1b) who - laborleitlinien zur Ejakula untersuchung

WHO-Laborhandbuch zur Untersuchung und Aufarbeitung
des menschlichen Ejakulates

5.Auflage
WHO -Laborhandbuch
zur Untersuchung
und Aufarbeitung
des menschlichen
Ejakulates
5. Auflage
Deutsche Übersetzung herausgegeben von

Eberhard Nieschlag, Stefan Schlatt, Hermann M. Behre
und Sabine Kliesch
unter Mitarbeit von:
Rebecca Bongers, Fedra Gottardo, Thomas Greither,

Barbara Hellenkemper, Susan Nieschlag, Verena Nordhoff,
Maria Schalkowski und Michael Zitzmann
Mit 48 Abbildungen davon 14 farbig
1C
World Health Organization
20, Avenue Appia
CH-1211 Geneva 27
Switzerland
Deutsche
Übersetzung herausgegeben von
Eberhard Nieschlag1, Stefan Schlatt1, Hermann M. Behre2 und Sabine Kliesch1
1 Centrum für Reproduktionsmedizin und Andrologie, WHO Kooperationszentrum zur Erforschung der männ-
lichen Fertilität, Universitätsklinikum Münster, Domagkstr. 11, 48149 Münst

er
2 Zentrum für Reproduktionsmedizin und Andrologie, Universitätsklinikum Halle (Saale), Ernst-Grube-Str. 40,
06120 Halle
unter Mitarbeit von:
Rebecca Bongers, Fedra Gottardo, Thomas Greither, Barbara Hellenkemper, Susan Nieschlag, Verena Nordhoff,
Maria Schalkowski und Michael Zitzmann
Die Originalausgabe wurde 2010 unter dem Titel WHO Laboratory manual for the examination and processing
of human sperm, 5th edition von der World Health Organization veröffentlicht.
© World Health Organization 2010

Die World Health Organization erteilte dem Springer-Verlag die Lizenz für die deutsche Ausgabe, für die er
allein die Verantwortung trägt.
ISBN 978-3-642-2112
2-5 Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York
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Gedruckt auf säurefreiem Papier 2111 – 5 4 3 2 1 0

V
Inhaltsv
erzeichnis
1 Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Die 5. Auflage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Zweck des und Umfang des Laborhandbuchs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
I Untersuchung des Ejakulates
2 Standardverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2 Probengewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.1 Vorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.2 Gewinnung des Ejakulates für diagnostische und Forschungszwecke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.3 Sterile Probengewinnung im Rahmen der assistierten Reproduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.4 Sterile Probengewinnung für die mikrobiologische Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2.5 Probengewinnung zu Hause . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2.6 Probengewinnung mittels Kondom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2.7 Sichere Probenhandhabung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3 Erste makroskopische Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3.1 Liquifizierung (Verflüssigung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Verzögerte Liquifizierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3.2 Konsistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.3 Aussehen des Ejakulates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.4 Ejakulatvolumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Unterer Referenzwert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3.5 pH-Wert des Ejakulates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Referenzwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4 Erste mikroskopische Untersuchung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4.1 Gründliche Mischung und repräsentative Probenentnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4.2 Herstellung eines Feuchtpräparates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4.3 Spermienaggregationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4.4 Spermienagglutinationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4.5 Zelluläre Elemente außer Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.5 Spermienmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5.1 K
lassifi zierung der Spermienmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5.2 Vorbereitung der Probe und Beurteilung der Motilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.5.3 Arbeitsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.5.4 Untere Referenzgrenze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.6 Spermienvitalität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.6.1 Vitalitätstest mittels Eosin-Nigrosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Zubereitung der Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.6.2 Vitalitätstest mittels Eosin allein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
VI Inhaltsverzeichnis
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.6.3 Vitalitätstest mittels hypoosmotischer Schwellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.7 Spermienanzahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.7.1 Verschiedene Arten von Zählkammern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.7.2 Das Neubauer-improved-Hämozytometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.7.3 Anwendung des Hämozytometer-Rasters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.7.4 Pflege der Zählkammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.7.5 Diluent zur Ejakulatverdünnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.7.6 Die Notwendigkeit, eine ausreichende Anzahl an Spermien zu zählen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.8 Routine-Zählverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.8.1 Bestimmung der erforderlichen Verdünnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.8.2 Vorbereitung der Verdünnungen und Beladung der Hämozytometerkammer . . . . . . . . . . . . . 38
2.8.3 Bestimmung der Spermienzahl in den Zählkammern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.8.4 Berechnung der Spermienkonzentration im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.8.5 Berechnungsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.8.6 Unterer Referenzwert für die Spermienkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.8.7 Berechnung der Spermiengesamtzahl im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.8.8 Unterer Referenzwert für die Spermiengesamtzahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.9 Niedrige Spermienzahl: Kryptozoospermie und vermutete Azoospermie . . . . . . . . . . . . . 42
2.10 Wenn eine exakte Bestimmung einer niedrigen Spermienzahl nicht notwendig ist . . . . 43
2.10.1 Keine weiteren Maßnahmen ergreifen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.10.2 Untersuchung von zentrifugierten Proben, um Spermien zu finden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.10.3 Untersuchung von nicht zentrifugierten Proben, um bewegliche Spermien zu finden . . . . . . 44
2.11 Wenn eine genaue Bestimmung auch bei wenigen Spermien notwendig ist . . . . . . . . . . 45
2.11.1 Die Bestimmung einer niedrigen Spermienzahl im gesamten Neubauer-improved-
Hämozytometer (Phasenkontrast-Mikroskopie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Berechnung niedriger Spermienkonzentrationen im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Sensitivität der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Berechnungsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Berechnung der Spermiengesamtzahl im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.11.2 Erfassung einer niedrigen Spermienzahl in großvolumigen Einweg-Zählkammern
(Fluoreszenzmikroskopie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Berechnung niedriger Spermienkonzentrationen im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Berechnungsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Berechnung der Spermiengesamtzahl im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.12 Zählung von Zellen, die keine Spermien sind . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.12.1 Berechnung der Konzentration von Rundzellen im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.12.2 Sensitivität der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.12.3 Berechnungsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
VII
Inhaltsverzeichnis
2.13 Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.13.1 Das Konzept normaler Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.13.2 Vorbereitung des Ejakulatausstriches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Normale Ejakulatproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Proben mit geringen Spermienkonzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Visköse Ejakulatproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Waschen von zellreichen oder viskösen Ejakulaten und Reduzieren von
Hintergrundartefakten für die computerunterstützte Spermienmorphometrie . . . . . . . . . . . . 56
2.14 Färbemethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.14.1 Traditionelle Fixierung und sequentielle Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.14.2 Papanicolaou-Färbung für die Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Fixierung der luftgetrockneten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Färbung der fixierten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Behandlung der gefärbten Ausstriche vor dem Einbetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Einbetten der gefärbten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.14.3 Shorr-Färbung für die Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Fixierung der luftgetrockneten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Färbung der fixierten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
2.14.4 Schnellfärbemethoden für die Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Fixierung der luftgetrockneten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Färbung der fixierten Ejakulatausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
2.15 Beurteilung der gefärbten Präparate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.15.1 lassifi
K zierung der normalen Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.15.2 lassifi
K kation der abnormalen Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.16 Abbildungen zur Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
2.17 Analyse eines Ejakulatausstriches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
2.17.1 Beurteilung der normalen Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
2.17.2 Arbeitsbeispiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
2.17.3 Unterer Referenzbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
2.17.4 Bestimmung der abnormalen Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
2.17.5 Arbeitsbeispiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
2.17.6 Beur teilung spezifischer Spermiendefekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
2.18 Beurteilung der Leukozyten im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
2.18.1 Zelluläre Peroxidase-Färbung mit Ortho-Toluidin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Bestimmung der Peroxidase-positiven Zellzahl im Hämozytometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Kalkulation der Konzentration der peroxidase-positiven Zellen im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . 98
Arbeitsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
Referenzwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
VIII Inhaltsverzeichnis
2.1
9 Beurteilung unreifer Keimzellen im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2.20 Testung auf Spermienantikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2.20.1 Der gemischte Antiglobulin-Reaktions-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Beurteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Referenzwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
2.20.2 Der direkte Immunobead-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Vorbereitung der Immunobeads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Vorbereitung der Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Referenzwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
2.20.3 Der indirekte Immunobead-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Vorbereitung der Immunobeads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Vorbereitung der Spenderspermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Vorbereitung der zu testenden Flüssigkeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Inkubation der Spenderspermien mit den zu testenden Flüssigkeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Immunobead-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
3 Fakultative Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

3.1 Index für multiple Spermiendefekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.1.1 Errechnen der Indizes für multiple morphologische Defekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.1.2 Beispiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.2 Panleukozyten-Marker CD45 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
3.2.1 Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
3.2.2 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
3.2.3 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Vorbereitung des Samens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Anfertigen der Spermienausstriche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Antikörper-Inkubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Färbung und Einbettung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Beurteilung der CD45-positiven Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Errechnen der CD45-Zell-Konzentration im Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Sensitivität der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Beispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Referenzbereiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
3.3 Interaktionen zwischen Zervikalschleim und Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
3.3.1 In-vivo-Test (postkoital) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Ziel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Timing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Instruktionen für die Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Die Untersuchung des Vaginalsekretes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Die Untersuchung der Mukusprobe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
3.3.2 In-vitro-Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
IX
Inhaltsverzeichnis
3.3.3 Vereinfachter In-vitro-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Beobachtungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Beurteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
3.3.4 Kapillar-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Untersuchung der Flachkapillare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
3.4 Biochemische Marker zur Testung der Funktion der akzessorischen
Geschlechtsdrüsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
3.4.1 Die Bestimmung von Zink im Seminalplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Berechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Unterer Referenzbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
3.4.2 Bestimmung der Fruktose aus dem Seminalplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2
Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Berechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
3.4.3 Bestimmung der neutralen α-Glukosidase im Seminalplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Berechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
3.5 Computerassistierte Spermienanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
3.5.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
3.5.2 Verwendung der CASA zur Bestimmung der Spermienmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
CASA-Terminologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
3.5.3 CASA zur Bestimmung der Spermienkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
3.5.4 Computergestützte Untersuchung der Spermienmorphologie (CASMA) . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
4 Forschungsrelevante Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

4.1 Reaktive Sauerstoffradikale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
4.1.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
4.1.2 ROS-Bestimmung in Spermiensuspensionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Opsonisierung des Zymosan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
X Inhaltsverzeichnis
Bestimmung spontaner ROS-Produktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

FMLP-Provokationstest in Leukozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Zymosan-Provokationstest in Leukozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
PMA-Provokationstest für Bestimmung der ROS-Produktion von
Leukozyten und Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.2 Humane Spermien-Oozyten-Interaktionstests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.3 Humaner Zona-pellucida-Bindungstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.4 Beurteilung der Akrosomreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
4.4.1 Fluoreszensverfahren zur Bestimmung der Akrosomreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
Einfaches Waschen der Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Behandlung der gereinigten Spermienpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Abstrichpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
PSA-FITC-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Bewertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Quantitative Bestimmung der Akrosomreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
4.4.2 Induzierter Akrosomreaktionstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
Bewertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
4.5 Hamster-Oozyten-Penetrationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
4.5.1 Protokolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Standardprotokoll ohne Ionophor-Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Alternative Protokolle mit Kalzium-Ionophor (Ca2+) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
Gewinnung der Ovarien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
Gewinnung der Kumulusmassen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Aufbereitung der Hamsteroozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Ko-Inkubation der Gameten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Analyse der Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
4.6 Spermien-Chromatin-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
II Spermienpräparationen
5 Spermienpräparationstechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
5.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
5.1.1 Wann ist das Abtrennen der Spermien vom Seminalplasma sinnvoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
5.1.2 Methodenwahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
5.1.3 Effizienz der Spermienseparation vom Seminalplasma und von infektiösen Organismen . . . 147
5.2 Generelle Prinzipien der Spermienpräparationstechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
5.3 Einfaches Waschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
5.3.1 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
5.3.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
5.4 Direkter Swim-up . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
5.4.1 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
XI
Inhaltsverzeichnis
5.4.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

5.5 Diskontinuierlicher Dichtegradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
5.5.1 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
5.5.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
5.6 Präparation von HIV-infizierten Spermienproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
5.7 Präparation testikulärer und epididymaler Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
5.7.1 Enzymatische Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
5.7.2 Mechanische Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
5.7.3 Verarbeitung der Spermiensuspension zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion . . . 151
5.8 Präparation von retrograden Spermienproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
5.9 Präparation von mit technischer Hilfe gewonnenen Ejakulatproben . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
6 Kryokonservierung von Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

6.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
6.2 Protokolle zur Kryokonservierung des Ejakulats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
6.2.1 Standarddurchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Vorbereitung des GEYC-Kryoprotektivums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Beimengung des Kryoprotektivums zum Ejakulat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Befüllen der Plastikstraws (»Strohhalme«) der Kryokassetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Versiegeln der Kryostraws . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Kühlen und Einfrieren des Ejakulates in programmierbaren Einfriergeräten . . . . . . . . . . . . . . 157
Manuelles Einfrieren und Auftauen des Ejakulates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Aufbewahrung der kryokonservierten Samenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Transport von kryokonservierten Samenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Auftauen der kryokonservierten Samenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
6.2.2 M
odifizierte Einfrierprotokolle für oligozoosperme Proben und operativ
gewonnene Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Modifizierte Kryoprotektiva (TGG) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
6.2.3 Beschriftung der Kryostraws und Kassetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
III Qualitätssicherung
7 Qualitätssicherung und Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

7.1 Qualitätskontrolle im Andrologielabor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
7.2 Die Art von Fehlern bei der Ejakulatanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
7.3 Minimierung des Stichprobenfehlers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
7.4 Programm zur Qualitätskontrolle (QK) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
7.5 Standardisierte Verfahrensanweisungen (SOPs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
7.6 Interne Qualitätskontrolle (IQK) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
7.6.1 äKuflich erhältliche QK-Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
7.6.2 Selbst hergestellte QK-Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
7.6.3 Gelagerte QK-Proben (gekauft oder selbst hergestellt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Spermienkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Spermienmorphologie und Vitalität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
Spermienmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
7.6.4 Frische QK-Proben (selbst hergestellt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
XII Inhaltsverzeichnis
7.7 Statistische Verfahren zur Analyse und Dokumentation systematischer

Fehler desselben Technikers oder zwischen mehreren Technikern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
7.7.1 Mittelwertkarte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
Kontrollgrenze einer Mittelwertkarte berechnen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
Graphische Darstellung der Mittelwertkarte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
7.7.2 Die S-Karte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
Bestimmung der Kontrollgrenze für die S-Karte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
Graphische Darstellung der S-Karte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
7.8 QK mit relativen Werten (Prozentangaben) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
7.9 Handhabung und Kontrolle der X- und S-Karten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
7.9.1 Wie kann man fehlerhafte Verfahren erkennen? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
7.9.2 Ursachen für »nichtbestandene« Verfahrenswerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
7.9.3 Reaktion nach Erhalt unbestandener QK-Probenwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
7.10 Statistische Verfahren zur Analyse der Variabilität zwischen Technikern . . . . . . . . . . . . . 175
7.10.1 Vergleich von Resultaten zwischen zwei oder mehreren Technikern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
7.10.2 Erstellen monatlicher Mittelwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
7.11 Externe Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
7.11.1 Bestimmung der EQK-Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
7.11.2 Reaktionsmaßnahmen bei nicht bestandener Bewertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
7.12 Frequenz und Priorität der Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
7.13 Ausbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
7.13.1 Praktische Hinweise für die Bestimmung der Spermienkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
7.13.2 Praktische Hinweise für die Bestimmung der Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
7.13.3 Praktische Hinweise für die Beurteilung der Spermienmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
7.13.4 Praktische Hinweise für die Bestimmung der Spermienvitalität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
IV Appendices
8 Referenzwerte und Nomenklatur der Ejakulatanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189

8.1 Referenzwerte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
8.2 Nomenklatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
9 Ausstattung und Sicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

9.1 Grundausstattung eines Andrologielabors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
9.1.1 Allgemeine Ausstattung für das Andrologielabor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
9.1.2 Notwendige Ausstattung und Materialien für eine Ejakulatanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
9.1.3 Notwendige Chemikalien und Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
9.2 Potentielle Gefährdungen im Andrologielabor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
9.3 Sicherheitsvorkehrungen für das Personal im Andrologielabor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
9.4 Sicherheitsmaßnahmen in Bezug auf die Laboreinrichtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
9.5 Sicherheitsvorkehrungen beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
10 Mikroskopie im Andrologielabor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

10.1 Das Auflegen der Probe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
10.2 Einstellen des Okulars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
10.3 Fokussieren des Bildes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
10.4 Fokussieren des Okulars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
XIII
Inhaltsverzeichnis
10.5 Fokussieren des Lichtkondensators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204

10.6 Zentrieren des Kondensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
10.7 Einstellen der Phasenringe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
10.8 Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
11 Vorrats- und Arbeitslösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

