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Enzymologie et métabolisme
ETUDE CINETIQUE ET DETERMINATION DU pH OPTIMUM
DE LA PHOSPHATASE ALCALINE
But du TP:
Le but de ce TP est d'étudier l'activité de la phosphatase alcaline lorsque l'on fait varier
différents facteurs comme la concentration en substrat et le pH.
Principes :
Méthode :
3. Solutions à différents pH
On a besoin 4 milieu réactionnel contenant l’eau, ZNCl2 et le tampon tris-HCl à 0.1M comme
précédemment mais avec 4 pH différents : 7,0 ; 7,5 ; 8,3 et 9,0. On réalise de nouveaux des
cinétiques en mesurant la DO à 410nm toutes les 10 secondes. Ces mesures permettent de
tracer les cinétiques sous la forme Abs410nm=f(temps) et de déterminer les vitesses initiales
des 4 réactions.
Calculs :
Vprélevé = 1,75 ml
Vtotal cuve = Vprélevé + Venzyme = 1,75 + 0,25 = 2 mL
[PNPP]finale dans cuve S1 =([PNPP]tube s1 x Vprélevé) / Vtotal cuve=(0,71 x 1,75) / 2 = 0,62 mM
3. Michaelis Menten
Grâce aux tangentes des différentes courbes d’apparition du pNP en fonction des différentes
concentrations de PNPP et du temps (voir courbe n°2) on a pu remplir le tableau 2 de la
feuille annexe grâce aux calculs présentés précédemment.
On a donc pu tracer la courbe n°3 de cinétique de Michaelis et Menten représentant les
vitesses initiales en fonction des différentes concentrations de substrat.
Grâce à cette courbe on peut estimer de manière peu précise les valeurs de Km et Vm.
Vmax ≈ 1 Ϥmol.min-1 (asymptote de l’hyperbole)
Km = 0.042 ϤM (Correspondance en abscisse de Vmax/2)
La difficulté vient du fait que la détermination graphique d'une asymptote est une chose
imprécise, entachant d'erreur la détermination de la Vmax et du Km.
Pour vérifier et préciser ces estimations on utilisera 2 méthodes de linéarisation
4. Linéarisation :
Afin d’obtenir des paramètres cinétiques le plus précis possibles :
-Lineweaver Burk ou double inverse
Dans le tableau 2 en annexe on a calculé les valeurs inverses 1/[PNPP] et 1/v
On a pu donc tracer en annexe 4 la courbe de Lineweaver Burk représentant
1/v = f(1/[PNPP])
On a représenté sur la courbe les points important afin de déterminer Km et Vm.
-Hanes Woolf
Dans le tableau 2 en annexe on a calculé les valeurs de [PNPP]/v
On a pu donc tracer en annexe 4 la courbe de Hanes Woolf représentant
[PNPP]/v = f([PNPP])
On a représenté sur la courbe les points important afin de déterminer Km et Vm.
Les valeurs de Vm sont extrêmement proche, on fera la moyenne des deux valeurs de
linéarisation pour la valeur de Vm soit Vm = 0,855 Ϥmol.min-1
Les valeurs de Km sont sensiblement plus éloignées on utilisera donc aussi la moyenne soit
Km= 0,028 ϤM
On sait que
Vmax = kcat x [PA] donc,
Kcat = (Vmax ) / [PA]= 0,855 / 1,56 . 10-4 = 5,47.10-3 s-1
6. Détermination du pH optimum
On a mesuré l’absorbance pour 4 tampons à 4pH différents. Les résultats sont représentés
dans le graphique n°5 de l’absorbance à 410nm en fonction du temps selon les 4 pH.
On a pu calculer grâce aux pentes des courbes à l’origine, les vitesses initiales selon tous les
pH comme on a pu le faire précédemment durant ce TP. (voir point 2)
On utilise le même ɛ que précédemment.
Les résultats sont compilés dans le point 3 de la fiche annexe.
Interprétations :
1. Gamme étalon :
Les courbes obtenues possèdent toutes la même forme : elles débutent linéairement puis
elles s'affaissent petit à petit avec le temps : c’est une forme hyperbolique.
On peut remarquer que plus la concentration en substrat augmente et plus la pente de la
courbe à l’origine augmente. Ce qui signifie que la concentration en substrat à un effet sur la
vitesse de réaction. En effet, un nombre important de molécules de substrat va induire une
saturation plus rapide des sites de fixation de l’enzyme.
3. Michaelis Menten :
Les déterminations ne sont pas précises : Vm se lit en théorie pour des valeurs infinies de
substrat (la courbe doit être linéaire ce qui est rarement le cas en conditions
expérimentales). Comme Vm n’est pas déterminée avec précision, donc Km ne peut pas
l’être non plus.
On a tout de même pu estimer les deux valeurs. (voir tableau ci-dessous)
Les valeurs ne sont pas exactes car elles sont le fruit de plusieurs approximations lors de la
mesure de l’absorbance, lors du traçage des droites ou encore lors du calcul des pentes. Elles
sont tout de même du même ordre de grandeur ce qui est rassurant.
5. Dépendance au pH :
La vitesse de réaction semble croitre avec le pH de la solution. Plus le pH est basique et plus
la vitesse augmente. Il aurait peut être été alors préférable d’utiliser un tampon à pH=9
plutôt que 8,3 pour l’expérience précédente.
Il faudrait tenter l'expérience avec un pH supérieur à 9 afin de voir si 9 est le pH optimal ou
s’il en est un autre.
Conclusion :