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La Chromatographie
Liquide haute
Performance (HPLC)
Salle de TP de Génie Analytique
Présentation Théorique de la HPLC
V. JACOB
IUT de Chimie de Grenoble
22/08/2010
La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010
1Généralités et appareillage.......................................................................................................1
1.1 La phase mobile............................................................................................................................. 2
1.4 L’injecteur....................................................................................................................................... 6
1 GENERALITES ET APPAREILLAGE
Les différents modules sont reliés par des canalisations courtes et de très faible diamètre interne
(0,1 mm).
Les différentes parties de l’appareillage en contact avec la phase mobile sont généralement
construites en acier inoxydable type 316 qui présente l’avantage de la tenue à la pression et
d’une bonne résistance à la corrosion chimique.
Les canalisations sont soit en acier inoxydable soit en polymère de type PEEK (polyether-
etherketone) qui est un polymère souple plus économique que l’acier et pouvant résister aux
solvants sous des pressions élevées jusqu’à 350 bars.
1
1.1 LA PHASE MOBILE
Une bonne séparation d’un mélange dépendra donc d’une bonne adéquation soluté-phase
stationnaire-phase mobile.
De nombreux solvants sont disponibles, mais seuls quelques uns pourront être utilisés car en
chromatographie liquide il existe de nombreuses limitations.
compatibilité avec le système de détection : avec des détecteurs par absorption (les
plus courants) on utilisera des solvants qui absorberont peu aux longueurs d’onde où les
solutés absorbent. Pour les détecteurs réfractométriques, il faudra choisir une phase
éluante dont l’indice de réfraction est différent de ceux des composés de l’échantillon à
analyser.
miscibilité des solvants et solubilité des solutés : si la phase mobile est constituée par
plusieurs solvants, ceux-ci doivent être totalement miscibles et les composés à analyser
doivent y être solubles.
o les alcanes sont transparents jusqu’à une longueur d’onde de 190 nm mais il
peuvent contenir des traces d’oléfines qui limitent la transparence de la phase
éluante à 250 nm.
Choix du solvant :
On classe donc les solvants par leur polarité, et la modification de la polarité. Parmi les solvant
utilisés on a l’hexane (ou les hycdrocarbures saturés (pentane, cyclohexane…) pour les solvants
les moins polaires et l’eau pour les solvants le plus polaire. Entre les deux, on a toute une série
de composés qui peuvent être utilisés.
Pour modifier la polarité de la phase mobile, on peut réaliser des mélanges de solvants (à
condition que ceux-ci soient miscibles)
Les appareils sont équipés d’un ou plusieurs réservoirs en verre ou parfois en acier inoxydable
de contenance d’environ 1 litre, ce qui permet de réaliser un nombre important d’analyses sans
interruption.
Ces réservoirs sont souvent étanches afin d’éviter l’évaporation des solvants (et ainsi la
modification de la composition du mélange) ou leur contamination.
Ils peuvent être équipés de dispositifs de dégazage (barbotage d’hélium ou mise sous vide)
permettant d’éliminer les gaz dissous et en particulier l’oxygène.
Il est donc préférable de dégazer les solvants soit par ultrasons soit par barbotage d’hélium soit
par filtration avant d’introduire les solvants dans leur réservoir.
1.3 LE SYSTEME DE POMPAGE
Ces pompes doivent être très puissantes car la viscosité des solvants et la granulométrie très
fine des phases stationnaires entraînent des différences de pression ou des pertes de charges
entre le sommet et l’extrémité des colonnes qui peuvent parfois être importantes (50 à 100
bars).
Les plus usuelles permettent d’obtenir des pressions de 420 bars (ou 6000 PSI (1 PSI = 0,07
bar)). Les pompes sont très onéreuses et interviennent pour une très grande part dans le coû t
élevé des appareils.
Il faut noter que les pressions très élevées engendrées par les pompes HPLC ne présentent
aucun danger d’explosion car les liquides ne sont pas très compressibles. La rupture d’une pièce
mécanique n’entraîne qu’une fuite de solvant.
