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Grundlage einer maschinellen Übersetzung getroffen werden.

BESCHREIBUNG WO02057739

BESCHREIBUNG Zusammensetzung und Verfahren zur Synthese neuartiger Tracer zum


Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin in Proben Erfindungsgebiet Diese Erfindung
betrifft neuartige Tracer und deren Synthese und Verwendung in einem Immunoassay zum
Nachweis kontrollierter Arzneimittel wie Amphetamin (APM), Methamphetamin (MAPM) und ihre
Derivate in einer biologischen oder wässrigen Probe. Insbesondere stellt diese Erfindung
Verfahren zur Synthese neuer Tracer bereit, bei denen eine nicht kontrollierte Substanz sowohl
das Ausgangsmaterial bei der Tracersynthese als auch die Bindungsstelle auf dem resultierenden
neuen Tracer für den Antikörper ist, wodurch die Notwendigkeit der Verwendung kontrollierter
Substanzen als Ausgangsmaterialien beseitigt wird. Zusätzlich können die neuen Tracer der
vorliegenden Erfindung als Analytanalogon in einem Immunoassay verwendet werden, wie
beispielsweise einem Immunoassay mit kontinuierlicher Flussverdrängung. Ein Immunoassay mit
kontinuierlicher Flussverdrängung arbeitet nach einem Prinzip, bei dem immobilisierter Antikörper
zuerst mit einem markierten Analytanalogon gesättigt wird, das markierte Analytanalogon durch
den Analyten in der Testprobe verdrängt wird und das verdrängte markierte Analytanalogon dann
gemessen wird.
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DESCRIPTION Composition And Methods For Synthesis Of Novel Tracers For Detecting
Amphetamine And Methamphetamine In Samples Field Of Invention This invention relates to
novel tracers and their synthesis and use in an immunoassay for the detection of controlled drugs
such as amphetamine (APM), methamphetamine (MAPM) and their derivatives, in a biological or
aqueous sample. In particular, this invention provides methods for synthesizing novel tracers in
which a noncontrolled substance is both the starting material in tracer synthesis and the binding
site on the resulting novel tracer for the antibody, thereby eliminating the necessity of using
controlled substances as starting materials. In addition, the novel tracers of the present invention
can be used as an analyte analog in an immunoassay, such as a continuous flow displacement
immunoassay. A continuous flow displacement immunoassay works on a principle whereby

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immobilized antibody is first saturated with a labeled analyte analog, the labeled analyte analog is
displaced by the analyte in the testing sample, and the displaced labeled analyte analog is then
measured.

Es wurde unerwartet entdeckt, dass die neuen Tracer der vorliegenden Erfindung die Leistung des
Immunoassays mit kontinuierlicher Flussverdrängung im Vergleich zu herkömmlich entworfenen
Tracern wesentlich verbessern.
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It was unexpectedly discovered that the novel tracers of the present invention substantially
improve the performance of the continuous flow displacement immunoassay as compared with
conventionally designed tracers.

Hintergrund der Erfindung Amphetamin und Methamphetamin sind Derivate einer Verbindung, die
als Phenylethylamin bekannt ist. Sowohl Amphetamin als auch Methamphetamin sind
Stimulanzien des Zentralnervensystems und der sympathischen Teilung des peripheren
Nervensystems. Wie bei anderen Stimulanzien gehören zu den kurzfristigen Auswirkungen der
Einnahme von Amphetamin oder Methamphetamin eine erhöhte Herzfrequenz, ein erhöhter
Blutdruck, ein verringerter Appetit, eine Erweiterung der Pupillen, ein Gefühl des Glücks und der
Kraft sowie eine verringerte Müdigkeit. Aufgrund ihrer stimulierenden Wirkung werden diese
Verbindungen missbraucht und illegal verkauft.
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Background Of The Invention Amphetamine and methamphetamine are derivatives of a
compound known as a phenylethylamine. Both amphetamine and methamphetamine are
stimulants of the central nervous system and of the sympathetic division of the peripheral nervous
system. Like other stimulants, the short-term effects of amphetamine or methamphetamine intake
include increased heart rate, increased blood pressure, reduced appetite, dilation of the pupils,
feelings of happiness and power, and reduced fatigue. It is because of their stimulant effects that
these compounds are abused and sold illicitly.

Aufgrund des häufigen Missbrauchs von Amphetaminen und Methamphetaminen besteht ein
wachsender Bedarf an nicht-invasiven Schnelltests, um das Vorhandensein dieser Arzneimittel in
biologischen Proben nachzuweisen. In der Vergangenheit wurden Amphetamine in biologischen
Proben durch eine Reihe von Techniken wie Dünnschichtchromatographie (DC),
Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) und Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC /
MS) nachgewiesen. Diese Assays sind im Allgemeinen zeitaufwändig und weisen eine schlechte
Assayempfindlichkeit auf. Siehe Vapatalo, H. K.
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Due to common abuse of amphetamines and methamphetamines, there is a growing need for

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non-invasive, rapid tests to detect the presence of these drugs in biological specimens. In the
past, amphetamines in biological samples were detected by a number of techniques such as thin
layer chromatography (TLC), high pressure liquid chromatography (HPLC), and gas
chromatography/mass spectrometry (GC/MS). These assays are generally time consuming and
have poor assay sensitivity. See Vapatalo, H. K.

S und Senius, K. E., Vergleich von Speichel- und Urinproben beim


dünnschichtchromatographischen Nachweis von Stimulanzien des Zentralnervensystems, Intl. J.
Clin.
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S, and Senius, K. E., Comparison of Saliva and Urine Samples in Thin-Layer Chromatographic
Detection of Central Nervous System Stimulants, Intl. J. Clin.

Pharmacol. Res., 4: 5-8 (1984), Cook, C. E., et al., Pharmakokinetik von Methamphetamin, das
menschlichen Probanden durch Rauchen von s- (+) - Methamphetaminhydrochlorid, Drug Metab.
Dispos., 21: 717-723 (1993), S. Suzuki et al., Analyse von Methamphetamin in Haar, Nagel,
Schweiß und Speichel durch Massenfragmentographie, J. Anal.
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Pharmacol. Res., 4: 5-8 (1984), Cook, C. E., et al., Pharmacokinetics of Methamphetamine Self-
administered to Human Subjects by Smoking s- (+)-Methamphetamine hydrochloride, Drug Metab.
Dispos., 21: 717-723 (1993), Suzuki, S., et al., Analysis of Methamphetamine in Hair, Nail, Sweat,
and Saliva by Mass Fragmentography, J. Anal.

Toxicol., 13: 176-178 (1989), auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, als ob sie
vollständig dargelegt wären. Darüber hinaus sind sie insofern schwierig, als hochqualifiziertes
Personal für die Durchführung von DC-, HPLC- und GC / MS-Assays erforderlich ist.
Immunoassays haben bevorzugte alternative Verfahren zur Verwendung von DC-, HPLC- und GC
/ MS-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Amphetaminen und Methamphetaminen
bereitgestellt. Insbesondere haben Immunoassays eine verbesserte Empfindlichkeit, Effizienz und
sind weniger arbeitsintensiv. Eine Reihe von Immunoassay-Techniken zum Nachweis von
Amphetaminen und Methamphetaminen im Urin wurde entwickelt. Siehe Brynes et al. al. EPA Nr.
279,213 B1, Hu et. al., EPO # 371,422A2 und Helman et. al., EPA # 371,253 A2, auf die hiermit
ausdrücklich Bezug genommen wird, als ob sie vollständig dargelegt wären. Ferner hat sich der
Immunoassay mit kontinuierlicher Flussverdrängung als nützliches und schnelles Verfahren zum
Nachweis von Drogenmissbrauch in Speichel und Urin erwiesen. Siehe Hao Yu et al.,
Verwendung des USDT-Flow-Immunosensors zur Quantifizierung von Benzolecgonin in Urin,
Biosensoren und Bioelektronik, 725-734 (1996); Nam, D. et al. Programm und Abstracts von
TIAFT 2000 in Helsinki, 2000; Liang, G. et al., Proc. von ICADTS 2000, 22.-26. Juni 2000, auf die

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hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, als ob sie vollständig dargelegt wären.
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Toxicol., 13: 176-178 (1989), which are incorporated herein by reference as if fully set forth. In
addition, they are difficult in that highly trained personnel are required to perform TLC, HPLC and
GC/MS assays. Immunoassays have provided preferable alternative methods to using TLC, HPLC
and GC/MS assays for the detection and quantitation of amphetamines and methamphetamines.
In particular, immunoassays have improved sensitivity, efficiency and are less labor intensive. A
number of immunoassay techniques for detecting amphetamines and methamphetamines in urine
have been developed. See Brynes, et. al. EPO # 279,213 B1, Hu et. al., EPO # 371,422A2, and
Helman et. al., EPO # 371,253 A2 which are incorporated herein by reference as if fully set forth.
Further, the continuous flow displacement immunoassay has been demonstrated as a useful and
rapid method for detecting drugs of abuse in saliva and urine. See Hao Yu et al., Use of the USDT
Flow Immunosensor for Quantitation of Benzolecgonine in Urine, Biosensors and Bioelectronics,
725-734 (1996); Nam, D. et al. Programme and Abstracts of TIAFT 2000 at Helsinki, 2000; Liang,
G., et al., Proc. of ICADTS 2000, June 22-26, 2000, which are incorporated herein by reference as
if fully set forth.

