung von Materialien, die mineralisierte Gewebe enthalten, nach einer lokalen
Implantation nach ISO 10993-6, wird zusätzlich zur routinemäßigen Prüfung der demineralisierten Schnitte eine Prüfung
der nicht demineralisierten Schnitte empfohlen.

c) Gruppe III

Diese Gruppe umfasst Prüfungen, die speziell für die in der Zahnheilkunde verwendeten Medizinprodukte
vorgesehen sind, und die in der Normenreihe ISO 10993 nicht erwähnt sind:

1) Pulpa- und Dentin-Anwendungsprüfung (siehe 6.4);

2) Pulpaüberkappungsprüfung (sieh 6.5);

3) endodontische Anwendungsprüfung (siehe 6.6).

ANMERKUNG Sofern zutreffend, sollte eine Anwendungsprüfung eines Dentalimplantatsystems nach ISO/TS 22911
ebenfalls berücksichtigt werden.

5.5 Erneute Beurteilung der Biokompatibilität

In Übereinstimmung mit ISO 10993-1 muss für ein Medizinprodukt eine erneute Beurteilung der Biokompati-
bilität nach 5.4 durchgeführt werden, wenn Überarbeitungen oder Modifikationen der Zusammensetzung,
Qualität und/oder Leistungsangaben vorgenommen werden.

6 Spezielle Prüfverfahren für zahnärztliche Werkstoffe


6.1 Empfehlungen zur Probenherstellung
6.1.1 Allgemeines

Diese Empfehlungen wurden für in vitro Prüfungen entwickelt, können aber auch für andere Zwecke
verwendet werden, wenn sie dafür geeignet sind.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

6.1.2 Allgemeine Empfehlungen zur Probenherstellung

Für die Herstellung von Prüfkörpern sind die entsprechenden Produktnormen und/oder die jeweiligen
Gebrauchsanweisungen einzusehen und diesen Beschreibungen ist möglichst genau Folge zu leisten. Jede
Abweichung von den Angaben in der Gebrauchsanweisung muss begründet werden. Eine genaue
Beschreibung der Probenherstellung muss in den Prüfbericht aufgenommen werden. Die folgenden Faktoren
(z. B. Umweltfaktoren) müssen bei der Betrachtung der Endanwendung des Medizinprodukts berücksichtigt
werden:

a) Temperatur;
b) Luftfeuchte;
c) Lichtexposition: Prüfkörper aus lichtempfindlichen Werkstoffen sollten unter der Voraussetzung
hergestellt werden, dass das Umgebungslicht diese nicht aktiviert;
d) Material der Form zur Herstellung der Prüfkörper: Es ist sicherzustellen, dass das Material für die
Form zur Herstellung der Prüfkörper und ein mögliches anzuwendendes Gleitmittel den Abbindeprozess
des Werkstoffs nicht stören;
ANMERKUNG Geeignete Materialien können halbtransparente oder weiße Kunststoffmaterialien sein, wie
Polyethylen oder Polytetrafluorethylen (PTFE).

e) Sauerstoffexposition: Für Werkstoffe, die während des Aushärtens eine sauerstoffinhibierende


Oberflächenschicht bilden, ist sicherzustellen, dass die Form für den Prüfkörper während des Aushärtens
entsprechend abgedichtet ist;
f) Sterilisation: Prüfkörper sollten entweder unter aseptischen Bedingungen hergestellt oder mit dem für
den Werkstoff geeigneten Verfahren sterilisiert werden, sofern dies erforderlich und möglich ist. Es ist
sicherzustellen, dass die Sterilisation den Werkstoff nicht angreift (z. B. durch das Eluieren von
Substanzen aus dem Werkstoff);
g) Verhältnis von Probenoberfläche zu Zellschichtoberfläche oder zum Zellkulturmedium: Das
Verhältnis der Probenoberfläche zu Zellschichtoberfläche oder zum Zellkulturmedium ist zu
dokumentieren. Die Auswahl der Form und Probenoberfläche sowie das angewandte Verhältnis von
Probenoberfläche zur Zellschichtoberfläche oder zum Zellkulturmedium ist zu begründen.
h) Extrakte: Sofern für die Durchführung einer Prüfung Extrakte erforderlich sind, müssen die Proben nach
ISO 10993-12:2007, Abschnitt 10 hergestellt werden.
6.1.3 Besondere Empfehlungen für lichthärtende Werkstoffe

Die folgenden Faktoren müssen bei der Betrachtung der Endanwendung von lichthärtenden Werkstoffen
berücksichtigt werden:

a) Material der Form zur Herstellung der Prüfkörper: Der Reflexionskoeffizient des Materials, das für die
Form zur Herstellung der Prüfkörper verwendet wird, sollte so genau wie möglich dem Dentin
entsprechen, damit die klinische Situation möglichst genau abgebildet wird.
ANMERKUNG Geeignete Materialien können halbtransparente oder weiße Kunststoffmaterialien sein, wie
Polyethylen oder PTFE.

b) Lichtexposition: Die Lichthärtung sollte so erfolgen, damit die klinischen Anwendung möglichst genau
abgebildet wird. Die Bebrauchsanweisung des Herstellers sollte eingehalten werden, damit der gleiche
Aushärtungsgrad wie in der praktischen Anwendung erreicht wird. Dies wird oft eine Lichthärtung nur von
einer Seite erfordern, aber manchmal auch eine zweiseitige Aushärtung mit sich bringen. Das
Aushärteverfahren ist material- und/oder prozessspezifisch. Sofern vollständig ausgehärtete Prüfkörper
für die Prüfung benötigt werden, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Prüfkörper nach der Entnahme
aus der Form homogen sind. Bei Einkomponenten-Werkstoffen sollten bei Betrachtung ohne
Vergrößerung keine Hohlräume, Spalten oder Luftblasen vorhanden sein. Angaben über die verwendete
Lichtquelle sollten erfolgen (Lichtstärke, Aushärtungsdauer, spektrale Verteilung des aushärtenden
Lichtes und die Art des Lichtpolymerisationsgerätes sollten dokumentiert werden). Insbesondere ist
sicherzustellen, dass die Lichtquelle für die zu prüfenden Werkstoffe empfohlen wurde und dass sich
diese in einem zufriedenstellenden Betriebszustand befindet.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

c) Sauerstoffexposition: Bei Werkstoffen, die während des Lichthärtens eine sauerstoffinhibierende


Oberflächenschicht bilden können, sollten während des Lichthärtens beide Enden der Form mit
transparenten, sauerstoffsundurchlässigen Materialien (z. B. eine Polyesterfolie) bedeckt werden. Sofern
vom Hersteller für den Werkstoff nach dem Aushärten eine Oberflächennachbearbeitung empfohlen wird,
sollten die Prüfkörperoberflächen mit einer in der klinischen Anwendung üblichen Vorgehensweise
beschliffen und poliert werden. Sofern derartige Anweisungen nicht vorliegen, sollten die Prüfkörper an
beiden Enden mit Schleifpapier der Körnung P2 000 nach ISO 6344-1 beschliffen werden, nachdem sie
zuerst auf das transparente, sauerstoffundurchlässige Barrierematerial gelegt wurden.

6.1.4 Besondere Empfehlungen für chemisch abbindende Werkstoffe

Die folgenden Faktoren müssen bei der Betrachtung der Endanwendung von chemisch abbindenden
Werkstoffen berücksichtigt werden:

a) Anmischen: Es ist ausreichend Werkstoff anzumischen, um sicherzustellen, dass jeder Prüfkörper aus
einer Mischung hergestellt wird. Für jeden Prüfkörper ist eine neue Mischung herzustellen. Das
Anmischen muss in Übereinstimmung mit den entsprechenden Produktnormen, falls anwendbar,
durchgeführt werden.

b) Sauerstoffexposition: Bei Werkstoffen, die während des chemischen Aushärtens eine


sauerstoffinhibierende Oberflächenschicht bilden, sollten während des Aushärtens beide Enden der Form
mit sauerstoffundurchlässigen Materialien (z. B. einer Polyesterfolie) bedeckt werden. Sofern vom
Hersteller für den Werkstoff nach dem Aushärten eine Oberflächennachbearbeitung empfohlen wird,
sollten die Prüfkörperoberflächen mit einer in der klinischen Anwendung üblichen Vorgehensweise
beschliffen und poliert werden. Sofern derartige Anweisungen nicht vorliegen, sollten die Prüfkörper an
beiden Enden mit Schleifpapier der Körnung P2 000 nach ISO 6344-1 beschliffen werden, nachdem sie
zuerst auf das sauerstoffundurchlässige Barrierematerial gelegt wurden.

6.1.5 Positivkontrolle

Sowohl für in vitro als auch für in vivo-Prüfungen ist es sinnvoll, eine genormte Positivkontrolle
einzuschließen, die wie das zu prüfende Material behandelt und verarbeitet wird (d.h. nach dem Mischen im
plastischen Zustand und dann abbindend erhärtend) und die auf frei verfügbaren Chemikalien oder
Materialien beruht. Solch eine Positivkontrolle für in vitro Prüfungen von plastischen Werkstoffen wird in
Anhang B, Tabelle B.1 beschrieben. Die Anwendung dieser speziellen Positivkontrolle ist optional und andere
Positivkontrollen mit validierten historischen oder anderen Daten zur reproduzierbaren Toxizität können
stattdessen verwendet werden."

6.2 Agardiffusionsprüfung

6.2.1 Ziel

Das Ziel dieser Prüfung ist es, die unspezifische Zytotoxizität der zu prüfenden Werkstoffe nach Diffusion
durch Agar oder Agarose nachzuweisen. Dieses Prüfverfahren ist nicht geeignet für herauslösbare
Bestandteile, die durch Agar oder Agarose nicht diffundieren.

6.2.2 Zelllinie

Verwendet wird eine Fibroblasten- oder Epithelzelllinie, die leicht zu beziehen ist [z. B. von der American Type
Culture Collection (ATCC), siehe http://www.atcc.org] 2). Im Prüfbericht ist die Identifikationsnummer der
Zelllinie, falls vorhanden, die Beschreibung und Bezeichnung der verwendeten Zelllinie sowie eine
Begründung für die Auswahl anzugeben.

2) Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine
Anerkennung des genannten Produkts durch die ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie
nachweislich zu identischen Ergebnissen führen.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

6.2.3 Kulturmedium, Reagenzien und Ausrüstung

Das für die ausgewählte Zelllinie festgelegte Kulturmedium muss verwendet werden. Durch Filtration wird
sterilisiert. Um den Agar herzustellen, wird das Kulturmedium doppelt konzentriert zubereitet. Durch Filtration
wird sterilisiert. Es wird entweder 3%iger Agar oder eine 3%ige Agarose hergestellt. Durch Autoklavieren wird
sterilisiert.

Der Vitalfarbstoff wird durch Verdünnung einer Stammlösung von 1 % wässriger Neutralrot-Lösung
(Bezugsquelle angeben) 1/100fach mit 0,01 ml/I Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (z. B.
Dulbecco’s Phosphat gepufferte physiologische Kochsalzlösung 3) unmittelbar vor der Anwendung verdünnt.
Die Neutralrot-Lösungen müssen vor Lichteinstrahlung geschützt gelagert werden. Verwendet werden
Zellkulturplatten mit 6 Aussparungen (6-Well) mit 35 mm Innendurchmesser oder für Zellkulturen geeignete
Petrischalen mit einem Nenndurchmesser von 50 mm bis 100 mm.