11.1 Biggers, Whitten und Whittingham . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
11.2 Dulbecco’s phosphatgepufferte Salzlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
11.3 Earle‘s Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
11.4 Ham’s-F-10-Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
11.5 Hanks’-Pufferlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
11.6 HTF-Medium (Human-Tubular-Fluid) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
11.7 Krebs–Ringer-Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
11.8 Tris-gepufferte Kochsalzlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
11.9 Tyrode-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
11.10 Papanicolaou-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
12 Zervikalmukus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
12.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
12.2 Gewinnung und Konservierung des Zervikalmukus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
12.2.1 Gewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
12.2.2 Lagerung und Konservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
12.3 Beurteilung des Zervikalmukus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
12.3.1 Volumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
12.3.2 Konsistenz (Viskosität) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
12.3.3 Farnkrautbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
12.3.4 Spinnbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
12.3.5 Zelluläre Bestandteile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
12.3.6 pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
13 Befundbögen für Ejakulatuntersuchungen und Untersuchungen des

Zervikalmukus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219
13.1 Vorlage für einen Befundbogen für Ejakulatuntersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
13.2 Vorlage für einen Befundbogen für Zervikalmukus-Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . 222
14 Messfehler und Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

14.1 Fehler bei der Messung der Spermienkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
14.1.1 Fehler bei Zählungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
14.1.2 Übereinstimmung von wiederholten Zählungen (Replikaten) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
14.2 Die Bedeutung der Kenntnis von Messfehlern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
14.3 Fehler bei der Messung von Prozenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
14.3.1 Fehler bei der Bestimmung von Prozentsätzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
14.3.2 Übereinstimmung zwischen Prozentsätzen von Wiederholungsmessungen . . . . . . . . . . . . . 228
14.4 Herstellung von Ejakulatproben für die Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
14.5 Vorbereitung von Videoaufnahmen für die interne Qualitätskontrolle
der Analyse der Spermienmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
14.5.1 Zusätzliche Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
14.5.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
XIV Inhaltsverzeichnis
14.5.3 Analyse der Videoaufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

14.6 Vorbereitung von verdünntem Ejakulat für die interne Qualitätskontrolle der
Spermienkonzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
14.6.1 Allgemeine Überlegungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
14.6.2 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
14.6.3 Zusätzliche Ausrüstung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
14.6.4 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
14.6.5 Nutzung der gelagerten Proben für die interne Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236
14.7 Herstellung von Objektträgern für die interne Qualitätskontrolle
für die Bestimmung der Spermienmorphologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
14.7.1 Allgemeine Überlegungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
14.7.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
14.8 Kalibrierung der Laborausstattung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
14.8.1 Waagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
14.8.2 Pipetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
14.8.3 Tiefe der Kammern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
14.8.4 Inkubatoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
14.8.5 pH-Papier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
14.8.6 Andere Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
15 Nationale externe Qualitätskontrollprogramme für die Ejakulatanalyse . . . 421
Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
XV
Danksagung
Diese Publikation wurde vom UNDP/UNFPA/WHO/World Bank Special Programme of Re-

search, Development and Research Training in Human Reproduction (HRP), WHO Depart-
ment of Reproductive Health and Research (RHR) produziert. Die Mitarbeit folgender Perso-
nen an der Präparation und der Herausgabe dieses Manuals wird hiermit dankend anerkannt.
Chefredakteur Dr. Lars Björndahl

AndrologyCentre Karolinska University
Dr. Trevor G. Cooper Hospital and Institute
Centre of Reproductive Medicine and Stockholm
Andrology of the University Münster Sweden
Münster
Germany Ms. Charlene Brazil
Redaktionsteam Center for Health and the Environment
University of California
Dr. John Aitken Davis
CAUSA
Biological Sciences School of Life and
Environmental Sciences
University Drive Dr. Christopher De Jonge
Callaghan , NewSouth Wales Universityof Minnesota
Australia Reproductive Medicine Center
Minneapolis
Dr. Jacques Auger MNUSA
Service de Biologie de la Réproduction
Pavillon Cassini Hôpital Cochin Dr. Gustavo F. Doncel
Paris CONRAD, Department of Obstetrics and
France Gynecology
EasternVirginia Medical School
Dr. H.W. Gordon Baker Norfolk
VAUSA
Departmentof Obstetrics
and Gynaecology
Royal Women’s Hospital Dr. Daniel Franken
Carlton Department of Obstetrics and Gynaeco-
University of Melbourne logy
Victoria TygerbergHospital
Australia Tygerberg
SouthAfrica
Dr. Chris L.R. Barratt
Division of Maternal and Child Health Dr. Trine B. Haugen
Sciences Facultyof Health Sciences
The Medical School, Ninewells Hospital Oslo University College
Dundee Oslo
Scotland Norway
Dr. Hermann M. Behre Dr. Aucky Hinting

Centre for Reproductive Medicine and Andrology Unit, Department of Biomedi-
Andrology, Martin-Luther-University cine
Halle Schoolof Medicine, Airlangga University
Germany Surabaya
Indonesia
XVI Danksagung
Mr. Godwin E. Imade Dr. Christina C.L. Wang

Departmentof Obstetrics and Gynaecology Harbor-UCLAMedical Center
Faculty of Medical Sciences University of TorranceCA
Jos USA
Jos
Nigeria Dr. William Shu-Biu Yeung
Departmentof Obstetrics and
Dr. Thinus F. Kruger Gynaecology
ReproductiveBiology Unit Universityof Hong Kong
Stellenbosch University HongKong SAR
Tygerberg China
SouthAfrica
WHO Secretariat
Dr. Hesbon O. Odongo Department of Reproductive Health
Departmentof Zoology and Research
Universityof Nairobi
Nairobi Dr. Kirsten M. Vogelsong
Kenya
Scientist
Research Area Manager
Ms. Elizabeth Noonan
FredHutchinson Cancer Research Center Dr. Sigrid von Eckardstein
Statistical Center for HIV/AIDS Research
and Prevention Former Acting Research Area Manager
SeattleWA
USA Dr. Michael T. Mbizvo
Directorad interim
Dr. Steven M. Schrader
National Institute for Occupational Safety Ms. Maud Keizer
and Health Centers for Disease Control Secretary
and Prevention
CincinnatiOH
USA
Zusätzlich gebührt Dank den f olgenden Personen: Ms. C athy Treece, Ms. Cha rlene Tollner
und Professor Jim Overstreet (University of California, Davis, CA, USA) f ür die mikrosko-
pischen Aufnahmen der Spermienmorphologie und die Überprüfung der Medien, Dr. Rune
Eliasson (S ophiahemmet Hospital, Stockholm, S chweden) f ür die H ilfe b ei der D efinition
der Zellen außer Spermien, Dr. Timothy Farley (World Health Organization, Geneva, Swit-
zerland) für die Durchsicht der Abschnitte zur Qualitätskontrolle, Dr. Gary N. Clarke (The
Royal Women’s H ospital, C arlton, A ustralia), Dr . Ro elof M enkveld (Tygerberg A cademic
Hospital and University of Stellenbosch, Tygerberg, South Africa), und P rof. Pieter Wranz
(University of Stellenbosch, Tygerberg, South Africa) für weitere Informationen, die bei der
Zusammenstellung dieses Laborhandbuchs nützlich waren.
Diefinanzielle Unterstützung der International Society of Andrology wird hiermit dankbar

anerkannt.
Diese Ausgabe d es L aborhandbuchs wird dem Andenken an G eoffrey Waites (1928–2005)

gewidmet, der einer der M anager der WH O Task Force on Methods for the Regulation of
Male Fertility und M itherausgeber der zw eiten, dritten und vier ten Ausgabe dieses Labor-
handbuchs war. Das Herausgebergremium wurde bei seiner Arbeit durch Geoffs Aufrichtig-
keit, Fairness und seine Sorge um die Unterprivilegierten motiviert.
XVII
bkürzungsverzeichnis
A
AI rtifi
a zielle Insemination
ALH eitliche
»s Kopfauslenkung« (engl. amplitude of lateral head displacement)
AN
OVA arianzanalyse
V (engl. analysis of variance)
APS
IS glutinationsverhindernde
ag Lösung
RA krosom-reagiert
A (engl. acrosome-reacted)
AR
T assistier
te reproduktive Techniken
ASA ti-Spermien-Antikörper
An
CFB opfschlagfrequenz«
»K (engl. beat-cross frequency [Hz])
BSA ovines
b Serumalbumin
WWB iggers-,
B Whitten- und Whittingham-(Lösungen)
CASA mputerassistierte
co Spermienanalyse
CASMA mputerassistierte
co Spermienmorphologieanalyse
CB
AVD ongenitales
k beidseitiges Fehlen des Vas deferens
CI K onfidenzintervall
CV ariationskoeffi
V zient
CUSUM umulativen
k Summe
MSO
D Dimet
hyl-Sulfoxyd
PBS
D ulbecco’s
D phosphatgepufferte Salzlösung
ED
TA thylenediamine-tetra-acetic
E acid
QKE xterne
e Qualitätskontrolle
EQ
V erne
ext Qualitätssicherung
FIT
C uorescein-Isothiocyanat
Fl
FMLP ormyl-Methionyl-Leucocyl-Phenylanalin
F
GIFT tratubarer
in Keimzellentransfer (engl. gamete intrafallopian transfer)
PCG ycerophosphocholin
Gl
HBSS anks’-balancierte
H Salzlösung
HB
V epatitis-B-Virus
H
CVH epatitis-C-Virus
H
HIV umanes
h Immundefizienzvirus
OP-Test
H amster-Oozyten-Penetrationstest
H
OSH ypoosmotische
h Schwellung (engl. hypo-osmotic swelling)
HPF auptgesichtsfeld
H (engl. high-power field)
RPH eerrettich-Peroxidase
M (engl. horseradish peroxidase)
HSA erumalbumin
S (engl. human serum albumin)
HTF umane
h Tubenflüssigkeit (engl. human tubal fluid)
TIB mmunobead-Test
I
CSII trazytoplasmatische
in Spermieninjektion
IM mmotilität
I (der Spermien)
QK I terne
in Qualitätskontrolle
ISO nternational
I Organisation für Standardisation
IU ternationale
in Einheit (engl. international unit)
IUI trauterine
in Insemination
IVF n-vitro-Fertilisation
I
KRM rebs-Ringer-Medium
K
LIN inearität
L
XVIII Abkürzungsverzeichnis
Q
LL ntergrenze
U der Quantifizierung
MAD »mi
ttlere Richtungsabweichung« (engl. mean angular displacement)
MAI ndexI der multiplen Anomalitäten
MAR tiglobulin-Reaktion
An
NP htprogressive
nic Motilität (der Spermien)
BSP hosphat-Puff
P er-Salzlösung
PD
CA lanen,
p testen, überprüfen/standardisieren, umsetzen (engl. plan, do, check, act)
PMA Pho
rbol-12-Myristat-13-Acetat
MNP olymorphkernige
p Leukozyten
PMSG regnant
P Mare Serum Gonadotropin (engl. pregnant mare serum gonadotropin)
PR rogressive
p Motilität (engl. progressive [motility])
PSA isum-sativum-Agglutinin
P
QS ualitätssicherungsprogramm
Q
KQ ualitätskontrolle
Q
MH
Q Quali
tätsmanagement-Handbuch
OSR eaktive
r Sauerstoffradikale (engl. reactive oxygen species)
pmr mdrehungen
U pro Minute (engl. revolutions per minute)
RZK elative
r Zentrifugalkraft
SCSA permien-Chromatin-Struktur-Assay
S
DS tandardabweichung
S (engl. standard deviation)
DIS permiendeformationen
S
ES tandardfehler
S (engl. standard error)
FS tichprobenfehler
S
SO
P andardisierte
st Verfahrensanweisung (engl. standard operating procedure)
TRS inearitätsindex«
»L (engl. straightness [VSL/VAP])
TBS ris-gepuff
T erte Kochsalzlösung
GGT yrode’s
T Glucoseglycerol
TP
T eitZbis zum Eintritt der Schwangerschaft (engl. time-to-pregnancy)
TZI eratozoospermieindex
T
APV fadgeschwindigkeit«
»P (engl. average path velocity)
CL
V purgeschwindigkeit«
»S (engl. curvilinear velocity)
SL
V rogressivgeschwindigkeit«
»P (engl. straight-line (rectilinear) velocity)
OB
W »Fla
ttrigkeit«, »Seitenausschlag« (engl. wobble [VAP/VCL]
1 1
intergrund
H
1.1 Einleitung – 2
1.2 Die 5. Auflage – 2
1.3 Zweck des und Umfang des Laborhandbuchs – 3
2 Kapitel 1 • Hintergrund
Einleitung
1.1 1.2 Die5. Auflage
1
Als Reaktion auf den wac hsenden Bedarf an einer Diefünfte Auflage enthält drei Teile: Ejakulatana-
Standardisierung der M ethoden zur U ntersu- lyse (7 Kap. 2–4), Spermienpräparationen (7 Kap. 5
chung des men schlichen Ejakulates er schien 1980 und 6 und) Qualitätssicherung (7 Kap. 7 ).Der Teil
die erste Auflage des WHO Labor-Handbuches für 1, der sic h mi t der E jakulatanalyse b efasst, ähnel t
die Untersuchung des menschlichen Ejakulates und dem aus früheren Auflagen, ist jedoch in drei Kapi-
der Spermien-Mukus-Interaktion. S either sind drei tel eingeteilt: Standardmethoden, die robuste Rou-
Neuauflagen er schienen s owie Üb ersetzungen in tine-Methoden zur Bestimmung der Spermienqua-
verschiedene Sprachen. Im Laufe der letzten 30 Jah- lität darstellen; fakultative Teste, die in bestimmten
re wurde das Laborhandbuch als globaler Standard Situationen benutzt oder von einzelnen L aborato-
anerkannt und weltweit extensiv in der F orschung rien bevorzugt werden; Forschungstests, die gegen-
und in klinischen Laboratorien benutzt. wärtig nicht als für die Routine geeignet betrachtet
Trotz dieses Erfolges wurde deutlich, dass eini- werden. Da die Ejakulatkultur normalerweise nicht
ge Empfehlungen aus früheren Auflagen im Lichte im Andrologie-Labor durchgeführt wird, wird die-
neuer Erkenntnisse revidiert werden mussten und se n ur in dem A bschnitt üb er die st erile G ewin-
einige Konzepte weiterer Erklärung und unterstüt- nung d es Ejakulates e rwähnt. D er Abschnitt ü ber
zender Evidenz bedurften. Im Lichte dieser Überle- die Spermienpräparation befasst sich nicht nur mit
gungen setzte die WHO ein Herausgebergremium der G ewinnung v on S permien a us d em E jakulat,
ein, um alle b eschriebenen Methoden des L abor- sondern a uch a us dem H oden und dem N eben-
handbuchs z u ü berarbeiten u nd u m s ie e ntweder hoden. Anmerk ungen mi t sp eziellen met hodolo-
zu b estätigen, zu ä ndern o der zu ak tualisieren. gischen Erklärungen sind in den T ext eingestreut,
In zahlr eichen Fällen entpuppte sic h dies als eine ferner Kommentare, die die Ergebnisse interpretie-
schwierige A ufgabe, da n ur un genügende D aten ren und die zusätzliche Erklärungen enthalten.
mit den im Laborhandbuch b eschriebenen Me- Die H auptpunkte der 5. A uflage w erden hier
thoden generiert worden waren. In einigen Fällen kurz vorgestellt:
erzielten gu t et ablierte L aboratorien üb ereinstim- 5 KDie
apitel zurEjakulatanalyse beinhalten
mende Daten, aber dies konnte von anderen nicht Details aller verwandten Lösungen, Verfahren,
bestätigt werden. In diesen Fällen fand das Heraus- Berechnungen und Interpretationen, so dass
gebergremium nach Evaluierung der einschlägigen jede Methode grundsätzlich komplett ist und
Literatur einen Konsensus. selten Hinweise auf andere Teile des Labor-
Zusätzliche Empfehlungen gingen von techni- handbuchs notwendig sind.
schen A ssistenten und W issenschaftlern ein, in s- 5 er Abschnitt
D über die Spermienpräparatio-
besondere im Hinblick auf die Notwendigkeit einer nen wurde ausgeweitet und ein Kapitel zur
detaillierteren B eschreibung der M ethoden. D as Kryokonservierung von Spermien hinzu-
Fehlen v on D etails in f rüheren A usgaben f ührte gefügt. Die Verfahren zur Analyse des Zervi-
dazu, dass es einige Laboratorien bevorzugten, an- kalmukus wurden zwischen dem Kapitel über
dere Methoden zu b enutzen oder sie en twickelten fakultative Methoden und einem Appendix
eigene Versionen dieser Methoden, wobei sie w ei- zur Charakterisierung des Mukus aufgeteilt.
terhin b ehaupteten, die E jakulatanalyse en tspre- 5 Bestimmung der Spermienzahl: Die Ejakulat-
chend dem WH O-Manual d urchzuführen. U m verdünnungen und die Abschnitte der Zähl-
globale Vergleiche einfac her zu g estalten, en thält kammer zur Bestimmung der Spermienzahl
die g egenwärtige A usgabe des L aborhandbuchs in einer Samenprobe wurden dahingehend
deshalb viel mehr D etails und b egründet alterna- geändert, dass 200 Spermien pro Doppelbe-
tive Methoden. Wenn Ergebnisse in Publikationen stimmung gezählt werden. Die Bedeutung von
mitgeteilt w erden, wir d jetzt em pfohlen, dass die Fehlern beim Umgang mit der Probe und die
Autoren klarstellen sollten, welche spezielle Metho- Sicherheit der gewonnenen Zahlenergebnisse
de aus dem Laborhandbuch benutzt wurde. werden betont. Das Herausgebergremium
1.3 • Zweck des und Umfang des Laborhandbuchs
3 1
betrachtet die Gesamtspermienzahl pro Eja- Aufnahmen von Spermien aufgenommen, die
kulat als eine wichtigere Information für die als normal oder grenzwertig beurteilt werden,
Beurteilung der Hodenfunktion als die Sper- und es werden mehr Erklärungen geliefert,
mienkonzentration, aber für diesen Zweck nach welchen Kriterien die Spermatozoen
muss das Ejakulatvolumen exakt gemessen klassifiziert werden. Dies sollte dazu beitragen,
werden. technische Assistenten besser zu trainieren,
5 Bestimmung der Azoospermie: Obwohl auf Spermatozoen einheitlich zu beurteilen. Neue
den ersten Blick einfach, wird die Diagnose Daten von einer fertilen Population erlauben
einer Azoospermie durch zahlreiche Fakto- es, Referenzwerte für den Prozentanteil nor-
ren kompliziert, zu denen große Fehler beim malgeformter Spermien zu geben.
Zählen nur weniger Spermien, die große 5 Qualitätskontrolle: Dieses Kapitel wurde
Zahl der Felder, die mikroskopisch analysiert komplett neu geschrieben. Strikte Qualitätssi-
werden müssen und Schwierigkeiten bei der cherung der Ejakulatanalyse ist notwendig, um
Untersuchung Debris-reicher Spermienpellets verlässliche analytische Ergebnisse zu erzielen.
gehören. Zu den empfohlenen Änderungen Es werden Hinweise und Vorschläge gemacht,
gehören die Untersuchung fixierter, un- wie die Laborarbeit verbessert werden kann,
zentrifugierter Proben und die Angabe der wenn die Ergebnisse der Qualitätskontrolle
Sensibilität der Zählmethode. Jedoch werden nicht zufriedenstellend sind.
auch Zentrifugationsmethoden für die An- 5 Referenzbereiche und Referenzgrenzen:
reicherung genügender Spermienzahlen für Daten zur Qualität des Ejakulates von fertilen
therapeutische Zwecke und Methoden für die Männern, deren Partnerinnen eine »time-to-
Identifizierung motiler Spermien in unfixier- pregnancy« (TTP) (Zeit bis zum Eintritt der
ten Proben für die Beurteilung eines Post-Vas- Schwangerschaft) von weniger als 12 Monaten
ektomie-Ejakulates erwähnt. hatten, liefern die Referenzbereiche in diesem
5 Beurteilung der Spermienmotilität: Eine Manual. Rohdaten von 400–1900 Ejakulatpro-
wichtige Änderung gegenüber früheren Auf- ben von kürzlich gewordenen Vätern aus acht
lagen bildet die Kategorisierung der Sper- Ländern auf drei Kontinenten wurden heran-
mienmotilität. Es wird jetzt empfohlen, dass gezogen, um die Referenzbereiche festzulegen.
Spermien in progressiv-motil, nichtprogressiv- Entsprechend konventioneller statistischer
motil und immotil (anstelle der Grade a, b, c Tradition wurden die 2,5te Zentile eines zwei-
oder d) eingeteilt werden. seitigen Referenzintervalles als der Grenzwert
5 Beurteilung der Spermienmorphologie: Eini- herangezogen, unter dem Werte als zu einer
ge Laboratorien bestimmen nur die normalen anderen Population gehörend betrachtet wer-
Formen, während andere den Typ, die Loka- den. Ein einseitiges Referenzintervall wurde
lisation und das Ausmaß der Abnormalität jedoch als für die Ejakulatanalyse angebrachter
für wichtig halten. Es bleibt zu diskutieren, ob betrachtet, da es unwahrscheinlich ist, dass
diese differenziellen oder semi-quantitativen hohe Werte irgendeines Parameters die Fertili-
Beurteilungen den Wert der Ejakulatanalyse tät negativ beeinflussen. Die 5. Zentile wird als
erhöhen. Ergebnisse, die eine Beziehung zwi- untere Referenzgrenze angegeben und die voll-
schen dem Prozentsatz normalgeformter Sper- ständige Verteilung jedes Ejakulatparameters
mien (entweder durch strikte Kriterien oder wird in 7 Kap. 8 dargestellt.
durch computer-assistierte Beurteilung der
Morphologie definiert) und In-vivo-Fertilisa-
tionsraten finden, rechtfertigen den Versuch, 1.3 Zweck des und Umfang des
eine spezifische morphologische Subpopula- Laborhandbuchs
tion der Spermatozoen im Ejakulat zu identi-
fizieren. In die vorliegende Auflage wurden Die hier beschriebenen Methoden sollen als Richt-
mehr und qualitativ bessere mikroskopische linie dienen, um die Quali tät der E jakulatanalyse
4 Kapitel 1 • Hintergrund
zu v erbessern und die Er gebnisse v ergleichbar zu