Ein hier verwendeter Tracer ist ein markiertes Antigen oder Hapten, das in einem Immunoassay
verwendet wird, um mit der speziellen interessierenden Substanz (dem Analyten) um
Antigenbindungsstellen eines Antikörpers zu konkurrieren. Der Tracer kann ein markiertes Antigen
oder Hapten sein, das mit dem nachzuweisenden Analyten identisch ist, oder er kann so
modifiziert werden, dass er strukturell mit dem Analyten verwandt ist und die gewünschte
Kreuzreaktivität gegenüber dem ausgewählten Antikörper aufweist. In einem Immunoassay mit
kontinuierlicher Flussverdrängung kann beispielsweise eine Modifikation des markierten Antigens
oder Haptens, die die Bindungsaffinität verringert, tatsächlich die Verdrängungsreaktion und
folglich die Empfindlichkeit des Systems verbessern. Zum Nachweis illegaler Drogen verwendeten
die meisten Immunoassays im Allgemeinen die illegalen Drogen selbst, d.h. e. gekennzeichnete
Amphetamine und Methamphetamine als Tracer zum Nachweis des Vorhandenseins und / oder
der Menge dieser Substanzen in der Probe. Da diese Medikamente illegal sind, werden sie im
Labor von einer Reihe von Verfahrensrichtlinien und Unterlagen begleitet.
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A tracer as used herein is a labeled antigen or hapten used in an immunoassay to compete with
the particular substance of interest (the analyte) for antigen binding sites of an antibody. The
tracer can be a labeled antigen or hapten identical to the analyte to be detected, or it can be
modified in such a way that it is structurally related to the analyte and has the desired cross-
reactivity toward the selected antibody. In a continuous flow displacement immunoassay for
example, a modification to the labeled antigen or hapten that decreases binding affinity may
actually enhance the displacement reaction, and consequently the sensitivity of the system. For
detection of illicit drugs, most immunoassays generally used the illicit drugs themselves, i. e.
labeled amphetamines and methamphetamines, as tracers to detect the presence and or quantity

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of these substances in the sample. Because these drugs are illegal, a series of procedural
guidelines and paperwork accompanies their utilization in the laboratory.

Kürzlich wurde über die Verwendung nicht kontrollierter Substanzen als Ausgangsmaterialien bei
der Amphetamin- und Methamphetamin-Tracersynthese berichtet (Heiman, D., et al., EP 0 371
233 A2), aber der endgültig synthetisierte Tracer enthält immer noch das Amphetaminmolekül
selbst als Bindungsstelle für die Anti-Amphetamin-Antikörper.
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Recent use of non-controlled substances as starting materials in amphetamine and
methamphetamine tracer synthesis has been reported (Heiman, D., et al. EP 0 371 233 A2), but
the final tracer synthesized still contains the amphetamine molecule itself as the binding site for
the anti-amphetamine antibodies.

Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es verschiedene Möglichkeiten, Tracer zu synthetisieren. Eine der
gebräuchlichen Methoden der Tracersynthese besteht darin, illegale Drogen wie Amphetamine
und Methamphetamine als Ausgangsmaterialien zu verwenden. (Salamamone, S. et al., EP 0 386
644 A2) Diese Ausgangsmaterialien werden durch mehrere Syntheseschritte geführt, um einen
Tracer auf Arzneimittelbasis zu erhalten. (Siehe Abbildung 1, Methode A.) Eine andere alternative
Methode zur Synthese von Tracern umfasst die Verwendung nicht kontrollierter Substanzen als
Ausgangsmaterialien, um einen Tracer auf Arzneimittelbasis zu erhalten. (Heiman, D.F. et al., EP
0 371 233 A2) (Siehe 1, Methode B.) Bei beiden Methoden umfassen die Synthesewege die
illegalen Drogen als Ausgangsmaterialien, Zwischenprodukte oder endgültig hergestellten Tracer.
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As shown in Figure 1, there are different ways of synthesizing tracers. One of the common
methods of tracer synthesis involves using the illicit drugs, such as amphetamines and
methamphetamines, as the starting materials. (Salamamone, S. et al, EP 0 386 644 A2) These
starting materials are carried through multiple synthesis steps to yield a drug-based tracer. (See
Figure 1, Method A.) Another alternative method of synthesizing tracers involves the use of non-
controlled substances as starting materials to yield a drug-based tracer. (Heiman, D. F. et al., EP 0
371 233 A2) (See Figure 1, Method B.) In both these methods, the synthesis routes involve the
illicit drugs as starting materials, intermediates or final prepared tracer.

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Synthese eines neuen Satzes von Tracern bereit,
die aus nicht kontrollierten Substanzen hergestellt wurden, wobei eine markierte nicht kontrollierte
Substanz als Tracer erhalten wurde (siehe 1, Verfahren C). Die Synthese dieser nicht auf Drogen
basierenden Tracer beinhaltet zu keinem Zeitpunkt des Synthesevorgangs die Herstellung
illegaler Drogen. Wir haben festgestellt, dass diese neuen Tracer ideal für die Verwendung in
Immunoassays sind, die das Vorhandensein und / oder die Menge von Amphetaminen und

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Methamphetaminen in biologischen oder wässrigen Proben nachweisen. Wir haben festgestellt,
dass es nicht notwendig ist, den spezifisch markierten Analyten selbst (d. H. Amphetamin) als
Tracer zu haben, solange der Antikörper im Immunoassay-System mit einer gegenüber dem des
Analyten in den biologischen Proben verringerten Affinität an den Tracer bindet.
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The present invention provides methods for the synthesis of a novel set of tracers produced from
non-controlled substances yielding a labeled non-controlled substance as the tracer (See Figure 1,
Method C). The synthesis of these non-drug based tracers does not involve the production of illicit
drugs at any point in the synthesis process. We have found that these novel tracers are ideal for
use in immunoassays detecting the presence and/or quantity of amphetamines and
methamphetamines in biological or aqueous samples. We have found that it is not necessary to
have the specific labeled analyte itself (i. e., amphetamine) as the tracer as long as the antibody in
the immunoassay system binds to the tracer with a decreased affinity from that of the analyte in
the biological samples.

Die neuen Tracer der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich bei dem Immunoassay mit
kontinuierlicher Flussverdrängung.
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The novel tracers of the present invention are particularly useful in the continuous flow
displacement immunoassay.