6.2.4 Probenvorbereitung

Die Proben sind nach 6.1 herzustellen. Die Prüfung ist entweder an einem Extrakt des Werkstoffes und/oder
am Werkstoff selbst, entsprechend der Anleitung in ISO 10993-5, durchzuführen.

a) Für feste Werkstoffe werden runde Prüfkörper mit einem Durchmesser von etwa 5 mm und einer flachen
Oberfläche vorbereitet, um einen ausreichenden Kontakt mit der Agarschicht zu garantieren.

b) Für abbindende Werkstoffe wird der frisch angemischte Werkstoff in Ringe mit einem Innendurchmesser
von 5 mm und einer Höhe von 2 mm eingebracht. Das Material, aus dem die Ringe bestehen, muss im
Prüfbericht angegeben werden. Bei der Prüfung von Werkstoffen in frisch angemischtem Zustand werden
die Ringe auf den Agar gelegt, bevor der Werkstoff eingebracht wird. Bei der Prüfung nach
verschiedenen Abbindezeiten werden die Ringe so gefüllt, dass der Werkstoff eben mit dem Rand
abschließt. Die Abbindung erfolgt bei (37 2) °C und einer relativen Luftfeuchte von (90 10) %, bis der
Werkstoff zur Prüfung bereit ist.

c) Für flüssige Werkstoffe oder Extrakte wird 0,01 ml Flüssigkeit auf eine auf den Agar gelegte Filterscheibe
aus Borosilicatmikroglas von 5 mm Durchmesser pipettiert.

ANMERKUNG 1 Geeignete inerte Materialien sind Glas oder PTFE.

ANMERKUNG 2 Geeignete Filterscheiben können aus Vorfiltern hergestellt werden.

6.2.5 Kontrollen

Für die Prüfung müssen Positivkontrollen, Negativkontrollen und Referenzmaterialien verwendet werden.

6.2.6 Durchführung der Prüfung

Die Zellen werden bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Das geeignete Volumen
(z. B. 10 ml für eine Petrischale mit 100 ml) der Zellsuspension (2,5 ! 105 Zellen/ml) wird in eine ausreichende
Anzahl von Petrischalen pipettiert und bei (37 2) °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit einem
Kohlendioxidgehalt von 5 % (Volumenanteil) für 24 h inkubiert. Wenn für die Kultivierung der Zellkultur davon
abweichende Bedingungen verwendet werden, muss dies im Prüfbericht begründet werden.

Der sterile Agar oder die sterile Agarose wird im Wasserbad auf 100 °C erhitzt und danach auf 48 °C
abgekühlt. Ein Teil des Agar bzw. der Agarose wird mit einem Teil des 2fach konzentriertem, frisch
zubereitetem Kulturmedium vermischt und auf 48 °C erwärmt. Von jeder Petrischale wird das flüssige
Kulturmedium abgesaugt und durch 10 ml frisch zubereitete Agar- oder Agarose/Kulturmedium-Mischung
ersetzt.

3) Dulbecco ist ein Warenzeichen. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm
und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch die ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet
werden, wenn sie nachweislich zu identischen Ergebnissen führen.

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Diese Agar- oder Agarose/Kulturmedium-Mischung lässt man bei Raumtemperatur gelieren (etwa 30 min).
10 ml Neutralrot-Lösung wird hinzugefügt und für 15 min bis 20 min im Dunkeln gelassen. Die überschüssige
Neutralrot-Lösung wird abgesaugt.

Die Zellkultur ist bei Anwesenheit von Neutralrot vor Lichteinstrahlung zu schützen, da die Zellen geschädigt
werden können.

Auf jede Petrischale wird eine geeignete Anzahl von Proben des zu prüfenden Werkstoffes und der Kontrollen
mit einem angemessenen Abstand (> 20 mm) zwischen zwei Proben, sofern zutreffend, gelegt. Sie werden
bei (37 2) °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit einem Kohlendioxidgehalt von 5 % (Volumenanteil)
für 24 h inkubiert. Jeder zu prüfende Werkstoff ist mindestens in vierfacher Ausfertigung zu untersuchen (d. h.
2 Schalen je Werkstoff).

6.2.7 Beurteilungskriterien

Die Entfärbungszone, die die zu prüfenden Werkstoffe und die Kontrollen umgibt, ist mithilfe eines
Umkehrmikroskops mit einem kalibrierten Raster zu beurteilen. Dabei wird für jeden Prüfkörper ein
Entfärbungs- und ein Lysis-Index nach den in Tabelle 1 und Tabelle 2 festgelegten Kriterien bestimmt.

Tabelle 1 — Entfärbungs-Index

Entfärbungs-Index Beschreibung
0 Keine erkennbare Entfärbungszone um oder unter dem Prüfkörper
1 Die Entfärbungszone ist auf die Fläche unter dem Prüfkörper begrenzt
2 Die Entfärbungszone um den Prüfkörper ist kleiner als 0,5 cm
3 Die Entfärbungszone um den Prüfkörper ist zwischen 0,5 cm und 1,0 cm
Die Entfärbungszone um den Prüfkörper ist größer als 1,0 cm, umfasst aber nicht
4
die gesamte Zellkultur
5 Die Entfärbungszone umfasst die gesamte Zellkultur

Tabelle 2 — Lysis-Index

Lysis-Index Beschreibung der Entfärbungszone


0 Keine erkennbare Zytotoxizität
1 < 20 % der Entfärbungszone sind betroffen
2 20 % bis < 40 % der Entfärbungszone sind betroffen
3 40 % bis < 60 % der Entfärbungszone sind betroffen
4 60 % bis 80 % der Entfärbungszone sind betroffen
5 > 80 % der Entfärbungszone sind betroffen

Für jeden zu prüfenden Werkstoff wird der Median für den Entfärbungs-Index und der Median für den Lysis-
Index separat berechnet. Weichen die Indexwerte für die vier Replikate des zu prüfenden Werkstoffes um
mehr als 2 Einheiten im Bereich von 0 bis 3 ab, muss die Prüfung wiederholt werden. Bei Indexwerten von 4
und 5 ist keine Wiederholung notwendig. Bei der Prüfung von Extrakten wird der Median des Index für das
Extraktionsmedium allein vom Median des Index für das Extraktionsmediums, das den zu prüfenden
Werkstoff enthält, subtrahiert, um den Index für den zu prüfenden Werkstoff allein zu erhalten. Ist der Median
des Index für das Extraktionsmedium, das als Kontrolle dient, größer als 1, so ist die Prüfung mit einem
anderen Extraktionsmedium zu wiederholen.

ANMERKUNG Für eine gültige Prüfung sollte die Zellschicht unter der Negativkontrolle intakt sein.

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6.2.8 Beurteilung der Ergebnisse

Alle Informationen, die während der Prüfung gesammelt werden, insbesondere alle Abweichungen in den
Ergebnissen zwischen der Prüfgruppe und der Kontrollgruppe, sind für die Beurteilung der Prüfergebnisse zu
berücksichtigen. Die Zellreaktion basiert auf dem Median für den Entfärbungs-Index und für den Lysis-Index
von mindestens vier Wiederholungen der Prüfungen. Die Zellreaktion muss für jeden Parameter separat
entsprechend Tabelle 3 beurteilt werden:

Tabelle 3 — Zellreaktion
(separat eingeteilt für den Entfärbungs-Index und den Lysis-Index)
und Interpretation der Zytotoxizität

Skala Zellreaktion Interpretation


0 0 nicht zytotoxisch
1 1 schwach zytotoxisch
2 2 bis 3 mäßig zytotoxisch
3 4 bis 5 stark zytotoxisch

Die Ergebnisse der Bewertung sind in den Prüfbericht aufzunehmen.

ANMERKUNG Es sollte berücksichtigt werden, dass bei der Interpretation von Daten aus Zellkulturprüfungen die
Grenzen dieses Prüfsystems berücksichtigt werden müssen; d. h. ein zytotoxischer Werkstoff ist nicht per se ungeeignet,
aber die Daten müssen für jede spezielle Anwendung beurteilt werden.

6.2.9 Prüfbericht

Die Ergebnisse sind in einem Prüfbericht festzuhalten, der eine vollständige Aufzeichnung aller durchge-
führten Prüfungen, der erzielten Ergebnisse und weitere andere Daten beinhaltet, die für die Beurteilung der
Ergebnisse benötigt werden. Genaue Angaben über die Vorbereitung und Anwendung des geprüften
Werkstoffes, zusammen mit der Losnummer des Werkstoffes sind ggf. hinzuzufügen.

6.3 Filterdiffusionsprüfung

6.3.1 Ziel

Das Ziel dieser Prüfung ist es, die unspezifische Zytotoxizität der zu prüfenden Werkstoffe nach Diffusion
durch einen Zelluloseacetat-Filter nachzuweisen.

6.3.2 Zelllinie

Verwendet wird eine etablierte Fibroblasten- oder Epithelzelllinie, die leicht zu beziehen ist [z. B. von der
American Type Culture Collection (ATCC), siehe http://www.atcc.org]. Im Prüfbericht ist die Identifikations-
nummer der Zelllinie, falls vorhanden, die Beschreibung und Bezeichnung der verwendeten Zelllinie sowie
eine Begründung für die Auswahl anzugeben.

6.3.3 Kulturmedium, Reagenzien und Ausrüstung

Das Kulturmedium und der Agar oder die Agarose sind, wie in 6.2.3 beschrieben, für eine Überschichtung
anzusetzen. Die Lösungen sind entweder für eine Färbung mit Succinatdehydrogenase oder für eine
unspezifische Färbung mit Hydrolase herzustellen.

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Für die Färbung mit Succinatdehydrogenase sind folgende Stammlösungen vorzubereiten:

a) Succinat Lösung, 13,6 g Natriumsuccinat in 100 ml Phosphatpuffer mit 0,2 mol/l, pH 7,6;

b) Nitroblau-Tetrazoliumchlorid Lösung, 100 mg Nitroblau-Tetrazoliumchlorid in 100 ml Phosphatpuffer


mit 0,2 mol/l, pH 7,6;

c) Phenazin Methosulfat Lösung, 4 mg Phenazin Methosulfat in 10 ml, frisch angesetztem destilliertem


Wasser.

Es wird eine Färbelösung aus 1 ml Succinat-Lösung, 9 ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid-Lösung und 1 ml


Phenazin Methosulfat Lösung hergestellt.

Für eine unspezifische Färbung mit Hydrolase wird eine Stammlösung Fluoresceindiacetat hergestellt mit
5 mg Fluoresceindiacetat in 1 ml Azeton. Für den Gebrauch werden 20 µl der Stammlösung in 100 ml
Phosphat gepufferte physiologische Kochsalzlösung (z. B. Dulbecco’s Phosphat gepufferte physiologische
Kochsalzlösung) gegeben. Verwendet werden Petrischalen mit einem Nenndurchmesser von 60 mm, die für
Gewebekulturen geeignet sind.

Es sind Filter aus einer Mischung aus Zelluloseazetat und Zellulosenitrat mit 47 mm Durchmesser und einer
Porengröße von 0,45 µm zu verwenden. 4)

6.3.4 Probenvorbereitung

Die Proben sind, wie in 6.1 beschrieben, vorzubereiten. Die Prüfung ist entweder an einem Extrakt des
Werkstoffs oder an dem Werkstoff selbst entsprechend der Anleitung in ISO 10993-5 durchzuführen.

a) Für feste Werkstoffe werden runde Prüfkörper mit einem Durchmesser von etwa 5 mm und einer flachen
Oberfläche vorbereitet, um einen ausreichenden Kontakt mit dem Filter sicherzustellen. Die Masse der
Prüfkörper darf nicht mehr als 3,5 g betragen.

b) Für abbindende Werkstoffe wird der frisch angemischte Werkstoff in Ringe mit einem Innendurchmesser
von 5 mm und einer Höhe von 2 mm eingebracht. Bei der Prüfung der Werkstoffe in frisch angemischtem
Zustand werden die Ringe auf den Filter gelegt, bevor der Werkstoff eingebracht wird. Bei der Prüfung
nach verschiedenen Abbindezeiten werden die Ringe so gefüllt, dass der Werkstoff eben mit dem Rand
abschließt. Die Abbindung erfolgt bei (37 2) °C und einer relativen Luftfeuchte von (90 10) %, bis der
Werkstoff zur Prüfung bereit ist. Die Masse der Prüfkörper darf nicht mehr als 3,5 g betragen.