1 machen. S ie s ollten v on lo kalen, na tionalen o der
globalen Einr ichtungen zur Ak kreditierung v on
Laboratorien nicht notwendigerweise als obligato-
risch betrachtet werden. Die E jakulatanalyse kann
sowohl im k linischen wie im F orschungsbereich
nützlich s ein, um den mä nnlichen F ertilitätssta-
tus zu er fassen, aber auch um die Spermatogenese
während und nac h einer mä nnlichen K ontrazep-
tion zu überwachen.
5 I
Untersuchung des
Ejakulates
Kapitel 2 Standardverfahren – 7
Kapitel 3 Fakultative Untersuchungen – 107
Kapitel 4 Forschungsrelevante Methoden – 131

7 2
Standar
dverfahren
2.2 Probengewinnung – 15
2.2.1 orbereitung
V – 15
2.2.2 Gewinnungdes Ejakulates für diagnostische
und Forschungszwecke – 15
2.2.3 St
erile Probengewinnung im Rahmen der assistierten
Reproduktion – 15
2.2.4 St
erile Probengewinnung für die mikrobiologische
Untersuchung – 16
2.2.5 robengewinnung
P zu Hause – 16
2.2.6 robengewinnung
P mittels Kondom – 16
2.2.7 SichereProbenhandhabung – 17
2.3 Erste makroskopische Untersuchung – 17

2.3.1 Liquifizierung (Verflüssigung) – 17
Verzögerte Liquifizierung – 17
2.3.2 Konsist
enz – 18
2.3.3 uAssehen des Ejakulates – 18
2.3.4 Ejakulat
volumen – 18
Unterer Referenzwert – 19
2.3.5 pH-
Wert des Ejakulates – 19
Referenzwerte – 20
2.4 Erste mikroskopische Untersuchung – 20

2.4.1 GründlicheMischung und repräsentative Probenentnahme – 20
2
.4.2 eHrstellung eines Feuchtpräparates – 20
2.4.3 Spermienagg regationen – 21
2.4.4 Spermienagglutinationen– 21
2.4.5 elluläre
Z Elemente außer Spermien – 22
2.5 Spermienmotilität – 24
2.5.1 K
lassifi zierung der Spermienmotilität – 24
2.5.2 Vorbereitung der Probe und Beurteilung der Motilität – 25
2.5.3 Arbeitsbeispiele– 26
2.5.4 Untere Referenzgrenze – 27
2.6 Spermienvitalität – 27
2.6.1 italitätstest
V mittels Eosin-Nigrosin – 28
Zubereitung der Reagenzien – 28
Durchführung – 28
Auswertung – 29
V mittels Eosin allein – 29
Auswertung – 30
V mittels hypoosmotischer Schwellung – 30
Auswertung – 31
2.7 Spermienanzahl – 32
2.7.1 erschiedene
V Arten von Zählkammern – 33
2.7.2 DasNeubauer-improved-Hämozytometer – 33
2.7.3 Anwendung des Hämozytometer-Rasters – 34
2.7.4 Pflege der Zählkammer – 35
2.7.5 Diluentzur Ejakulatverdünnung – 35
2.7.6 Die Notwendigkeit, eine ausreichende Anzahl an Spermien
zu zählen – 35
2.8 Routine-Zählverfahren – 36
2.8.1 Bestimmungder erforderlichen Verdünnung – 36
2.8.2 orbereitung
V der Verdünnungen und Beladung der
Hämozytometerkammer – 38
2.8.3 Bestimmung der Spermienzahl in den Zählkammern – 39
2.8.4 Bere
chnung der Spermienkonzentration im Ejakulat – 40
2.8.5 Bere
chnungsbeispiele – 40
2.8.6 Unt
erer Referenzwert für die Spermienkonzentration – 42
2.8.7 Bere
chnung der Spermiengesamtzahl im Ejakulat – 42
2.8.8 Unt
erer Referenzwert für die Spermiengesamtzahl – 42
2.9 Niedrige Spermienzahl: Kryptozoospermie und vermutete

Azoospermie – 42
2.10 Wenn eine exakte Bestimmung einer niedrigen Spermienzahl nicht
notwendig ist – 43
2.10.1 Keineweiteren Maßnahmen ergreifen – 43
9 2
2.10.2 Untersuchung von zentrifugierten Proben, um Spermien
zu finden – 43
2.10.3 Untersuchung von nicht zentrifugierten Proben, um bewegliche
Spermien zu finden – 44
2.11 Wenn eine genaue Bestimmung auch bei wenigen Spermien

notwendig ist – 45
2.11.1 Die Bestimmung einer niedrigen Spermienzahl im gesamten
Neubauer-improved-Hämozytometer
(Phasenkontrast-Mikroskopie) – 45
Berechnung niedriger Spermienkonzentrationen im Ejakulat – 47
Sensitivität der Methode – 47
Berechnungsbeispiele – 47
Berechnung der Spermiengesamtzahl im Ejakulat – 48
2.11.2 Er
fassung einer niedrigen Spermienzahl in großvolumigen
Einweg-Zählkammern (Fluoreszenzmikroskopie) – 48
Berechnung niedriger Spermienkonzentrationen im Ejakulat – 49
Berechnungsbeispiele – 50
Berechnung der Spermiengesamtzahl im Ejakulat – 51
2.12 Zählung von Zellen, die keine Spermien sind – 51

2.12.1 Berechnung der Konzentration von Rundzellen im Ejakulat – 51
2.12.2 ensitivität
S der Methode – 51
2.12.3 Bere
chnungsbeispiele – 51
2.13 Spermienmorphologie – 52
2.13.1 DasKonzept normaler Spermien – 52
2.13.2 orbereitung
V des Ejakulatausstriches – 53
Normale Ejakulatproben – 54
Proben mit geringen Spermienkonzentrationen – 55
Visköse Ejakulatproben – 55
Waschen von zellreichen oder viskösen Ejakulaten und Reduzieren
von Hintergrundartefakten für die computerunterstützte
Spermienmorphometrie – 56
2.14 Färbemethoden – 56
2.14.1 raditionelle
T Fixierung und sequentielle Färbung – 56
2.14.2 apanicolaou-Färbung
P für die Spermienmorphologie – 57
Reagenzien – 57
Fixierung der luftgetrockneten Ejakulatausstriche – 57
Färbung der fixierten Ejakulatausstriche – 58
Behandlung der gefärbten Ausstriche vor dem Einbetten – 58
Einbetten der gefärbten Ejakulatausstriche – 58
2.14.3 Shorr-F
ärbung für die Spermienmorphologie – 58
Reagenzien – 59
2.14.4 chnellfärbemethoden
S für die Spermienmorphologie – 59
Reagenzien – 59
2.15 Beurteilung der gefärbten Präparate – 60

2.15.1 K
lassifi zierung der normalen Spermienmorphologie – 60
2.15.2 K
lassifi kation der abnormalen Spermienmorphologie – 61
2.16 Abbildungen zur Spermienmorphologie – 62

2.17 Analyse eines Ejakulatausstriches – 94
2.17.1 Beur
teilung der normalen Spermienmorphologie – 94
2.17.2 Arbeitsbeispiel– 94
2.17.3 Unt
erer Referenzbereich – 95
2.17.4 Bestimmungder abnormalen Spermienmorphologie – 95
2.17.5 Arbeitsbeispiel– 95
2.17.6 Beur
teilung spezifischer Spermiendefekte – 95
2.18 Beurteilung der Leukozyten im Ejakulat – 96

2.18.1 elluläre
Z Peroxidase-Färbung mit Ortho-Toluidin – 96
Prinzip – 96
Reagenzien – 97
Bestimmung der Peroxidase-positiven Zellzahl im Hämozytometer – 97
Kalkulation der Konzentration der peroxidase-positiven Zellen im Ejakulat – 98
Arbeitsbeispiele – 98
2.19 Beurteilung unreifer Keimzellen im Ejakulat – 100

11 2
2.20 Testung auf Spermienantikörper – 100
2.20.1 Dergemischte Antiglobulin-Reaktions-Test – 101
Beurteilung – 102
2.20.2 Derdirekte Immunobead-Test – 102
Reagenzien – 103
Vorbereitung der Immunobeads – 103
Vorbereitung der Spermien – 103
2.20.3 Derindirekte Immunobead-Test – 104
Reagenzien – 104
Vorbereitung der Immunobeads – 104
Vorbereitung der Spenderspermien – 104
Vorbereitung der zu testenden Flüssigkeiten – 104
Inkubation der Spenderspermien mit den zu
testenden Flüssigkeiten – 105
Immunobead-Test – 105
12 Kapitel 2 • Standardverfahren
Einleitung
2.1 einem spermizidfreien Kondom während des Ge-
schlechtsverkehrs zuhause gewonnen werden (Za-
Während der E jakulation wir d das E jakulat aus vos u. Goodpasture 1989). Der Unterschied könnte
2 einer k onzentrierten S permiensuspension, die in durch d ie u nterschiedliche s exuelle S timulation
den paa rig a ngelegten N ebenhoden g espeichert bedingt s ein, da die Z eitspanne zur G ewinnung
wird, mit den Flüssigkeiten aus den akzessorischen der Probe durch Masturbation, die ein Maß für die
Geschlechtsdrüsen g emischt und v erdünnt. E s Stimulation der akzessorischen Geschlechtsdrüsen
wird in mehr eren P ortionen ejak uliert. Ein V er- ist, die Ejakulatqualität b eeinflusst ( Pound e t a l.
gleich v on S permavolumina v or und nac h einer 2002).
Vasektomie zeigt, dass un gefähr 90% des E jaku- Unter den g egebenen B edingungen der P ro-
latvolumens aus S ekreten den akzess orischen G e- bengewinnung hängt die S permaqualität von nor-
schlechtsdrüsen besteht (Weiske 1994), vorwiegend malerweise nic ht zu b eeinflussenden F aktoren a b
aus der Prostata und den Samenbläschen mit einem wie die Spermienproduktion in den Testes, die Se-
kleineren Anteil aus den bulbourethralen (C ow- kretionsaktivität d er a kzessorischen G eschlechts-
per’schen) Drüsen und den Nebenhoden. drüsen und kürzlich durchgemachte, insbesondere
Das Ejakulat hat zwei hauptsächliche und quan- febrile Erkrankungen sowie anderen Faktoren wie
tifizierbare Bestandteile: die Karenzzeit, die f estgehalten werden muss und
5 Gesamtzahl
Die der Spermien, die eine Aussa- die für die Interpretation der Ergebnisse eine Rolle
ge über die Spermienproduktion in den Testes spielt.
und die Durchgängigkeit des posttestikulären Die Er gebnisse der L aboruntersuchungen der
Gangsystems erlaubt. Spermaqualität hängen von folgenden Faktoren ab:
5 as gesamte
D Flüssigkeitsvolumen, das aus den 5 er Vollständigkeit
D der gewonnenen Probe:
akzessorischen Geschlechtsdrüsen stammt Die ersten ejakulierten Fraktionen enthalten
und deren sekretorische Aktivität widerspie- vorwiegend spermienreiche Prostatasekrete,
gelt. während die späteren Fraktionen vorwiegend
aus Flüssigkeit der Samenbläschen bestehen
Die Beschaffenheit der Spermien (ihr e Vitalität, (Björndahl u. Kvist 2003). Daher hat der Ver-
Motilität und Morphologie) und die Zusammen- lust der ersten, spermienreichen Fraktion des
setzung der S eminalflüssigkeit sind f ür die S per- Ejakulates einen größeren Einfluss auf die
mienfunktion von großer Wichtigkeit. Ergebnisse der Ejakulatanalyse als der Verlust
Während des G eschlechtsverkehrs k ommt die der letzten Portion.
erste, sp ermienreiche p rostatische F raktion des 5 Aktivität
Die der akzessorischen Geschlechts-
Ejakulates in K ontakt mi t Z ervikalmukus in der drüsen, deren Sekrete die konzentrierten
Vagina (Sobrero u. MacLeod 1962), wobei der Rest epididymalen Spermatozoen während der
der Flüssigkeit als ein Pool in der Vagina verbleibt. Ejakulation verdünnen (Eliasson 2003): Die
Im Gegensatz dazu wird das gesamte Ejakulat unter Spermienkonzentration ist nicht ein direktes
Laborbedingungen in einem Gefäß gesammelt, wo Maß für den Spermienausstoß aus den Hoden,
die Spermien in einem Koagulum eingeschlossen da das Ejakulatvolumen durch die Funktion
sind, das aus Proteinen aus den Samenbläschen be- anderer reproduktiver Organe beeinflusst
steht. Dieses Koagulum wird später durch die pro- wird, wohingegen die Gesamtspermienzahl im
statischen P roteasen liq uifiziert, währ end die O s- Ejakulat (Spermienkonzentration multipliziert
molalität ansteigt (Björndahl u. Kvist 2003; Cooper mit dem Ejakulatvolumen) ein direktes Maß
et al. 2005). für die Spermienproduktion in den Hoden ist.
Es gibt Hinweise, dass die Qualität der Samen- So können z.B. die Spermienkonzentrationen
probe von der Art der Gewinnung abhängt. Ejaku- in Ejakulaten jüngerer und älterer Männer
late, die durch Masturbation in ein Gefäß in einem gleich sein, die Gesamtspermienzahl kann
Raum nahe dem L abor g ewonnen w erden, k ön- jedoch unterschiedlich sein, da sowohl das Vo-
nen von minderer Qualität als s olche sein, die aus lumen der Samenflüssigkeit wie die Gesamt-
2.1 • Einleitung
13 2
spermienproduktion mit dem Alter geringer hat K onsequenzen f ür die I nterpretation der E ja-
werden, zumindest in einigen Populationen kulatanalyse:
(Ng et al. 2004). 5 s ist E unmöglich, die Qualität des Ejakulates
5 Karenzzeit
Die seit der letzten sexuellen Akti- eines Mannes anhand der Beurteilung einer
vität: Wenn nicht ejakuliert wird, kumulieren einzigen Probe zu erfassen.
die Spermien in den Epididymides, treten 5 aherDsollten zwei oder drei Ejakulatproben
dann in die Urethra über und werden mit analysiert werden, um Ausgangswerte zu er-
dem Urin ausgespült (Cooper et al. 1993; De halten (Poland et al.1985; Berman et al. 1986;
Jonge et al. 2004). Die Spermienvitalität und Carlsen et al. 2004; Castilla et al. 2006; Keel
das Chromatin bleiben von der Länge der 2006).
Abstinenzzeit unberührt (Tyler et al. 1982b; De
Jonge et al. 2004), es sei denn, dass die Neben- Obwohl Untersuchungen der Gesamtpopulation
hodenfunktion gestört ist (Correa-Perez et al. der ejakulierten Spermien die Fertilisierungskapa-
2004). zität der w enigen S permien, die b is zum Or t der
5 Zeit
Diebis zur vorletzten Ejakulation: Da die Fertilisation g elangen, b estimmen k önnen, lief ert
Epididymides durch eine Ejakulation nicht die Ejakulatanalyse dennoch essentielle Informatio-
vollständig geleert werden (Cooper et al. 1993), nen über der k linischen Status eines Individuums.
können noch einige Spermien von der vorher- Alle Aspekte der Ejakulatgewinnung und -analyse
gehenden Ejakulation vorhanden sein. Dies müssen unter streng standardisierten Bedingungen
beeinflusst das Altersspektrum und die Quali- durchgeführt w erden, w enn sie valide und n ütz-
tät der Spermien in einer Ejakulatprobe (Tyler liche I nformationen lief ern s ollen. Die in dies em
et al. 1982a). Das Ausmaß dieser Einflussfakto- Kapitel beschriebenen Methoden sind akzep tierte
ren ist schwierig zu beurteilen und wird kaum Verfahren, die die gr undsätzlichen S chritte in der
in Betracht gezogen. Ejakulatbewertung enthalten.
5 as Hodenvolumen,
D das die Gesamtspermien- Die E jakulatanalyse umfasst f olgende S chritte
zahl pro Ejakulat beeinflusst (Handelsman et (die in den f olgenden A bschnitten det ailliert b e-
al. 1984; WHO 1987; Behre et al. 2000; Ander- schrieben werden).
sen et al. 2000): D as Hodenvolumen spiegelt In den ersten 5 Minuten:
die spermatogenetische Aktivität wider, die 5 tzierung
Pla des Probenbehälters auf dem La-
wiederum die Spermienmorphologie beein- bortisch oder in einem Inkubator (37 °C) zur
flusst (Holstein et al. 2003). Liquifizierung.
Kommentar Zwischen 30 und 60 Minuten:

Die große biologische Bandbreite der Qualität der 5 eurteilung
B der Liquifizierung und des Aus-
Ejakulate ( Castilla et al. 2006) spiegelt die vielen sehens des Ejakulates.
hier auf geführten F aktoren wider und v erlangt, 5 essung M des Ejakulatvolumens.
dass alle M essungen im Ejakulat präzise dur chge- 5 essung M des pH-Wertes (falls erforderlich).
führt werden. 5 erstellung
H eines Feuchtpräparates für die
mikroskopische Beurteilung, die Spermienmo-
Diese va riablen und w eitgehend unk ontrollierba- tilität und die für die Bestimmung der Sper-
ren F aktoren erk lären die gr oße in traindividuelle mienzahl notwendige Verdünnung.
Variation in der Z usammensetzung des E jaku- 5 estimmung
B der Spermienvitalität (bei niedri-
lates (B aker u . Kovacs 1985; Alvarez et al . 200 3). gem Prozentsatz der motilen Spermien).
. Abb. 2.1zeigt die mi t WH O-Methoden g emes- 5 erstellung
H von Ausstrichen für die Beurtei-
senen Variationen über die Z eit in Ejakulatproben lung der Spermienmorphologie.
von 5 gesunden jungen Freiwilligen, die im Place- 5 erstellung
H von Ejakulatverdünnungen, um
boarm e iner S tudie z ur m ännlichen h ormonellen die Spermienkonzentration zu bestimmen.
Kontrazeption teilnahmen. Eine solche Variabilität 5 estimmung
B der Spermienzahl.
300 1 250
1
200 200
2 100 150
0 100
200 2 50
100 0
250
2
0
200 200
Konzentration (106 per ml)

3
150
100
Gesamtspermienzahl (106)
100
0
50
600 4
0
500 100
3
400 50
300 0
200
200 4
150
100
100
0
50
200 5
0
100 50
5
0 0
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540
Tag Tag
. Abb. 2.1 ariation
V der Gesamtspermienzahl und der Spermienkonzentration über einen Zeitraum von 1 ½ Jahren.
Ordinate links: Gesamtspermienzahl (106). Ordinate rechts: Konzentration (106 per ml). Abszisse rechts und links: Tag (mit
freundlicher Genehmigung von Schering Plough und Bayer Schering Pharma AG)
5 chführung
Dur des »Mixed-Antiglobulin-Re- Nach 4 Stunden:
action-(MAR-)Test« (wenn erforderlich). 5 Fixier
en, Färben und Beurteilung der Ausstri-
5 estimmung
B der Peroxidase-positiven Zellen che für die Spermienmorphologie.
(wenn Rundzellen vorhanden sind).
5 orbereitung
V der Spermien für den Immuno- Später an demselben Tag (oder an einem der folgen-
bead-Test (falls erforderlich). den Tage, wenn die Proben eingefroren werden):
5 entrifugation
Z des Ejakulates (falls biochemi- 5 estimmung
B der Markersubstanzen der akzes-
sche Marker gemessen werden sollen). sorischen Geschlechtsdrüsen (falls erforder-
lich).
Innerhalb von 3 Stunden: 5 chführung
Dur des indirekten Immunobead-
5 eiterleiten
W von Proben an das Mikrobiologie- Tests (falls erforderlich).
Labor (falls erforderlich).
2.2 • Probengewinnung
15 2
2.2 rPobengewinnung
Kasten 2.1 Eignungsprüfung des Gefäßes
2.2.1 o
Vrbereitung für die Samenprobe
Mehrere Ejakulatproben mit einer hohen Sper-
5 Ejakulatprobe
Die sollte in einem separaten mienkonzentration und guter Motilität sollten
Raum nahe dem Labor gewonnen werden, ausgewählt werden. Die Hälfte der Probe wird in
um Temperaturschwankungen zu vermeiden ein erwiesenermaßen nichttoxisches Gefäß einge-
bracht (Kontrolle) und die andere Hälfte wird in das
und um die Zeit zwischen der Gewinnung Testgefäß eingebracht. Dann wird die Spermien-
und dem Beginn der Analyse zu kontrollieren motilität (7 Abschn. 2.5) bei Zimmertemperatur
(7 Abschn. 2.2.5 und 2.2.6 im Hinblick auf Aus- oder bei 37 °C in einstündigen Intervallen über 4
nahmen). Stunden geprüft. Wenn sich bei keinem Zeitpunkt
5 ie Probe
D sollte nach mindestens 2 Tagen und ein Unterschied zwischen Kontrolle und Testpro-
be ergibt (P >0,05 im gepaarten t-Test), kann das
maximal 7 Tagen sexueller Karenz gewon- Gefäß als nichttoxisch für Spermatozoen betrachtet
nen werden. Wenn weitere Proben benötigt werden und erfüllt die Voraussetzungen für die
werden, sollte die Zahl der Abstinenztage Probengewinnung.
zwischen den Proben so konstant wie möglich
sein.
5 er Patient/Proband
D sollte klare schriftliche
und mündliche Anweisungen im Hinblick auf den, die die Spermien nach der Ejakulation
die Probengewinnung erhalten. Hierbei sollte beeinflussen könnten. Das Gefäß muss mit
betont werden, dass die Samenprobe komplett dem Namen des Patienten/Probanden und
sein sollte und der Kandidat jeden Verlust be- einer Identifikationsnummer versehen werden
richten sollte. sowie mit dem Datum und dem Zeitpunkt der
5 folgenden
Die Informationen sollten Gewinnung.
im Laborprotokoll festgehalten werden 5 as Probengefäß
D sollte während der Liqui-
(7 Kap. 13, 7 Abschn. 13.1: )Name des Mannes, fizierung auf dem Labortisch oder in einem
Geburtsdatum und persönliche Kodierungs- Inkubator (37 °C) platziert werden.
nummer, die Karenzzeit, das Datum und die 5 uf dem
A Auswertungsbogen sollte vermerkt
Zeit der Probengewinnung, die Vollständigkeit werden, wenn die Probe inkomplett ist, insbe-
der Probe, eventuelle Schwierigkeiten beim sondere wenn die erste spermienreiche Frak-
Gewinnen der Probe und das Zeitintervall tion verloren gegangen ist. Wenn die Probe
zwischen der Probengewinnung und dem unvollständig ist, sollte eine zweite Probe wie-
Beginn der Ejakulatanalyse. derum nach einer Abstinenzzeit von 2–7 Tagen
gewonnen werden.
2.2.2 G
ewinnung des Ejakulates für
diagnostische und SterileProbengewinnung im
2.2.3
Forschungszwecke Rahmen der assistierten
Reproduktion
5 Probe
Die sollte durch Masturbation gewon-
nen werden und in ein sauberes, weithalsiges Die Probe wird wie f ür diagnostis che Zwecke g e-
Glas- oder Plastikgefäß ejakuliert werden, das wonnen (7 Abschn. 2.2.2 , )aber das Probengefäß,
aus einem Material hergestellt wurde, dessen die Pipettenspitzen und die Pipetten zum Mischen
Unschädlichkeit für Spermien nachgewiesen müssen steril sein.
wurde (7 Kasten 2.1 ).
5 as Probengefäß
D sollte bei einer Temperatur
zwischen 20 und 37 °C gehalten werden, um
starke Temperaturschwankungen zu vermei-
2.2.4 Sterile
Probengewinnung für die 5 er Patient/Proband
D sollte die Zeit der Pro-
mikrobiologische Untersuchung bengewinnung festhalten und die Probe inner-
halb 1 Stunde im Labor abliefern.
2 In dies em F all m uss eine mikr obiologische K on- 5 ährend
W des Transportes in das Labor sollte
tamination aus anderen Quellen als dem E jakulat die Probe zwischen 20 und 37 °C gehalten
vermieden werden (z.B. symbiotische Organismen werden.
auf der Haut). D as Probengefäß, die Pipettenspit- 5 er Laborbericht
D sollte vermerken, dass die
zen und die P ipetten zum M ischen müssen st eril Probe zu Hause oder an einem anderen Ort
sein. außerhalb des Labors gewonnen wurde.
Zu diesem Zwecke sollte der Patient/Proband:
5 rinierenU
5 ie HändeD und den Penis mit Seife waschen, 2.2.6 rPobengewinnung mittels
um das Risiko der Kontamination der Ejaku- Kondom
latprobe mit symbiotischen Organismen von
der Haut zu vermindern. 5 ur unter
N außergewöhnlichen Umständen wie
5 Seife
Die abwaschen. bei nachgewiesener Unfähigkeit, ein Ejakulat
5 Hände
Die und den Penis mit einem frischen durch Masturbation zu gewinnen, sollte die
Einmalhandtuch trocknen. Probe mittels eines Kondoms während des
5 n einen I sterilen Behälter ejakulieren. Geschlechtsverkehrs gewonnen werden.
5 ur speziell
N für die Samengewinnung her-
Anmerkung gestellte und nicht-toxische Kondome sollten
Die Z eit z wischen der P robengewinnung und dem Beg inn
benutzt werden; solche Kondome sind kom-
der mikrobiologischen Untersuchung sollte nicht mehr als 3
Stunden betragen.
merziell erhältlich.
D sollte vom Hersteller kla-
re Instruktionen erhalten, wie dieses Kondom
benutzt, verschlossen und zum Labor gesandt
2.2.5rPobengewinnung zu Hause oder transportiert wird.
D sollte die Zeit der Eja-
5 nterUbesonderen Umständen kann die Probe kulatgewinnung registrieren und die Probe
ausnahmsweise zu Hause gewonnen werden, innerhalb 1 Stunde im Labor abliefern.
wenn z.B. eine Unfähigkeit zur Masturbation 5 ährend
W des Transportes sollte die Probe
in der Klinik oder ein Mangel an passenden zwischen 20 und 37 °C gehalten werden.
Räumlichkeiten nahe dem Labor besteht. 5 er Laborbericht
D sollte vermerken, dass die
D sollte klare schriftliche Probe mittels eines speziellen Kondoms wäh-
und mündliche Instruktionen zur Gewinnung rend des Geschlechtsverkehrs zu Hause oder
und zum Transport der Ejakulatprobe er- an einem anderen Ort außerhalb des Labors
halten. Dabei sollte betont werden, dass die gewonnen wurde.
Ejakulatprobe möglichst vollständig sein sollte,
d.h., dass die gesamte Probe inklusive der Anmerkung
Gebräuchliche Lat ex-Kondome dür fen nicht für die Ejaku-
ersten spermienreichen Fraktion aufgefangen
latgewinnung benutzt w erden, da sie mit der M otilität der
wurde. Der Patient/Proband sollte jeden Ver- Spermien interferierende Substanzen enthalten (Jones et al.
lust einer Portion melden, und dies sollte in 1986).
dem Auswertebogen notiert werden.
D sollte ein Gefäß mit
bekanntem Gewicht erhalten, das mit dem Kommentar
Namen und der Identifizierungsnummer ver- Coitus int erruptus ist keine geeig nete M ethode
sehen ist. zur Ejakulat gewinnung, da die erst e P ortion mit
der höchst en Spermienzahl v erloren gehen k ann.
Ferner k ann die P robe mit Z ellen und Bakt erien
2.3 • Erste makroskopische Untersuchung
17 2
kontaminiert werden, und das niedrige pH der Va- fizieren (dünnflüssiger zu w erden) und b ildet in
ginalsekrete können die Spermienmotilität negativ dieser Zeit eine Flüssigkeit mit unterschiedlich gro-
beeinflussen. ßen Klumpen. Mit Fortschreiten der Liquifizierung
wird das Ejakulat immer homogener und flüssiger,
Kommentar und im Endstadium bleiben nur kleine Stellen mit
Wenn ein P atient/Proband keine Ejakulatpro- Koageln üb rig. N ormalerweise liq uifiziert das g e-
be pr oduzieren k ann, k ann der P ostkoital-Test samte Ejakulat innerhalb von 15 Minuten bei Zim-
(7 Abschn. 3.3.1gewisse
) Information über die mertemperatur, g elegentlich nimm t der V organg
Spermien liefern. auch bis zu 60 M inuten o der mehr in An spruch.
Wenn eine k omplette L iquifizierung nic ht inner -
halb v on 60 M inuten er folgt, muss dies v ermerkt
2.2.7Sicher
e Probenhandhabung werden. Zu Hause oder mittels Kondom gewonne-
ne Ejakulatproben kommen normalerweise bereits
Ejakulatproben k önnen g efährliche K rankheits- verflüssigt im Labor an.
erreger en thalten (z.B . h uman imm unodeficiency Einenormale liquifizierte E jakulatprobe k ann
virus [HIV], Hepatitis-Viren oder Herpes-simplex- geleeartige Kügelchen en thalten, die nic ht liq uifi-
Viren) und s ollte deshalb als b iologisches Risik o- zieren; dies e sind o ffenbar o hne k linische B edeu-
material gehandhabt werden. Wenn die Probe wei- tung. Wenn jedoch Schleimfäden auftreten, kön-
ter verwendet wird für Bioassays, für die intraute- nen diese mit der Ejakulatanalyse interferieren.
rine I nsemination (IUI), die I n-vitro-Fertilisation Anmerkung
(IVF) oder die intrazytoplasmische Spermieninjek- DieLiquifizierung k ann mak roskopisch wie oben beschrie -
tion (ICSI) (7 Abschn. 5.1) oder wenn eine Ejakulat- ben und mik roskopisch f estgestellt w erden. I mmobilisierte
kultur angelegt werden soll ( 7 Abschn. 2.2.4 ),müs- Spermien gewinnen währ end der Liquifizerung die F ähig-
keit, sich zu bewegen. Wenn bei der mikroskopischen Unter-
sen st erile M aterialien und T echniken a ngewandt
suchung immobilisier te Spermien (auf grund mangelhaf ter
werden. Sicherheitsrichtlinien wie im Kapitel 9 Liquifizierung) beobacht et w erden, muss mehr Z eit für die
dargestellt, sollten strikt eingehalten werden. Gute komplette Verflüssigung angesetzt werden.
Laborpraxis (G ood L aboratory P ractice) ist eine
grundsätzliche V oraussetzung f ür S icherheit im Anmerkung
Labor (WHO 2004). Während der Liquifizierung kann sanftes Schütteln dazu bei-
tragen, eine homogene Probe zu produzieren.
Anmerkung
2.3 Erstemakroskopische Wenn die Ejakulatpr obe nicht innerhalb v on 30 M inuten li-
Untersuchung quifiziert, sollt en w eitere 30 M inuten abgewar tet w erden,
bevor mit der Analyse fortgefahren wird. Wenn die Liquifizie-
Die Ejakulatanalyse s ollte mit einer einfac hen In- rung auch innerhalb von 60 Minuten nicht stattgefunden hat,
sollte wie im nachfolgenden Abschnitt fortgefahren werden.
spektion kurz nac h der L iquifizierung beginnen,
vorzugsweise nac h 30 M inuten, a ber nic ht lä nger
als 1 S tunde nac h der E jakulation, um D ehydrie-
rung oder Temperaturschwankungen, die die E ja- erzögerte
V Liquifizierung
kulatqualität beeinflussen können, zu vermeiden. Gelegentlich liquifizieren P roben n icht, w as d ie
Untersuchung er schwert. I n s olchen F ällen ka nn
eine zus ätzliche mec hanische o der enzyma tische
2.3.1Liquifizierung (Verflüssigung) Behandlung notwendig sein.
1. DieLiquifizierung einiger Proben kann durch
Das E jakulat bildet t ypischerweise u nmittelbar die Zugabe eines gleichen Volumens eines
nach der Ejakulation in das Probengefäß eine halb- physiologischen Mediums (z.B. Dulbecco’s
fest koagulierte Masse. Innerhalb weniger Minuten Phosphatepuffer; 7 Kap. 11 ,Abschn. 11.2 mit
)
bei Raumtemperatur beginnt das Ejakulat zu liqui-
normer Konsistenz einen Faden von mehr als 2 cm