Zusammenfassung der Erfindung Diese Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen, die zur
Verwendung in Immunoassays zum Nachweis von Amphetamin (APM), Methamphetamin (MAPM)
und ihren Derivaten in biologischen oder wässrigen Proben geeignet sind. Die in dieser Erfindung
entwickelten Tracersynthesemethoden eliminieren die Verwendung der illegalen Drogen, d.h. e.
Amphetamin und Methamphetamin als Ausgangsmaterialien für oder Produkte der
Tracersynthese. Diese nicht auf Arzneimitteln basierenden Tracer sind besonders nützlich für den
Immunoassay mit kontinuierlicher Flussverdrängung. Die vorliegende Erfindung beschreibt die
Verfahren zur Synthese der neuen Tracer und die Anwendung dieser Tracer in
Fluoreszenzimmunoassays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Phenylethylaminderivaten
in biologischen Proben.
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Summary Of The Invention This invention relates to novel compositions suitable for use in
immunoassays for detecting amphetamine (APM), methamphetamine (MAPM) and their
derivatives in biological or aqueous samples. The tracer synthesis methods developed in this
invention eliminate the use of the illicit drugs, i. e. amphetamine and methamphetamine, as the
starting materials for or products of tracer synthesis. These non-drug based tracers are particularly
useful for the continuous flow displacement immunoassay. The present invention describes the
processes for synthesizing the novel tracers, and the application of these tracers in fluorescence

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immunoassays for the detection and quantitation of phenylethylamine derivatives in biological
samples.

Abbildung 2 zeigt die Grundstrukturen von Amphetamin und Methamphetamin.


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Figure 2 depicts the basic structures of amphetamine and methamphetamine.

Amphetamin und Methamphetamin sind Beispiele für die Analyten, die in den Immunoassays der
vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können. Amphetamin hat einen n-Wert von 1. Die
Tracer dieser Erfindung haben den n-Wert größer als 1. Die bevorzugten Tracer haben einen n-
Wert von 2 oder mehr. Die 3 und 4 zeigen übliche fluoreszierende Markierungen, die bei der
Tracersynthese dieser Erfindung verwendet werden können.
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Amphetamine and methamphetamine are examples of the analytes that can be detected in the
immunoassays of the present invention. Amphetamine has an n value of 1. The tracers of this
invention have the n value of greater than 1. The preferred tracers have an n value that is 2 or
more. Figures 3 and 4 show common fluorescent labels that can be used in the tracer synthesis of
this invention.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der synthetische neue Tracer die
Verbindung, markiert mit 1-Methyl-3-phenylalkylamin, die in 5 dargestellt ist.
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In one embodiment of the present invention, the synthetic novel tracer is the compound, labeled
1-methyl-3-phenylalkylamine, which is depicted in Figure 5.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der synthetische neue Tracer die
Verbindung N-markiertes 1-Methyl-3-phenylalkylamin, die in 6 dargestellt ist.
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In another embodiment of the present invention, the synthetic novel tracer is the compound N-
labeled l-methyl-3-phenylalkylamine, which is depicted in Figure 6.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der synthetische neue Tracer
eine Verbindung, die mit N-Methyl-1-methyl-3-phenylallcylamin markiert ist und in 7 dargestellt ist.
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In another embodiment of the present invention, the synthetic novel tracer is a compound labeled
N-methyl-l-methyl-3-phenylallcylamine, which is depicted in Figure 7.

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In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der synthetische neue Tracer
eine Verbindung N-markiertes N-Methyl-1-methyl-3-phenylalkylamin, die in 8 dargestellt ist.
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In another embodiment of the present invention, the synthetic novel tracer is a compound N-
labeled N-methyl-l-methyl-3-phenylalkylamine, which is depicted in Figure 8.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der synthetische neue
Tracer das Reaktionsprodukt des Succinidyl-aktiven Esters von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-
phenylpropylamin-N-trifluoracetamid mit Cy5EDA, wie in den 9 und 10 gezeigt. Der bevorzugte
Tracer wird nach dem in Beispiel II beschriebenen Verfahren synthetisiert.
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In a preferred embodiment of the present invention, the synthetic novel tracer is the reaction
product of succinidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3- phenylpropylamine-N-
trifluoroacetamid with Cy5EDA shown in Figures 9 and 10. The preferred tracer is synthesized by
the method described in Example II.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Abbildung 1 zeigt Methoden zur Herstellung des Tracers.
Methode A beinhaltet die Verwendung illegaler Drogen als Ausgangsmaterial, um einen
drogenbasierten Tracer zu erhalten. Methode B beinhaltet die Verwendung von nicht kontrollierten
Substanzen, um einen Tracer auf Arzneimittelbasis zu erhalten. Das Verfahren C offenbart das
Verfahren der vorliegenden Erfindung der Tracersynthese unter Verwendung nicht kontrollierter
Substanzen als Ausgangsmaterialien und Erzielung eines Tracers ohne Arzneimittel.
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Brief Description Of The Drawings Figure 1 shows methods of tracer preparation. Method A
involves the use of illicit drugs as starting materials to yield a drug-based tracer. Method B
involves the use of noncontrolled substances to yield a drug-based tracer. Method C discloses the
method of the present invention of tracer synthesis using non-controlled substances as starting
materials and yielding a non-drug-based tracer.

Abbildung 2 zeigt die Grundstrukturen von Amphetamin und Methamphetamin.


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Figure 2 shows the basic structures of amphetamine and methamphetamine.

Die 3 und 4 zeigen übliche fluoreszierende Markierungen, die bei der Tracer-Herstellung dieser
Erfindung verwendet werden können.

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Figures 3 and 4 show common fluorescent labels that can be used in the tracer preparation of this
invention.

5 zeigt die synthetische neue Tracerverbindung N-markiertes 1-Methyl-3-phenylalkylylamin.


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Figure 5 depicts the synthetic novel tracer compound N-labeled l-methyl-3phenylalkylylamine.

Fig. 6 zeigt die synthetische neue Tracerverbindung, die mit 1-Methyl-3-phenylalkylamin markiert
ist.
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Figure 6 depicts the synthetic novel tracer compound labeled 1-methyl-3 phenylalkylamine.

Fig. 7 zeigt die synthetische neue Tracerverbindung, die mit N-Methyl-1-methyl-3-phenylalkylamin


markiert ist.
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Figure 7 depicts the synthetic novel tracer compound labeled N-methyl-l-methyl3-
phenylalkylamine.

Fig. 8 zeigt die synthetische neue Tracerverbindung N-markiertes N-Methyl-1-methyl-3-


phenylalkylamin.
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Figure 8 depicts the synthetic novel tracer compound N-labeled N-methyl-lmethyl-3-
phenylalkylamine.

9 zeigt die bevorzugten synthetischen neuen Tracerverbindungen, die das Reaktionsprodukt des
Succinimidyl-Aktivesters von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-trifluoracetamid
sind, das mit Cy5EDA markiert ist.
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Figure 9 depicts the preferred synthetic novel tracer compounds which are the reaction product of
succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3- phenylpropylamine-N-trifluoroacetamid
labeled with Cy5EDA.

10 zeigt die bevorzugten synthetischen neuen Tracerverbindungen, die das Reaktionsprodukt des
Succinimidyl-Aktivesters von para-Hemisuccinito-N-methyl-1-methyl-3phenylpropylamin-N-

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trifluoracetamid sind, das mit Cy5EDA markiert ist.
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Figure 10 depicts the preferred synthetic novel tracer compounds which are the reaction product
of succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-N-methyl-l-methyl 3phenylpropylamine-N-
trifluoroacetamid labeled with Cy5EDA.

Fig. 11 zeigt einen herkömmlichen (arzneimittelbasierten) Tracer GW5-12.


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Figure 11 depicts a conventional (drug based) tracer GW5-12.

Fig. 12 ist ein Flussdiagramm, das die allgemeinen Verfahren zur Herstellung von p ', m'- und o'-
substituierten Amphetamin-Tracern darstellt.
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Figure 12 is a flow-chart setting forth the general procedures for preparation of p', m'and o'-
substituted amphetamine tracers.

Fig. 13 ist ein Flussdiagramm, das das Verfahren zur Synthese eines der bevorzugten Tracer der
vorliegenden Erfindung darstellt.
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Figure 13 is a flow-chart setting forth the procedure for synthesis of one of the preferred tracers of
the present invention.