ANMERKUNG Geeignete inerte Materialien können Glas oder PTFE sein.

c) Für flüssige Prüfkörper oder Extrakte wird 0,01 ml Flüssigkeit auf eine auf den Agar gelegte Filterscheibe
aus Borosilicatmikroglas von 5 mm Durchmesser pipettiert.

ANMERKUNG Geeignete Filterscheiben können aus Vorfiltern hergestellt werden.

6.3.5 Kontrollen

Für die Prüfung müssen Positivkontrollen, Negativkontrollen und Referenzmaterialien verwendet werden.

4) Millipore HATF 04700 ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Angabe dient nur
zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung dieses
Produktes durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu
identischen Ergebnissen führen.

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

6.3.6 Durchführung der Prüfung

Die Zellen werden bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Die Zelluloseacetat-Filter
werden auf den Boden einer ausreichenden Anzahl von Petrischalen gelegt. 6 ml Zellsuspension (2,5 105
Zellen/ml) werden in jede Petrischale pipettiert und bei (37 ! 2) °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit
einem Kohlendioxidgehalt von 5 % (Volumenanteil) für 24 h inkubiert. Wenn für die Kultivierung der Zellkultur
davon abweichende Bedingungen verwendet werden, muss dies im Prüfbericht begründet werden. 5 ml einer
frisch angesetzten Agar- oder Agarose-/Kulturmedium-Mischung (siehe 6.2.6), die bei 48 °C aufbewahrt
wurde, werden in eine ausreichende Anzahl von Petrischalen pipettiert. Danach lässt man sie bei
Raumtemperatur gelieren. Das überschüssige Kulturmedium wird aus den mit Zelluloseacetat-Filtern
besetzten Petrischalen abgesaugt. Die Filter werden mit Phosphat gepufferter physiologische Kochsalzlösung
(z. B. Dulbecco’s Phosphat gepufferte physiologische Kochsalzlösung) bei (37 ! 2) °C gewaschen und auf die
Oberfläche des Agars oder der Agarose mit der Zellseite nach unten gelegt. Drei bis fünf Prüfkörper werden
auf die Oberfläche des Filters in jede Petrischale appliziert und für weitere 2 h bei (37 ! 2) °C in einer
wassergesättigten Atmosphäre mit einem Kohlendioxidgehalt von 5 % (Volumenanteil) inkubiert. Es ist
sicherzustellen, dass die Prüfkörper in engem Kontakt mit der Filteroberfläche stehen. Der Nachweis der
Zytotoxizität muss nach Expositionszeiten von 2 h und 24 h bewertet werden. In jede Petrischale wird eine
Positivkontrolle und eine Negativkontrolle gelegt. Zusätzlich sind weitere Kontrollen erforderlich: ein Filter mit
einer Zellschicht, jedoch ohne Prüfkörper, sowie ein Filter ohne Zellen, jedoch mit Prüfkörpern. Bei der
Prüfung von Extrakten muss eine Kontrolle mit dem Extraktionsmedium allein verwendet werden. Jeder
Prüfkörper muss mindestens in 4facher Ausfertigung geprüft werden.

Nach der Inkubation werden die Prüfkörper entfernt und der Filter wird vorsichtig vom Agar oder der Agarose
gelöst. Der Bereich reduzierter Zellenzymaktivität wird zytochemisch mit Verfahren A oder Verfahren B
beurteilt.

a) Verfahren A

Die Succinatdehydrogenase (EC 1.3.99.1) wird nach dem Verfahren von Barka und Anderson [14]
nachgewiesen. Die Inkubationszeit beträgt 3 h bei (37 ! 2) °C. Der Filter wird in destilliertem Wasser
gewaschen und vor der Messung an der Luft getrocknet.

ANMERKUNG Das Anhaften der Zellen kann durch Fixieren der Zellen mit 10 % Neutralformalin für 15 min vor dem
Waschen in destilliertem Wasser unterstützt werden.

b) Verfahren B

Die unspezifische Hydrolase wird durch Inkubation mit einer Fluoresceindiacetatlösung für 30 min bei 4 °C
nachgewiesen. Der Filter wird unter ultraviolettem Licht untersucht.

6.3.7 Beurteilung der Zellschädigung

Die Zellschädigung wird entweder

a) durch die Messung der Entfärbungszone (z. B. mit Hilfe eines Bildanalysesystems) oder

b) durch die Anwendung der in Tabelle 4 festgelegten Skala beurteilt.

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Tabelle 4 — Beurteilung der Zellschädigung

Skala Beurteilung Bereich der Entfärbung


0 Kein Unterschied in der Farbintensität über den gesamten Filter Keine
Eine Zone reduzierter Farbintensität oder eine entfärbte Zone mit
1 einem Durchmesser, der kleiner als der Durchmesser des < 20 mm2
Prüfkörpers (5 mm) ist
2 Eine entfärbte Zone mit einem Durchmesser von 5 mm bis 7 mm 20 mm2 bis 40 mm2
3 Eine entfärbte Zone mit einem Durchmesser von über 7 mm > 40 mm2

ANMERKUNG Die Filter unter den Negativkontrollen und die Kontrollfilter sollten einheitlich dunkelblau (wenn
Succinatdehydrogenase verwendet wird) oder hellgrün (wenn unspezifischer Hydrolase verwendet wird) gefärbt sein. Die
Kontrollfilter ohne Zellen erlauben es, eine möglichen Wirkung des Prüfkörpers auf den Filter festzustellen.

6.3.8 Beurteilung der Ergebnisse

Alle in der Prüfung gesammelten Informationen, insbesondere alle Abweichungen in den Ergebnissen
zwischen den Prüfgruppen und den Kontrollen, sind bei der Beurteilung der Prüfergebnisse zu
berücksichtigen. Eine sinnvolle Vorgehensweise zur Einstufung der zu prüfenden Werkstoffe wird in Tabelle 5
dargestellt.

Tabelle 5 — Einstufung des zu prüfenden Werkstoffs

Index der
Beschreibung der Entfärbungszone
Zellschädigung
0 nicht zytotoxisch
1 schwach zytotoxisch
2 mäßig zytotoxisch
3 stark zytotoxisch

Die Ergebnisse der Bewertung sind in den Prüfbericht aufzunehmen.

ANMERKUNG Es sollte berücksichtigt werden, dass bei der Interpretation von Daten aus Zellkulturprüfungen die
Grenzen dieses Prüfsystems berücksichtigt werden müssen; d. h. ein zytotoxischer Werkstoff ist nicht per se ungeeignet,
aber die Daten müssen für jede spezielle Anwendung beurteilt werden.

6.3.9 Prüfbericht

Die Ergebnisse sind in einem Prüfbericht festzuhalten, der eine vollständige Aufzeichnung aller durchge-
führten Prüfungen, der erzielten Ergebnisse und weitere andere Daten beinhaltet, die für die Beurteilung der
Ergebnisse benötigt werden. Genaue Angaben über die Vorbereitung und Anwendung des geprüften Werk-
stoffes, zusammen mit der Losnummer des Werkstoffes sind ggf. hinzuzufügen.

6.4 Pulpa- und Dentin-Anwendungsprüfung

6.4.1 Ziel

Das Ziel dieser Prüfung ist es, die Biokompatibilität von zahnärztlichen Werkstoffen zu beurteilen, die im
Kontakt mit dem Dentin und der Pulpa stehen. Verfahren, die für die empfohlene klinische Anwendung des
Werkstoffes erforderlich sind, sind in die Beurteilung einzubeziehen.

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6.4.2 Tiere und Tierschutz

Zum Schutz der Tiere sind entweder einzuhalten

a) ISO 10993-2, oder

b) nationale gesetzliche Bestimmungen für Labortiere.

ANMERKUNG 1 Die Tiere sollten nach ISO 10993-2 gehalten werden und freien Zugang zu Futter und Wasser haben.

Säugetiere aus nur einer Gattung (aber keine Nagetiere) sind zu verwenden. Das Alter der Tiere sollte so
gewählt werden, dass ihr Gebiss intakte permanente Zähne mit abgeschlossenem Wurzelwachstum aufweist.

Affen, Hunde, Frettchen oder Minischweine sind geeignete Gattungen. Andere Gattungen können für
spezielle Zwecke geeignet sein. Die ausgewählte Gattung sollte die zur Erfüllung der wissenschaftlichen
Zielstellung erforderliche niedrigste Gattung bei geringster Beeinträchtigung des Tierschutzes sein. Die
Auswahl der Gattung muss begründet und dokumentiert werden.

ANMERKUNG 2 Affen, Hunde und Minischweine sind geeignet, wenn alle permanenten Zähne, außer M3,
durchgebrochen sind. Frettchen sind geeignet, wenn die vier permanenten Eckzähne durchgebrochen sind, da nur diese
Zähne zur Prüfung geeignet sind.

6.4.3 Durchführung der Prüfung

6.4.3.1 Vorbereitung der Tiere

Es wird eine ausreichende Anzahl von Tieren ausgewählt, um mindestens sieben Zähne mit dem Prüfwerk-
stoff für jeden Zeitraum zur Verfügung zu haben.

Die Tiere werden betäubt, und die Behandlung der Zähne wird nach 6.4.3.2 vorgenommen.

6.4.3.2 Behandlung der Zähne

6.4.3.2.1 Alle Konkremente und Zahnbeläge werden von den Zahnoberflächen entfernt. Die Oberflächen
der Zähne, die behandelt werden sollen, werden gereinigt und desinfiziert indem sie mit 3 % (Volumenanteil)
Wasserstoffperoxid abgetupft und anschließend mit einem Desinfektionsmittel, das aus Polyvidon-lod
(Povidon-Iod) oder Chlorhexidin besteht, desinfiziert werden. Die erforderliche Anzahl an bukkalen oder
labialen Kavitäten der Klasse V werden mit scharfen Bohrern und ausreichendem Luft-Wasser-Spray
präpariert. Alle Kavitäten sind so tief zu präparieren, dass die Restdentindicke weniger als 1,0 mm und
vorzugsweise weniger als 0,5 mm beträgt, jedoch die Pulpa nicht freigelegt wird. Die Kavitäten werden mit
Wasser gespült und mit Wattepellets getrocknet, es sei denn, die Einsetzmethode des Prüfwerkstoffs erfordert
ein anderes Vorgehen.

ANMERKUNG 1 Weist das Gebiss der Tiere eine ausgeprägte Gingivaentzündung auf, so kann es notwendig sein, die
Konkremente und Zahnbeläge einige Tage vor der Kavitätenpräparation zu entfernen und dies eventuell mehrmals zu
wiederholen, bis die Gingivaentzündung unter Kontrolle ist.

ANMERKUNG 2 Elektrische Impedanzmessgeräte, wie zum Beispiel ein Apexlokalisator, können vorkalibriert und
verwendet werden um die verbleibende Dentindicke während der Kavitätenpräparation abzuschätzen.

6.4.3.2.2 Bei der Vorbereitung der zu prüfenden Werkstoffe ist die Gebrauchsanweisung einzuhalten.
Empfiehlt der Hersteller des zu prüfenden Werkstoffes dessen Anwendung mit einem Unterfüllungswerkstoff
oder einem Kavitätenbehandlungsmittel (z. B. einem Dentinadhäsiv), so sind diese zusätzlichen Verfahren
nach den Herstellerangaben durchzuführen.

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

6.4.3.2.3 Für jeden Zeitraum sind mindestens sieben Kavitäten mit dem zu prüfenden Werkstoff und vier
Kavitäten mit einer Negativkontrolle in zufälliger Reihenfolge zu präparieren. Falls notwendig (siehe
ANMERKUNG 1), sind für jeden Zeitraum bis zu vier Kavitäten mit einer Positivkontrolle zu präparieren.

