Modelos experimentales de

enfermedades metabólicas: Porfiria

y Síndrome Metabólico. Proteómica
y Metabolómica de estos
disturbios.

Alumnos: Duperron y Mauro Elencwajg

ORT 1, 6º Química

Investigadores: Marta Mazzetti y Laura

Matkovic’

Laboratorio de Disturbios Metabólicos por

Xenobióticos, Salud Humana y Medio Ambiente
(DIMXSA)
Departamento de Química Biológica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Ciudad Universitaria
 Introducción al proyecto final

El organismo está sujeto a continuas situaciones de estrés, tanto

por su defensa contra la acidosis proveniente del metabolismo como
debido a causas exógenas como son los tóxicos. El presente plan
abordará el estudio de estos tipos de estrés en varios modelos
experimentales: ratas tratadas con hexaclorobenceno y alil-isopropil-
acetamida (AIA)/3,5dietoxi-carbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC), que
mimetizan cuadros de porfiria crónica y aguda respectivamente y ratas
con acidosis como modelo experimental de estrés metabólico. En ellos
estudiaremos diferentes metabolismos como el de los hidratos de
carbono, tratando de explicar el conocido “efecto glucosa” sobre la
enzima 5-aminolevulínico-sintetasa (ALA-S), y de indoles a partir de
triptofano, investigando a nivel molecular las modulaciones ejercidas
sobre enzimas claves regulatorias y las alteraciones producidas por el
estrés toxico sobre el nivel de varias hormonas (glucagón insulina,
corticosterona, adrenalina y noradrenalina). Investigaremos el rol de los
glucocorticoides y la regulación de su actividad, precisamente esta
última está involucrada en el desarrollo de enfermedades como el
Síndrome Metabólico y afectarían también la condición y sintomatología
de los pacientes con porfiria. Asimismo, se evaluará la importancia que
el estrés oxidativo tiene en estas patologías, analizando la actividad de
enzimas antioxidantes y diferentes biomarcadores de daño a
macromoléculas (lípidos, proteínas y DNA).

Modelos experimentales de porfiria

Se trabajará con varios modelos experimentales de porfiria mediante la
administración de drogas porfirinogérnicas: las inducidas por AIA + DDC ó
modelos agudos y la producida por la administración de HCB (modelo de
PCT ó modelo crónico) a distintos tiempos y dosis de las drogas
porfirinogénicas.

Modelos experimentales de estrés

Se trabajará en dos modelos experimentales de estrés producido en ratas
machos, Sprague-Dawley, por cánula y por acidosis clorhídrica (Igarreta y
col. 1999, Zallocchi y col. 2004, Altuna y col. 2006). Se respetarán las
normas internacionales del uso y cuidado de animales de laboratorio (Guide
for Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, USA,
1996, and the Council of the European Communities Directive, 86/609/ECC)
y se usarán guantes y barbijos para el preparado y administración de las
drogas.

Objetivos generales del proyecto subsidiado por UBACyT :

-Ahondar en los estudios bioquímicos, metabólicos, hormonales y

moleculares en modelos experimentales de toxicidad, investigando las
alteraciones producidas por drogas porfirinogénicas (estrés toxico-oxidativo)
o por acidosis (estrés acídico y por cánula) sobre caminos metabólicos tales
como los de hidratos de carbono y el de triptofano a indoles, investigando
su relevancia en la terapéutica y la sintomatología clínica de las porfirias y
del Síndrome Metabólico. Evaluar especialmente la contribución y
mediación de los glucocorticoides activos, a través de su impacto en los
caminos metabólicos del hemo y de los hidratos de carbono.