Die 14 und 15 zeigen den Vergleich des Durchflussimmunoassays von Amphetamin mit dem
bevorzugten Tracer GW3-38 und dem herkömmlichen Tracer GW5-12.
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Figures 14 and 15 show the comparison of the flow immunoassay of amphetamine with the
preferred tracer GW3-38 and the conventional tracer GW5-12.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Diese Erfindung stellt


Zusammensetzungen und Verfahren zur Synthese von Verbindungen zur Verwendung in
Fluoreszenzimmunoassays zum Nachweis des Vorhandenseins und / oder der Menge von
Amphetamin, Methamphetamin und ihren Derivaten in biologischen Proben bereit. Die
Zusammensetzungen oder Tracer zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetaminen in
biologischen Proben eignen sich besonders für Immunoassays mit kontinuierlicher
Flussverdrängung.
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Detailed Description Of The Preferred Embodiments This invention provides compositions and
methods for synthesizing compounds for use in fluorescence immunoassays for detecting the
presence and or quantity of amphetamine, methamphetamine and their derivatives in biological
samples. The compositions or tracers for the detection of amphetamine and methamphetamines in
biological samples are especially suitable for continuous flow displacement immunoassays.

Bei Immunoassays mit kontinuierlicher Flussverdrängung spielen die kinetischen Eigenschaften


des Analyten und des Antikörpers eine sehr wichtige Rolle. Ein Analyt ist die Substanz, die in
einem Immunoassay getestet wird. Beispielsweise kann in der vorliegenden Erfindung der Analyt
Amphetamin oder Methamphetamin sein. Ein Antikörper erkennt und kann spezifisch an den
Analyten binden. Ein Tracer ist eine markierte Verbindung, die mit dem Analyten um die Bindung
an den Antikörper konkurriert. Die vorliegende Erfindung verwendet einen Tracer, der drei Teile
aufweist, nämlich eine Stelle, die an einen Antikörper, eine Verknüpfungsgruppe und eine
Markierung bindet. Die Stelle auf dem Analyten, die an den Antikörper bindet, ähnelt
normalerweise der Stelle auf dem Tracer, die an den Antikörper bindet.
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In continuous flow displacement immunoassays, the kinetic properties of the analyte and the
antibody play a very important role. An analyte is the substance being tested in an immunoassay.
For instance, in the present invention, the analyte can be amphetamine or methamphetamine. An
antibody recognizes and is capable of specifically binding to the analyte. A tracer is a labeled
compound that competes with the analyte for binding to the antibody. The present invention uses
a tracer that has three parts, namely, a site that binds to an antibody, a linking group, and a label.
The site on the analyte that binds to the antibody is usually similar to the site on the tracer that
binds to the antibody.

Mit anderen Worten, wenn der Analyt Amphetamin ist, erkennt der Antikörper gegen Amphetamin
die gleiche Bindungsstelle auf dem Tracer, die er auf dem Analyten erkennt.
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In other words, if the analyte is amphetamine, the antibody to amphetamine recognizes the same
binding site on the tracer that it recognizes on the analyte.

Ein typischer Immunoassay mit kontinuierlicher Verdrängung beinhaltet einen


festphasenimmobilisierten Antikörper gegen Amphetamin oder Methamphetamin. Die
Antigenbindungsstelle des Antikörpers wird einem synthetisch markierten Tracer ausgesetzt, um
einen markierten synthetischen Tracerantikörperkomplex zu bilden. Der Antikörper wird Tracern
ausgesetzt, so dass die Antigenbindungsstellen des Antikörpers mit den markierten synthetischen
Tracern gesättigt sind. Als nächstes wird eine biologische Probe, von der vermutet wird, dass sie
den Analyten Amphetamin oder Methamphetamin enthält, kontinuierlich an dem mit

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festphasenimmobilisierten Antikörpern markierten synthetischen Tracerkomplex vorbeigeflossen.
Wenn der Analyt in der Probe vorhanden ist, bindet der Analyt an den Antikörper und verdrängt
den markierten synthetischen Tracer. Der Nachweis des markierten Tracers stromabwärts vom
Bindungspunkt zeigt daher das Vorhandensein und / oder die Menge des in der biologischen
Probe vorhandenen Analyten. Siehe Ligler et al., US-Patent Nr. 5,183,740, auf das hiermit
ausdrücklich Bezug genommen wird, als ob es vollständig dargelegt wäre.
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A typical continuous flow displacement immunoassay involves a solid-phase immobilized antibody
to amphetamine or methamphetamine. The antigen binding site of the antibody is exposed to a
synthetic labeled tracer to form a labeled synthetic tracerantibody complex. The antibody is
exposed to tracers such that the antigen binding sites of the antibody are saturated with the
labeled synthetic tracers. Next, a biological sample suspected of containing the analyte,
amphetamine or methamphetamine, is continuously flowed past the solid-phase immobilized
antibody-labeled synthetic tracer complex. If analyte is present in the sample, the analyte binds to
the antibody and displaces the labeled synthetic tracer. Detection of the labeled tracer
downstream from the binding point hence shows the presence and or quantity of the analyte
present in the biological sample. See Ligler, et al., U. S. Patent No. 5,183,740, which is
incorporated herein by reference as if fully set forth..

Der Erfolg der Entwicklung eines auf einem kontinuierlichen Flussverdrängungs-Immunoassay


basierenden Produkts basiert auf der Auswahl von Antikörper und Tracer, um eine schnelle
Dissoziationsrate des gebundenen Tracers vom Antikörper zu erreichen, wodurch eine schnelle
Bindung des Analyten ermöglicht wird.
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The success of developing a continuous flow displacement immunoassay based product, is
based on the selection of antibody and tracer to achieve a fast dissociation rate of the bound
tracer from the antibody, thereby permitting a rapid binding of the analyte.

Im Allgemeinen verwendet der ideale Immunoassay mit kontinuierlicher Flussverdrängung ein


System, bei dem der Antikörper eine hohe Affinität für den Analyten und eine niedrigere Affinität
für den Tracer aufweist. Diese Anordnung, bei der der Antikörper eine hohe Affinität für den
Analyten und eine niedrigere Affinität für den Tracer aufweist, fördert eine schnellere
Verdrängung. In der vorliegenden Erfindung verkörpern die Tracer die folgende Eigenschaft: Die
Affinität des Tracers für den Antikörper liegt irgendwo zwischen 20100%. Ein bevorzugter Tracer
hat eine Kreuzreaktivität von etwa 40 bis 80% für den Antikörper. Für die Zwecke dieser Erfindung
ist es unerheblich, dass der Tracer strukturell mit dem Analyten, Amphetamin oder
Methamphetamin verwandt ist. Solange die Ligandenbindungsstelle des Tracers eine
Kreuzreaktivität von 20-100% mit dem Antikörper aufweist, ist sie zur Verwendung in einem
Immunoassay geeignet, insbesondere dem Immunoassay mit kontinuierlicher Flussverdrängung.

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Die meisten Antikörper gegen Amphetamin und Methamphetamin erkennen die
Phenylethylaminderivate. Die vorliegenden Tracer sind nützlich, solange die Antikörper die
Phenylethylaminanaloga erkennen können.
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In general, the ideal continuous flow displacement immunoassay utilizes a system where the
antibody has a high affinity for the analyte, and a lower affinity for the tracer. This arrangement
where the antibody has a high affinity for the analyte and a lower affinity for the tracer promotes
faster displacement. In the present invention, the tracers embody the following characteristic: the
affinity of the tracer for the antibody is anywhere between 20100%. A preferred tracer has about
40-80% cross-reactivity for the antibody. For the purposes of this invention, it is immaterial that the
tracer be structurally related to the analyte, amphetamine or methamphetamine. So long as the
ligand-binding site of the tracer has 20-100% cross-reactivity with the antibody, it is suitable for
use in an immunoassay, especially, the continuous flow displacement immunoassay. Most
antibodies to amphetamine and methamphetamine recognize the phenylethylamine derivatives.
The present tracers are useful, so long as the antibodies are capable of recognizing the
phenylethylamine analogs.

Eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem Analyten steht nicht zur Debatte. Diese Eigenschaft, die
strukturelle Unähnlichkeit zwischen dem Tracer und dem Analyten, unterscheidet die vorliegenden
Tracer von denen des Standes der Technik.
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Structural similarity to the analyte is not at issue. This characteristic, the structural dissimilarity
between the tracer and the analyte, distinguishes the present tracers from those of prior art.