La grande majorité des appareils est équipé par des pompes à pistons alternatifs. Leur avantage
réside principalement dans :
leur pression de sortie élevée (jusqu'à 700 bars), leur adaptabilité à la technique de
gradient d’élution,
Afin d’éviter l’écoulement pulsé qui est propre au mouvement de va-et-vient du piston
(remplissage-expulsion), les constructeurs ont mis au point des pompes à deux pistons qui
fonctionnent soit en mode série soit en mode parallèle.
En mode série, le piston amont (piston A) refoule une quantité de solvant deux fois plus
importante que le piston aval, soit parce que son diamètre est plus important, soit parce
que sa course est plus grande.
Les deux pistons sont déphasés : lorsque l’un aspire, l’autre refoule. Dans ce système,
pendant que le piston A aspire une quantité d’éluant, le piston B refoule la phase mobile
dans la colonne. Ensuite, lorsque le piston A refoule l’éluant, une partie de ce dernier
vient remplir le cylindre du piston B qui règle ainsi le débit nominal et l’autre partie est
refoulée dans la colonne. Ces montages nécessitent des vannes en amont et en aval de
chaque piston.
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FIGURE 2 : MONTAGE A PISTON DOUBLE
En mode parallèle le système de pompage est constitué de deux têtes de pompe fonctionnant
en opposition permettant d’obtenir un débit de phase liquide sans pulsations.
les solvants sont dosés et mélangés en aval des pompes (système haute pression). Dans
ce dispositif, il est nécessaire d’avoir autant de pompes que de solvants. Le gradient est
obtenu simplement en modifiant, à débit total constant, le rapport des débits des
pompes.
dans le système basse pression, le nombre de pièce mobile est moindre. Ce système
donne la possibilité de réaliser des gradients quaternaires. Notons enfin qu’un pré-
mélange des solvants avant pompage permet de s’affranchir des phénomènes de
contraction de volume.
1.4 L’INJECTEUR
L’injection doit se faire en un temps très bref afin de ne pas perturber le régime d’écoulement
dans la colonne et le détecteur. La difficulté consiste à introduire en tête de colonne un volume
d’échantillon là ou la pression atteint plusieurs dizaines de bars. On utilise pour cela une vanne
haute pression à plusieurs voies (vanne à boucle d’injection). Ce type de vannes peut être utilisé
soit manuellement soit commandé par un passeur automatiques d’échantillons.
Le principe de fonctionnement de ces vannes est le suivant : l’échantillon est introduit avec une
seringue à la pression atmosphérique dans la boucle (position chargement ou load), puis il est
mis en communication par rotation de la vanne avec la phase mobile et la colonne (position
inject).
FIGURE 5 : VANNE D’INJECTION HPLC
Ce système évite les brusques variations de pression dans l’appareil et est d’une grande
reproductibilité car il y a peu d’irrégularité dans les injections étant donné que la quantité
introduite est obligatoirement celle du volume de la boucle.
Les volumes injectés sont fixés par la capacité de la boucle qui a des volumes variables allant du
microlitre au millilitre.
Les colonnes d’HPLC sont généralement courtes et droites en acier inoxydable 316 capable de
résister aux fortes pressions.
Ce type de colonne offre souvent de 40 000 à 60 000 plateaux par mètre. Le débit de la phase
mobile ne peut dépasser quelques ml/min.
La colonne est souvent précédée par une colonne de garde ou précolonne. Ces colonnes ont pour
rô le d'augmenter la durée de vie de la colonne d’analyse en retenant tous les composés qui ne
sont pas élués. Elle est plus courte (0,4 à 1 cm) et est remplie de la même phase stationnaire.
Cette colonne sera changée périodiquement.