Kasten 2.2 Präparation von Bromelaine Länge bildet.
10 IU/ml Bromelaine werden in Dulbecco’s phos- Alternativ kann die K onsistenz durch Einf üh-
2 phate buffered saline (7 Kap. 11, Abschn. 11.2) ren eines Glasst abes und d urch B eobachtung der
angesetzt; es löst sich nur schwer auf, aber unter Fadenlänge beurteilt werden, die sich bei Heraus-
Mischen sollte sich der größte Anteil in 15–20 Mi- nehmen des S tabes bildet. Die Viskosität sollte als
nuten aufgelöst haben. Vermische das Ejakulat 1+ 1
abnormal eingestuft w erden, wenn der F aden län-
(1:2) mit der 10 IU/ml Bromelaine-Lösung, rühre mit
einer Pipettenspitze und inkubiere für 10 Minuten ger als 2 cm wird.
bei 37 °C. Durchmische die Probe gründlich vor der Im Gegensatz zu einer nur teilweise liquifizier-
weiteren Analyse. ten Probe zeigt ein visköses Ejakulat eine homoge-
ne Klebrigkeit und s eine Konsistenz wird sich mit
der Z eit nicht ändern. Eine ho he Viskosität ka nn
durch die p lastischen Eig enschaften der P robe
anschließendem wiederholten Pipettieren er- festgestellt werden, die f est zus ammenhält, w enn
reicht werden. man v ersucht, sie zu p ipettieren. Z ur Verminde-
2.nhomogenitäten
I können durch das wieder- rung der Viskosität werden dieselben Methoden
holte (6–10-mal) vorsichtige Aufziehen durch angewandt wie bei der verzögerten Liquifizierung
eine stumpfe Nadel mit Kaliber 18 (innerer (7 Abschn. 2.3.1 »Verzögerte
, Liquifizierung«).
Durchmesser 0,84 mm) oder Kaliber 19 (in- Anmerkung
nerer Durchmesser 0,69 mm) in eine Spritze Eine hohe Viskosität kann die Bestimmung der Spermienmo-
beseitigt werden. tilität, der Spermienkonz entration, der M essung v on Sper-
3. EineInkubation mit Bromelaine, einem un- mienantikörpern und der Bestimmung v on biochemischen
Markern beeinflussen.
spezifischen proteolytischen Enzym (EC
3.4.22.32), kann die Liquifizierung vorantrei-
ben (7 Kasten 2.2 ).
2.3.3A
ussehen des Ejakulates
Kommentar
Diese Behandlungen können die Biochemie des Se- Eine normal liquifizierte E jakulatprobe ha t ein
minalplasmas, die Spermienmotilität und die Sper- homogenes, grau-opales Aussehen. Sie mag w eni-
mienmorphologie beeinflussen und daher muss ger opak erscheinen, wenn die S permienkonzent-
ihre An wendung v ermerkt we rden. Die 1 + 1 (1:2) ration sehr niedrig ist; die F arbe kann auch davon
Verdünnung des Ejakulat es mit Bro melaine muss abweichen z.B . zu r ot-braun, w enn r ote B lutkör-
bei der Ber echnung der Spermienkonz entration perchen anwesend sind o der zum G elben hin b ei
berücksichtigt werden. Gelbsucht oder der Einnahme bestimmter Vitami-
ne und Medikamente.
2.3.2o
Knsistenz
2.3.4 Ejakula
tvolumen
Nach der Liquifizierung ka nn die K onsistenz (o ft
als »Viskosität« bezeichnet) der Probe durch sanfte Das Volumen des Ejakulates setzt sich vorwiegend
Aspiration in eine weitlumige (etwa 1,5 mm Durch- aus Sekreten der Sa menbläschen und der P rostata
messer) Einmal-Plastikpipette beurteilt werden, in- sowie einem k leinen Anteil aus den bulbourethra-
dem das Ejakulat durch Schwerkraft aus der Pipette len Drüsen und den Epididymides zusammen. Die
tropft und die F adenlänge b eobachtet wir d. Eine exakte Messung des Volumens ist f ür jede w eitere
normale Probe tropft in kleinen einzelnen Tropfen Berechnung essentiell, da mittels des Volumens die
von der Pipette ab, wohingegen der Tropfen ab- Gesamtzahl der S permien und a nderer Z ellen im
Ejakulat berechnet werden.
2.3 • Erste makroskopische Untersuchung
19 2
Das Volumen w ird a m b esten d urch W iegen Kommentar
der Probe in dem Sammelgefäß bestimmt. Ein niedriges Ejakulat volumen k ann auch das Er-
5 Probe
Die wird in einem gewogenen, sauberen gebnis f ehlerhafter P robengewinnung ( Verlust
Einmalbehälter gewonnen. einer Ejakulatfraktion), einer partiellen retrograden
5 as Gefäß D wird zusammen mit der Ejakulat- Ejakulation oder eines Androgenmangels sein.
probe gewogen.
5 as Gewicht
D des Gefäßes wird abgezogen. Kommentar
5 as Volumen
D wird aus dem Gewicht der Probe Ein hohes Ejakulat volumen k ann A usdruck einer
berechnet, wobei angenommen wird, dass die starken Absonderung aus den akz essorischen Ge -
Dichte des Ejakulates 1 g/ml beträgt (Auger et schlechtsdrüsen im Falle einer Entzündung sein.
al. 1995). Die Ejakulatdichte variiert zwischen
1,043 und 1,102 g/ml (Huggins et al. 1942; Bra- terer
Un Referenzwert
zil et al. 2004a; Cooper et al. 2007). Der untere Referenzwert für das E jakulatvolumen
beträgt 1,5 ml (5. Z entile, 95% K onfidenzintervall
Anmerkung (CI) 1,4-1,7).
Unbenutzte Ejakulat gefäße können unt erschiedliche Ge -
wichte aufweisen, sodass jeder Container individuell vorge-
wogen werden muss. Das Gewicht k ann auf dem C ontainer
vermerkt werden, ehe er dem Patienten/Probanden überge- 2.3.5pH-
Wert des Ejakulates
ben wird. Ein nicht entf ernbarer M arkierungsstift sollt e auf
dem Gefäß oder auf dem Etikett benutzt w erden. F alls ein Der pH-Wert des E jakulates entsteht aus den v er-
Etikett zur Eintragung des Gewicht es benützt wir d, sollte es
schiedenen pH-Werten der S ekrete der akzess ori-
auf dem leeren Gefäß vor dem Wiegen angebracht werden.
schen G eschlechtsdrüsen, v orzugsweise a us dem
Alternativ kann das Volumen direkt gemessen wer- alkalischen Sekret der Sa menblasen und dem s au-
den. ren S ekret der P rostata. D er pH-Wert s ollte nac h
5 Probe
Die wird direkt in einen weithalsigen der L iquifizierung zu einem b estimmten Z eit-
modifizierten, graduierten Glasmesszylinder punkt, v orzugsweise n ach 30 M inuten, g emessen
gewonnen. Diese können kommerziell erwor- werden, auf jeden Fall aber innerhalb 1 Stunde nach
ben werden. der Ejakulation, da er d urch einen Verlust an CO2
5 as Volumen
D wird direkt von der Graduierung beeinflusst wird, der nach der Ejakulation eintritt.
abgelesen (0,1 ml Genauigkeit). Für no rmale P roben s ollte ein pH-P apier im
Bereich von 6,0–10,0 benutzt werden.
Anmerkung 5 Probe
Die muss gut gemischt werden (7 Kas-
Eine Bestimmung des Volumens durch Aspiration der P robe
ten 2.3 ).
aus dem Sammelgefäß in eine P ipette oder Spritze oder das
Dekantieren der Probe in einen Messzylinder wird nicht emp-
5 in Tropfen
E des Ejakulates wird gleichmäßig
fohlen, we il so nicht die ganz e P robe er fasst w erden k ann auf das pH-Papier gestrichen.
und das Volumen deshalb unt erschätzt wir d. Der v erlorene 5 sollte
Es so lange gewartet werden, bis der be-
Volumenanteil kann zwischen 0,3 und 0,9 ml liegen (Brazil et strichene Bereich eine homogene Farbe zeigt
al. 2004a; Iwamoto et al. 2006; Cooper et al. 2007).
(< 30Sekunden).
5 Farbe
Die wird mit der Kalibration zur Ab-
Kommentar lesung des pH-Wertes verglichen.
Ein niedriges Ejakulatvolumen ist für die Obstruk-
tion des Duc tus ejaculat orius oder für das konge - Anmerkung
Die Genauigkeit des pH-Papiers sollte an Hand von bekann-
nitale beidseitige Fehlen des Vas deferens (CBAVD)
ten Standards überprüft werden.
charakteristisch (de la Taille et al. 1998; Daudin et
al. 2000; v on Eck ardstein et al. 2000; Weiske et al. Im Falle v on visk ösen P roben ka nn der pH-W ert
2000). Bei dieser Erk rankung sind auch die Samen- eines kleinen Aliquots der Probe mittels eines pH-
bläschen unterentwickelt. Meters gemessen werden, das speziell für die Mes-
sung visk öser Fl üssigkeiten ein gerichtet ist (H au-
gen u. Grotmol 1998).
Ref
erenzwerte
Gegenwärtig gibt es mehrere Referenzwerte für den Kasten 2.3 Gründliche Mischung des
pH-Wert des Ejakulates fertiler Männer. Bis weitere Ejakulates
2 Daten v orliegen, b ehält das M anual den K onsen- Vor der Entnahme eines Aliquots aus einer Eja-
suswert von 7,2 als unteren Grenzwert bei. kulatprobe sollte die Probe in dem Sammelgefäß
gut durchmischt werden, aber nicht so intensiv,
Kommentar dass Luftblasen entstehen. Dies kann durch etwa
10-malige Aspiration der Probe in eine weitlumige
Wenn der pH- Wert einer Ejakulatpro be mit niedri-
(ungefähr 1,5 mm Diameter) Einmal-Plastikpipette
gem Volumen und niedriger Spermienzahl weniger (steril, wenn erforderlich) erreicht werden. Ein
als 7,0 beträgt, kann es sich um einenVerschluss der Vortex-Mixer sollte nicht bei hoher Geschwindig-
Ductus ejaculatorii oder das kongenitale bilaterale keit verwandt werden, da dies zu einer Schädigung
Fehlen der Vasa differentia handeln ( CBAVD) (de la der Spermien führt.
Taille et al. 1998; Daudin et al. 2000; von Eckardstein

et al . 2000; Weiske et al . 2000), K rankheiten, bei
denen die Samenbläschen ebenfalls unt erentwi- 5 Bestimmung
die der erforderlichen Verdün-
ckelt sind. nung, um eine genaue Spermienzahl erfassen
zu können (7 Abschn. 2.8 ).
Kommentar
Der pH- Wert des Ejakulat es st eigt mit der Z eit an,
da die natürliche Pufferkapazität abnimmt, so dass 2.4.1GründlicheMischung und
hohe pH-Werte wenig nützliche klinische Aussage- repräsentative Probenentnahme
kraft haben.
DieBeschaffenheit des liquifizierten Ejakulates be-
reitet ein gewisses Problem für die Entnahme einer
2.4 Erstemikroskopische repräsentativen P robe. Wenn d ie P robe n icht g ut
Untersuchung durchmischt ist, ka nn die Anal yse v on zw ei v er-
schiedenen Aliquots deutliche Unterschiede in der
Für alle Untersuchungen des frischen Ejakulatprä- Spermienmotilität, V italität, K onzentration und
parates em pfiehlt sic h ein Phas enkontrastmikro- Morphologie zeigen. Um sicher zu s ein, repräsen-
skop (7 Kap. 10 zur Einstellung des Mikroskops). Zur tative Daten zu erhalten, sollte die Probe gründlich
ersten mikroskopischen Untersuchung einer Probe durchmischt w erden, b evor An teile zur U ntersu-
gehört eine Üb ersicht über das P räparat bei einer chung entnommen werden (7 Kasten 2.3 ),und, be-
Vergrößerung von ×100 (d.h. eine Kombination aus vor d ie Werte a kzeptiert w erden, s ollte e ine g ute
einem ×10-Objektiv und einem ×10-Okular). Übereinstimmung zwischen wiederholten Aliquots
Diese Übersicht gibt Hinweise auf: bestehen. Üb ereinstimmung zwis chen wiederho l-
5 ormationF von Schleimfäden, ten B estimmungen der S permienzahl wir d d urch
5 ggregation
A und Agglutination von Spermien, eine Poisson-Verteilung bestimmt (7 Kasten 2.7 und
5 as Vorhandensein
D von anderen Zellen als 2.10und . Tab. 2.4und2.5) und für die prozentualen
Spermien, z.B. Epithelzellen, Rundzellen (Leu- Angaben durch eine binominale Verteilung (7 Kas-
kozyten und immature Keimzellen) und iso- ten 2.5 und 2.6 sowie . Tab. 2.1).
lierte Spermienköpfe oder -schwänze.
Das P räparat sollte dann b ei e iner Vergrößerung H

erstellung eines
2.4.2
von ×200 oder ×400 untersucht werden (d.h. einer Feuchtpräparates
Kombination a us einem ×20 o der ×40-Ob jektiv
mit einem ×10-Okular). Dies erlaubt: 5 ute Durchmischung
G der Samenprobe (7 Kas-
5 ie Beurteilung
d der Spermienmotilität ten 2.3 ).
(7 Abschn. 2.5 und
)
2.4 • Erste mikroskopische Untersuchung
21 2
. Tab. 2.1 AnnehmbareUnterschiede zwischen