Das Markieren des Tracers kann mittels herkömmlicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren
durchgeführt werden. Die Markierung selbst kann geeigneterweise ein Fluorophor, ein
Chromophor, eine radioaktive Markierung, ein Metallkolloid, ein Enzym oder ein
chemilumineszierendes oder biolumineszierendes Molekül sein.
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Labeling of the tracer may be carried out by means of conventional methods well known in the art.
The label itself may suitably be a fluorophore, a chromophore, a radiolabel, a metal colloid, an
enzyme, or a chemiluminescent or bioluminescent molecule.

Geeignete Fluorophore und Chromophore sind in R.P. Haugland, Molecular Probes, Handbuch für
fluoreszierende Sonden und Forschungschemikalien, 5. Auflage, Molecular Probes, Inc., Eugene,
Oregon, 1992, offenbart, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Beispiele für
bevorzugte Fluorophore umfassen Fluorescein, Rodamin und Sulfoindocyaninfarbstoff Cy5
(Mujumdar, R. B., et al., Bioconjugate Chemistry, Vol. 4, p. 105 (1992).

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Suitable fluorophores and chromophores are disclosed in R. P. Haugland, Molecular Probes,
Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5th Ed., Molecular Probes, Inc.,
Eugene, Oreg., 1992, which is incorporated herein by reference. Examples of preferred
fluorophores include fluorescein, rodamine, and sulfoindocyanine dye Cy5 (Mujumdar, R. B., et al.,
Bioconjugate Chemistry, vol. 4, p. 105 (1992).

Ein umfangreiches Spektrum von Antikörpern, die zur Verwendung in dieser Erfindung anwendbar
sind, sind im Handel erhältlich (zum Beispiel von Omega Biologicals, Inc., 910 Technology Blvd.,
Bozeman, MT) oder können aus Beschreibungen von in der Literatur verfügbaren
Herstellungsverfahren hergestellt werden. Alle Antikörper, wie monoklonale oder polyklonale
Antikörper, die im Handel erhältlich oder in der Literatur beschrieben sind, können zur
Identifizierung eines weiten Bereichs von Zielen eingesetzt oder an das erfindungsgemäße
Verfahren angepasst werden.
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An extensive range of antibodies applicable for use in this invention are commercially available
(for example, from Omega Biologicals, Inc., 910 Technology Blvd., Bozeman, MT) or can be made
from descriptions of methods of preparation available in the literature. Any antibodies, such as
monoclonal or polyclonal antibodies, which are commercially available or described in the
literature can be employed or adapted to the method of this invention for identification of a wide
range of targets.

Das Verfahren kann verwendet werden, um spezifische Komponenten von biologischen oder
wässrigen Proben nachzuweisen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wasser, Blut, Plasma,
Serum, Blut oder Urin. Speichel hat sich als nützliche Testmatrix zum Nachweis und zur Messung
von Drogenmissbrauch erwiesen. ("Speichel als diagnostische Flüssigkeit", Hrsg. Von D.
Malamud und L. Tabak, Annalen der New Yorker Akademie der Wissenschaften, 1993, V. 694. )
Beispielsweise kann Methamphetamin in Speichelproben bis zu 2 Tage nach der letzten Dosis
durch GC / MASS nachgewiesen werden. (S. Suzuki, T. Inoue und S. Inayama, Analyse von
Methamphetamin in Haaren, Nägeln, Schweiß und Speichel durch Massenfragmentographie, J.
Anal. Toxicol. 1989,13,176-178. ) Die folgenden Beispiele veranschaulichen die spezifischen
Anwendungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich spezifischer Techniken, die zur
Durchführung der Erfindung verwendet werden können. Diese spezifischen Beispiele sollen den
Umfang der in der Anmeldung beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
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The method can be used to detect specific components of biological or aqueous samples,
including but not limited to water, blood, plasma, serum, blood or urine. Saliva has been
demonstrated as a useful test matrix for the detection and measurement of drugs of abuse.
("Saliva as a Diagnostic Fluid", Ed by D. Malamud and L. Tabak, Annals of the New York

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Academy of Sciences, 1993, V. 694. ) For example, methamphetamine in saliva samples can be
detected by GC/MASS up to 2 days after the last dose. (S. Suzuki, T. Inoue and S. Inayama,
Analysis of methamphetamine in hair, nail, sweat, and saliva by mass fragmentography, J. Anal.
Toxicol. 1989,13,176-178. ) The following examples are giving to illustrate the specific applications
of the present invention including specific techniques which can be used to perform the invention.
These specific examples are not intended to limit the scope of the invention described in the
application.

Beispiel I - Allgemeines Verfahren zur Herstellung eines markierten Tracers Ein Flussdiagramm
für die Synthese eines p ', o'- und m'-substituierten Tracers ist in Abbildung 12 dargestellt. Es folgt
eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitungsschritte.
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Example I-General Procedure for Preparation of Labeled Tracer A flow-chart for the synthesis of a
p', o'and m'-substituted tracers is set forth in Figure 12. A detailed description of the steps for
preparation follows.

A. Herstellung und Isolierung von para, meta und ortho-Nitroamphetamin-N-trifluoracetamid.


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A. Preparation and Isolation of para, meta, and ortho-nitroamphetamine-N- trifluoroacetamide.

0.7 ml Trifluoressigsäureanhydrid wurden langsam zu einer Lösung eines Gemisches aus 0,4 g
para-, meta- und ortho-Nitroamphetamin in 1 ml Acetronitril bei 0 ° C gegeben. Das resultierende
Gemisch wurde eine Stunde bei 0 ° C gerührt und aufbewahrt im Kühlschrank bei 4 ° C über
Nacht. Das flüchtige Material wurde entfernt und das Rohprodukt mit einer Kieselgelsäule
gereinigt und mit 1: 2 Ethylacetat / Hexan eluiert. Auf diese Weise wurden 0,15 g eines reinen
para-Nitroamphetamin-N-trifluroacetamids, 0,03 g eines reinen meta-Nitroamphetamin-
Ntrifluoracetamids und 0,04 g eines reinen ortho-Nitroamphetamin-N-trifluoracetamids erhalten.
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0.7 mL of trifluoroacetic anhydride was added slowly to a solution of a mixture of 0.4 g of para-,
meta-, and ortho-nitroamphetamine in 1mL of acetronitrile at 0 C. The resulting mixture was stirred
at 0 C for one hour, and was kept in the refrigerator at 4 C overnight. The volatile material was
removed and the crude product was purified with a silica gel column and eluted with 1: 2 Ethyl
acetate/hexane. In this manner, 0. 15g of a pure para-nitroamphetamine-N-trifluroacetamide,
0.03g of a pure meta-nitroamphetamine-Ntrifluoroacetamide, and 0.04g of a pure ortho-
nitroamphetamine-N-trifluoroacetamide was obtained.

B. Herstellung von para-Aminoamphetamin-N-trifluoracetamid: 0,15 g hergestelltes para-

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Nitroamphetamin-N-trifluoracetamid wurden in 8 ml Ethanol gelöst. 0.4Zu der Lösung wurden mg
10% Pd / C gegeben. Das Gemisch wurde unter Ha bei Raumtemperatur über Nacht hydriert. Der
Katalysator und das Lösungsmittel wurden entfernt, wobei ein dunkelgrüner Rückstand
zurückblieb. Die resultierende Mischung wurde durch präparative Siliciumdioxid-
Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer 1/1 Mischung von Ethylacetat / Hexan als
Entwicklungslösungsmittel gereinigt. 0.75So wurden mg des entsprechenden Aminprodukts
erhalten.
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B. Preparation of para-aminoamphetamine-N-trifluoroacetamide : 0. 15g of prepared para-
nitroamphetamine-N-trifluoroacetamide was dissolved in 8ml of Ethanol. 0.4mg of 10% Pd/C was
added to the solution. The mixture was hydrogenated under Ha at room temperature overnight.
The catalyst and solvent were removed, leaving a dark green residue. The resulting mixture was
purified by preparative silica thin layer chromatography, using a 1/1 mix of Ethyl acetate/Hexane
as a developing solvent. 0.75mg of the corresponding amine product was thus obtained.