Depuis peu de temps est apparu sur le marché des microcolonnes de diamètre intérieur de 0,3
mm et de longueur de 5 cm. La taille des particules varie de 3 à 5 m et les débits atteignent à
quelques L/min. La colonne et l’injecteur doivent être adaptés.
de la rapidité de l’analyse,
de consommer moins de solvant (les solvants de haute pureté pour l’HPLC sont très
coû teux),
de conduire à une meilleure résolution de l’analyse (par suite d’une moindre diffusion),
En HPLC, il n’existe pas de détecteurs universels aussi sensibles que ceux utilisés en
chromatographie gazeuse mais des détecteurs spécifiques de grande sensibilité. Dès lors, le
dispositif utilisé dépend de la nature de l’échantillon. le tableau ci-dessous présente quelques
détecteurs courants et leurs propriétés.
Ces détecteurs sont les plus couramment utilisés en HPLC car ils sont peu sensibles aux
fluctuations de débit et de température et un grand nombre de solvants ont une bonne
transparence dans l’UV.
A = l C
Avec :
La sensibilité est d’autant plus grande que l est grand, mais il faut dans le même temps que le
volume soit aussi faible que possible pour ne pas affecter l’efficacité du système
chromatographique. Les cellules ont en général un volume de quelques microlitres (5 à 10 L) et
ont un trajet optique de l’ordre de 1 cm.
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La limite de détection dépend :
Cmin 2104
2.108 moll1
104*1
Ceci correspond, en prenant un facteur de dilution f lors de l’introduction dans la colonne
chromatographique de 25 et en faisant une injection de 5 l, à une quantité minimale détectable
de 2,5 10-12 mole, soit pour une masse molaire de 300 g mol -1, à une quantité détectable de 0,75
ng.
FIGURE 10 : SCEMA DE PRINCIPE D’UN DETECTEUR PHOTOMETRIQUE A UNE SEULE LONGUEUR D’ONDE
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Ce type de détecteur est très limité et est progressivement remplacé par des
spectrophotomètres polychromatiques.
Ce mode de détection a une grande sélectivité et une grande sensibilité. Il exploite les propriétés
qu’ont certaines molécules en solution d’absorber des radiations dans l’ultraviolet (passage à un
état excité) et de reémettre une fraction de la lumière absorbée donc à une longueur d’onde
supérieure, l’autre fraction étant convertie en énergie interne
(conversion interne) :
La loi fondamentale en fluorimétrie est que l’intensité If du rayonnement émis par fluorescence
est proportionnelle pour un volume donné, à l’intensité lumineuse absorbée :
En remplaçant l’intensité transmise It par son expression donnée par la loi de Beer-Lambert, on
peut calculer If :
If = kIo(1 – 10-l C)
Si l’absorption de la solution est faible (solution diluée) et le trajet optique petit alors
10-l C 1 – 2,3*l C
et If 2,3*l C = a C
La réponse de ce type de détecteur est linéaire qu’aux faibles concentrations, ce qui justifie
l’emploi de ce mode de détection pour l’analyse de traces où la sensibilité est supérieure à celle
de l’absorption.
En fluorimétrie on effectue une mesure directe de l’intensité lumineuse tandis qu’en absorption
on effectue une mesure relative A = logIo/It.
Ainsi les quantité minimales détectables des composés présentant une forte fluorescence
peuvent être de l’ordre de quelques femtomoles (10-15 mole) injectées.
La fluorimétrie est un mode de détection très sensible mais très sélectif car il y a peu de
molecules qui sont naturellement fluorescentes. On peut étendre le domaine d’application de la
spectrofluorimétie grâ ce aux techniques de dérivatisation pré ou post-colonne qui permettent
de modifier les molécules afin de les rendre fluorescentes.
Le principe repose sur les lois de Fresnel de transmission de la lumière dans les milieux
transparents dont l’indice de réfraction est n.
La limite de détection de la réfractométrie n’est pas très bonne. Elle dépend à la foi de la nature
du soluté et de celle de la phase éluante. La réponse du réfractomètre est donnée par la relation :
R1 = Z(n - no)
Avec
N = nipi + no(1-pi)
Avec
R1 = Z pi (ni - no)
Supposons un bruit de fond (R1/Z) égal à 10-7 et une différence d’indice de réfraction entre la
phase éluante et l’effluent égal à 0,1 unité, la fraction massique minimale détectable est de
2107
pmin
2106 soit2ppm
0,1
En considérant un facteur de dilution imposé par la colonne de 25, une injection de 5 l et une
masse volumique de la phase éluante de 0,7 g cm-3, la quantité détectable est de :
Elle conduit à des pics soit négatifs soit positifs, ce qui implique le réglage de la ligne de
base à mi-hauteur du graphe.