ANMERKUNG 1 In Laboratorien, die über Daten aus früheren Versuchen mit Positivkontrollen verfügen, sind weitere
Untersuchungen nicht notwendig, außer einer gelegentlichen Überprüfung, um eine positive Reaktion zu bestätigen.

Die ausgewählte Gattung sollte die zur Erfüllung der wissenschaftlichen Zielstellung erforderliche niedrigste
Gattung bei geringster Beeinträchtigung des Tierschutzes sein. Die Auswahl der Gattung muss begründet und
dokumentiert werden. Bei Versuchen mit Affen, Hunden oder Minischweinen sollte für jeden Zeitraum ein Tier
verwendet werden; bei Frettchen sollten es für jeden Zeitraum mindestens drei Tiere sein.

ANMERKUNG 2 Ein schnellabbindender Zinkoxideugenol-Zement (ZOE) ist eine geeignete Negativkontrolle. Bei
Langzeituntersuchungen ist es ratsam, den ZOE gegen Hydrolyse zu schützen. Dies kann erreicht werden, indem eine
dünne Schicht von entweder Polycarboxylat-Zement oder konventionellem (selbsthärtendem) Glasionomer-Zement auf
den ZOE aufgebracht wird, gefolgt von einem durch eine Säure-Ätz-Technik befestigten Komposit-Kunststoff. Zu beachten
ist, dass der direkte Kontakt des Komposit-Kunststoffes mit dem ZOE-Zement zu einer Hemmung der Polymerisation des
Komposit-Kunststoff führen kann. Konventioneller Glasionomerzement könnte als eine alternative Negativkontrolle
angesehen werden.

ANMERKUNG 3 Ein Füllungswerkstoff oder eine Füllungstechnik ohne Freilegung der Pulpa, die durchweg zu einer
mäßigen bis starken Pulpareaktion führt, ist eine geeignete Positivkontrolle.

6.4.3.2.4 Der Zustand der Tiere sollte postoperativ mindestens einmal täglich überprüft und aufgezeichnet
werden. Es sollten Maßnahmen ergriffen werden, um Schmerzen oder Stress infolge veränderter
Essgewohnheiten, Entzündungen oder Infektionen zu minimieren. Schmerzmittel sollten, falls postoperativ
erforderlich, verabreicht werden.

6.4.3.3 Histologische Aufarbeitung

6.4.3.3.1 Nach (7 2) Tagen, (28 3) Tagen und (70 5) Tagen wird eine ausreichende Anzahl der Tiere
mit einer Überdosis Betäubungsmittel oder durch die Anwendung von anderen allgemein akzeptierten
Substanzen getötet, um mindestens sieben Zähne mit dem zu prüfenden Werkstoff zur Verfügung zu haben.
Die Restaurationen, die Zähne und ihr Stützgewebe sind zu untersuchen, und genaue Angaben über jegliche
Abnormalitäten sind festzuhalten. Jeder behandelte Zahn ist zusammen mit dem umgebenden Hart- und
Weichgewebe zu entfernen und in einem geeigneten Medium zu fixieren.

ANMERKUNG Eine vaskuläre Perfusion der Gewebe mit dem Fixativ zum Zeitpunkt der Tötung, bevor sie entnommen
werden, verbessert die Fixierung.

6.4.3.3.2 Nach der Fixierung werden die Zähne in einem geeigneten Reagens (z. B. 10 % Ameisensäure
oder 0,5 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure mit pH 7,4) demineralisiert, und 5 µm bis 7 µm dicke Serien-
schnitte durch jede Kavität werden in der Längsachse des Zahnes angefertigt. Jeder zweite Schnitt wird mit
Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Dazwischen liegende Schnitte werden mit einer geeigneten Bakterienfärbung
(z. B. Brown und Brenn) oder mit anderen Färbungen behandelt, um Bakterien nachweisen zu können.

6.4.3.4 Beurteilung von Dentin und Pulpa

Die Schnitte werden ohne vorherige Kenntnis darüber, ob sie dem zu untersuchenden Werkstoff oder einem
Kontrollmaterial zugeordnet sind, untersucht. Für jede Schnittserie ist eine vollständige Beschreibung aller
histologischen Merkmale im Dentin, in der Pulpa und im periapikalen Gewebe erforderlich, einschließlich
solcher Merkmale, die sich möglicherweise aus der Kavitätenpräparationstechnik ergeben haben. Von den
Serienschnitten sind für die nachfolgende Untersuchung auf Entzündungen mindestens fünf auszuwählen, die
gleichmäßig durch die Kavität verteilt sind. Das entzündliche Infiltrat in den Oberflächengeweben (Odonto-
blastenschicht, zellfreiem Bereich und zellreichem Bereich) wird separat vom restlichen (tieferen)
Pulpagewebe nach der in Tabelle 6 festgelegten Skala beurteilt:

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Tabelle 6 — Einstufungsskala für die Pulpa- und Dentin-Anwendungsprüfung

Entzündungsgrad Beschreibung entzündlicher Veränderungen


Keine Entzündung: normal strukturiertes, am Dentin anliegendes Pulpagewebe
0
in tubularem Kontakt mit dem Kavitätenboden
Schwache Entzündung: verstreute Entzündungszellen innerhalb eines ansonsten
1 normal strukturierten, am Dentin anliegenden Pulpagewebe in tubularem Kontakt
mit dem Kavitätenboden
Mäßige Entzündung: Entzündungszellen mit kleinen Herdgruppen innerhalb
2 eines Pulpagewebes, das noch normal strukturierte, am Dentin anliegende
Bereiche in tubularem Kontakt mit dem Kavitätenboden enthält
Starke Entzündung: ausgeprägte Infiltration von Entzündungszellen mit Verlust
3 der normalen Struktur in dem am Dentin anliegenden Pulpagewebe in tubularem
Kontakt mit dem Kavitätenboden
Abszessbildung oder ausgeprägte Infiltration von Entzündungszellen, nicht nur
4 auf das am Dentin anliegende Pulpagewebe in tubularem Kontakt mit dem
Kavitätenboden begrenzt

Für jeden bewerteten Schnitt ist die verbleibende Mindest-Dentindicke durch Messung im rechten Winkel vom
Kavitätenboden zur Pulpa-(Prä-)dentin-Grenzfläche und durch Messung entlang des Verlaufs der Dentintubuli
aufzuzeichnen. Im letztgenannten Fall ist die Messung entlang der Linie der Hauptrichtung der Dentintubuli
vorzunehmen, wenn die Schnittebene nicht genau mit der der Dentintubuli übereinstimmt, sodass jedes
Kanälchen im interessierenden Bereich nicht über die volle Länge vom Kavitätenboden bis zur Pulpa-
(Prä-)dentin-Grenzfläche verläuft. Es ist ein Reaktionsindex für beide Entzündungsstellen in jedem Zeitraum
zu berechnen, indem die einzelnen Abstufungen addiert und durch die Gesamtanzahl der Beobachtungen
dividiert werden.

Die Daten für die mit dem Prüfwerkstoff gefüllten Kavitäten, einschließlich des Unterfüllungswerkstoffes oder
des Werkstoffes zur Kavitätenbehandlung, falls vom Hersteller empfohlen, werden getrennt von den Daten für
die Kavitäten, die allein mit dem Negativkontrolle gefüllt sind, sowie für die Kavitäten, die als Positivkontrolle
dienen, dargestellt. Die Daten für die mit Positivkontrolle gefüllten Kavitäten können aus früheren Studien
stammen, sofern die Prüfbedingungen identisch waren. Zusätzlich ist die Anzahl der Kavitäten, die Bakterien
auf dem Kavitätenboden oder an der Kavitätenwand enthalten, in jedem Zeitraum für den zu prüfenden
Werkstoff und die Kontrollen aufzuzeichnen. Dadurch wird ein Index für die Entzündungsreaktion in jedem
Zeitraum für jeden Werkstoff entsprechend der obigen Einstufung angegeben, der durch die Darstellung des
Bereichs der gemessenen, verbleibenden Mindest-Dentindicke und des beobachteten Umfangs der bakte-
riellen Undichtigkeit (Microleakage) charakterisiert.

6.4.3.5 Analyse der Überlebensrate von Odontoblastenzellen (optional)

Zur histomorphometrischen Analyse der Überlebensrate von Odontoblastenzellen sind mindestens fünf
gleichmäßig über den Kavitätenboden verteilte und mit Hämotoxylin und Eosin angefärbte Schnitte
auszuwählen und bei einer Vergrößerung zu untersuchen, die eine Identifizierung einzelner getrennter Zellen
ermöglicht und einen Sehbereich bietet, der die gesamte Pulpa-(Prä-)Dentingrenzfläche unter der Kavität
erfasst. Mit einem Okularfadenkreuz ist die Anzahl morphologisch unbeschädigter Odontoblasten je
Längeneinheit der (Prä-)Dentinoberfläche auf der gesamten Länge der Pulpa-(Prä-)Dentingrenzfläche unter
der Kavität zu zählen. Die Grenzfläche wird als der Bereich definiert, in dem die Dentintubuli mit dem Boden
der Kavität in Verbindung stehen, wie in Bild 1 gezeigt.

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Legende
1 Kavität
2 Dentintubuli
3 Pulpa-(Prä-)Dentingrenzfläche zum Zählen der Odontoblasten

Bild 1 — Pulpa-(Prä-)Dentingrenzfläche zum Zählen der Odontoblasten

Das Zählen der Odontoblastenzellen je Längeneinheit der Pulpa-(Prä-)Dentingrenzfläche unter der Kavität ist
für jeden der fünf Schnitte aus jedem Prüfkörper vorzunehmen und es ist der Mittelwert der Zellzahl für diese
Kavität abzuleiten. Dann sind die Mittelwerte der Zellzahlen für alle Prüf- (T) und die Negativkontroll-Kavitäten
(NC) abzuleiten. Der Zelltod in % wird aus Gleichung (1) berechnet:

& NC' T #
CD ( $ ! 100 (1)
% NC "

Dabei ist

CD der Zelltod in Prozent;

NC die gezählte Zellzahl in der Negativkontrolle der Kavität;

T die gezählte Zellzahl für den zu prüfenden Werkstoff in der Kavität.

Der Zelltod der Odontoblasten wird auf einer Skala wie in Tabelle 7 angegeben eingeteilt.

Tabelle 7 — Einstufung des Zelltodes der Odontoblasten

Skala Odontoblasten-Zelltod
0 Kein Zelltod
1 < 25 % Zelltod
2 25 % bis 50 % Zelltod
3 > 50 % bis 75 % Zelltod
4 > 75 % Zelltod

Für jeden eingestuften Schnitt wird die verbliebene Mindest-Dentindicke aufgezeichnet, wie es oben
beschrieben ist. Dadurch wird ein Index für die Überlebensrate der Odontoblasten für jeden Werkstoff
entsprechend der obigen Einstufung angegeben, der durch die Darstellung des Bereichs der gemessenen,
verbleibenden Mindest-Dentindicke für die Kavitäten in dieser Werkstoffgruppe charakterisiert wird.

Sofern vom Hersteller empfohlen, sind die Daten getrennt für die mit dem zu prüfenden Werkstoff,
einschließlich Unterfütterung oder Kavitäten-Behandlungsmittel gefüllten und für die als Positivkontrollen
verwendeten Kavitäten aufzuführen. Die Daten für die Positivkontrollen sind als prozentualer Anteil der
Negativkontrollen je obiger Prüfkavitäten anzugeben. Sofern zutreffend, können die Daten für die Positiv-
kontrollen aus früheren Studien entnommen werden, bei denen die Prüfbedingungen mit denen der aktuellen
Studie identisch waren.

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6.4.4 Beurteilung der Ergebnisse

Alle in der Prüfung gesammelten Informationen, insbesondere jede Abweichung in den Ergebnissen zwischen
den Versuchs- und den Kontrollgruppen, sind für die Beurteilung der Prüfergebnisse in Betracht zu ziehen.