Nuestros objetivos como estudiantes de ORT serán:

-Abordar una de las líneas de investigación en la que se analiza el daño

producido por estrés en modelos de porfiria en relación a la actividad de
enzimas claves de la gluconeogenesis como la fosfoenolpiruvato-
carboxiquinasa (PEPCK), de la glucógenolisis como la glucógeno fosforilasa
(GP) y los niveles de hormonas regulatorias de estos metabolismos. Así,
mediremos sus actividades y la concentración de metabolitos
biomarcadores de porfiria tales como ácido 5-aminolevulínico (ALA),
porfobilinógeno (PBG) y porfirinas hepáticas, es decir que estableceremos
un perfil metabólico de la enfermedad. En otras palabras, nos acercaremos
a determinar un a descripción metabólica de la patología.
-Analizar estructuralmente a la porfobilinógeno deaminasa (PBG-D),
enzima clave en las porfirias agudas. Se la caracterizará determinando sus
parámetros moleculares (peso molecular, presencia de subunidades, forma
de la molécula nativa, radio de Stokes) y se analizará su composición
aminoacídica. También se analizarán las proteínas hepáticas de hígado
normal y porfírico haciendo electroforesis bidimensional y con ello nos
acercaremos al campo de la Proteómica.
-Con respecto a la PEPCK, se la estudia genéticamente, para lo cual se
requiere su amplificación por PCR. Esto último es una aproximación al
campo de la Genómica. Las distintas actividades se completarán con
prácticas virtuales y mostraciones de técnicas.
-Se realizará con los alumnos una visita al Centro de Estudios Químicos
y Biológicos por Espectrometría de Masa MALDI-TOF (CEQUIBIEM)
depende de dos universidades nacionales (UBA-UNLP), con sede propia en
la FCEyN de la UBA