Herstellung von Para-Isothiocyanatoamphetamin-N-trifluoracetamid: Eine Mischung von 25 mg


para-Aminoamphetamin-N-trifluoracetamid in 0,5 ml Dichlormethan wurde gerührt und 15 u1
NaHCO 3 und Thiophosgen wurden zu der Mischung gegeben. Die resultierende Mischung wurde
30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde als nächstes mit einer
Siliciumdioxidplatte gereinigt, wobei 21 mg Paraisothiocyanantoamphetamin-N-trifluroacetamid
erhalten wurden.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
C. Preparationofpara-isothiocyanatoamphetamine-N-trifluoroacetamide : A mixture of 25mg of
para-aminoamphetamine-N-trifluoroacetamide in 0. 5ml of dichloromethane was stirred, and 15,
u1 of NaHCO3 and thiophosgene were added to the mixture. The resulting mix was stirred at room
temperature for 30 minutes. The reaction mixture was next purified with a silica plate, giving 21 mg
of paraisothiocyanantoamphetamine-N-trifluroacetamide.

D. Kupplung von para-Isothiocyanatoamphetamin-N-fluorpacetamid mit Cv5EDA: Eine Mischung


aus 2 mg para-Isothiocyanatoamphetamin-N-trifluoracetamid und Cy5EDA in 0,5 ml Boratpuffer
(pH 8) wurde vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
D. Coupling of para-isothiocyanatoamphetamine-N-fluorpacetamide with Cv5EDA : A mixture of
2mg of para-isothiocyanatoamphetamine-N-trifluoroacetamide and Cy5EDA in 0.5 ml of borate
buffer (pH 8) was stirred at room temperature for four hours.

Die resultierende Lösung wurde direkt auf eine C18-Platte getupft und mit 70/30 (v / v) Methanol /
Wasser entwickelt. Die Produktbande wurde ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert.

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The resulting solution was directly spotted onto a C18 plate, and developed with 70/30 (v/v)
Methanol/Water. The product band was cut out and extracted with methanol.

Beispiel II - Herstellung eines bevorzugten Amphetamin-Immunoassay-Tracers: Ein


Flussdiagramm für die Synthese eines bevorzugten Tracers ist in 13 dargestellt. Es folgt eine
detaillierte Beschreibung der Schritte zur Herstellung des Tracers.
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Example II--Preparation of a preferred amphetamine immunoassay tracer : A flow-chart for the
synthesis of a preferred tracer is set forth in Figure 13. A detailed description of the steps for
preparation of the tracer follows.

Schritt 1: Herstellung von 1-Methyl-3-phvlpropylamin-N-trifluoracetamid: Eine Lösung von 3 g 1-


Methyl-3-phenylpropylamin in 5 ml Acetronil wurde bei Raumtemperatur gerührt. 4 ml
Trifluoressigsäureanhydrid und 1,3 ml Pyridin wurden zu der Lösung bei Raumtemperatur
gegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt
und das Gemisch wurde dann in Eiswasser gegeben. Das Rohprodukt wurde mit Ethylacetat
extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden über Na 2 SO 4 getrocknet.
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Step 1 : Preparation of 1-methyl-3-phvlpropylamine-N-trifluoroacetamide : A solution of 3g of 1-
methyl-3-phenylpropylamine in 5 ml of acetronile was stirred at room temperature. 4mL of
trifluoroacetic anhydride and 1.3mL of pyridine were added to the solution at room temperature.
The resulting reaction mixture was stirred at room temperature overnight, and the mixture was
then placed in ice water. The crude product was extracted with ethyl acetate, and the combined
organic layers were dried over Na2S04.

Die Entfernung des organischen Lösungsmittels ergab 1-Methyl-3-phenylpropylamin-N-


trifluroacetamid.
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Removal of the organic solvent yielded 1-methyl-3-phenylpropylamine-N- trifluroacetamide.

Schritt 2: Herstellung von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-trifluoracetamid


Aids wurde zu einer Mischung aus 0,24 g Bernsteinsäureanhydrid und 0,4 g 1-Methyl-3-
phenylpropylamin-N-trifluoracetamid in 5 ml Dichlormethan gegeben Zimmertemperatur.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Step 2: Preparation of para-hemisuccinito-l-methyl-3-phenylpropylamine-N- trifluoroacetamide
Aids was added to a mixture of 0.24g succinic anhydride and 0.4g 1-methyl-3- phenylpropylamine-

10-04-2020 17
N-trifluoroacetamide in 5mL of dichloromethane at room temperature.

Die resultierende Mischung wurde eine Stunde bei 0 ° C gerührt und dann über Nacht bei
Raumtemperatur stehen gelassen. 5 ml 3 M wässrige HCl-Lösung wurden zu der Mischung
gegeben und die organischen Schichten wurden mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten
organischen Schichten wurden über Na 2 SO 4 getrocknet und ergaben ein Rohprodukt von 0,5 g.
Die weitere Reinigung des Rohprodukts wurde mit einer Kieselgelsäule abgeschlossen, wobei mit
1: 2 Ethyl / Hexanen eluiert wurde. 0.3Man erhielt g reines Parahemisuccinito-1-methyl-3-
phenylpropylamin-N-trifluoracetamid.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
The resulting mixture was stirred at 0 C for one hour and then left at room temperature overnight.
5ml of 3M aqueous HC1 solution was added to the mixture and the organic layers were extracted
with ethyl acetate. The combined organic layers were dried over Na2S04, and yielded a crude
product of 0. 5g. Further purification of the crude product was completed with a silica gel column,
eluting with 1: 2 ethyl/hexanes. 0.3g of pure parahemisuccinito-l-methyl-3-phenylpropylamine-N-
trifluoroacetamide was obtained.

Schritt 3: Reduktion von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenvlpropylamin-N-trifluoracetamid 0,2 g


des hergestellten para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-trifluroacetamids wurden in
3 ml Essigsäure gelöst. 0.3Zu der Lösung wurden mg 10% Pd / C gegeben. Das Gemisch wurde
über Nacht bei Raumtemperatur unter H & sub2; hydriert, und der Katalysator und das
Lösungsmittel wurden entfernt, wobei ein öliger Rückstand zurückblieb. Die resultierende
Mischung wurde durch präparative Kieselsäure-DC unter Verwendung von Ethylacetat / Hexan als
Entwicklungslösungsmittel in einem Verhältnis von 1: 1 gereinigt. Auf diese Weise wurden 83 mg
reines reduziertes para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-trifluroacetamid erhalten.
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Step 3: Reduction of para-hemisuccinito-l-methyl-3-phenvlpropylamine-N- trifluoroacetamide 0.2g
of the prepared para-hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamine-N- trifluroacetamide was
dissolved in 3ml of acetic acid. 0.3mg of 10% Pd/C was added to the solution. The mixture was
hydrogenated under H2 at room temperature overnight, and the catalyst and solvent were
removed, leaving an oily residue. The resulting mixture was purified by preparative silica TLC,
using ethyl acetate/hexane as a developing solvent in a ratio of 1 : 1. 83mg of pure reduced para-
hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamine-N- trifluroacetamide was thus obtained.

Schritt 4: Herstellung von Succinimidyl-Aktivester von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-


phenylpropylamin-N-trifluroacetamid 40 mg N, N'-Disuccinmidylcarbonat und 60 p1 Pyridin wurden
zu einer gerührten Mischung von 40 mg para-Hemi-Succinito gegeben -1-Methyl-3-
phenylpropylamin-N-trifluoracetamid in 1 ml Acetonitril. Die resultierende Mischung wurde 4

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Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reinigung des Reaktionsgemisches mit einer
Siliciumdioxidplatte ergab 25 mg Succinimidyl-Aktivester von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-
phenylpropylamin-N-trifluroacetamid.
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Step 4: Preparation of succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3-
phenylpropylamine-N-trifluroacetamide 40mg of N, N'-disuccinmidyl carbonate and 60p1 of
pyridine was added to a stirred mixture of 40mg para-hemi-succinito-1-methyl-3-
phenylpropylamine-N- trifluoroacetamide in 1mL of acetonitrile. The resulting mixture was stirred
at room temperature for 4 hours. Purification of the reaction mixture with a silica plate gave 25 mg
of succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3-phenylpropylamine-N-
trifluroacetamide.