Die Ergebnisse der Beurteilung sind im Prüfbericht anzugeben.

6.4.5 Prüfbericht

Die Ergebnisse sind in einem Prüfbericht anzugeben, der eine vollständige Aufzeichnung aller eingehaltenen
Abläufe, erhaltenen Ergebnisse und aller sonstigen Daten enthält, die für die Beurteilung der Ergebnisse
erforderlich sind. Aufzunehmen sind Einzelheiten zur Herstellung und zu den Anwendungsverfahren des
geprüften Werkstoffs, zusammen mit der Losnummer des Werkstoffs.

6.5 Pulpaüberkappungsprüfung
6.5.1 Ziel

Das Ziel der Prüfung ist es, die Biokompatibilität von Pulpaüberkappungswerkstoffen in Kontakt mit der Pulpa
zu beurteilen. Methodische Verfahren, die für die empfohlene klinische Anwendung des Werkstoffes
erforderlich sind, sind in die Beurteilung einzubeziehen.

ANMERKUNG 1 Mit wenigen Änderungen kann diese Prüfung auch für die Pulpotomieprüfung angewendet werden.

ANMERKUNG 2 Die Pulpa- und Dentinanwendungsprüfung und die Pulpaüberkappungsprüfung können gleichzeitig an
den gleichen Tieren unter Verwendung unterschiedlicher Zähne durchgeführt werden.

6.5.2 Tiere und Tierschutz

Der Tierschutz ist entsprechend 6.4.2 umzusetzen.

Wie in 6.4.2 beschrieben, sind mindestens zwei Säugetiere (keine Nagetiere) einer Gattung zu verwenden.

6.5.3 Durchführung der Prüfung

6.5.3.1 Vorbereitung der Tiere

Es wird eine ausreichende Anzahl an Tieren ausgewählt, um für jeden Zeitraum mindestens sieben Zähne mit
dem zu prüfenden Werkstoff zur Verfügung zu haben.

Die Tiere werden betäubt, und das Verfahren wird nach 6.5.3.2 durchgeführt.

6.5.3.2 Behandlung der Zähne

6.5.3.2.1 Alle Konkremente und Zahnbeläge werden von den Zahnoberflächen entfernt. Um die zu
verwendenden Zähne zu isolieren, wird Kofferdam angelegt. Die Zahnoberflächen und das Behandlungsfeld
werden gereinigt und getrocknet. Dieser Bereich wird mit 3 % (Volumenanteil) Wasserstoffperoxid abgetupft
und mit einem aus Polyvidon-lod oder Chlorhexidin bestehenden Desinfektionsmittel desinfiziert. Die
erforderliche Anzahl bukkaler oder labialer Kavitäten der Klasse V wird mit einem neuwertigen
Präparationsinstrument unter ausreichender Luft-Wasserkühlung präpariert. Die Präparationen sollten durch
den Schmelz begrenzt werden, aber nach mesial und distal extendiert werden und in das innere Drittel des
Dentins reichen. In der Kavitätenmitte wird ein Pulpenbereich von 0,5 mm bis 1,0 mm Durchmesser vorsichtig
unter Einsprühen einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung [0,9 % (Massenanteil)] freigelegt, ohne mit
dem Präparationsinstrument in das Pulpagewebe einzutauchen. Der Durchmesser des freigelegten Bereichs
sollte in zehntel mm gemessen werden. Zur Blutstillung ist die freigelegte Stelle gründlich mit steriler
physiologischer Kochsalzlösung zu spülen und danach mit sterilen Wattepellets zu trocknen.

ANMERKUNG Weist das Gebiss der Tiere eine ausgeprägte Gingivaentzündung auf, so kann es notwendig sein, die
Konkremente und Zahnbeläge einige Tage vor der Kavitätenpräparation zu entfernen und dies eventuell mehrmals zu
wiederholen, bis die Gingivaentzündung unter Kontrolle ist.

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6.5.3.2.2 Bei der Vorbereitung der Prüfwerkstoffe sind die Herstellerangaben zu befolgen. Empfiehlt der
Hersteller andere Spüllösungen oder Substanzen zur Blutstillung oder eine spezifische Vorbehandlung der
Pulpawunde, so sind diese Anweisungen zu befolgen.

6.5.3.2.3 Für jeden Zeitraum sind mindestens zehn Kavitäten mit dem Prüfwerkstoff und fünf Kavitäten mit
einem geeigneten Referenzwerkstoff nach zufälliger Reihenfolge zu präparieren. Die Überkappungs- und
Kontrollen werden auf einer Platte (Anmischblock) angemischt, wobei eine mikrobielle Kontamination zu
vermeiden ist. Die Werkstoffe werden ohne Druck auf die offene Pulpa aufgetragen. Die Kavität wird entweder
mit einem Kompomer oder mit einem Glasionomerzement geschlossen. Diesem Schritt sollte eine Komposit-
Kunststoff-Restauration mittels Klebetechnik folgen.

Die ausgewählten Gattungen sollten die zum Erfüllen der wissenschaftlichen Zielstellung erforderlichen
niedrigsten Gattungen bei geringster Beeinträchtigung des Tierschutzes sein. Die Auswahl der Gattung ist zu
begründen und zu dokumentieren. Bei Versuchen mit Affen, Hunden oder Minischweinen sollte für jeden
Zeitraum mindestens ein Tier verwendet werden; bei Frettchen sollten es für jeden Zeitraum mindestens vier
Tiere sein.

ANMERKUNG 1 Kalziumhydroxid, das mit 0,9 % (Massenanteil) steriler physiologischer Kochsalzlösung frisch zu einer
sehr harten Konsistenz gerührt wird, ist ein geeignetes Referenzmaterial.

ANMERKUNG 2 Bei der Verwendung von ZOE für Langzeituntersuchungen ist es ratsam, diesen gegen Hydrolyse zu
schützen. Dies kann erreicht werden, indem eine dünne Schicht von entweder Polycarboxylat-Zement oder
konventionellem (selbsthärtendem) Glasionomer-Zement auf den ZOE aufgebracht wird, gefolgt von einem durch eine
Säure-Ätz-Technik befestigten Komposit-Kunststoff. Zu beachten ist, dass der direkte Kontakt des Komposit-Kunststoff mit
dem ZOE-Zement zu einer Hemmung der Polymerisation des Komposit-Kunststoffes führen kann.

6.5.3.2.4 Die Tiere sind, wie in 6.4.3.2.4 beschrieben, zu beobachten.

6.5.3.3 Histologische Aufarbeitung

6.5.3.3.1 Nach (7 2) Tagen und (70 5) Tagen wird eine ausreichende Anzahl der Tiere mit einer
Überdosis Betäubungsmittel getötet, um mindestens zehn Zähne mit dem Prüfwerkstoff zur Verfügung zu
haben. Die Restaurationen, die Zähne und deren Stützgewebe sind zu untersuchen und genaue Angaben
über alle Abnormalitäten festzuhalten. Jeder behandelte Zahn ist zusammen mit dem umgebenden Hart- und
Weichgewebe in einem Block zu entfernen und in einem geeigneten Medium zu fixieren.

ANMERKUNG Eine vaskuläre Perfusion der Gewebe mit dem Fixativ zum Zeitpunkt der Tötung, bevor sie entnommen
werden, verbessert die Fixierung.

6.5.3.3.2 Nach der Fixierung ist eine Röntgenaufnahme von jedem Gewebeblock anzufertigen, um
festzustellen, ob röntgenologische Veränderungen aufgetreten sind. Danach werden die histologischen
Schnitte für die Untersuchung, wie in 6.4.3.3.2 beschrieben, vorbereitet.

6.5.3.4 Beurteilung der Pulpa

Wie in dem in 6.4.3.4 beschriebenen Protokoll, werden die histologischen Schnitte untersucht, die
histologischen Merkmale beschrieben, das entzündliche Infiltrat eingestuft und der Index der Entzündungs-
reaktion berechnet. Da das Pulpaoberflächengewebe beim Freilegen des Pulpabereichs zerstört werden wird,
ist mithilfe der in Tabelle 8 festgelegten Skala eine einfache Einstufung des entzündlichen Infiltrats
vorzunehmen.

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Tabelle 8 — Einstufungsskala für die Pulpaüberkappungsprüfung

Entzündungsgrad Beschreibung entzündlicher Veränderungen


0 Keine Entzündung
Schwache Entzündung: verstreute Entzündungszellen im am freigelegten
1
Pulpabereich anliegenden Pulpagewebe
Mäßige Entzündung: Entzündungszellen mit kleinen Herdgruppen im am
2
freigelegten Pulpabereich anliegenden Pulpagewebe
Starke Entzündung: ausgeprägte Infiltration von Entzündungszellen im am
3
freigelegten Pulpabereich anliegenden Pulpagewebe
Abszessbildung oder ausgeprägte Infiltration von Entzündungszellen, nicht nur
4
auf das am freigelegten Pulpabereich anliegende Pulpagewebe begrenzt

Zusätzlich ist eine vollständige Beschreibung des Ausmaßes, der Verteilung und der Art von Dentinbrücken
vorzunehmen, wobei dem Vorhandensein von Tunneldefekten und Zelleinschlüssen besondere Berücksich-
tigung zu schenken ist, die die Wirksamkeit der Brücke als eine Barriere beeinträchtigen können. Der Grad
der Brückenbildung der Pulpaeröffnung durch tertiäres Reizdentin ist auf einer Skala mit den Beurteilungs-
kriterien „keine“, „teilweise“ oder „vollständig“ einzustufen. In der nachfolgenden Anmerkung wird eine
Anleitung zur Interpretation der histologischen Merkmale der Dentin-Brückenbildung gegeben.

ANMERKUNG Das Ausmaß und die Verteilung einer möglichen Dentinbrücke sollte dahingehend betrachtet werden,
ob der freigelegte Pulpabereich vollständig überbrückt ist, wie tief oder dick dies ist sowie auch dessen Verteilung in
Bezug auf den freigelegten Bereich. Eine unvollständige Brücke bietet keinen wirksamen Schutz für die freigelegte Pulpa.
Obwohl eine angemessene Brückentiefe für einen wirksamen Pulpaschutz gefordert wird, kann eine unkontrollierte
reparative Dentinogenese zur Brückenbildung einen Verschluss der Pulpakammer hervorrufen und die Vitalität der Pulpa
beeinträchtigen. Eine ausgedehnte reparative Dentinogenese außerhalb der lokalen Begrenzungen der Dentinbrücke und
dessen tubularer Verbindungen mit dem Werkstoff kann neben der direkten Reaktion auf den Werkstoff auf eine
Zellreaktion infolge einer Verletzung (z. B. chirurgische Verletzung) hindeuten. Die Regelmäßigkeit der tubularen Struktur
in der Dentinbrücke kann auf den Grad der Dysplasie während der Bildung hinweisen, wobei die Abwesenheit oder das
Vorhandensein weniger Kanälchen auf eine größere dysplastische Gewebebildung hindeutet. Das Vorhandensein von
Tunneldefekten und Zelleinschlüssen in der Dentinbrücke sind auch Hinweise auf eine dysplastische Gewebebildung und
können die Permeabilität und den Grad der Dichtheit, den diese Brücke bieten kann, beeinträchtigen.

6.5.4 Beurteilung der Ergebnisse

Die Ergebnisse sind, wie in 6.4.4 angegeben, zu beurteilen.

6.5.5 Prüfbericht

Die Ergebnisse sind in einem Prüfbericht nach 6.4.5 festzuhalten.

6.6 Endodontische Anwendungsprüfung

6.6.1 Ziel

Das Ziel der Prüfung ist es, die Biokompatibilität endodontischer Werkstoffe in Kontakt mit dem restlichen
apikalen Pulpagewebe (Pulpastumpf) und den periapikalen Geweben zu beurteilen. In die Beurteilung sind
Verfahren, die für die empfohlene klinische Anwendung des Werkstoffes erforderlich sind, einzubeziehen.