En la Fig. 1 y 2 se representan los caminos metabólicos a los que

pertenecen las enzimas en estudio
 Fig. 1: Biosíntesis del hemo

Fig. 2: Gluconeogenesis y glucólisis

 Estado actual del conocimiento sobre el tema

El estrés es uno de los desencadenantes principales de enfermedades

de diversos tipos como hipertensión, depresión, alteración del metabolismo,
diabetes, dislipemias, alteraciones vasculares, porfirias agudas etc.
Las porfirias denominadas agudas o inducibles son enfermedades
genéticas y pueden presentar ataques agudos desencadenados por
factores diversos que generan la de-represión de la enzima ALA-S (Kappas
y col. 1995).
El ALA por semejanza con el ácido 5-aminobutirico (GABA), es un
compuesto neurotóxico que produce en estos pacientes serios problemas
neuropsiquiátricos y abdominales, llegando en muchos casos al coma y a la
muerte (Emmanuelli y col. 2001). En la literatura se ha reportado que la
acumulación de ALA es tóxica ya que produce especies reactivas de
oxígeno (ROS) (Bechara, 1996, Karbownik y col. 2000). Se ha informado
que las ROS son capaces de oxidar ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y
carbohidratos, afectando e inactivando funciones claves para la célula
(Costa y col. 2002). El daño oxidativo a nivel de proteínas involucra la
oxidación de las cadenas laterales aminoacídicas, la fragmentación y el
entrecruzamiento (Costa y col. 2002). Para la transcripción de PEPCK se ha
reportado un factor NF-1 sensible al estrés oxidativo (Morel y Barouki,
1998).
El ALA también es productor de radicales libres y genera estrés
oxidativo. AIA y DDC, son compuestos que utilizados solos o en forma
combinada generan modelos experimentales de porfiria aguda que se
asemejan a la porfiria, de allí su importancia.
Recientemente hemos demostrado, en el modelo experimental AIA/DDC, un
bloqueo gluconeogénico a nivel de PEPCK y glucogenolítico a nivel de la
glucógeno fosforilasa (GP). Si bien se han involucrado parcialmente a las
ROS en estos disturbios (Lelli y col. 2005), es importante evaluar la
contribución de los glucocorticoides, del glucagon y de la insulina, teniendo
en cuenta que estas hormonas regulan el metabolismo hidrocarbonado.
Por otra parte el modelo experimental más usado de la porfiria cutánea
tarda (PCT), la porfiria crónica con mayor incidencia en la población
mundial, es el inducido en ratas por acción del hidrocarburo policlorado
hexaclorobenceno (HCB).
Este funguicida produce una porfiria experimental semejante a la PCT
humana en distintos tipos de animales (San Martín de Viale, 1970). El HCB
es un disruptor endócrino, metabólico y hormonal. Altera: el metabolismo del
hemo generando una porfiria, el metabolismo de los hidratos de carbono
(Mazzetti y col., 2004; Taira y col. 2004), el de lípidos (Billi de Catabbi y col.
2005), de ciertos aminoácidos (Llambías y col. 2003), el estado de óxido
reducción celular y el metabolismo hormonal (Lelli y col. 2004, 2007).
La glucosa reprime la inducción del ALA-S, es decir, modula la porfiria
(Tschudy y col. 1964) y nuestro grupo ha reportado que el HCB produce un
bloqueo gluconeogénico y glucogenolítico, altera la captación de glucosa y
los niveles plasmáticos de insulina (Mazzetti y col 2004; Taira y col. 2004).
y que dietas ricas en hidratos de carbono suprimen la producción de porfiria
por HCB, efecto que es mas marcado en dietas con glucosa (Ivanov,y col.
1976).
Se sugirió un rol de las ROS producidos por HCB en el descenso de la
actividad de la enzima PEPCK y por lo tanto en el bloqueo gluconeogénico
que este pesticida produce. Así se han postulado varios puntos de acción
para estos radicales: a nivel de la proteína enzimática, a nivel de DNA y a
nivel de factores de trascripción (Mazzetti y col. 2004).
Datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio demuestran una disrupción
hormonal de glucocorticoides (GC) en este modelo experimental de porfiria
a nivel circulatorio, hepático y adrenal. Con una disminución de niveles
plasmáticos de corticosterona, en sus receptores hepáticos y en sus niveles
en adrenales. Se ha postulado que las alteraciones provocadas por el HCB
en el metabolismo de los glucocorticoides jugaría un rol en el bloqueo de la
PEPCK en esta PCT experimental. (Lelli y col. 2007).
Los corticosteroides están involucrados, entre otros, en la respuesta del
organismo al estrés, principalmente debido a un aumento de su secreción y
al efecto de las 11β-Hidroxiesteroide deshidrogenasas (HSDs) localizadas
en órganos efectores
La activación de la isoforma HSD1 “in vivo” aumenta la oferta de
glucocorticoides activos, mientras que la de la isoforma 2 (HSD2) la
disminuye.
Considerando que los glucocorticoides: 1) regulan la actividad de la
tirosina aminotransferasa (TAT) (Kido y col. 1987 ) de la PEPCK (Petrescu y
col.1979) y de la triptofano pirrolasa (Knox ,1951; Badawy y Evans, 1977)
enzima involucrada en la degradación de triptofano a quinurenina; 2) que el
triptofano y sus metabolitos inhiben la gluconeogénesis; 3) que la HSD1
aumenta la oferta de glucocorticoides activos, es interesante estudiar en el
modelo de PCT crónico, inducido por HCB, y en los modelos de porfirio
aguda, cómo están afectadas la triptofano pirrolasa, la TAT, la HSD1 y la
PEPCK y si estas alteraciones están correlacionadas.
Debido a que la HSD1 está ampliamente distribuidas en el organismo: SNC,
hígado, tejido adiposo, pulmón y tejido vascular. (Stewart y Krozowski,
1999), su activación potencia la función de los corticoides en esos tejidos.
El efecto del estrés sobre la regulación de las actividades de las HSDs y los
mecanismos involucrados en esta regulación han sido investigados entre
otros, por nuestro grupo de trabajo. En los mismos observamos que el
estrés actúa inhibiendo la HSD2 renal permitiendo la unión de la
corticosterona al receptor a aldosterona y produciendo hipertensión arterial
(Igarreta y col. 1999).
La isoforma HSD1 fue la primera encontrada, la importancia de la
actividad de la misma y su función en la regulación del metabolismo del
organismo está siendo estudiada y discutida actualmente (Tomlinson y col.
2004). Probablemente debido a la variedad de especies y tejidos en los
cuales se desarrollan las investigaciones y a la gran cantidad de sustancias
encontradas en la regulación de la HSD1, los resultados no son aun
concluyentes (Seckl y Walker 2001).
Sin embargo, todos coinciden en una premisa y es que la actividad de la
HSD1 está involucrada en el desarrollo del Sindrome Metabólico, que
produce cada vez con más frecuencia y en personas más jóvenes
disminución de la calidad de vida y aumento de la mortalidad (Sapolsky y
col. 2000, Paterson y col. 2004, Rask y col. 2002).
En esta última década se han replanteado los mecanismos por los
cuales los glucocorticoides influencian la respuesta al estrés, una
interesante revisión ha sido realizada por Sapolsky et al. (Sapolsky y col.
2000).
Además de lo detallado nuestro grupo observó que el estrés, producido
por acidosis, producía un aumento de la actividad de la HSD1 hepática
 acompañada alteraciones metabólicas, aumento de la PEPCK, de la
glucemia y disminución del glucógeno hepático (Altuna y col. 2006).