Les indices de réfraction pouvant varier de plusieurs dixièmes d’unité d’un solvant à un
autre, on ne peut utiliser le réfractomètre en gradient d’élution.
La principale qualité du réfractomètre est son caractère quasi-universel, sauf dans le cas rare où
l’indice de réfraction de la phase éluante est identique à celui du soluté.
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1.6.4 DETECTEURS PAR CONDUCTIMETRIE
Ce détecteur est limité à la détection des espèces ionisées et est surtout utilisé en
chromatographie ionique. Son principe repose sur la mesure, en sortie de colonne, de la
conductance de la phase mobile riche en composé ionique. La difficulté dans cette analyse est de
reconnaître dans le signal global la part de conduction due aux ions ou substances ioniques
faiblement chargées appartenant à l’échantillon de celle de l’électrolyte contenu dans la phase
mobile.
GiziCi
i 103K
Avec :
G : conductance de la solution S
Lors de l’élution d’un soluté, la variation de la conductance Sx- sera donnée par l’expression :
x(S E )
G [S
x 3
] 10 K
Avec
la différence (S - E) soit aussi grande que possible en valeur absolue.
[Sx-] soit le plus grand possible, c’est à dire que la dilution apportée par l’ensemble du
système chromatographique soit faible (ceci est vrai pour tout type de détection).
la conductance de l’éluant soit très stable. Pour cela, il est nécessaire d’avoir une
thermorégulation de l’ensemble du système, la conductivité des ions variant avec la
température (les variations de i sont de l’ordre de 2% par °C).
la conductance de l’éluant soit très faible pour permettre une forte amplification du
signal au passage du soluté.
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Deux voies ont été développées dans la recherche d’une bonne détection :
dans la deuxième méthode dite sans neutralisation, on utilise comme ion éluant un ion
organique volumineux donc peu mobile et par conséquent de faible E. La détection
s’effectue directement à la sortie de la colonne de séparation.
2) la quantité de phase mobile utilisée est beaucoup plus grande que celle pouvant être
raisonnablement introduite dans la chambre du spectromètre.
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2 LES PRINCIPALES CHROMATOGRAPHIES LIQUIDES
La connaissance des masses molaires, des polarités et des caractères ioniques des
solutés va orienter le choix de la méthode chromatographique à mettre en œuvre pour
réaliser leur séparation. Suivant la polarité et la masse molaire des composés on utilise
différents type de chromatographie:
Pour les molécules de masses molaires élevées (> à 10 000 g mol-1), on utilise
généralement une des deux méthodes d’exclusion : la perméation de gel pour les
espèces non polaires et la filtration de gel pour les composés polaires ou
ioniques.
Pour les petites molécules non ioniques on préférera les analyser par des
méthodes de partage.
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2.1 LA CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION
Cette technique est utilisée essentiellement pour fractionner les mélanges de composés
présentant des groupements fonctionnels différents et des isomères de position tels que
les dérivés du benzène substitués en méta et en para.
La séparation des solutés dépend des différences de solubilité des solutés dans la phase
mobile, et des différentes interactions des solutés avec la phase stationnaire (force de
Van der Waals, forces électrostatiques).
La phase stationnaire est un liquide immobilisé par greffage sur gel de silice.
La phase mobile est un liquide dont les interactions avec la phase stationnaire doivent
être faibles, ce qui est obtenu lorsque leurs polarités sont différentes. On distinguera
donc deux types de chromatographie de partage :
Excepté quelques nouvelles phases constituées par des polymères organiques, le gel de
silice est le matériau de base des phases stationnaires des colonnes HPLC.