Schritt 5: Coublin von Succinimidyl-Aktivester von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-


phenylproylamin-N-trifluoracetamid mit Cy5EDA Eine Mischung von 2 mg Succinimidyl-Aktivester
von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-trifluor und 2,5 mg Cy5EDA in 0,5 ml
Boratpuffer (pH 9) wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung
wurde mit einer C18-Platte gereinigt und mit Methanol und Wasser in einem Verhältnis von 70/30
(v / v) entwickelt. Die Produktbande wurde geschnitten und mit Methanol extrahiert. Das
gekoppelte Produkt ist der bevorzugte Amphetamin-Immunoassay-Tracer.
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Step 5 : Coublin of succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3- phenylproylamine-
N-trifluoroacetamide with Cy5EDA A mixture of 2mg of succinimidyl active ester of para-
hemisuccinito-1-methyl-3- phenylpropylamine-N-trifluoroacetamide and 2.5mg of Cy5EDA in 0.
5ml of borate buffer (pH 9) was stirred at room temperature for 4 hours. The resulting solution was
purified with a C18 plate, and developed with methanol and water in a ratio of 70/30 (v/v). The
product band was cut and extracted with methanol. The coupled product is the preferred
amphetamine immunoassay tracer.

Beispiel III: Flow Immunoassav-Verfahren LifePoint, Inc. hat das Flow Immunoassay-Instrument
entwickelt, das die erforderlichen Pumpen, Ventile, Schläuche, austauschbaren Säulen und
Fluoreszenzdetektoren für die Durchführung eines Immunoassays mit kontinuierlicher
Flussverdrängung enthält. Amphetaminstandards wurden hergestellt, indem Amphetamin (Sigma
Chemicals, St. Louis, MO) in verschiedenen Konzentrationen in den negativen Speichel gegeben
wurde. Chemikalien und Puffer wurden von Sigma und Aldrich, Company, erhalten.
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Example III: Flow Immunoassav Procedure LifePoint, Inc. developed the Flow Immunoassay
Instrument which contains the necessary pumps, valves, tubing, exchangeable columns and
fluorescence detector for performing a continuous flow displacement immunoassay. Amphetamine
standards were prepared by adding amphetamine (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) at different

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concentrations into the negative saliva. Chemicals and buffers were obtained from Sigma and
Aldrich, Company.

(a) Herstellung von Reagenzien Um das Vorhandensein von Amphetamin im Speichel zu


bestimmen, wurde ein spezifischer monoklonaler Anti-Amphetamin-Antikörper (erhältlich
beispielsweise von Omega Biologicals, Inc., Bozeman, MT) an poröse Emphase-Perlen gemäß
dem gekoppelt oder auf diesen immobilisiert Standardprotokoll des Herstellers. Die Antikörper-
gekoppelten Perlen wurden dann mit hergestellten Cy5-markierten Amphetamin-Tracern gesättigt.
Das resultierende Tracer-Antikörper-Harz-Komplex-Gemisch wurde über Nacht bei 4 ° C während
des Walzenmischens belassen. Das komplexe Harz wurde mit 0 gewaschen.
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(a) Preparation of Reagents To determine the presence of amphetamine in saliva, a specific anti-
amphetamine monoclonal antibody (available for example, from Omega Biologicals, Inc.,
Bozeman, MT) was coupled to or immobilized on Emphase porous beads according to the
manufacturer's standard protocol. The antibody-coupled beads were then saturated with prepared
Cy5-labeled amphetamine tracers. The resulting tracer-antibody-resin complex mixture was left
overnight at 4 C while roller mixing. The complex resin was washed with 0.

1
M PBS (10% MeOH), bis eine stabile Grundlinie erhalten wurde. Das gewaschene Harz wurde zu
einem gleichen Volumen von 150 mM Trehalosepuffer in 50 mM PBS (pH 7,4) gegeben. Das Harz
wurde gefriergetrocknet.
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M PBS (10% MeOH) until a stable baseline was obtained. The washed resin was added to an
equal volume of 150mM trehalose buffer in 50mM PBS (pH 7.4). The resin was freeze-dried.

(b) Fließassay Eine Mikropolystyrolsäule mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einer Länge
von 10 mm wurde mit 4 mg des hergestellten Harzes gefüllt. Die gefüllte Säule wurde in einen der
fünf Strömungskanäle des LifePoint Immunoassay Instruments eingebaut. Die Säule war mit
einem geeigneten Puffer vorgewaschen worden, der von einem automatischen System gesteuert
wurde, das von der Labview-Software (National Instruments, Inc.) unterstützt wurde. 50 ul der
Speichelprobe wurden mit einer Flussrate von 100 bis 300 pl / Minute durch den Kanal geleitet.
Die durchschnittliche Intensität des Fluoreszenzsignals wurde verwendet, um die Konzentration
von Amphetamin in der Probe zu bestimmen.
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(b) Flow Assay A micro-polystyrene column with an inner diameter of 2mm and a length of 10mm
was filled with 4mg of the prepared resin. The filled column was installed into one of the five flow
channels of the LifePoint Immunoassay Instrument. The column had been prewashed with an

10-04-2020 20
appropriate buffer controlled by an automatic system supported by Labview software (National
Instruments, Inc.). 50 ul of the saliva sample was passed through the channel at a flow rate of 100
to 300 pl/minute. The average intensity of the fluorescence signal was used to determine the
concentration of amphetamine in the sample.

Beispiel IV: Herstellung eines bevorzugten Methamphetamin-Immunoassay-Tracers Schritt 1:


Herstellung von N-Methyl-1-methv1-3-phenYlpropYlamin-N-trifluoracetamid: Eine Lösung von 0,4
g N-Methyl-1-methyl-3-phenylpropylamin in 1 ml Acetonitril wurden gerührt. 1 ml
Trifluoressigsäureanhydrid und 0,6 ml Pyridin wurden zu der Lösung bei Raumtemperatur
gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Als
nächstes wurde die Mischung in Eiswasser gegeben. Das Rohprodukt wurde mit Ethylacetat
extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt und über Na 2 SO 4 getrocknet.
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Example IV: Preparation of a preferred methamphetamine immunoassay tracer Step 1 :
Preparation of N-methyl-l-methv1-3-phenYlpropYlamine-N- trifluoroacetamide: A solution of 0.4 g
of N-methyl-l-methyl-3-phenylpropylamine in 1 ml of acetonitrile was stirred. 1 ml of trifluoroacetic
anhydride and 0.6 ml of pyridine was added to the solution at room temperature, and the resulting
mixture was stirred overnight at room temperature. Next, the mixture was placed in ice water. The
crude product was extracted with ethyl acetate, and the organic layers were combined and dried
over Na2S04.

Das gewünschte Produkt wurde durch Entfernen des organischen Lösungsmittels erhalten. Die
DC-Analyse stellte sicher, dass das Produkt für den nächsten Syntheseschritt rein genug war.
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The desired product was obtained by removal of the organic solvent. TLC analysis ensured that
the product was pure enough for the next synthesis step.

Schritt 2: Herstellung von p'-Hemisuccinito-N-methyl-1-methyl-3-phenylpropvlamin-N-


trifluoracetamid 0,2 g Aid; wurde zu einer Mischung von 0,1 g Bernsteinsäureanhydrid und 0,2 g
N-Methyl-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-trifluoracetamid in 5 ml Dichlormethan bei
Raumtemperatur gegeben. Die resultierende Mischung wurde 1 Stunde bei 2 bis 8 ° C gerührt und
dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu der Mischung wurden 2 ml 3 M
wässrige HCl-Lösung gegeben, und das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen
Schichten wurden vereinigt und über Na 2 SO 4 getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde
entfernt, um 0,2 g eines Rohprodukts zu erhalten.
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Step 2: Preparation of p'-hemisuccinito-N-methyl-l-methyl-3-phenylpropvlamine- N-
trifluoroacetamide 0.2g of Aid ; was added to a mixture of 0. 1g succinic anhydride and 0.2g

10-04-2020 21
Nmethyl-l-methyl-3-phenylpropylamine-N-trifluoroacetamide in 5ml of dichloromethane at room
temperature. The resulting mixture was stirred at 2 -8 C for 1 hour and then left at room
temperature overnight. 2ml of 3M aqueous HC1 solution was added to the mixture, and the
product was extracted with ethyl acetate. The organic layers were combined and dried over
Na2S04. The organic solvent was removed to obtain 0.2g of a crude product.