¿Qué son los “omas”?

El conocimiento de la secuencia génica y la composición nucleotídica de los

genes está abriendo caminos insospechados poco tiempo atrás, acerca de
numerosos procesos patológicos, así como andariveles casi increíbles en el
camino de la prevención y curación de las enfermedades, el conocimiento de la
genómica funcional abre el camino para la investigación sobre un grupo
particular de los así denominados "omas", ellos son el genoma, transcriptoma,
proteoma y metaboloma. ( ver tabla abajo)

Nivel de análisis Definición Método de análisis

Conjunto completo de
Secuenciación
GENOMA genes de un organismo o
sistemática del ADN
sus organelas
Conjunto completo de
moléculas de ARN Hibridización. SAGE
TRANSCRIPTOMA mensajero presentes en (serial analysis of
una célula, tejido u gene expresion)
órgano.
Total de moléculas
proteicas presentes en Electroforesis bi-
PROTEOMA
una célula, tejido u dimensional.
órgano.
Espectroscopía con
Conjunto completo de luz infrarroja.
metabolitos Espetrometría de
METABOLOMA (intermediarios de bajo masa.
peso molecular) en una Espectrometría con
célula, tejido u órgano. resonancia nuclear
magnética.

Proteoma

El proteoma se define como la totalidad de las proteínas específicas

complementarias al genoma tanto temporalmente como por el tipo de célula.
Esto incluye todas las proteínas que se expresan en una célula en un
determinado momento, ya sean las isoformas como las proteínas modificadas.

Su complejidad es extraordinaria si se supone que en la especie humana

hay 45.000 genes, y que cada RNA transcrito puede sufrir uniones alternativas,
y cada proteína codificada puede sufrir modificaciones post-traduccionales. Es
posible, por tanto, que el proteoma de cada individuo independiente, retratado
en un momento particular de su vida, tenga una complejidad de dos a tres
órdenes de magnitud superior a la del genoma. De hecho se estima que el
proteoma completo de la especie humana podría estar constituido por 108
cadenas polipeptídicas.
 El conocimiento del proteoma constituye uno de los desafíos más
importantes de la era post-genómica. A diferencia del genoma, el proteoma
presenta una gran variabilidad -estructural y funcional-, que depende del
individuo considerado, de su estado de desarrollo, del tejido estudiado, e
incluso de las condiciones ambientales. El análisis de dicha variabilidad está
cobrando cada vez mayor interés, debido a que está asociada tanto al
funcionamiento normal del organismo, como a muchas de sus patologías.

Los principales mecanismos generadores de dicha variabilidad son tres:

 el splicing alternativo del mRNA

 las modificaciones postraduccionales
 los SNPs ("single nucleotide polymorphisms")

Aunque la aproximación experimental al estudio de la variabilidad del

proteoma facilita una información de gran calidad, de momento se ha ceñido al
estudio de sistemas específicos. Frente a esta situación, la bioinformática
puede proporcionar una aproximación original a este problema, al permitir
realizar un análisis sistemático del amplio volumen de datos disponible. Así la
bioinformática permitirá racionalizar y sintetizar los resultados de los estudios
experimentales, la información sobre el genoma humano y de otros genomas,
la enorme colección de datos sobre SNPs, la información estructural sobre
proteínas, los datos sobre patrones de splicing alternativo, y las bases de datos
de patologías asociadas a mutaciones.