Ce matériau doit être exempt de tout ion métallique et les grains doivent être de
dimension régulière. Ces gels de silices :
L’utilisation de la silice est limitée par sa solubilité en milieu alcalin (pH > 8). Il faudra
donc respecter la condition d’un milieu acide lorsqu’on utilise des colonnes
chromatographiques avec silice.
La plupart des silices greffées sont préparées par la réaction d’un organochlorosilane
avec les groupements silanols à la surface du gel de silice. Cette réaction se fait par
hydrolyse dans l’acide chlorhydrique dilué et chaud :
Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est polaire et elle peut être
schématisée sous la forme :
Si(-)3-CH2-CH2-CH2-NH2
les composés apolaires seront élués avant les composés polaires puisqu’ils sont
plus solubles dans la phase mobile. Si R’ est un groupement alkyl par exemple :
pour un soluté donné, la rétention d’un soluté (k’ ou tr) diminuera lorsque la
polarité de la phase mobile augmente.
Le tableau ci-dessous rassemble quelques valeurs de force éluante sur silice greffée
aminopropyle :
Solvant o
Tétrachlorure de carbone 0,067
Acétate d’éthyle 0,110
Tétrahydrofuranne 0,115
Dichlorométhane 0,124
Chloroforme 0,130
les composés polaires seront élués avant les composés apolaires puisqu’ils sont
plus solubles dans la phase mobile,
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la rétention est d’autant plus importante que la polarité de l’éluant est plus
grande, c’est-à -dire que la proportion en eau sera importante.
Quand les espèces étudiées comportent des groupements acide ou basique, il est
nécessaire de contrô ler le pH de l’éluant. Plus le soluté est ionisé, plus son temps de
rétention diminue (forte solubilité en phase aqueuse). Les variations des temps de
rétention sont très importantes lorsque le pH varie autour du pKa d’une espèce :
Lorsque les composés sont très polaires, ils peuvent avoir une rétention insuffisante sur
les silices alkylées. On utilisera alors des silices greffées amino ou cyano.
Remarque sur la pureté des solvants : L’eau utilisée doit être rigoureusement exempte
de matières organiques. Ces substances peuvent être retenues par la phase stationnaire
puis être éluées lorsque la teneur en solvant organique augmente, d’où l’apparition de
pics parasites ou de dérive de la ligne de base.
L’eau simplement déminéralisée sur résine échangeuse d’ions contient souvent des
traces de matières organiques provenant du relargage des résines. Elle devra donc être
déminéralisée sur REI puis :
soit provenir d’appareil de production d’eau ultra pure (passage sur diverses
résines et charbons actifs).
Cette eau doit être stockée exclusivement dans des récipients en verre.
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2.3 LA CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
La phase stationnaire est un échangeur d’ions, c’est-à -dire un solide comportant des
groupements fonctionnels ionisés, fixes, porteurs de charges positives ou négatives, et
des ions mobiles de signe contraire assurent l’électroneutralité. Les ions sont retenus au
voisinage du groupement fonctionnel par des forces électrostatiques. Lors de l’échange,
il se crée des équilibres du type :
Un échangeur d’ion est constitué de deux parties : la matrice (ou support) sur laquelle
seront greffés les groupements fonctionnels, et les groupements fonctionnels.
2.3.1.1 LES GROUPEMENTS FONCTIONNELS
On distingue :
les échangeurs de cations pour lesquels les groupements fixes sont chargés
négativement. Les plus utilisés sont les groupements du type sulfonate RSO3-, qui
agissent comme des acides forts lorsqu’ils sont protonés. L’ions H3O+ sera l’ion
échangeable contre un autre cation :
Ces échangeurs sont susceptibles de fixer tous les cations et de les échanger avec des
protons.
les échangeurs d’anions dont les groupements fixes sont chargés positivement. Ce
sont généralement des ions ammonium quaternaire du type triméthyl
+
ammonium : –N(CH3)3 qui agissent comme des bases fortes lorsqu’ils sont sous
forme OH et l’ion OH- sera l’ion échangeable contre un autre anion :
R–N(CH3)3OH + Cl- → R–N(CH3)3Cl + OH-
Ces échangeurs sont susceptibles de fixer tous les anions et de les échanger avec des
ions OH-.