Die weitere Reinigung des Rohprodukts wurde mit einer Kieselgelsäule abgeschlossen. Eluieren
mit (1: 2) Ethyl: Hexanen ergab 0,12 g reines Produkt.
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Further purification of the crude product was completed with a silica gel column. Eluting with (1: 2)
ethyl : hexanes yielded 0.12g of pure product.

Schritt 3: Die Reduktionsreaktion von para-Hemisuccinito-N-methyl-1-methyl-3-phenvlpropylamin-


N-trifluoracetamid 0,2 g des aus para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-
trifluoracetamid hergestellten wurde in 3 ml gelöst Essigsäure. 0.3Zu der Lösung wurden g 10%
Pd / C gegeben. Das Gemisch wurde unter H & sub2; über Nacht bei Raumtemperatur hydriert.
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Step 3: Reduction reaction of para-hemisuccinito-N-methyl-l-methyl-3- phenvlpropylamine-N-
trifluoroacetamide 0.2 g of the prepared of para-hemisuccinito-l-methyl-3-phenylpropylamine-N-
trifluoroacetamide was dissolved in 3ml of acetic acid. 0.3g of 10% Pd/C was added to the
solution. The mixture was hydrogenated under H2 overnight at room temperature.

Die Entfernung des Katalysators und des Lösungsmittels ergab einen öligen Rückstand. Die
resultierende Mischung wurde durch Silica-DC unter Verwendung von (1/1) Ethylacetat / Hexan
als Entwicklungslösungsmittel gereinigt. Am Ende dieses Schritts wurden 62 mg des reinen
Produkts erhalten.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Removal of the catalyst and solvent yielded an oily residue. The resulting mixture was purified by
silica TLC using (1/1) ethyl acetate/hexane as developing solvents. 62mg of the pure product was
obtained at the end of this step.

Schritt 4: Herstellung von Succinimidvl-Aktivester von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-


phenylpropylamin-N-trifluoracetamid: 40 mg para-Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-
trifluoracetamid wurden in ml Aceton gerührt. Zu der Lösung wurden 40 mg N, N'-
Disuccinimidylcarbonat und 601 Pyridin gegeben. Die resultierende Mischung wurde 4 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Die Reinigung des Reaktionsgemisches mit einer
Siliciumdioxidplatte ergab 25 mg Succinimidyl-Aktivester von para-Hemisuccinito-1-methyl-3-

10-04-2020 22
phenylpropylamin-N-trifluoracetamid.
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Step 4: Preparation of succinimidvl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3-
phenylpropylamine-N-trifluoroacetamide : 40mg of para-hemisuccinito-1-methyl-3-
phenylpropylamine-N-trifluoroacetamide was stirred into lml of acetonitrile. 40mg of N, N'-
disuccinimidyl carbonate and 601 of pyridine was added to the solution. The resulting mixture was
stirred at room temperature for 4 hours. Purification of the reaction mixture with a silica plate gave
25mg of succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methyl-3-phenylpropylamine-N-
trifluoroacetamide.

Schritt 5: Kupplung des Succinimidyl-aktiven Esters von para-Hemisuccinito-1-methvl-3-


phenylpropylamin-N-fluoracetamid mit Cv5EDA: 2 mg Succinimidyl-aktiver Ester von para-
Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-fluoracetam wurden gemischt mg CyEDA in 0,5 ml
Boratpuffer, pH 9. Die Lösung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die resultierende
Lösung wurde direkt auf eine C18-Platte getupft und mit 70/30 Methanol / Wasser entwickelt. Die
Produktbande wurde ausgeschnitten und der gekoppelte Succinimidyl-Aktivester von para-
Hemisuccinito-1-methyl-3-phenylpropylamin-N-fluoracetamid mit Cy5EDA mit Methanol extrahiert.
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Step 5: Coupling of succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-methvl-3-
phenylpropylamine-N-fluoroacetamide with Cv5EDA : 2mg of succinimidyl active ester of para-
hemisuccinito-1-methyl-3phenylpropylamine-N-fluoroacetamide was mixed with 2.5mg of CyEDA
in 0. 5ml of borate buffer pH 9. The solution was stirred at room temperature for 4 hours, and the
resulting solution was directly spotted onto a C18 plate and developed with 70/30methanol/water.
The product band was cut out and the coupled succinimidyl active ester of para-hemisuccinito-l-
methyl-3-phenylpropylamine-N-fluoroacetamide with Cy5EDA was extracted with methanol.

Beispiel V: Fließimmunoassay von Amphetamin in Speichel a) Herstellung von Reagenzien Der


ausgewählte Anti-Amphetamin-Antikörper (erhältlich beispielsweise von Omega Biologicals, Inc.,
Bozeman, MT) wurde gemäß dem Standardverfahren des Herstellers an Emphase-Harz
gekoppelt und dann gesättigt mit präparierten Tracern wie GW3 38, einem neuen Tracer der
vorliegenden Erfindung (9) und GW5-12, einem herkömmlichen Tracer (11). Die resultierende
komplexe Mischung wurde über Nacht bei 4 ° C unter Walzenmischen ablaufen gelassen. Das
komplexe Harz wurde mit 0 gewaschen. 1M PBS (10% MeOH), bis eine stabile Grundlinie
erhalten wurde. Das gewaschene Harz wurde zu dem gleichen Volumen von 150 mM
Trehalosepuffer in 50 mM PBS (pH 7,4) gegeben und gefriergetrocknet. a) Flow Immunoassav-
Verfahren 4 mg des hergestellten Harzes wurden in eine Mikropolystyrolsäule mit einem
Innendurchmesser von 2 mm und einer Länge von 10 mm gefüllt. Die gefüllte Säule wurde in
einen der fünf Strömungskanäle des LifePoint Immunoassay Instruments eingebaut. Dieser
Immunoassay beinhaltet das Vorwaschen der Säule mit dem geeigneten Puffer, der von einem

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automatischen System gesteuert wird, das von der Labview-Software (National Instruments, Inc.)
unterstützt wird.
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Example V: Flow Immunoassay of Amphetamine in Saliva a) Preparation of Reagents The
selected anti-amphetamine antibody (available for example, from Omega Biologicals, Inc.,
Bozeman, MT) was coupled to Emphase resin according to the manufacturer's standard
procedure and then, saturated with prepared tracers such as GW3 38, a novel tracer of the
present invention (Figure 9) and GW5-12, a conventional tracer (Figure 11). The resulting complex
mixture was allowed to proceed at 4 C overnight while roller mixing. The complex resin was
washed with 0. 1M PBS (10% MeOH) until a stable baseline was obtained. The washed resin was
added to the same volume of 150 mM trehalose buffer in 50 mM PBS (pH 7.4), and freeze dried.
a) Flow Immunoassav Procedure 4 mg of the prepared resin was filled into a micro-polystyrene
column with an inner diameter of 2 mm and a length of 10 mm. The filled column was installed into
one of the five flow channels of the LifePoint Immunoassay Instrument. This immunoassay
involves pre-washing the column with the appropriate buffer controlled by an automatic system
supported by Labview software (National Instruments, Inc.).

Danach 50 jj. 1 l der Testprobe wurde mit einer Flussrate von 100 J / min durch den Kanal geleitet,
gefolgt von 350 tl 0,2% BSA / PBS-Puffer. b) Ergebnisse Die durchschnittliche Intensität des
Fluoreszenzsignals wurde verwendet, um die Arzneimittelkonzentration in der Probe zu
bestimmen. Der Vergleich des Durchflussimmunoassays von Amphetamin mit den Tracern GW3-
38 und GW5-12 ist in den 14 und 15 gezeigt. Der bevorzugte Tracer der vorliegenden Erfindung
zeigt fast das Zehnfache (10X) der Signalintensität als der herkömmliche Tracer.
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After that, 50 jj. l of the test sample was passed through the channel at a flow rate of 100 J. 1/
minute and followed by 350 ttl of 0.2 % BSA/PBS buffer. b) Results The average intensity of the
fluorescence signal was used to determine the drug concentration in the sample. The comparison
of the flow immunoassay of amphetamine with tracers GW3-38 and GW5-12 is shown in Figures
14 and 15. The preferred tracer of the present invention shows almost ten times (10X) the signal
intensity as that of the conventional tracer.

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