Considerando esta gran complejidad, está claro que el científico, hoy en día,
necesita tener a disposición un amplio abanico de instrumentación para separar
e identificar cada proteína del proteoma de cualquier organismo.

Entre los más antiguos y populares, también en nuestros días, está la

clásica electroforesis bidimensional que consta de un isoelectroenfoque como
primera dimensión, que discrimina en base a la carga superficial, y un SDS-
PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida saturados de docecilsulfato
sódico) como segunda dimensión, que separa en base a la masa. A esta
metodología se le han sumado, en los últimos años, métodos cromatográficos
bidimensionales, que en general combinan cromatografía de intercambio iónico
y de interacción hidrofóbica (con diversas variantes, dado que se pueden
utilizar múltiples procesos cromatográficos, como quelación de metales,
exclusión molecular, chromatofocusing, resinas de fosfato cálcico, etc., sin
considerar las resinas basadas en la bioafinidad).

Estas últimas metodologías pueden incluso hibridarse, p.ej. el eluído de una

columna de RP-HPLC acoplada con la electroforesis capilar. Por último, no
podemos olvidar los chips de proteínas que pueden constituir interesantes
superficies de captura de marcadores en líquidos biológicos para un rápido
diagnóstico en bioquímica clínica. Estos chips de proteínas no llegan a alcanzar
los sistemas variados y complejos de los chips de ADN, donde es posible
mostrar simultáneamente miles y miles de genes diferentes, cosa que es
impensable para los chips de proteínas de hoy en día.

Sin embargo, el análisis proteómico actual, no avanzaría mucho si sólo

dependiera de los instrumentos anteriormente mencionados. De hecho, ya en
1975 O’Farrel perfeccionó bastante los geles 2-D, pero se avanzó muy poco
debido a la falta de medios tanto para el análisis cuantitativo como cualitativo.
La identificación de la proteína o proteínas contenidas en un punto
electroforético o en un pico cromatográfico necesita de ulteriores técnicas que
son independientes de la separación. La proteómica moderna es en realidad un
conjunto de al menos tres disciplinas diferentes, que contribuyen por igual a la
solución de problemas complejos, siendo estas:

 Metodologías de separación: tanto las enumeradas anteriormente como

las futuras.
 Espectrometría de masas: técnica indispensable para el reconocimiento
de las cadenas polipeptídicas eluídas de los geles 2-D, cromatografía
bidimensional, chips de proteínas, etc.
 Bioinformática: instrumento en continua evolución, con creación de
buscadores, bancos de datos y métodos de screening cada vez más
avanzados en la identificación de proteínas de cualquier origen. La
bioinformática, es un instrumento fundamental para conectar las bases
de datos de proteínas y genes

Estas tres disciplinas contribuyen por igual al análisis proteómico y por

tanto, tienen que estar a disposición en los laboratorios ligados al proteoma.
La Proteómica de expresión involucra el análisis global de cambios en la
expresión de proteínas durante un proceso biológico o una enfermedad. La
interactómica permite estudiar las interacciones proteína-proteína e
identificar miembros de complejos funcionales, caminos de señalización,
análisis de redes de proteínas e Interacciones proteínas-pequeñas
moléculas y unión proteína-droga

Introducción a la Metabolómica

La Metabolómica es el estudio de todos los metabolitos, encontrados en

muestras biológicas tales como células, fluidos biológicos o tejidos. Estas
pequeñas moléculas son el producto del metabolismo e incluyen, por ejemplo,
azúcares (o carbohidratos), grasas (o lípidos) y aminoácidos. La colección de
todos los metabolitos dentro de una célula se llama el metaboloma. Los
científicos han comenzado a caracterizar al metaboloma con el fin de
comprender mejor y diagnosticar a las enfermedades.