5 Standardvolumen
Ein von etwa 10 μl der Eja-
zwei Prozentsätzen für einen bestimmten Durch- kulatprobe wird auf einen sauberen Glasob-
schnittswert, bestimmt aus der wiederholten Zählung jektträger aufgebracht.
von 200 Spermien (insgesamt 400 Spermien aus- 5 er
Dies
Tropfen wird mit einem Deckglas von
gezählt)
z.B. 22 × 22 mm für 10 μl abgedeckt, um eine
Durchschnitts- Annehmbarer Unterschied* Kammer von etwa 20 μm Tiefe zu erreichen
wert (%) (7 Kasten 2.4). Das Gewicht des Deckglases
0 1
verteilt die Probe.
5 Bildung
Die und der Einschluss von Luftblasen
1 2 zwischen dem Deckglas und dem Objektträger
2 3 muss vermieden werden.
3–4 4 5 obald S der Inhalt sich nicht mehr verschiebt,
sollte die frisch zubereitete nasse Probe unter-
5–7 5
sucht werden.
8–11 6
Anmerkung
12–16 7
Eine Kammertiefe von weniger als 20 µm beeinträchtigt die
17–23 8 rotierenden Bew egungen der Spermien (L e Lannou et al .
1992; Kraemer et al. 1998).
42–34 9
35–65 10 Anmerkung
Wenn die Kammer zu tief ist, ist es schwierig, die Spermien zu
66–75 9
beurteilen, da sie in und aus dem Fokus wandern.
7–83 8
Anmerkung
84–88 7
Wenn die Anzahl der Spermien pr o Gesichtsf eld stark
89–92 6 schwankt, ist die P robe nicht homogen. I n solchen F ällen
sollte die Samenprobe erneut gründlich durchmischt werden
93–95 5 (7 Kasten 2.3) und ein neuer Objektträger sollte wie oben be-
96–97 4 schrieben präpariert werden.
98 3 Anmerkung
99 2 Inhomogenität der Probe kann auch das Ergebnis abnorma-
ler Viskosität, abnormaler Liquifizierung (7 Abschn. 2.3.1von
),
010 1 Spermienaggregationen ( 7 Abschn. 2.3.4oder ) von Sper-
mienagglutinationen (7 Abschn. 2.4.4) sein.
* Basierend auf dem gerundeten 95% Konfindenzin-
tervall
2.4.3Spermienaggr
egationen
5 nmittelbar
U nach dem Mischen Entnahme
eines Aliquots, bevor sich die Spermien in der Das Aneinanderhaften immotiler Spermien mitei-
Suspension absetzen. nander oder motiler Spermien mit Mukussträngen,
5 ische
M die Probe erneut vor der Entnahme von Zellen, die nicht Spermien sind, oder von De-
weiterer Aliquots. bris, wird als unspezifische Aggregation angesehen
(. Abb. 2.2 )und sollte als solche registriert werden.
Das V olumen der en tnommenen P robe und die
Dimension des D eckglases m üssen st andardisiert
sein, s odass die U ntersuchung a n einem P räparat 2.4.4Spermienagglutina
tionen
mit fixierter T iefe v on un gefähr 20 µm ( 7 Kas-
ten 2.4) er folgt, die es den S permien erla ubt, sic h Der Begriff A gglutination b ezieht sich sp ezifisch
frei zu bewegen: auf motile Spermien, die aneinander haften, entwe-
Kasten 2.4 Tiefe der nassen Präparation

e Tiefe des Präparates (D, µm)
Di mit einem 22 × 22 mm Deckglas wird (Fläche von 546 mm2 )resultiert
2 wird durch die Teilung des Volu- (Fläche von 484 mm2 )bedeckt wird, in einer Tiefe von 20,1 µm. Gelegent-
mens der Probe (V, µl = mm3 )durch eine Kammer mit 20,7 μm Tiefe; lich wird eine tiefere Kammer benö-
die Fläche des Präparates (A, mm2 ) eine Probe mit 6,5 μl unter einem tigt: Eine 40-µl-Probe, die mit einem
geteilt: D = V/A. Auf diese Weise 18× 18 mm Deckglas (Fläche von 324 24 × 50 mm Deckglas bedeckt wird
resultiert aus einem Volumen von mm2) resultiert in einer Tiefe von (Fläche von 1200 mm2) resultiert in
10 μl Ejakulat, das auf einen saube- 20,1 µm; eine Probe von 11 μl, die mit einer Tiefe von 33,3 µm.
ren Objektträger aufgebracht und einem 21× 26 mm Deckglas bedeckt
. Abb. 2.2a–d N
ichtspezifische Aggregation von Spermien im Ejakulat a Epitheliale Zellen, b Debris. c, d Spermatozoen
(Mikroskopische Aufnahmen wurden freundlicherweise von C. Brazil zur Verfügung gestellt.)
Anmerkung
der Kopf an Kopf oder Schwanz an Schwanz oder Motile Spermien oder immotile Spermien, die aneinander
in g emischter F orm. Die B eweglichkeit der S per- haften (Aggregation), sollt en nicht als A gglutination einge -
mien ist o ft s ehr kräftig mit wilder S chüttelbewe- stuft werden.
gung, a ber ma nchmal s chränkt die A gglutination
die Beweglichkeit der Spermien auch ein. Alle mo-
tilen Spermien, die entweder mit den Köpfen oder Kommentar
Schwänzen oder Mittelstücken aneinander haften, Die Anwesenheit von Agglutinationen ist nicht aus-
sollten registriert werden. reichend, um die Diag nose immunologische Infer-
Die ha uptsächlichen Typen v on A gglutinatio- tilität zu st ellen, aber lässt das Vorhandensein von
nen (Grad 1–4) und die Lokalisation der Anheftung Spermienantikörpern v ermuten, so dass w eitere
(Grade A–E, . Abb. 2.3) sollten festgehalten werden Abklärung erforderlich ist (7 Abschn. 2.20).
(Rose et al. 1976).
Kommentar
Grad1 isoliert <10 Spermien pro Agglutina- Ausgeprägte Agglutinationen können die Beurtei-
tion, viele nicht agglutinierte lung der Spermienmotilität und der Konz entration
Spermien beeinflussen.
Grad2 mäßig 10–50Spermien pro Agglutina-
tion, einige nicht agglutinierte
Spermien
2.4.5e
Zlluläre Elemente außer
Grad3 viele mehrals 50 Spermatozoen Spermien
sind agglutiniert, einige sind
noch frei beweglich
Das Ejakulat enthält auch andere Zellen als Sper-
Grad 4 ausge- alle Spermien sind agglutiniert mien, einig e v on ihnen sind v on k linischer Rele-
prägt und die Agglutinate sind mit- vanz. D azu g ehören Epithelzellen d es Urogenital-
einander verbunden
2.4 • Erste mikroskopische Untersuchung
23 2
Grad der Agglutination
Teile des 1. Isoliert 2. Mäßig 3. Viele 4. Ausgeprägt

Spermiums (<10 Spermien/ (10-50 Spermien/ (mehr als 50 (alle Spermien
Agglutinat, viele Agglutinat, Spermien, nur agglutiniert und
freie Spermien) einige freie wenige Spermien miteinander
Spermien) noch frei) verbunden)
A. Kopf-zu-Kopf
B. Schwanz-zu-
Schwanz (Die
Köpfe sind frei
und können sich
bewegen)
C. Schwanzspitze-an-
Schwanzspitze
D. Gemischt
(Kopf-zu-Kopf und
Schwanz-zu-
Schwanz-
Agglutinationen)
E. Verstrickt
(Köpfe und Schwänze
sind miteinander
verwoben. Die Köpfe
sind nicht frei
beweglich wie
in den Schwanz-
zu-Schwanz-
Agglutinationen)
. Abb. 2.3 Schematische Darstellung der unterschiedlichen Formen der Spermienagglutination (Reproduziert von Rose et
al. (1976) mit Genehmigung von Wiley-Blackwell)
traktes s owie L eukozyten und imma ture K eim- len können mittels Peroxidasefärbung oder mit Hil-
zellen. Die beiden letzteren werden gemeinsam als fe des Antigens CD45 (7 Abschn. 2.3 genauer
) iden-
»Rundzellen« bezeichnet ( Johanisson et al . 2000). tifiziert und q uantifiziert werden ( 7 Abschn. 2.18 ).
In einem gefärbten Ausstrich können sie bei ×1000 Ihre Konzentration kann wie die der Spermien aus
Vergrößerung identifiziert werden ( 7 Abschn. 2.12 , einer nassen Präparation bestimmt werden oder an
Farbtafeln 13 und 14 und 7 Abschn. 2.19 ).Diese Zel- dem Verhältnis dieser Zellen zur Anzahl der S per-
mien in einem g efärbten Ausstrich oder zur S per- sollte aber in jedem Labor standar disiert durchgeführt wer-
den. Wenn die Sper mienmotilität bei 37 °C bestimm t wird,
mienkonzentration (7 Abschn. 2.12.1 ).
sollten die P roben auch bei dieser Temperatur und mit v or-
gewärmten Objektträgern und Deckgläsern v orgenommen
2 werden.
2.5 Spermienmotilitä
t
Anmerkung
Die progressive Spermienmotilität (7 Abschn. 2.5.1 ) Um das Gesichtsf eld zu beg renzen, wir d die Verwendung
eines Okulars mit Gitter empfohlen (. Abb. 2.4 a).
Dies erlaubt
korreliert mi t den S chwangerschaftsraten (Jouan- die Beurteilung desselben Abschnittes auf dem Objektträger
net et al. 1988; Larsen et al. 2000; Zinaman et al. während beider Phasen der Beur teilung. Zunächst sollte die
2000). M ethoden zur co mputerassistierten Analy- progressive Motilität bestimmt werden, dann die nichtpro-
se (CASA) zur Bestimmung der Spermienmotilität gressive und schließlich die Immotilität (7 Abschn. 2.5.1Eine ).
werden in 7 Abschn. 3.5.2 beschrieben. Begrenzung des unt ersuchten Feldes und damit der Anzahl
der Spermien garantiert, dass mehrere Felder des Präparates
Die S permienmotilität sollte s o s chnell wie im Hinblick auf die Spermienmotilität untersucht werden.
möglich nac h der L iquifizierung der P robe b e-
stimmt werden, vorzugsweise nach 30 Minuten,
aber spätestens 1 Stunde nach der Ejakulation, um
den nega tiven Einfluss einer D ehydrierung, des Klassifizierung der
2.5.1
pH-Wertes oder von Veränderungen der Tempera- Spermienmotilität
tur auf die Motilität zu begrenzen.
5 ründliches
G Mischen der Ejakulatprobe Ein einfaches System zur Klassifizierung der Sper-
(7 Kasten 2.3 ). mienmotilität wir d em pfohlen, w obei S permien
5 nmittelbar
U nach dem Mischen Abpipettieren mit p rogressiver o der nic htprogressiver M otilität
eines Aliquots, um keine Zeit zur Sedimen- von immmotilen Spermien unterschieden werden.
tierung der Spermien aus der Suspension zu Die Motilität jedes Spermiums wird wie folgt klas-
erlauben. sifiziert:
5 neute
Er Durchmischung der Ejakulatprobe, 5 rogressive
P Motilität (PR): Spermien, die sich
bevor ein zweites Aliquot zur Doppelbestim- aktiv vorwärts bewegen, entweder linear oder
mung entnommen wird. im großen Bogen, ohne Berücksichtigung der
5 ür jede F Bestimmung wird eine nasse Geschwindigkeit.
Präparation mit 20 μm Tiefe vorbereitet 5 ichtprogressive
N Motilität (NP): alle anderen
(7 Abschn. 2.4.2 ). Muster der Spermienmotilität ohne Progres-
5 bwarten, A bis die Probe keinen Drift mehr sion, z.B. Schwimmen in kleinen Kreisen,
aufweist (innerhalb von 60 Sekunden) Schwanzbewegungen, die den Kopf nicht fort-
5 ntersuchung
U des Präparates mit Phasen- bewegen, oder wenn nur Schwanzbeweglich-
kontrastoptik bei einer ×200 oder ×400 Ver- keit beobachtet werden kann.
größerung. 5 mmotilität
I (IM): keine Beweglichkeit.
5 ro Doppelwert
P werden etwa 200 Spermien
zur Bestimmung der Grade der Spermienmo- Kommentar
tilität untersucht. In der vorigen Auflage dieses Manuals wurde emp-
5 ergleich V der Doppelbestimmungen, um fest- fohlen, dass pr ogressiv-motile Spermien in schnell
zustellen, ob sie gut oder langsam eingeteilt werden sollten, wobei eine
5 ereinstimmen.
üb Wenn dies der Fall ist, fort- Geschwindigkeit >25 µm/s bei 37 °C als »Grad a« de-
fahren mit den Berechnungen; wenn dies finiert wurde. Es ist jedoch schwierig für den Beob-
jedoch nicht der Fall ist, muss eine neue Dop- achter, die Vorwärtsbeweglichkeit auf diese Art und
pelbestimmung angesetzt werden. Weise vorurteilsfrei exakt zu bestimmen (Cooper u.
Yeung 2006).
Anmerkung
Die Untersuchung kann bei Raumtemperatur oder auf einem
geheizten M ikroskoptisch bei 37 °C durc hgeführt we rden,
2.5 • Spermienmotilität
25 2
>5 mm
a b
. Abb. 2.4a, b H
ilfen zur Bestimmung der Spermienmotilität. a Ein Zählokular erleichtert die Zählung motiler und immoti-
ler Spermien. b Systematische Wahl der Felder zur Bestimmung der Spermienmotilität stets mindestens 5 mm vom Rand des
Deckglases entfernt
Kommentar sollten oft gewechselt werden. Es sollte vermie-

Wenn v on Spermienmotilität gespro chen wird, ist den werden, Felder nach der Anzahl der moti-
es wichtig, die Gesamtmotilität (PR + NP) oder die len Spermien auszuwählen (die Wahl sollte per
progressive Motilität (PR) anzugeben. Zufall erfolgen).
5 Beurteilung
Die sollte in einem zufälligen
Augenblick beginnen. Es sollte nicht darauf
2.5.2o
Vrbereitung der Probe und gewartet werden, bis ein Spermium in das Ge-
Beurteilung der Motilität sichtsfeld oder das Gitter hineinschwimmt.
5 estimme
B die Motilität aller Spermien inner-
5 ennW die Motilität bei 3 °C beurteilt werden halb eines bestimmten Gebietes des Feldes.
soll, sollte die Heizung des Mikroskoptisches Das kann am leichtesten unter Benutzung
10 Minuten vorher eingeschaltet werden, da- eines Okulars mit Gitter erfolgen (. Abb. 2.4a).
mit sich die Temperatur stabilisieren kann. Richte die Größe des ausgewählten Feldes oder
5 ereite
B eine nasse Präparation mit 20 µm Tiefe Gitters, das beurteilt werden soll, nach der
vor (7 Abschn. 2.4.2 ). Spermienkonzentration aus, d.h. beurteile nur
5 ntersuche
U das Präparat mit Phasenkontrast- die oberste Reihe des Gitters, wenn die Sper-
optik bei ×200 oder ×400facher Vergröße- mienkonzentration hoch ist; beurteile aber das
rung. gesamte Gitter, wenn die Spermienkonzentra-
5 arteWmit der Untersuchung, bis die Probe tion niedrig ist.
aufgehört hat zu driften. 5 chmustere
Dur und zähle das Präparat schnell,
5 as untersuchte
D Gebiet sollte mindestens um eine Überbewertung der motilen Spemien
5 mm von der Kante des Deckglases entfernt zu vermeiden. Das Ziel sollte es sein, alle mo-
sein (. Abb. 2.4b), um durch Eintrocknung tilen Spermien in einem Abschnitt des Gitters
bedingte Einflüsse auf die Motilität zu ver- auf einmal zu zählen; vermeide das Zählen von
hindern. den Spermien, die anfangs da sind plus denen,
5 as Präparat
D sollte systematisch durchsucht die während des Auszählens in das Gitter
werden, um eine wiederholte Beobachtung hineinschwimmen, wodurch das Ergebnis zu
desselben Feldes zu vermeiden. Die Felder
mittleren Prozentsatz für jeden Motilitätsgrad