ANMERKUNG Die endodontische Anwendungsprüfung sollte für bioaktive endodontische Werkstoffe verwendet
werden, die zur orthograden oder retrograden Applikation vorgesehen sind, z. B. für Werkstoffe, für die angegeben wird,
dass sie die Bildung von apikalem Hartgewebe stimulieren.

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6.6.2 Tiere und Tierschutz

Der Schutz der Tiere erfolgt entsprechend 6.4.2.

Mindestens vier Säugetiere (keine Nagetiere) einer Gattung müssen nach 6.4.2 verwendet werden. Das Alter
der Tiere sollte so gewählt werden, dass ihr Gebiss intakte permanente Zähne mit abgeschlossenen (reifen)
Wurzeln aufweist; die Verwendung der Schneide-, Eckzähne und Prämolaren wird bevorzugt. Die
Verwendung von Prämolaren ist fakultativ, wenn zwei Wurzeln vorhanden sind.

6.6.3 Durchführung der Prüfung

6.6.3.1 Vorbereitung der Tiere

Es ist eine ausreichende Anzahl von Tieren auszuwählen, um für jeden Zeitraum mindestens zehn Zähne mit
dem Prüfwerkstoff zur Verfügung zu haben.

ANMERKUNG Bei manchen Hunderassen kann die Morphologie des apikalen Teils des Wurzelkanals eine Wurzel-
präparation erschweren.

Die Tiere werden betäubt, und das Verfahren wird nach 6.6.3.2 durchgeführt.

6.6.3.2 Behandlung der Zähne

6.6.3.2.1 Es sind Röntgenaufnahmen vom periapikalen Bereich aller zu füllenden Zähne anzufertigen. Die
Zähne sind, wie in 6.4.3.2.1 beschrieben, zu reinigen und zu isolieren.

ANMERKUNG Weist das Gebiss der Tiere eine ausgeprägte Gingivaentzündung auf, so kann es notwendig sein, die
Konkremente und Zahnbeläge einige Tage vor der Kavitätenpräparation zu entfernen und dies eventuell mehrmals zu
wiederholen, bis die Gingivaentzündung unter Kontrolle ist.

Die erforderliche Anzahl an Zähnen wird für das Legen der Wurzelkanalfüllungen vorbereitet. Dazu wird eine
geeignete Öffnung in die Pulpakammer mit scharfen Präparationsinstrumenten unter aseptischen
Bedingungen gebohrt. Die freigelegte Pulpa wird mit physiologischer Kochsalzlösung [0,9 % (Massenanteil)]
gespült und mit sterilen Wattepellets getrocknet. Die Pulpa wird mit einer neuen, sterilen Wurzelkanalfeile
oder einer geeigneten Exstirpationsnadel (1,0 0,5) mm vor dem Foramen apicale abgetrennt und entfernt,
indem die Instrumentenanwendung mit Hilfe der Röntgenbilder kontrolliert wird. Der Wurzelkanal wird
mehrmals mit Natriumhypochloridlösung gespült (empfohlener Konzentrationsbereich von 1,0 % bis 5,25 %
(Massenanteil) und danach mit steriler 0,9 % (Massenanteil) physiologischer Kochsalzlösung ausgespült.

Der Wurzelkanal wird durch mehrere, zunehmend größer werdende sterile Wurzelkanalfeilen erweitert, die in
der Länge bis zur Stelle kalibriert sind, an der die Pulpa beschädigt ist, bis eine geeignete Größe für die
Füllung erreicht ist. Es sind alle Anstrengungen zu unternehmen, um alle Dentinsplitter aus dem Wurzelkanal
zu entfernen, die den Apex blockieren könnten und dadurch den Kontakt des endodontischen Werkstoffes mit
dem apikalen Gewebe verhindern. Nachdem die instrumentelle Aufbereitung abgeschlossen ist, wird der
Wurzelkanal mit Natriumhypochloridlösung (empfohlener Konzentrationsbereich von 1,0 % bis 5,25 %
(Massenanteil) gespült und danach mit steriler 0,9 % (Massenanteil) physiologischer Kochsalzlösung
ausgespült. Die Trocknung erfolgt mit sterilen Wattepellets und großen, stumpfen, sterilen Papierspitzen,
ohne den verbliebenen apikalen Pulpastumpf zu berühren.

6.6.3.2.2 Bei der Vorbereitung des zu prüfenden Werkstoffes muss die Gebrauchsanweisung des
Herstellers eingehalten werden. Wenn der Hersteller Verfahren zur Zahnpräparation empfiehlt, die von den
oben genannten abweichen, dann sind die Anweisungen des Herstellers zu befolgen.

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6.6.3.2.3 Für jeden Zeitraum sind mindestens zehn Zähne mit dem zu prüfenden Werkstoff und
mindestens fünf Zähne mit einem geeigneten Referenzwerkstoff in zufälliger Reihenfolge zu füllen. Die
endodontischen Werkstoffe und die Referenzwerkstoffe werden auf einer Platte (Anmischblock) angemischt,
wobei eine mikrobielle Kontamination vermieden werden sollte. Der Wurzelkanal wird entweder mit dem zu
prüfenden Werkstoff oder dem Referenzwerkstoff mit Guttapercha bis zum abgetrennten Teil der Pulpa
gefüllt. Die Zugangskavität wird mit einem verstärkten Zinkoxideugenol-Zement (ZOE) geschlossen, der
entweder mit einem Polycarboxylatzement oder einem konventionellen (selbsthärtenden) Glasionomerzement
oder einem durch Säureätzen befestigten Kompositkunststoff abgedeckt wird. Es müssen Röntgenbilder
aufgenommen werden, die den periapikalen Bereich von allen Zähnen zeigen, die gefüllt wurden.

Bei Versuchen mit Affen, Hunden oder Minischweinen sollten mindestens zwei Tiere für jeden Zeitraum
verwendet werden; bei Versuchen mit Frettchen sollten dies mindestens vier Tiere für jeden Zeitraum sein.

Wenn ein Kompositkunststoff verwendet wird, sollte eine dünne Schicht aus entweder konventionellem
(selbsthärtenden) Glasionomerzement oder Polycarboxylatzement zuerst über den ZOE gelegt werden. Das
Aufbringen eines Kompositkunststoffes in direktem Kontakt mit dem ZOE-Zement kann zu einer Hemmung
der Polymerisation des Kompositkunststoffes führen.

ANMERKUNG ZOE-Zement, entweder allein oder mit weiteren Zusätzen, wie im Grossmann-Sealer, ist ein geeignetes
Referenzmaterial.

6.6.3.2.4 Die Tiere sind, wie in 6.4.3.2.4 beschrieben, zu beobachten.

6.6.3.3 Histologische Aufarbeitung

6.6.3.3.1 Nach (28 3) Tagen und (90 5) Tagen ist eine ausreichende Anzahl der Tiere mit einer
Überdosis Betäubungsmittel zu töten, um mindestens zehn Zähne mit dem zu prüfenden Werkstoff zur
Verfügung zu haben. Die Restaurationen, die Zähne sowie deren Stützgewebe sind zu untersuchen und
genaue Angaben über jede Abnormität festzuhalten. Jeder behandelte Zahn ist zusammen mit dem
umgebenden Hart- und Weichgewebe in einem Block zu entfernen und in einem geeigneten Fixationsmedium
zu fixieren.

ANMERKUNG Eine vaskuläre Perfusion der Gewebe mit dem Fixativ zum Zeitpunkt der Tötung, bevor sie entnommen
werden, verbessert die Fixierung.

6.6.3.3.2 Nach der Fixierung muss von jedem Gewebeblock ein Röntgenbild aufgenommen werden, um
festzustellen, ob röntgenologische Veränderungen aufgetreten sind. Die Schnitte für die Untersuchung
werden, wie in 6.4.3.3.2 beschrieben, angefertigt. Sie sollen parallel zur Längsachse des Zahnes durch den
Wurzelkanal und dessen Verzweigungen laufen und die Grenzfläche zwischen Werkstoff und Pulpagewebe
und das angrenzende periapikale Gewebe zeigen.

6.6.3.4 Gewebebeurteilung

Die histologischen Schnitte werden untersucht ohne vorherige Kenntnis darüber, ob sie von dem zu
prüfenden Werkstoff oder einem Kontrollmaterial stammen. Für jede Schnittserie ist eine vollständige
Beschreibung aller histologischen Merkmale in der Pulpa, im periapikalen Gewebe, im Dentin und im Zement
des apikalen Teiles des Zahnes erforderlich. Für jeden zu prüfenden Werkstoff sind die Veränderungen im
Gewebe nach den in Tabelle 8 festgelegten Kriterien einzustufen. Beispiele für histologische Merkmale, die zu
berücksichtigenden sind, sind in der nachfolgenden Anmerkung enthalten.

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Tabelle 9 — Einstufungsskala für die endodontische Anwendungsprüfung

Skala Beobachtung
0 Keine Entzündung
Schwache Entzündung: Die Prüfkörper zeigen verstreute Entzündungszellen,
1 überwiegend chronischer Art. Die Strukturmerkmale der restlichen Pulpa sind noch
erkennbar.
Mäßige Entzündung: Die Prüfkörper zeigen eine umschriebene Ansammlung von
2 Entzündungszellen, jedoch keine Gewebenekrose. Die Strukturmerkmale der restlichen
Pulpa und des periapikalen Gewebes sind gestört.
Starke Entzündung: Die Prüfkörper zeigen einen umfangreichen Ersatz der restlichen
3
Pulpa oder des periapikalen Gewebes durch ein Infiltrat der Entzündungszellen.
4 Abszessbildung

ANMERKUNG Beispiele für die histologischen Merkmale, die aufgezeichnet werden müssen, werden im Folgenden
angegeben.
a) Eine Beurteilung zum Nachweis, ob die Wurzelkanalfüllung kurz, bündig oder extrudiert ist. Diese Beobachtung ist
mit dem Vorhandensein einer Entzündung, Wurzelresorption und Knochenreaktion in Beziehung zu bringen;
b) Extrusion des Wurzelkanalversiegelungswerkstoffes (Zementes) Es ist festzustellen, ob der Wurzelkanalversiege-
lungswerkstoff durch den Apex in den umgebenden periodontalen Raum und in das Knochengewebe extrudiert ist.
Auch wenn dies wahrscheinlich am 28. Tag zu beobachten ist, sollte ein längerer Zeitraum von dieser Bewertung
nicht ausgeschlossen werden;
c) Das Vorhandensein nekrotischen Apikalgewebes;
d) Die Einstufung der Qualität der Adaptation des Wurzelkanalfüllungswerkstoffs als gut, deutlich oder gering. Eine gute
Adaptation bedeutet, dass der Füllungswerkstoff gut an die Kanalwände bei nicht nur einem Schnitt sondern bei
Serienschnitten angepasst ist, ohne das freie Stellen vorhanden sind. Mit deutlich wird eingestuft, wenn einige
Schnitte freie Stellen oder Bereiche aufweisen, an denen der Füllungswerkstoff nicht gut an die Wurzel angepasst ist.
Eine geringe Adaptation wird aufgezeichnet, wenn der Füllungswerkstoff mit der Kanalwand nicht bündig ist oder
wenn zahlreiche freie Stellen vorhanden sind;
e) Weitere Spezifikation der oben ausgeführten Entzündung (und von 0 bis 4 eingestuft) nach dem vorliegenden Typ
der Entzündungszellen. Es ist der vorherrschende Zelltyp aufzuführen und zu erkennen, dass akute Zellen
(Leukozyten) früher auftreten, während mononukleare Zellen (Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und
multinukleare Riesenzellen) später erscheinen. Die Entzündungsreaktionen sind als akut (A), chronisch (C) oder
gemischt (M) einzustufen;
f) Wurzelresorption (vorhanden oder nicht vorhanden);
g) Die Reaktion des apikalen Knochens, die als normal oder entzündet (Grad der Entzündung) eingestuft wird und eine
Bestimmung, ob ein Granulom vorhanden ist und ob der Knochen Anzeichen einer Resorption aufweist.
h) Grad der Hyperämie, einzustufen auf einer Skala von 0 bis 3.