 La metabolómica incorpora el uso de la bioinformática, es decir, la

aplicación de las computadoras u ordenadores y de las técnicas
estadísticas en la comprensión y el manejo de información biológica, con
el fin de buscar patrones únicos de metabolitos que pueden ser
indicadores de una enfermedad en particular.

 La metabolómica es un acercamiento multidisciplinario que involucra a

biólogos, computadores científicos y químicos analíticos. Las
herramientas usadas para medir a los metabolitos se asocian
comúnmente con los laboratorios químicos, e incluye a la espectroscopia
por medio de la resonancia magnética nuclear (RMN) y la
espectrometría de masa.
 La ventaja de la metabolómica para el diagnóstico de las enfermedades,
radica en el hecho de que este acercamiento mide el fenotipo de un organismo,
es decir, las características biológicas de un organismo, que resultan de la
interacción de su paquete genético con el medio ambiente. Cuando un
organismo se enferma o se estresa, disparando así cambios moleculares
específicos, el fenotipo se ve alterado. Este cambio puede entonces, en
principio, ser medido usando la metabolómica.

Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades humanas

Por muchos años los médicos han estado midiendo metabolitos específicos
en la sangre o en la orina de sus pacientes con el fin de diagnosticar
enfermedades particulares. Quizás el procedimiento más familiar es la
medición de la glucosa para el diagnóstico de la diabetes. La metabolómica
está abriendo nuevos horizontes, dado que se pueden medir rápida y
simultáneamente a cientos de metabolitos, proveyendo una medida mucho más
completa del estado de salud de un paciente. Recientemente, varias
aplicaciones notables de la metabolómica en el estudio de las enfermedades
humanas han comenzado a emerger:

 La detección de la presencia y la severidad de la enfermedad coronaria

usando metabolómica basada en la Resonancia Magnética Nuclear
(RMN). Este técnica no invasiva identifica a la enfermedad a partir de
una muestra de suero de la sangre, y en el futuro puede reducir el uso
de los angiogramas, los cuales son altamente invasivos.

 La predicción del resultado clínico de una hemorragia repentina

en un vaso sanguíneo sobre la superficie del cerebro (llamado
hemorragia subarachnoidea), por medio del análisis metabolómico
del fluido cerebroespinal.

¿Qué es la porfiria?

El término porfiria se refiere a un grupo de al menos ocho desórdenes que

difieren clínicamente uno de otro, pero todos comparten el mismo problema de
acumulación de Protoporfirina III o de sus precursores (Kappas y col. 1995). La
Protoporfirina III es un metabolito de la síntesis del hemo, que es un
constituyente esencial de la hemoglobina, mioglobina, catalasa, peroxidasa, y
citocromos P450 y del sistema respiratorio.

Se han descripto porfirias tanto hereditarias como adquiridas, siendo éstas:

porfiria aguda intermitente (PAI), nueva porfiria aguda (NPA), porfiria variegata
o mixta (PV), coproporfiria hereditaria (CPH), porfiria congénita eritropoyética
(PCE), protoporfiria eritropoyética (PPE), coproporfiria eritropoyética (CPE)
porfiria hepatoeritropoyética (PHE) y porfiria cutánea tardía (PCT), esta última
puede ser congénita o adquirida. Existen tres clasificaciones distintas para
agruparlas: en la primera, las porfirias se clasifican según el sitio principal de
expresión de la falla metabólica. Si bien en las enfermedades genéticas, la falla
reside en el genoma de todas las células, en las porfirias hepáticas se
acumulan precursores en hígado, mientras que en las eritropoyéticas se
acumulan precursores en células sanguíneas.
 También se clasifican según las principales manifestaciones clínicas en
agudas y no agudas así como cutáneas y no cutáneas. La diferencia entre
estas dos últimas clasificaciones es que en el caso de las enfermedades
agudas se acumulan precursores neurotóxicos correspondientes al inicio del
camino metabólico, mientras que en las cutáneas se acumulan intermediarios
correspondientes al final del camino biosintético, que son fotosensibles,
causando quemaduras, ampollas y desgarre en las áreas expuestas al sol.