Kasten 2.5 Fehlerquellen bei der (PR, NP und IM) ein. Wenn der Unterschied
Bestimmung der prozentualen zu hoch ist, benutze zwei neue Aliquots der
2 Verteilungen Ejakulatprobe, fertige zwei neue Präparate
Die Korrektheit der gemessenen Prozente an und wiederhole den Messvorgang (7 Kas-
hängt nicht nur von der Zahl (N) der gezählten ten 2.6 ).
Spermien ab, sondern auch von dem wahren, aber 5 er Mittelwert
D der Prozentsätze jedes Motili-
unbekannten Prozentanteil (p) ab (binominale
tätsgrades sollte mit der nächsten auf- oder
Verteilung). Der ungefähre Standardfehler (SE)
beträgt für Prozentanteile zwischen 20 und 80 abgerundeten ganzen Zahl registriert werden.
√((p (100-p ))/N). Außerhalb dieses Bereiches ist die
anguläre Transformation eine bessere Methode Anmerkung
(arc sin Quadratwurzel), z = sin-1 √(p/100) mit einer Nur intakt e Spermien sollt en beur teilt w erden (charakt eri-
Standardabweichung von 1/(2√N ).Dieser Wert siert durch einen Kopf und einen S chwanz, 7 Abschn. 2.7.3 ),
hängt nur von der Zahl der gezählten Spermien da nur intakt e Spermien in die Ber echnung der Spermien-
und nicht von dem wahren Prozentsatz ab. konzentration eingehen. Bew egliche P inhead-Formen soll-
ten nicht mitgezählt werden.
Anmerkung
Wenn die Spermien in z wei Durchgängen beur teilt werden
Gunsten der motilen Spermien verschoben
(d.h. PR zuerst, und danach NP und IM aus demselben Ge -
würde. biet) und 200 Spermien akkumuliert werden, bevor alle Moti-
5 u Beginn
Z sollte der Gitterabschnitt nach PR- litätskategorien in diesem Gebiet ausgewertet sind, muss das
Spermien abgesucht werden (7 Abschn. 2.5.1 ). Zählen über 200 Spermien hinausgehen, bis alle K ategorien
Dann sollten die NP-Spermien und schließlich beurteilt wurden, damit keine Überbewertung der zuerst be-
urteilten stattfindet.
die IM-Spermien in demselben Gitterabschnitt
gezählt werden. Mit der notwendigen Er- Anmerkung
fahrung können alle drei Kategorien an Sper- Häufig wir d die Spermienmotilität überschätzt, dies k ann
mienbeweglichkeit gleichzeitig erfasst werden aber durch Änderung der Reihenf olge der Analy se (NP und
und ein größeres Gebiet des Gitters kann IM zuerst) v ermieden werden, wenn ein Zählokular v erwen-
untersucht werden. det wir d und man bewusst, so weit es eben geht, mögliche
Fehlerquellen vermeidet (7 Abschn. 7.13.3).
5 Anzahl
Die der Spermien in jeder Motilitäts-
klasse sollte mittels eines Laborcounters fest- Anmerkung
gehalten werden. In selt enen F ällen und speziell bei inhomogenen P roben
5 sollten
Es mindestens 200 Spermien in einer kann selbst ein dritter Satz von Doppelwerten unakzeptabel
Gesamtzahl von mindestens fünf Feldern in hohe Unt erschiede aufw eisen. I n einem solchen F all sollt e
der M ittelwert aus allen Doppelbestimmungen ber echnet
jeder Doppelbestimmung untersucht werden,
und dies im Laborbericht vermerkt werden.
um einen möglichst niedrigen Zählfehler zu
erhalten (7 Kasten 2.5 ).
5 erechne
B den durchschnittlichen Prozentsatz
und den Unterschied zwischen den beiden A
rbeitsbeispiele
2.5.3
Prozentsätzen für den häufigsten Motilitäts-
grad (PR, NP oder IM) in den Doppelbestim- Beispiel 1: D ie D oppelbestimmungen d er S per-
mungen. mienmotilität basier end a uf 200 S permien b etra-
5 estimme
B aus . Tab. 2.1oder . Abb. 14.2 ob
, gen: p rogressiv 30% und 5 0%; nic htprogressiv 5%
der Unterschied akzeptabel ist (Tabelle und und 15%; immotil 65% und 35%. Die häufigste Kate-
Abbildung zeigen den größten Unterschied gorie sind immo tile S permien, die im M ittelwert
zwischen zwei Prozentsätzen, der aufgrund bei 5 0% lieg en und einen U nterschied v on 30%
des Zählfehlers alleine in 95% der Proben zu haben. A us . Tab. 2.1ka nn en tnommen w erden,
erwarten ist). Wenn der Unterschied zwischen dass bei einem Mittelwert von 50% ein Unterschied
den Prozentsätzen akzeptabel ist, trage den von bis zu 10% allein zufällig en tstehen ka nn. D a
2.6 • Spermienvitalität
27 2
Kasten 2.6 Vergleich der doppelt gemessenen Prozentsätze

rozente
P sollten zu der nächsten Pipettierfehler aufgetreten ist oder sollten frische Präparate aus neuen
ganzen Zahl gerundet werden. Kon- dass die Probe nicht gut gemischt Aliquots des Ejakulates hergestellt
ventionell wird 0,5% zur nächsten war, sodass eine nichtzufällige werden. Zur Bestimmung der Vitali-
geraden Zahl gerundet z.B. 32,5% Verteilung in der Kammer oder auf tät aus Eosin-Nigrosin-gefärbten
wird auf 32% abgerundet und 3,5% dem Objektträger erfolgte. Ausstrichen und der Spermienmor-
wird zu 4% aufgerundet. Beachte, Wenn der Unterschied zwi- phologie sollten die Präparate in
dass gerundete Prozente in der schen den Prozentsätzen größer als Doppelwerten untersucht werden.
Summe nicht 100% ergeben mögen. akzeptabel ist, werden die ersten Mit diesen auf 95% Kon-
Wenn der Unterschied zwi- beiden Werte verworfen und er- fidenzintervall basierenden
schen wiederholt gemessenen neut bestimmt. (Es sollte keine Grenzwerten sollten etwa 5% der
Prozentsätzen weniger oder gleich dritte Zählung mit Bestimmung des wiederholten Messungen außer-
dem in . Tab. 2.1 für einen be- Mittelwertes aus den drei Werten halb der zufälligen Grenzen liegen
stimmten Mittelwert beträgt, wird erfolgen, und es sollte auch nicht (7 Kap. 14, 7 Abschn. 14.3). Exakte
die Messung akzeptiert und der der Mittelwert aus den beiden binominale Konfidenzintervalle
Mittelwert als Ergebnis angenom- nächstliegenden Werten genom- können jetzt mittels Computer
men. men werden.) erstellt werden und solche werden
Wenn der Unterschied über Zur Bestimmung der Sper- auch in diesem Manual für die Gra-
den akzeptablen Wert hinausgeht, mienmotilität, der Vitalität durch fiken und Tabellen zur Bestimmung
legt das die Vermutung nahe, dass Eosinfärbung und für den hypo- der Übereinstimmung von wieder-
entweder ein Zählfehler oder ein osmotischen Schwelltest (HOS) holten Messungen benutzt.
der tatsächlich beobachtete Unterschied diese Zahl Kommentar

übersteigt, wird das Ergebnis verworfen, zwei neue Die Gesamtzahl der pr ogressiv-motilen Spermien
Präparate w erden a ngefertigt und die S permien- in einem Ejakulat hat biologische Signifikanz. Diese
motilität wird erneut gemessen. Zahl wird durch Multiplikation der Gesamtzahl der
Beispiel 2: Die in Doppelwerten von 200 Sper- Spermien in einem Ejakulat ( 7 Abschn. 2.8.7mit )
mien g emessene Motilität b eträgt: p rogressiv 37% dem Prozentsatz der pr ogressiv-motilen Spermien
und 28%; nichtprogressiv 3% und 6%; immotil 60% errechnet.
und 66%. Die hä ufigste Kategorie ist die immo tile
mit einem M ittelwert von 6 3% und einem U nter-
schied v on 6%. A us . Tab. 2.1ka nn en tnommen 2.6 Spermien
vitalität
werden, dass b ei einem M ittelwert von 6 3% ein
Unterschied von bis zu 10% als rein zufällig ange- Die B estimmung der S permienvitalität d urch die
nommen werden kann. D a der g emessene Unter- Beurteilung der Z ellmembranintaktheit s ollte im
schied kleiner ist, kann das Resultat angenommen Rahmen der Routinediagnostik durchgeführt wer-
werden und die Mittelwerte werden eingetragen: den und ist besonders wichtig bei Proben mit weni-
PR 32%, NP 4%, IM 63%. ger als 40% vorwärts beweglichen Spermien. Dieser
Test kann zur Überprüfung der Motililtätsevaluati-
on dienen, da die Anzahl der toten Zellen nicht die
2.5.4 Un
tere Referenzgrenze Anzahl der immotilen Spermien übersteigen sollte
(innerhalb des S tichprobenfehlers). Im Normalfall
Die untere Referenzgrenze für die Gesamtmotilität gibt es mehr vitale Zellen als bewegliche Zellen.
(PR + NP) beträgt 40% (5. Zentile, 95% CI 38–42). Die A nzahl v italer S permien w ird d urch d ie
Die untere Referenzgrenze für progressive Mo- Identifikation v on Z ellen mi t in takter Z ellmem-
tilität (PR) beträgt 32% (5. Zentile, 95% CI 31–34). bran bestimmt. Hierzu kann entweder der Farb-
ausschluss o der der h ypoosmotische S chwelltest
verwendet w erden. Die F arbausschlussmethode
basiert auf der Tatsache, dass tote Spermien mit ge- ch Filterpapier filtern (z.B. 90 g/m 2 ),um
4. Dur
schädigter Plasma membran b estimmte F arbstoffe grobkörnige und gallertartige Präzipitate zu
aufnehmen. Bei dem hypoosmotischen Schwelltest entfernen; danach Lagerung in einer versiegel-
2 kommt es nur bei vitalen Zellen mit einer intakten ten dunklen Glasflasche.
Membran zum Anschwellen der Zellen in hypoto-
ner Lösung. Beispiele für jeden Test werden im Ver-
lauf beschrieben. Dur
chführung
Mit der Bestimmung der Spermienvitalität soll- 1. menprobe
Sa gut mischen (7 Kasten 2.3 )
te dir ekt nac h Verflüssigung der Sa menprobe b e- 2. 0 μl
5 Ejakulat entnehmen und mit derselben
gonnen w erden, mög lichst nac h 30 M inuten und Menge Eosin-Nigrosin-Suspension mischen,
nicht später als 60 M inuten, um s o negative Ein- z.B. in einem Zentrifugenröhrchen oder im
flüsse auf die Vitalität wie Dehydrierung und Tem- Reagenzglas, anschließend 30 Sekunden war-
peraturschwankungen zu verhindern. ten.
3. menprobe
Sa erneut mischen, 50 μl Ejakulat für
Kommentar die Doppelbestimmung entnehmen und wie in
Es ist v on k linischer Relevanz, ob immotile Sper- Schritt 2 fortfahren.
mien vital oder t ot sind. Die Vitalität sollte zusam- 4. ürFjede Suspension wird ein Ausstrich-
men mit der M otilität aus demselben Ant eil der präparat auf einem Objektträger angefertigt
Samenprobe bestimmt werden. (7 Abschn. 2.13.2 und
) luftgetrocknet.
5. eurteilung
B unmittelbar nach Lufttrocknung
Kommentar oder später, nach Eindeckung mit einem per-
Ein hoher Ant eil vitaler , jedoch immotiler Z ellen manenten nichtwasserhaltigen Medium.
kann ein I ndikator für strukture lle Def ekte im F la- 6. eurteilung
B der Objektträger mit Öl-Immer-
gellum sein (Chemes u. Rawe 2003). Eine große An- sion mittels Hellfeld-Einstellung bei 1000fa-
zahl immotiler und toter Zellen (Nekrozoospermie) cher Vergrößerung.
kann auf eine P athologie im Nebenhoden hin wei- 7. ezählt
G werden gefärbte (tote) und ungefärbte
sen (Wilton et al. 1988; Correa-Perez et al. 2004). (vitale) Zellen mit Hilfe eines Laborcounters.
8. 200Spermien pro Doppelbestimmung müssen
beurteilt werden, um einen akzeptablen Stich-
2.6.1 iVtalitätstest mittels probenfehler zu erhalten (7 Kasten 2.5 ).
Eosin-Nigrosin 9. Durchschnitt und Differenz der Anzahl vitaler
Zellen der Doppelbestimmungen errechnen.
Bei dieser Färbetechnik wird Nigrosin benutzt, um 10. schließend
An wird mit . Tab. 2.1oder
den Kontrast zwischen dem Hintergrund und den . Abb. 14.2festgestellt, ob die Differenz ak-
Spermienköpfen zu erhöhen und so die Zählung zu zeptabel ist. (Es wird jeweils die maximal er-
erleichtern. Zusätzlich können so die Objektträger laubte Differenz zwischen zwei Prozentzahlen
für eine spä tere Re-E valuation und Quali tätskon- dargestellt, die erwartungsgemäß bei 95% der
trolle gelagert werden (Björndahl et al. 2003). Proben allein wegen des Stichprobenfehlers
auftritt.)
ubereitung
Z der Reagenzien 11. enn
W die Differenz zwischen den Prozentzah-
1. EosinY: 0,67 g Eosin Y (Farbindex 45380) und len akzeptabel ist, wird der Durchschnittswert
0,9 g Natriumchlorid (NaCl) werden in 100 ml der vitalen Spermien dokumentiert. Wenn die
Aqua dest. unter langsamer Erwärmung auf- Differenz zu groß ist, müssen neue Doppelbe-
gelöst. stimmungen aus der Samenprobe entnommen
2. Eosin-Nigrosin: 10 g Nigrosin (Farbindex werden und die Schritte 1–11 wiederholt wer-
50420) zu der Eosin Y-Lösung hinzufügen. den (7 Kasten 2.6 ).
3. uspension
S kochen, anschließend auf Raum-
temperatur abkühlen lassen.
29 2
Kommentar
Die Gesamtzahl der membranintakten Spermien im
Ejakulat ist v on biologischer Bedeutung. Den Wert
erhält man durch Multiplikation der Gesamtzahl al-
ler Spermien im Ejakulat ( 7 Abschn. 2.8.7mit
) der
Prozentzahl der membranintakten Zellen.
2.6.2iVtalitätstest mittels Eosin allein
Die Methode ist einfach und kostet nicht viel Zeit,

allerdings können Nativpräparate nicht für spätere
Qualitätskontrollzwecke gelagert werden.
ubereitung
Z der Reagenzien
. Abb. 2.5 Eosin-N
igrosin-Ausstrich unter dem Hellfeld-
. 1 aCl
N 0,9% (w/v): 0,9 g NaCl wird in 100 ml
Mikroskop. Spermien mit roten (D1) oder tiefrosafarbenen
Köpfen gelten als tot (Membrandefekt), wohingegen Sper-
Aqua dest. aufgelöst.
mien mit weißen Köpfen oder hellrosafarbenen Köpfen als 2. Eosin
Y 0,5% (w/v): 0,5 g Eosin Y (Farbindex
vital eingestuft werden (Membran intakt) (Mikroskopische 45380) wird in 100 ml NaCl 0,9% aufgelöst.
Aufnahme mit freundlicher Genehmigung von TG Cooper)
Anmerkung
Einige gew erblich erhältliche Eosin-L ösungen sind h ypoto-
12.erDDurchschnittswert der vitalen Spermien
ne wässrige L ösungen, die die Spermien str essen und so -
sollte auf die nächste ganze Zahl auf- oder ab- mit falsch positiv e Ergebnisse liefern (Björndahl et al . 2004).
gerundet werden. Wenn eine solche zur An wendung kommt, sollt e 0,9 g NaCl
zu 100 ml der Lösung hinzugegeben werden, um die Osmo -
lalität zu erhöhen.
uswertung
A
. 1 asDNigrosin liefert einen dunklen Hinter- chführung
Dur
grund, der das Erkennen von nur schwach 1. menprobe
Sa gut mischen (7 Kasten 2.3 )
angefärbten Spermien erleichtert. 2.5 μl Ejakulat entnehmen und mit 5 μl Eosin-
2.n der
I Hellfeld-Einstellung haben vitale Sper- Lösung auf einem Objektträger zusammen-
mien weiße Köpfe und tote Spermien rote oder bringen. Zum Mischen auf dem Objektträger
tiefrosafarbene Köpfe (. Abb. 2.5 ).Spermien eine Pipettenspitze verwenden.
mit einem hellrosafarbenen Kopf sind als vital 3. itM einem 22 × 22 mm großen Deckglas abde-
zu werten. cken und für 30 Sekunden ruhen lassen.
3. enn
W nur ein Teil der Nackenregion des 4. menprobe
Sa erneut mischen, 5 μl Ejakulat für
Spermiums angefärbt ist, der Rest des Kopfes die Doppelbestimmung entnehmen, mit Eosin
aber ungefärbt ist, spricht man von einer »un- mischen und wie in Schritt 2–3 fortfahren.
dichten Nackenmembran« (»leaky neck mem- 5. Die Objektträger werden bei 200- oder 400fa-
brane«). Dies ist kein Zeichen von Zelltod und cher Vergrößerung beurteilt, vorzugsweise in
kompletter Membrandesintegration. Diese der Negativ-Kontrast-Einstellung (in der Posi-
Zellen werden als vital eingestuft. tiv-Kontrast-Einstellung sind hellrosafarbene
Spermienköpfe schwer zu erkennen).
terer
Un Referenzwert 6. ezählt
G werden gefärbte (tote) und ungefärbte
Der un tere Ref erenzwert f ür die V italität (mem- (vitale) Zellen mit Hilfe eines Laborcounters.
branintakte Spermien) liegt b ei 58% (5. Perzentile, 7. 200 Spermien pro Doppelbestimmung müssen
95%-Konfidenzintervall 55–63). beurteilt werden, um einen akzeptablen Zähl-
fehler zu erhalten (7 Kasten 2.5 ).
8. Durchschnitt und Differenz der Anzahl vitaler 2.6.3iVtalitätstest mittels