6.6.4 Beurteilung der Ergebnisse

Die Ergebnisse sind, wie in 6.4.4 angegeben, zu beurteilen.

6.6.5 Prüfbericht

Die Ergebnisse sind in einem Prüfbericht nach 6.4.5 festzuhalten.

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Anhang A
(informativ)

Prüfungen, die bei der Beurteilung der Biokompatibilität von in der Zahnheilkunde verwendeten
Medizinprodukten in Erwägung gezogen werden müssen
Tabelle A.1

Kontakt- Gruppe I Gruppe II Gruppe III


dauer
Pulpa und Endo-
A– Zytoto- Irritation
Zyto- Zyto- Verzögerte Akute Subchronisch Dentin- Pulpaüber- dontische
Begrenzt xizitäts- oder Genotoxizitä Implantatio
toxizitäts- toxizitäts- Sensibili- systemische e (subakute) Anwen- kappungs- Anwen-
( 24 h) prüfunge intrakutane t n
prüfungen prüfungen sierung Toxizität Toxizität dungs- prüfung dungs-
n Reaktivität
Art des B– prüfung prüfung
Körper- Verlänger ISO 7405, 6. ISO 10993- ISO 7405, ISO 10993-1 ISO 10993-1 ISO 10993-1 ISO 10993-11 ISO 10993-3 ISO 10993-6 ISO 7405, 6. ISO 7405, 6. ISO 7405, 6.
kontakts t 2 und 6.3 5 Anhang B 0 0 1 4 5 6
(24 h bis
30 d)
C–
Dauernd
(> 30 d)

A X X X X
Körperober
B X X X X
flächen
C X X X X X X

Von außen A X X X X X X
mit dem
B X X X X X X X X X X
Körper-
inneren C X X X X X X X X X X

A X X X X X X
Implantier-
bares B X X X X X X X X X X
Produkt
C X X X X X X X X X X

ANMERKUNG 1 X zeigt an, dass die Durchführung dieser Prüfung erwogen werden muss.
ANMERKUNG 2 Diese Tabelle ist ein Gerüst zur Ausarbeitung eines Beurteilungsprogramms und keine Checkliste.

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Anhang B
(informativ)

Dentin-Barriere-Zytotoxizitätsprüfung

B.1 Ziel

Das Ziel dieser Prüfung ist es, die Zytotoxizität von Füllungswerkstoffen in der Zahnheilkunde mithilfe eines
Zellkulturverfahrens zu beurteilen, bei dem die Zellen und der Werkstoff durch eine Dentinbarriere getrennt
sind. Dabei wird die klinische Situation einer mit einem restaurativen Füllungswerkstoff gefüllten Zahnkavität
simuliert.

B.2 Geräte und Materialien

B.2.1 Zelllinie

Verwendet wird eine etablierte Zelllinie, die leicht zu beziehen ist, z. B. von der American Type Culture
Collection (ATCC); oder, alternativ können klonale SV 40 große T-Antigen-Transfektionszellen, z. B.
gewonnen aus den Zahnpapillen von Kälbern, verwendet werden. Sie werden in einem Wachstumsmedium
bei (37 2) °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit einem Kohlendioxidgehalt von 5 % (Volumenanteil)
gehalten. Es können auch andere etablierte Zelllinien mit odontoblastenähnlichen Eigenschaften oder
anderen Eigenschaften verwendet werden, die für die Physiologie der Pulpagewebe von Bedeutung sind.

B.2.2 Kulturmedium

Das Kulturmedium für die ausgewählte Zelllinie, die durch die ATCC oder äquivalent festgelegt ist, muss
verwendet werden.

ANMERKUNG Zur Anleitung siehe http://www.atcc.org. Das Wachstumsmedium für SV 40 große T-Antigen-
Transfektionszellen besteht aus MEM!, ergänzt durch 20 % fötales Rinderserum (FBS), 150 I.E./ml Penicillin, 150 µg/ml
Streptomycin, 0,125 µg/ml Amphotericin B und 0,1 mg/ml Geneticin.

B.2.3 Reagenzien

B.2.3.1 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT).

B.2.3.2 Antibiotika/Antifungizide: Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B und Geneticin nur für klonale
SV 40 Transfektionszellen.

B.2.4 Geräte und Prüfmittel

B.2.4.1 Einlagen für Zellkulturplatten (z. B. Millicell 5).

B.2.4.2 Kulturplatten mit 6 Aussparungen (6 Well Zellkulturschale) und 24 Aussparungen (24 Well
Zellkulturschale).

B.2.4.3 8-mm-Polyamid-Netze (z. B. Sefar 6)), Maschenweite 150 µm.

5) Millicell ist die Herstellerbezeichnung des Produkts, geliefert von Millipore, Billercia, USA. Diese Angabe dient nur zur
Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts
durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu identischen Ergebnissen
führen.

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

B.2.4.4 Perfusionsgerät mit geteilter Kammer.

Im folgenden Text werden zwei Perfusionskammern beschrieben, die beide geeignet sind:

Das erste Perfusionsgerät mit geteilter Kammer, Minucells 7) (Bild B.1) besteht aus einer Perfusionskammer
aus Polycarbonat mit einer Grundfläche von 40 mm 40 mm und einer Höhe von 35 mm. Der pulpale Teil des
Gerätes ist auf einer Seite mit einer Flasche zur Einspeisung des Zellkulturmediums und auf der anderen
Seite mit einer peristaltischen Pumpe sowie einer Flasche für das Abfallmedium verbunden. Innerhalb des
Prüfgeräts sind die beiden Kammern durch eine Dentinscheibe getrennt, die durch einen Halter aus Stahl
fixiert wird (Bild B.2).

Legende
1 Einspeisung des Kulturmediums
2 Heizplatte
3 Perfusionskammer
4 Pumpe
5 Abfallflasche

Bild B.1 — Experimenteller Aufbau für die Dentin-Barriere-Zytotoxizitätsprüfung

6) Sefar ist die Herstellerbezeichnung des Produkts, geliefert von Sefar, Wasserburg/Inn, Deutschland. Diese Angabe
dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung des
genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu
identischen Ergebnissen führen.
7) Minucell ist die Herstellerbezeichnung des Produkts, geliefert von Minucells & Minutissue GmbH, Bad Abbach,
Deutschland. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet
keine Anerkennung des genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie
nachweislich zu identischen Ergebnissen führen.

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Legende
1 zu prüfender Werkstoff
2 Netz mit Zellen
3 Dentinscheibe
4 Stahlring
5 Stahleinlage

Bild B.2 — Halter aus nichtrostendem Stahl zur Fixierung der Dentinscheibe und der Zellkultur
in der Prüfapparatur

Legende
1 Oberteil
2 Gummi O-Ring
3 Mittelteil
4 Elastomerschicht
5 Einlass – Auslass
6 Glasabdeckung
7 Unterteil
8 Kulturmedium
9 zu prüfender Werkstoff
10 Dentinscheibe, die durch Gummi-O-Ringe gehalten wird

Bild B.3 — ADA-Perfusionskammer

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Das zweite Perfusionsgerät mit geteilter Kammer, die Perfusionskammer der American Dental Association
(ADA 8) (Bild B.3), besteht aus lichtdurchlässigen Wänden, die entweder aus Delrin 9) oder Lexan 10) hergestellt
sind. Beide Materialien sind nicht toxisch. Die Einlass- und Auslassventile sind Nadelöffnungen aus nicht
toxischem nichtrostendem Stahl. Die kleinen O-Ringe bestehen aus rotem Silikon (15,9 mm Außen-
durchmesser, 12,42 mm Innendurchmesser). Der 6-mm-Innendurchmesser des kleineren O-Rings bildet eine
Oberflächendiffusionsfläche von 28 mm2. Die Kammerfläche enthält 0,5 ml Flüssigkeit. Diese Fläche kann
durch Füllen der Kammer vom Boden aus mit einer nicht toxischen Polyvinylsiloxan-Abformmasse (z. B.
Reprosil 11)) verkleinert werden, sodass weniger als 100 µl innerhalb der Kammer sind.

B.2.4.5 Mikroplattenlesegerät, Zellkulturplatten mit 96 Aussparungen, Wellenlänge 540 nm oder jedes


andere geeignete Photometer.

B.2.4.6 Dentinscheiben, aus Human- oder Rinderdentin.

ANMERKUNG Wenn kein menschliches Dentin verwendet wird, ist vor der Anwendung die Permeabilität der Scheiben
zu bestimmen, um nachzuweisen, dass diese dem Humandentin im Bereich der Pulpa-Dentin-Grenzfläche ähnlich ist. Für
diesen Zweck ist ein Kapillarsystem (z. B. Flowdec 12)), zu verwenden.

B.3 Durchführung der Prüfung

B.3.1 Herstellung der Zellkulturen

B.3.1.1 Dreidimensionale Zellkulturen

Für die Anwendung in der Minucell Perfusionskammer werden dreidimensionale Zellkulturen empfohlen.
Polyamidnetze werden 30 min in 0,1 mol/l Essigsäure inkubiert, dreimal mit entmineralisiertem Wasser
gewaschen, luftgetrocknet, mit Fibronectin (0,03 mg/ml) beschichtet und unter sterilen Bedingungen
luftgetrocknet. Eine Zellkultureinlage wird in jede Aussparung einer 6-Well-Platte zusammen mit 1,25 ml
Kulturmedium pipettiert. Die Netze werden auf die Einlagen gelegt und mit und mit 20 µl Zellsuspension bei
4 × 106 Zellen/ml wird eine Kultur angesetzt. Nach 48 h Inkubation bei (37 2) °C und unter 5 % CO2 bei
einer relativen Luftfeuchte von (90 10) % werden die Netze auf 24-Well-Platten überführt und (14 2) Tage
inkubiert. Das Kulturmedium wird dreimal wöchentlich gewechselt. Am Ende der ersten Woche werden die
Netze in eine neue 24-Well-Platte gelegt.

8) ADA Perfusionskammer ist die Herstellerbezeichnung des Produkts, geliefert von Biomedical Engeneering, Medical
College of Georgia, Augusta, GA30912, #NT-8214A. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser
Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte
dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu identischen Ergebnissen führen.
9) Delrin ist der Handelsname eines Produktes aus der Materialklasse der Polyacetale, der von DuPont geliefert wird.
Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine
Anerkennung des genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie
nachweislich zu identischen Ergebnissen führen.
10) Lexan ist der Handelsname eines Produktes aus der Materialklasse der Polycarbonate, der von General Electric
Plastics geliefert wird. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und
bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden,
wenn sie nachweislich zu identischen Ergebnissen führen.
11) Reprosil ist der Handelsname eines Produktes aus der Materialklasse der hydrophoben, nicht toxischen
Polyvinylsiloxan-Abformmassen, das von Dentsply, York, PA, USA, geliefert wird. Diese Angabe dient nur zur
Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts
durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu identischen Ergebnissen
führen.
12) Flowdec ist die Herstellerbezeichnung des Produkts, geliefert von DeMarco Engineering, Genf, Schweiz. Diese
Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung des
genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu
identischen Ergebnissen führen.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

B.3.1.2 Einschichtenkulturen

Für die Anwendung in der ADA-Perfusionskammer werden Einschichtenkulturen empfohlen. Die in


ISO 10995-5 beschriebenen Verfahren werden mit einer leicht erhältlichen etablierten Zelllinie, z. B. von der
American Type Culture Collection (ATCC), verwendet.