Fig.3. Quemaduras y ampollas

observadas en una porfiria
cutánea

El tipo de porfiria con más incidencia mundial es la Porfiria cutánea tarda y

luego la porfiria aguda intermitente
Las porfirias agudas tienen como característica distintiva que las personas
que la poseen son susceptibles de desencadenar un ataque agudo por simple
exposición a una gran variedad de fármacos comunes. Es por ello que se las
conoce como enfermedades fármaco-genéticas.
En el caso de la PAI, la enfermedad se produce como consecuencia de
una disminución en la actividad de la enzima PBG-D. Una actividad enzimática
por debajo de los niveles normales, produce una acumulación del sustrato de la
PBG-D, el PBG, y por ende, también del anterior en la ruta metabólica: el ALA.
Es sumamente importante destacar el papel que desarrolla una
acumulación de ALA y PBG, ya que estos dos compuestos son neurotóxicos y
contribuyen particularmente a uno de los síntomas más trascendentes de este
tipo de porfiria. La neurotoxicidad de estos productos intermedios puede
provocar convulsiones, ataques de pánico y ansiedad. Asimismo, también son
frecuentes los síntomas de excitación, manía y alucinaciones visuales, entre
otras. De ser este estado muy avanzado, el desarrollo de una neuropatía puede
llevar a una parálisis respiratoria y así a la muerte. De hecho, el mayor
porcentaje de los descenlaces fatales se debe a paros respitratorios y
cardíacos.
Cabe aclarar que una persona con una deficiencia genética en esta enzima
puede no desencadenar nunca un ataque agudo (aproximadamente un 75-80%
de los afectados) y llevar una vida normal en términos generales, siempre y
cuando no se consuman los compuestos porfirinogénicos que pueden inducir a
estas manisfestaciones clínicas.
Entre los agentes precipitantes de dichos ataques podemos mencionar la
ingesta de alcohol, el ayuno, y desde ya, las hormonas esteroideas. Un cambio
en los niveles hormonales usuales puede provocar variaciones que afecten a la
síntesis del hemo y puedan desencadenar una crisis. Es por ello que el
embarazo y los anticonceptivos orales son probables inductores.
Cuando un paciente llega a la sala de un hospital y se detecta la
enfermedad, se pueden aplicar distintos tratamientos. Uno de los más
importantes, es el suministro de ácido fólico. Éste actúa estimulando la
actividad de la PBG-D Debido a su acción, los niveles de PBG y ALA
disminuyen. También es conocido como un posible y efectivo tratamiento de los
ataques porfíricos el grupo hemo, en forma de hematina, directamente por vía
intravenosa, el producto final del camino metabólico con el cual se puede
conseguir reprimir la actividad de la ALA-S, limitando así su propia síntesis.
Los hidratos de carbono también son conocidos como un posible y efectivo
tratamiento de los ataques porfíricos. Estos compuestos actúan a través de un
mecanismo llamado “efecto glucosa”, inhibiendo el metabolismo de las
porfirinas, es decir impidiendo la inducción de la primera enzima de la vía, la
ALA-S. El mecanismo de este efecto no se conoce todavía. De ahí el interés de
nuestro grupo por relacionar el metabolismo de hidratos de carbono con la
biosíntesis de hemo.
La porfiria afecta el camino metabólico del hemo en diferentes puntos
según el tipo. Se explica a continuación el mismo:
La enzima regulatoria más importante de la síntesis del hemo es la ALA-
sintetasa (ALA-S). Esta enzima se regula principalmente por el producto final
de la vía metabólica, es decir por el hemo. A su vez la baja proporción
fisiológica de Protoporfirina III con hierro en estado férrico (hematina), también
puede regular a la ALA-S. Estos dos compuestos regulan a la enzima por
diversos mecanismos que se pueden agrupar en: inducción-represión de la
síntesis de la ALA-S y por retroalimentación negativa. El punto de partida para
esta regulación es la existencia de uno o más pools de hemo libre,
probablemente ubicados en citosol, mitocondria o retículo endoplasmático; las
variaciones que ocurren en los mismos son las que dirigen ambos
mecanismos.
Cabe destacar que la regulación de la ALA-S por parte del hemo difiere en
hígado y en tejido eritropoyético. Se hará referencia principalmente a la
regulación en hígado y se mencionarán algunos puntos sobre la regulación en
tejido eritropoyético:
La ALA-S es una enzima mitocondrial que utiliza como cofactor al fosfato
de piridoxal. La deficiencia de piridoxal y la presencia de drogas que compiten
con el cofactor disminuyen la actividad de esta enzima.
Debido a la baja actividad y a la corta vida media de la ALA-S y su ARNm,
la regulación primaria de esta enzima a nivel de su síntesis constituye un
control muy sensible y por esto mismo es el principal de la vía. A continuación
se detallarán las diversas formas en las cuales el hemo regula la síntesis y la
actividad de esta enzima en hígado.
• La transcripción del gen de ALA-S es reprimida por la unión de un holo-
represor formado por un apo-represor proteico y un grupo hemo. A su
vez el hemo induce la transcripción del apo-represor.
• La sensibilidad de la regulación por inhibición de la ALA-S es tal que,
incluso a bajas concentraciones de hemo, éste inhibe la síntesis de la
misma a nivel de la traducción, ya que el ARNm contiene una secuencia
que se une a una proteína reguladora sensible al hemo. De esta forma,
disminuye la vida media del mensajero.
 • El hemo en concentraciones elevadas puede afectar la translocación de
la enzima a la mitocondria.
• El hemo y la hematina actúan como inhibidores alostéricos de la ALA-S.
Si bien la ALA-S es la enzima regulatoria más importante de la vía, existen
otras enzimas que pueden ser puntos de control en ciertas condiciones, en
particular cuando la ALA-S está desreprimida (Fig. 4). En estos casos, la
desrepresión de la ALA-S convierte a la PBG-D en la enzima de velocidad
limitante, por lo cual la reacción catalizada por esta última pasa a ser el punto
de control más importante de la vía biosintética. También es importante por lo
tanto su regulación.