Il existe également des échangeurs d’ions dont les groupements ont le caractère d’acides
ou de bases faibles (R-COOH ou R-NR2). La capacité d’échange des échangeurs d’ions
faibles dépend du degré d’ionisation des groupements fonctionnels donc du pH de la
phase éluante :
les groupements carboxyliques ne pourront échanger que les cations liés aux
anions d’acides faibles (HCO3-, SiO3-).
les échangeurs faiblement basiques fixent uniquement les anions liés aux anions
d’acides forts tels que Cl-, SO42- et NO3-.
2.3.1.2 LA MATRICE
La matrice est constituée par un réseau tridimensionnel macromoléculaire, le plus
souvent un copolymère styrène-divinylbenzène sur lequel sont greffés les groupements
fonctionnels. Elle se présente sous forme de petites sphères d’un diamètre de quelques
micromètres qui sont généralement d’une très grande dureté pour résister à
l’écrasement dans la colonne.
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FIGURE 21 : PHASE STATIONNAIRE EN CI. SCHEMA D’UNE PARTICULE SPHERIQUE DE POLYSTYRENE A
USAGE D’ECHANGE DE CATIONS
En présence d’eau, ces résines gonflent c’est-à -dire que les molécules d’eau pénètrent à
l’intérieur des grains et solvatent les groupements fonctionnels provoquant leur
ionisation et leur dissociation en un ion fixe (RSO3- par exemple) et un ion libre
échangeable (H3O+ par exemple).
Il s’établit sur la colonne une suite d’équilibres réversibles régis par la constante K
d’équilibre ionique (loi d’action de masse) :
[E ]S [ A ] KE
M
[E ] [ A ] K
M S A
Ainsi pour un échangeur d’anions de type ammonium quaternaire, l’ordre d’affinité sera
le suivant :
Citrate > SO42- > oxalate > I- > NO3- > Br- > SCN- > Cl- > formiate > acétate > OH- > F-
Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ >
NH4+ > Na+ > H+ > Li+
Cet ordre est important car il définit en partie la force éluante des phases mobiles
utilisées.
Par exemple, dans le cas d’échange d’anions, l’utilisation de l’ion nitrate dans la
phase éluante conduira à une élution beaucoup plus rapide que l’utilisation de
l’ion chlorure.
La rétention des espèces est régie à la fois par la concentration des ions dans la solution
(déplacement de l’équilibre d’échange) et par le pH de celle-ci (ionisation des espèces à
séparer). On utilise généralement des solutions tampons de pH.
2.3.3.1 LA VALEUR DU PH
C’est le facteur le plus important qu’il faut optimiser en premier puisqu’il régit la
sélectivité. En effet un accroissement du taux d’ionisation conduit à une rétention plus
importante des espèces. Le degré d’ionisation sera défini par la valeur du pK A des
espèces acido-basiques.
Il est difficile d’établir une règle quant au choix du pH. Souvent on opère à un pH voisin
du pKA des espèces à séparer, légèrement supérieur pour les composés basiques et
légèrement inférieur pour les composés acides.
Les composés les plus souvent utilisés pour préparer les solutions tampons sont :
Par ce terme, on entend une chromatographie qui associe un échange d’ions avec une
détection conductimétrique.
La détection des composés ioniques de l’échantillon est rendue difficile par suite de leur
faible concentration au sein de la phase mobile aqueuse chargée d’une grande quantité
d’ions. Deux voies ont été développées dans la recherche d’une bonne détection la
détection : conductométrique avec ou sans neutralisation.
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2.3.4.1 DETECTION AVEC NEUTRALISATION
Par exemple : supposons l’analyse d’un mélange de cations Li+, Na+ et K+. la séparation
s’obtient aisément sur une colonne avec une résine échangeuse de cations de type
sulfonate comme phase stationnaire et d’une solution d’acide fort (acide chlorhydrique
par exemple).