B.3.2 Herstellung der Dentinscheiben

B.3.2.1 Menschlicher Ursprung

Ausgewählt werden nicht kariöse, frisch extrahierte Molaren. Konkremente sowie anhaftendes Weichgewebe
wird mit Handinstrumenten entfernt. Die Zähne werden mindestens 15 min in 70 % Ethanol eingelegt. Die
Dentinscheiben werden durch das Schneiden der Zähne rechtwinklig zu deren Längsachsen im breitesten Teil
ihrer Kronen, unter dem okklusalen Schmelz und über den okklusalen Begrenzungen der Pulpakammern
hergestellt.

B.3.2.2 Boviner Ursprung

Ausgewählt werden intakte Zähne, die keine Anzeichen von übermäßigem Abrieb aufweisen, ausgewählt aus
den mittleren vier unteren Schneidezähnen von 3 bis 7 Jahre alten Schlachthaustieren. Die Zähne werden
extrahiert. Konkremente sowie anhaftendes Weichgewebe wird mit Handinstrumenten entfernt. Die Zähne
werden bis zur Prüfung in 0,5 % Chloramin oder anderen geeigneten Agenzien gelagert. Die Dentinscheiben
werden durch das Schneiden der Zähne entlang ihrer Längsachsen möglichst dicht an der Pulpakammer
hergestellt. Für die Prüfung sind Scheiben nahe des zervikalen Zahnanteils zu verwenden.

B.3.2.3 Behandlung der Dentinscheiben

Der vorgesehene „pulpale“ Anteil der Dentinscheibe wird mit 50%iger Zitronensäure für 30 s geätzt, gründlich
gewaschen und entweder durch Autoklavieren (121 °C, 9,6 MPa, 25 min) in 0,9 % Natriumchlorid sterilisiert
oder durch Eintauchen in 70 % Ethanol für 15 min und danach mit entmineralisiertem Wasser gründlich
agespült. Dentinscheiben können in 0,9%iger Natriumchloridlösung bei (4 2) °C bis zu drei Wochen
aufbewahrt werden. Die Sterilität der Dentinscheiben ist durch mikrobiologische Kulturen eines zu prüfenden
Körpers aus jeder Charge zu bestätigen.

ANMERKUNG Die Dicke der Dentinscheibe kann entsprechend der Tiefe der klinischen Kavität, die die Prüfung
simulieren soll, variieren. Eine Dentinscheibe mit einer Dicke von (500 50) µm stellt das verbliebene Dentin unter einer
klinischen Kavität mittlerer Tiefe dar. Dünnere Scheiben dürfen verwendet werden, um die Situation tieferer klinischer
Kavitäten darzustellen.

Bis zur Prüfung dürfen die Dentinscheiben in 0,9 % NaCl gelagert werden.

B.3.2.4 Zusammenbau der Perfusionskammer

B.3.2.4.1 Minucell-Gerät

Das Netz mit den Zellen wird in das Prüfgerät gelegt und die Dentinscheibe wird hineingelegt, fixiert durch
einen Halter aus nichtrostendem Stahl.

ANMERKUNG Ein geeigneter Halter ist in Bild B.2 dargestellt.

Die Kammern werden mit 0,3 ml Untersuchungsmedium je Stunde (Wachstumsmedium mit 6 g/l HEPES-
Puffer) für 24 h durchströmt. Die Perfusion wird gestoppt und der zu prüfende Werkstoff wird in den oberen
Teil in direktem Kontakt mit der Kavitätenseite der Dentinscheibe gelegt.

Nach einem geeigneten Zeitraum (z. B. 24 h oder 3 Tagen) wird das Netz mit den Zellen aus dem pulpalen
Anteil aus der Kammer entnommen und in 48-Well-Platten gelegt, die 0,5 ml vorgewärmte MTT-Lösung
(0,5 ml Wachstumsmedium) enthalten und für 2 h bei 37 °C mit Phosphat gepufferter physiologischer
Kochsalzlösung inkubiert. Das blaue Formazan-Prezipitat wird extrahiert indem 0,25 ml Dimethylsulphoxid
verwendet wird, wobei die Platten bei Raumtemperatur für 30 min geschüttelt werden. 200 µl dieser Lösung

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

werden auf eine 96-Well-Platte überführt und die Absorption wird spektralphotometrisch bei 540 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Kontrollmaterialien oder als photometrische Ablesewerte anzugeben.

Für jeden Werkstoff und für jede Kontrolle werden in einer Prüfung 5 bis 10 Kammern verwendet. Jede
Prüfung muss mindestens zweimal durchgeführt werden.

B.3.2.4.2 Zusammenbau der ADA-Perfusionskammer

Die Dentinscheibe wird in die Perfusionskammer gelegt. Der untere Teil wird mit einem geeignetem Zellkultur-
medium (oder einem anderen Extraktionsmittel) gefüllt und an die Versorgungs- und Entsorgungsflaschen,
sofern erforderlich, angeschlossen. Dann wird der zu prüfende Werkstoff hineingelegt. Nach einer vorgegebe-
nen Expositionszeit wird das Zellkulturmedium entfernt und für Zytotoxizitätsprüfungen in routinemäßigen
Einschichtkulturen verwendet; z. B. unter Anwendung der DNA-Synthese, Mitochondrienaktivität (MTT-Test)
oder Stimulation von Funktionen wie Genregulation als biologischer Endpunkt.

B.4 Kontrollen
Für jeden zu prüfenden Werkstoff müssen Positiv- und Negativkontrollen verwendet werden. Die
Positivkontrolle sollte die Lebensfähigkeit der Zellen nach einer Exposition von 24 h um etwa 50 %
reduzieren; die Negativkontrolle sollte keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen haben. Ein
Beispiel für ein Positivkontrollmaterial 13) wird in Tabelle B.1 gegeben.

ANMERKUNG Als Negativkontrolle ist eine hydrophobe nicht toxische Polyvinylsiloxan-Abformmasse geeignet. Als
Positivkontrolle kann ein Material mit der in Tabelle B.1 angegebenen Zusammensetzung oder ein äquivalentes Material
verwendet werden.

13) Die folgenden Rohmaterialien sind Beispiele für geeignete Produkte, die kommerziell hergestellt werden. Diese
Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung des
genannten Produkts durch ISO. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweislich zu
identischen Ergebnissen führen.
Glaspulver mit Korngröße 30 µm 10 µm: Schott, Bestellnummer GM35429.
Polyacrylsäure: Sigma-Aldrich, Bestellnummer 323667.
Diphenyliodonium chlorid: Sigma, Bestellnummer D209082.
Camphorquinon: Sigma, Bestellnummer 124893.
Ethyl-4-dimethylaminobenzoat: Merck, Bestellnummer 841086.
HEMA (2-Hydroxylethyl-methacrylat): Merck, Bestellnummer 800588

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Tabelle B.1 — Beispiel für ein positives Kontrollmaterial

Materiala Abgewogene Probe Abgewogene Probe Endgewicht


mg % %
Pulver
Glaspulver 829,000 82,90 66,30
Polyacrylsäure 146,000 14,60 11,70
Diphenyliodonium chlorid 25,000 2,50 2,00
Gesamt 1 000,00 100,00 80,00
Flüssigkeit
Camphorquinon 0,625 0,25 0,05
Ethyl-4-
0,625 0,25 0,05
dimethylaminobenzoate
HEMA 187,500 75,00 15,00
Destilliertes Wasser 61,250 24,50 4,90
Gesamt 250,000 100,00 20,00
!ANMERKUNG Siehe Literaturhinweis [31]. "

Die Bestandteile für das Pulver und die Flüssigkeit werden separat angemischt. Unmittelbar darauf werden
beide im Verhältnis von 1 000 mg Pulver und 250 mg Flüssigkeit gemischt. Diese Mischung wird mit einem
üblichen Lichtpolymerisationsgerät 40 s bei 700 mW/cm2 bis 800 mW/cm2 ausgehärtet.

B.5 Beurteilung der Ergebnisse


Das Experiment ist zu verwerfen, wenn zwischen der Negativkontrolle und der Positivkontrolle keine
signifikanten Unterschiede erkennbar sind.

Zusätzlich zu der beschriebenen Beurteilung ist ISO 10993-5 für weitere Angaben heranzuziehen. Die
Beurteilung der Daten die vom Minucell-Gerät stammen, basiert auf einem statistischem Vergleich (nicht
parametrisches Verfahren) der Daten von dem zu prüfenden Werkstoff mit den Daten aus den Kontrollmateri-
alien, unter Annahme von 5 bis 10 unabhängigen Kulturen für jeden Werkstoff. Die Zellschädigung wird nach
Tabelle B.2 beurteilt und die Ergebnisse werden entsprechend der Tabelle B.3 eingestuft.

Die Ergebnisse der Beurteilung müssen in den Prüfbericht aufgenommen werden.

Tabelle B.2 — Beurteilung der Zellschädigung

Skala Beurteilung
Kein statistischer Unterschied zur Negativkontrolle, aber zur Positivkontrolle besteht ein Unterschied,
0
oder es werden weniger Zellschädigungen als bei der Negativkontrolle beobachtet
Statistischer Unterschied zu beiden Kontrollen, sowohl zur Negativkontrolle als auch zur
1
Positivkontrolle
Kein statistischer Unterschied zur Positivkontrolle, aber zur Negativkontrolle besteht ein Unterschied,
2
oder es werden mehr Zellschädigungen als bei der Positivkontrolle beobachtet

Tabelle B.3 — Einstufung des Prüfmaterials

Skala Beschreibung
0 Nicht zytotoxisch
1 Moderat zytotoxisch
2 Stark Zytotoxisch

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EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

B.6 Prüfbericht
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:

a) verwendete Zelllinie;

b) verwendetes Kulturmedium;

c) Einzelheiten des geprüften Werkstoffes;

d) Einzelheiten zur Herstellung der Prüfkörper;

e) Einzelheiten zu den Positiv- und Negativkontrollen;

f) prozentualer Anteil an lebensfähigen Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle;

g) Ergebnisse der Bewertung.

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Anhang C
(informativ)

Akute Toxizitätsprüfung

Aufgrund des Tierschutzes hat sich das klassische LD50-Verfahren als unnötig und nicht annehmbar
erwiesen. Das „Fixed-Dose“-Verfahren (OECD-Richtlinie 420) [11], das „Stepwise“-Verfahren (OECD-
Richtlinie 423) [12] und das „Up- and Down“-Verfahren (OECD-Richtlinie 425) [13] wurden für die Anwendung
als gesetzlich anerkannte Prüfung auf akute Toxizität validiert.

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DIN EN ISO 7405:2013-12
EN ISO 7405:2008 + A1:2013 (D)

Literaturhinweise

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quantification of potential degradation products

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degradation products from polymeric medical devices

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degradation products from ceramics

[5] ISO 10993-15, Biological evaluation of medical devices — Part 15: Identification and quantification of
degradation products from metals and alloys

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degradation products and leachables

[7] ISO 10993-17, Biological evaluation of medical devices — Part 17: Establishment of allowable limits for
leachable substances

[8] ISO 10993-18, Biological evaluation of medical devices — Part 18: Chemical characterization of
materials

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[10] ANSI/ADA Specification No. 41, Recommended Standard Practices for Biological Evaluation of Dental
Materials

[11] OECD 420: OECD Guidelines for Testing Chemicals – Acute Oral Toxicity. Fixed Dose Procedure,
Organisation for Economic Co-operation and Development, 75775 Paris Cedex 16, France

[12] OECD 423: OECD Guidelines for Testing Chemicals – Acute Oral Toxicity. Acute Toxic Call Method,
Organisation for Economic Co-operation and Development, 75775 Paris Cedex 16, France

[13] OECD 425: OECD Guidelines for Testing Chemicals – Acute Oral Toxicity. Up-and-Down Procedure,
Organisation for Economic Co-operation and Development, 75775 Paris Cedex 16, France

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vitro pulp chamber” using the cytotoxicity of phenol, J. Oral Path. 18, pp 97–107, 1989

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Abstract # 273, http://iadr.confex.com/iadr/2011sandiego/webprogramschedule/Paper146565.html.

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