Fig 4. Regulación de la ALA-S por grupo Hemo

Gen regulador promotor Gen estructural para la ALA-S

Represor activo ARN-m

(holorrepresor)
Mecanismo
ALA-S rápido:
Apo-represor + Hemo inhibición
(-) de la
(+) actividad de
Hemo la ALA-S
Mecanismo lento:
represión de la
síntesis de la
enzima

La PBG-D es una enzima alostérica sulfhídrica que presenta cooperatividad

homotrópica positiva para su sustrato (PBG). Un cambio en la concentración de
PBG afectará considerablemente la actividad de la enzima.
En células eritroides, la actividad de la PBG-D es inducible por hormona
eritropoyetina, una proteína que disocia la combinación apo-represor-hemo.
Por último, la Ferroquelatasa es también una enzima regulable aunque, en
general, su regulación es mucho menos importante que la de la ALA-S y la
PBG-D. Sin embargo, la regulación de la Ferroquelatasa, y sobre todo su
inhibición, puede cobrar importancia en situaciones de intoxicación por plomo y
en algunas porfirias.

La actividad de la Ferroquelatasa es inhibida por oxígeno, plomo y diversos

cationes bivalentes. Al ser ésta una enzima sulfhídrica, la oxidación de un solo
grupo -SH puede inactivarla completamente.
Por otra parte, se cree que en el tejido eritropoyético el hemo regula la
adquisición de Fe2+ de la transferrina (proteína transportadora de hierro en
estado ferroso), modificando así la actividad de la Ferroquelatasa.
 En cuanto a la acción de sustancias exógenas sobre las enzimas antes
descritas, existe una gran cantidad de drogas (compuestos porfirinogénicos)
que modifican la biosíntesis del hemo, disminuyendo su concentración y, en
consecuencia, aumentando marcadamente la actividad de la ALA-S. (Kappas y
col. 1995)
Habitualmente para el estudio de estas patologías se suelen utilizar
modelos experimentales generados en roedores (rata, ratón) por la
administración de drogas que inhiben enzimas del camino metabólico del
hemo.

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