L’ion Li+ ne sera pas retenu et migre à la même vitesse que la phase mobile dans la
colonne tandis que K+ et Na+ migrent plus lentement.
En sortie de colonne chaque ion sera en mélange avec la phase mobile (H+ et Cl-). Pour
éliminer l’acide chlorhydrique, on fait percoler l’effluent de la colonne sur une seconde
colonne placée en série contenant une REI de type anionique forte sous forme OH. On
observe deux réactions :
une réaction de permutation des ions Cl- par les ions OH-
une réaction de neutralisation des ions H+ de la phase mobile par les ions OH-. En
sortie, ne subsisteront que les espèces (Li+ OH-), (Na+ OH-), (K+ OH-).
Par exemple, les ions Na+ de la phase éluante sont échangés par des ions H+ à la surface
interne de la membrane et diffusent ensuite vers l’autre surface où il seront échangés
avec des ions H+ de la solution acide de régénération. Les ions H+ de cette solution
migrent dans le sens opposé afin de maintenir l’électroneutralité.
Plus récemment sont apparus des suppresseurs autorégénérés par une réaction
d’électrolyse de l’eau :
Les performances de ces systèmes sont telles qu’elles permettent la mise en œuvre de
gradient d’élution, ce qui n’est pas permis en analyse sans neutralisation.
2.3.4.2 DETECTION SANS NEUTRALISATION
C’est une méthode plus simple que la précédente mais elle impose :
d’utiliser un éluant peu conducteur (ce qui implique une faible concentration
ionique et, par suite, la mise en œuvre d’une colonne de faible capacité.
On utilise généralement un ion organique volumineux, donc peu mobile, mais présentant
une forte affinité pour la phase stationnaire, de façon à limiter sa concentration dans
l’éluant. La détection s’effectue directement à la sortie de la colonne de séparation.
Par exemple : l’analyse des anions organiques peut être effectuée en utilisant l’ion
benzoate comme ion développeur. Cet ion a une conductivité ionique de 32 S cm2 mol-1
qui est largement inférieure à celle des anions organiques courants tels Cl-, NO3-, SO42-
pour lesquels elle est de l’ordre de 70 S cm2mol-1. La variation de la conductance sera
suffisante pour pouvoir détecter ces espèces.
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La détection peut être améliorée en utilisant l’acide benzoïque qui n’est que
partiellement dissocié en solution aqueuse. Une solution d’acide benzoïque à 8,4 10-4
mol l-1 contient 2 10-4 mol l-1 d’ions benzoate (taux de dissociation est de 24%) et
présente une force éluante très proche de celle d’une solution de benzoate de sodium à
la même concentration. Le remplacement de l’ion sodium par un proton exalte la
réponse chromatographique par mesure conductimétrique la conductivité ionique de H+
est beaucoup plus élevée que celle de Na+).
2.3.4.3 ASPECTS PRATIQUES ET APPLICATIONS
La mise en œuvre de phases mobiles soit très acides soit fortement basiques demande
d’accorder une attention particulière à la corrosion et aux risques de contamination des
échantillons.
On appelle ‘paire d’ions’ ou appariement d’ions, une entité formée par l’association de
deux ions de charges opposées. Cette association peut être due :
soit à des interactions électrostatiques : ces paires d’ions s’observent dans des
solvants de faible constante diélectrique.
soit à des effets hydrophobes : les ions organiques de grande taille comportent
une partie apolaire et un groupement ionique s’associent en paire d’ions en
solution aqueuse.
Exemple : soit en phase aqueuse à pH 7-8 un ion carboxylate RCOO- en présence d’un
cation ammonium quaternaire comportant des chaînes alkyle hydrophobes, par
exemple l’anion tétrabutylammonium Bu4N+. Il y a formation d’une paire d’ions en
phase aqueuse en raison du caractère hydrophobe du cation ammonium quaternaire.
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Cette paire d’ions peut être extraite par un solvant organique de faible constante
diélectrique comme un mélange chlorure de méthylène hexane :
La propriété fondamentale des paires d’ions est leur aptitude à passer des solutions
aqueuses dans les milieux de faible constante diélectrique.
La formation de paires d’ions peut être utilisée pour effectuer des séparations
chromatographiques de substances ionisées ou ionisables. Elle rivalise avec la
chromatographie d’échange d’ions.
Elle met en œuvre des phases stationnaires de gel de silice greffée et elle a l’avantage
d’avoir de meilleures propriétés mécaniques ainsi q’une efficacité supérieure.
Cette technique d’appariement d’ions à l’avantage sur l’échange d’ions réside dans le fait
que les interactions mises en jeu peuvent être plus variées par le choix de l’ion
antagoniste de solutés à séparer et par la nature de la phase mobile.
On utilise :
Pour la phase stationnaire : soit des silices greffées de chaîne alkyle (octyle ou
octadécyle), soit un copolymère styrène divinylbenzène.
Ainsi, il y distribution du contre ion des solutés ionisés et des paires d’ions entre une
phase mobile hydro-organique et une phase stationnaire apolaire.
Il s’agit d’un mécanisme par formation d’une double couche électrique à l’interface
solide hydrophobe –phase mobile. Le contre ion est adsorbé par sa partie hydrophobe
par les chaînes alkyles de la silice et celle–ci devient équivalent à un échangeur d’ions :
Le contre ion fixe le potentiel de surface de la phase stationnaire et le soluté ionisé se
concentre dans la couche diffuse.
La fixation du contre ion sur la phase stationnaire sera définie par le tracé d’isothermes
d’adsorption, c’est-à -dire l’étude de la variation de la concentration du contre ion dans la
phase stationnaire en fonction de sa concentration dans la phase mobile pour des phases
mobiles de nature et de composition différentes. Ces isothermes montrent que la
fixation du contre ion est d’autant plus importante que :
La rétention du soluté est d’autant plus importante que le soluté est ionisé. Pour un
acide la rétention maximale sera obtenue pour un pH > pKA +2 et pour une base pour un
pH < pKA – 2 (99% de la base sera sous forme protonée HB+) ;
-CH2-CH(NH2)COOH
a deux constantes d’acidité et peut exister sous les formes suivantes en fonction du pH :
Son indice de Rekker est de 2,24. C’est une espèce hydrophobe dont sa rétention
augmente fortement au-dessous de pH 3,5 par échange d’ions sur des chaînes alkyles
recouvertes de l’anion dodécylsulfate et par partage des paires d’ions hydrophobes.
On forme des paires d’ions avec le cation tétrabutylammonium (TBA). La phase mobile
est constituée d’une solution aqueuse de TBA et d’acide salicylique à pH 4,62 dont une
partie sous la forme d’anions salicylates C6H4(OH)COO-.
Le chromatogramme montre qu’il y a une élution successive des différents anions par
l’ion salicilate comme celui-ci absorbe dans l’ultraviolet chaque anion donne un pic
négatif par diminution de l’absorbance de l’effluent lorsqu’il passe dans le détecteur
spectroscopique.
2.4.3.2 SEPARATION D’ACIDES CARBOXYLIQUES SUR SILICE GREFFEE ALKYLE AVEC
UN CONTRE ION CATIONIQUE
Solutés :
Les acides chromatographiés sont listés dans le tableau ci-dessous avec leur
valeur de pKA
La phase mobile :
40
Le contre ion est cationique : le bromure de cétyltriméthylammonium :
C16H33(CH3)3N+, Br- (ou cétrimide).
Le pKA le plus élevé des solutés est celui correspondant à la deuxième acidité de
l’acide maléique (6,26). Nous fixerons donc le pH à 7 (pour ces phases il faut
éviter les pH > 8).
La phase mobile sera constituée d’un mélange eau-acétonitrile (65 :35 v/v)
contenant 0,05 mol l-1 d’acétate d’ammonium et 10-2 mol l-1 du cétrimide.
La phase stationnaire :
Chromatogramme :