Zellen der Doppelbestimmungen errechnen. hypoosmotischer Schwellung
9. schließend
An wird mit . Tab. 2.1oder
2 . Abb. 14.2festgestellt, ob die Differenz ak- Als Alternative zur Färbemethode kann der hypo-
zeptabel ist. (Es wird jeweils die maximal er- osmotische S chwelltest ( HOS) z ur V italitätsbe-
laubte Differenz zwischen zwei Prozentzahlen urteilung d urchgeführt w erden ( Jeyendran e t a l.
dargestellt, die erwartungsgemäß bei 95% der 1984). Er sollte angewendet werden, wenn eine Fär-
Proben allein wegen des Stichprobenfehlers bung der S permien v ermieden w erden muss, z.B .
auftritt.) bei der Spermienselektion für eine ICSI. Spermien
10. enn
W die Differenz zwischen den Prozentzah- mit einer in takten M embran s chwellen innerhalb
len akzeptabel ist, wird der Durchschnittswert von 5 M inuten in h ypoosmotischem M edium a n
der vitalen Spermien dokumentiert. Wenn die und alle Flagellenformen sind nach 30 Minuten sta-
Differenz zu groß ist, müssen neue Doppel- bilisiert (Hossain et al. 1998).
bestimmungen aus dem Ejakulat entnommen Daher:
werden und die Schritte 1–11 wiederholt wer- 5 Minuten
30 Inkubationszeit für die Routine-
den (7 Kasten 2.6 ). diagnostik, aber
11.erDDurchschnittswert der vitalen Spermien 5 ur 5nMinuten Inkubationszeit, wenn die Sper-
sollte auf die nächste ganze Zahl auf- oder ab- mien noch für therapeutische Zwecke genutzt
gerundet werden. werden müssen.
uswertung
A ubereitung
Z der Reagenzien
1. itale
V Spermien haben weiße oder hellrosafar- 1. chwell-Lösung
S für diagnostische Zwecke:
bene Köpfe und tote Spermien haben rote oder 0,735 g Natriumcitrat (Na3 C6 H5 O7 2H2 O)und
tiefrosafarbene Köpfe. 1,351 g D-Fruktose werden in 100 ml Aqua
2. enn
W nur ein Teil der Nackenregion des Sper- dest. aufgelöst. 1-ml-Aliquots dieser Lösung
miums angefärbt ist, der Rest des Kopfes aber werden bei −20 °C eingefroren.
ungefärbt ist, spricht man von einer undichten 2. ürFtherapeutische Zwecke: das zu verwenden-
Membran. Dies ist kein Zeichen von Zelltod de Medium 1+ 1 (1:2) mit sterilem Aqua dest.
und kompletter Membrandesintegration. Diese verdünnen.
Zellen werden als vital eingestuft.
. 3 ennW es schwierig ist, die hellrosafarbenen Dur
chführung
Köpfe zu unterscheiden, kann Nigrosin ver- 1. chwell-Lösung
S auftauen und vor Gebrauch
wendet werden, um den Kontrast zum Hinter- gut mischen.
grund zu erhöhen (7 Abschn. 2.6.1 ). 2.1 ml der Schwell-Lösung oder 1 ml des 1+ 1
(1:2) verdünnten Mediums in einer geschlosse-
terer
Un Referenzwert nen Mikrozentrifuge bei 37 °C für 5 Minuten
Der un tere Ref erenzwert f ür die V italität (mem- erwärmen.
branintakte Spermien) liegt b ei 58% (5. Perzentile, 3. jakulat
E gut mischen (7 Kasten 2.3 ).
95%-Konfidenzintervall 55–63). 4.100 μl Ejakulat entnehmen und mit der
Schwell-Lösung zusammenbringen. Vorsichtig
Kommentar mit einer Pipette durch Ansaugen und Ablas-
Die Gesamtzahl membranintakter Spermien im Eja- sen mischen.
kulat ist von biologischer Bedeutung. Den Wert er- 5. ei B37 °C für exakt 5 oder 30 Minuten inkubie-
hält man durch Multiplikation der Gesamtzahl aller ren (siehe unten), dann ein 10-µl-Aliquot auf
Spermien im Ejakulat ( 7 Abschn. 2.8.7mit) der Pro- einen sauberen Objektträger geben und mit
zentzahl der membranintakten Zellen. einem 22 × 22 mm großen Deckglas bedecken.
6. jakulat
E erneut mischen, entsprechende Men-
ge für die Doppelbestimmung entnehmen, mit
31 2
a b c d e f g
. Abb. 2.6a–g Schematische Darstellung typischer morphologischer Veränderungen menschlicher Spermien nach Kon-
takt mit hypoosmotischer Lösung. a keine Veränderungen. b–g unterschiedliche Schwanzveränderungen. Die Schwellung
im Schwanzbereich ist in grau gekennzeichnet. (Reproduziert von Jeyendran RS, Van der Ven HH, Perez-Peleaz M, Crabo BG,
Zaneveld LJD, 1984. Journal of Reproduction and Fertility, 1984;70:219-228. ©Society for Reproduction and Fertility)
Schwell-Lösung mischen, inkubieren und wie pelbestimmungen aus dem Ejakulat entnom-
oben beschrieben fortfahren. men werden und die Schritte 1–11 wiederholt
7. DieObjektträger unter dem Phasenkontrast- werden (7 Kasten 2.6 ).
mikroskop bei 200- oder 400facher Vergröße- 13.erDDurchschnittswert der vitalen Spermien
rung beurteilen. sollte auf die nächste ganze Zahl auf- oder ab-
8. ezählt
G wird die Anzahl nichtgeschwollener gerundet werden.
(toter) und geschwollener (vitaler) Zellen mit-
tels Laborcounters. uswertung
A
9. 200Spermien pro Doppelbestimmung müssen 1. asDSchwellen der Spermien macht sich durch
beurteilt werden, um einen akzeptablen Stich- Veränderungen in der Zellform, in Form
probenfehler zu erhalten (7 Kasten 2.5 ). einer Aufwicklung der Schwänze, bemerkbar
10. Dur
chschnitt und Differenz der Anzahl vitaler (. Abb. 2.6 ).
Zellen der Doppelbestimmungen errechnen. 2. Als
vital gelten Spermien, deren Schwänze an-
11. schließend
An wird mit . Tab. 2.1oder schwellen; gezählt und als vital gewertet wer-
. Abb. 14.2festgestellt, ob die Differenz akzep- den alle Formen von geschwollenen Schwän-
tabel ist. (Es wird jeweils die maximal erlaubte zen.
Differenz zwischen zwei Prozentanteilen dar-
gestellt, die erwartungsgemäß bei 95% der terer
Un Referenzwert
Proben allein wegen des Stichprobenfehlers Der HOS-Test ist mit dem Eosin-Test vergleichbar
auftritt.) (Carreras at al. 1992).
12. enn
W die Differenz zwischen den Prozentzah- Der untere Referenzwert für die Vitalität (mem-
len akzeptabel ist, wird der Durchschnittswert branintakte Spermien) liegt b ei 58% (5. Perzentile,
der vitalen Spermien dokumentiert. Wenn die 95%-Konfidenzintervall 55–63).
Differenz zu groß ist, müssen zwei neue Dop-
Kommentar die Gesamtzahl aller Spermien im gesamt en Eja-

Die Gesamtzahl der membranintakten Spermien im kulat und errechnet sich aus der Multiplik ation der
Ejakulat ist v on biologischer Bedeutung. Den Wert Spermienkonzentration mit dem Ejakulatvolumen.
2 erhält man durch Multiplikation der Gesamtzahl al-
ler Spermien im Ejakulat ( 7 Abschn. 2.8.7mit
) der Kommentar
Prozentzahl der membranintakten Zellen. Die Generalisierung , dass die Spermiengesamt-
zahl die testikuläre Spermienproduktivität wider-
spiegelt, g ilt nicht bei dur ch Elektr ostimulierung
2.7 Spermienanzahl gewonnenem Ejakulat (z.B. bei Patienten mit Wir-
belsäulenverletzung), bei Andr ogenmangel, nach
Die S permiengesamtzahl p ro E jakulat und die langer Karenzzeit oder retrograder Ejakulation.
Spermienkonzentration korrelieren sowohl mit der
Zeit bis zum Eintritt einer Schwangerschaft (Slama Kommentar 3
et a l. 2002) als auch mit den S chwangerschaftsra- DerBegriff »Spermiendichte« (Masse pro Volumen-
ten (WHO, 1996; Zinaman et al. 2000) und ha ben einheit) sollt e nicht mit »Spermienkonz entration«
einen prädiktiven Wert in Bezug auf die Konzep- (Anzahl pro Volumeneinheit) verwechselt werden.
tion (Bonde et al . 1998; L arsen et al . 2000) . Mehr
Daten über die Korrelation zwischen Spermienge- Die Bestimmung der Spermienanzahl umfasst fol-
samtzahl und r eproduktsmedizinischen Er gebnis- gende Schritte (die detailliert in nachfolgenden Ab-
sen sind erforderlich. schnitten beschrieben sind).
Die Anzahl der Spermien im Ejakulat errechnet 5 ntersucht
U wird ein gut gemischtes, unver-
sich aus der S permienkonzentration, die währ end dünntes Präparat von liquefiziertem Ejakulat
der Ejakulatbeurteilung bestimmt wird. Bei einem auf einem Glasobjektträger unter einem Deck-
normalen E jakulat, w enn die a bleitenden Sa men- glas, um die entsprechende Verdünnung und
wege durchgängig sind und b ei kurzer Karenzzeit, Zählkammer zu wählen (7 Abschn. 2.8.1 ).
korreliert die Spermiengesamtzahl mit dem Ho- Hierbei handelt es sich für gewöhnlich um das
denvolumen (Handelsman et al . 1984; WHO 1987; Nativpräparat (7 Abschn. 2.4.2 ),welches bereits
Andersen et al. 2000; B ehre et al. 2000) und ist da- zur Motilitätsbestimmung verwendet wurde.
her ein Maß für die Leistungsfähigkeit des Hodens 5 jakulatE mischen und Verdünnung mit Fixans
hinsichtlich der Spermienproduktion (MacLeod u. vorbereiten.
Wang 1979) und ein M aß für die Dur chgängigkeit 5 ämozytometerkammer
H beladen und den
der ableitenden Samenwege. Die Spermienkonzen- Spermien erlauben, sich in einer feuchten
tration, wovon Fertilisation und Schwangerschafts- Kammer anzuordnen.
raten abhängig sind, unterliegt Einflüssen wie dem 5 Probe
Die muss innerhalb von 10–15 Minuten
Volumen von Samenblasen- und Prostatasekret beurteilt werden (danach hat die Evaporisation
(Eliasson 1975) und ist daher kein spezifisches Maß einen merkbaren Effekt auf die Spermienposi-
für die testikuläre Funktion. tion in der Kammer).
5 indestens
M 200 Spermien pro Doppelbestim-
Kommentar mung zählen.
Die Bez eichnungen »Spermiengesamtzahl« und 5 ie beiden
D Doppelbestimmungen vergleichen,
»Spermienkonzentration« sind nicht synonym zu um festzustellen, ob die Differenz akzeptabel
verwenden. Die Spermienkonz entration bezieht ist. Wenn ja, wird die Berechnung fortgesetzt;
sich auf die Anzahl von Spermien pro Einheit Ejaku- wenn nicht, müssen 2 neue Verdünnungen
latvolumen und ist eine Funktion der Spermienzahl hergestellt werden.
und dem Volumen des sie umgebenden flüssigen 5 Konzentration
Die wird in Spermien pro ml
Anteils. Die Spermiengesamtzahl bezieht sich auf angegeben.
5 annDwird die Spermiengesamtzahl pro Ejaku-
lat errechnet.
2.7 • Spermienanzahl
33 2
1 2 3
4 5 6
7 8 9
. Abb. 2.7 Das Neubauer-improved-Hämozytometer. Abbildungen der Zählraster: 9 Rasterquadrate einer Kammer des Hä-
mozytometers (linkes Bild); das zentrale Rasterquadrat (Nummer 5) ist in 25 kleinere Rasterquadrate unterteilt (mittleres Bild);
eines der 25 Rasterquadrate (eingekreistes Quadrat im mittleren Bild) besteht wiederum aus 16 noch kleineren Quadraten
und ist außen durch 3 Linien begrenzt (rechtes Bild), hier in mikroskopischer Ansicht nach Spermienbefüllung der Kammer.
(Mikrobild mit freundlicher Genehmigung von C Brazil)
2.7.1 eVrschiedene Arten von Bestimmung niedr iger S permienkonzentrationen

Zählkammern können gr oßvolumige Z ählkammern n otwendig
werden (7 Abschn. 2.11.1»Durchführung«).
,
Empfohlen w ird d ie A nwendung e ines 1 00 µm
tiefen H ämozytometers. I n dies em M anual sind
Verdünnungsfaktoren für die Neubauer-improved- 2.7.2 Das
Neubauer-improved-
Zählkammer angegeben. Andere Tiefka mmer-Hä- Hämozytometer
mozytometer können verwendet werden, allerdings
sind Unterschiede im F assvolumen und R aster zu Das Neubauer-improved-Hämozytometer hat
beachten, die un terschiedliche V erdünnungsfak- zwei s eparate Z ählkammern, v on den en jede ein
toren f ür die B erechnung er fordern. Ein wegma- 3 × 3 mm g roßes m ikroskopisch s ichtbares R aster
terial z ur Bestimmung d er S permienkonzentra- auf der g läsernen Ob erfläche ein graviert ha t. Es
tion ist erhäl tlich (S eaman et al . 1996; M ahmoud wird mi t einem sp eziellen dic ken D eckglas b e-
et al. 1997; Brazil et al . 200 4b), allerdings können nutzt (Dicke Nummer 4, 0,4 4 mm), das üb er dem
die Er gebnisse im V ergleich zum N eubauer-im- Raster liegt und v on Glassäulen 0,1 mm über dem
proved-Hämozytometer abweichen. Flache Kam- Kammergrund gestützt wird. Jede Zählfläche ist in
mern, die mi ttels K appillarkraft b efüllt w erden, neun 1× 1 mm große Rasterquadrate unterteilt. Auf
können aufgrund von Strömungen unterschiedliche die Rasterquadrate wird mittels Nummerierung in
Verteilungsmuster der Spermien aufweisen (D ou- . Abb. 2.7 eingegangen.
glas-Hamilton et al. 2005a). Es ist möglich, einen Mit einer Tiefe von 100 µm fasst jedes der 9 grö-
Korrekturfaktor einzub ringen (D ouglas-Hamilton ßeren Rasterquadrate 100 nl. Vier dieser neun Ras-
et a l. 2 005a), a ber n icht empfehlenswert ( Björn- terquadrate (Nr. 1, 3, 7 und 9) bestehen aus 4 Reihen
dahl u. Barrat 2005). Die Validität der alternativen aus 4 Quadraten, von denen jedes 6,25 nl fasst; zwei
Zählkammern muss noch etabliert werden, indem Rasterquadrate (Nr. 4 und 6) bestehen aus 5 Reihen
die K ammerdimension ( 7 Abschn. 14.8 )über- aus 4 Quadra ten, v on denen jedes 5 nl fasst; das
prüft wird, die Er gebnisse mit dem N eubauer-im- zentrale Rasterquadrat (Nr. 5) ist mit 5 Reihen aus
proved-Hämozytometer abgeglichen wird und eine 5 Quadraten ausgestattet, von denen jedes 4 nl fasst
zufriedenstellende L eistung d urch eine ext erne (. Abb. 2.7, mittleres Bild). Jedes dieser 25 Quadrate
Qualitätskontrolle gesichert wird. Für eine exakte des zentralen Rasterquadrates (Nr. 5) ist wiederum
. Abb. 2.8 Welches Spermium in den Rasterquadraten gezählt werden sollte. Die mittlere der drei Linien definiert die
Grenze des Quadrates (schwarze Linie, linkes Bild). Alle Spermien im zentralen Quadrat werden gezählt, genauso wie die
Spermien, deren Köpfe zwischen den beiden inneren Linien liegen (weiße Kreise, linkes Bild); nicht gezählt werden die
Spermien, deren Köpfe zwischen den beiden äußeren Linien liegen (schwarze Kreise, linkes Bild). Ein Spermium mit dem
Großteil des Kopfes auf der mittleren Linie wird nur gezählt, wenn die Linie zum linken oder unteren Schenkel des Quadrates
gehört (weiße Kreise, mittleres Bild). Nicht gezählt werden Spermien, deren Kopf auf dem rechten oder oberen Schenkel des
Quadrates liegt (schwarze Kreise, rechtes Bild) (Mikroskopische Abbildungen mit freundlicher Genehmigung von C Brazil)
in 16 noch kleinere Quadrate unterteilt (. Abb. 2.7 , beiden inneren Linien liegt; nicht gezählt wird
rechtes B ild). A lso h aben d ie R asterquadrate 1, 2, es, wenn der Großteil des Kopfes zwischen den
3, 7, 8 und 9 jeweils 4 Reihen, die 25 nl pro Reihe beiden äußeren Linien liegt (. Abb. 2.8 ,linkes
fassen; wohingegen die R asterquadrate 4, 5 und 6 Bild).
jeweils 5 Reihen haben, die 20 nl pro Reihe fassen. 5 m zu U vermeiden, dass dasselbe Spermium bei
Abhängig v on der V erdünnung und der g e- aneinander grenzenden Quadraten doppelt ge-
zählten Spermienanzahl kommen unterschiedliche zählt wird, geht man folgendermaßen vor: Ein
Gebiete der Z ählkammer zur Anwendung, um die Spermium an der Grenzlinie zwischen zwei
Spermienkonzentration zu b estimmen. B ei einer Quadraten wird nur gezählt, wenn die Linie
Verdünnung von 1+ 19 (1:20) und 1+ 4 (1:5) wer- eine von zwei im rechten Winkel zu einander
den die Reihen des zen tralen R asterquadrates Nr. stehenden Grenzlinien ist; z.B. wird ein Sper-
5 ausgezählt, und falls nö tig, auch no ch v on R as- mium gezählt, wenn der Großteil des Kopfes
terquadrat Nr. 4 und 6 (7 Abschn. 2.8 ).Bei einer auf dem unteren oder linken mittleren Schen-
Verdünnung v on 1 + 1 (1:2) müssen g gf. alle neun kel des Quadrates liegt, also auf den Linien,
Rasterquadrate a usgezählt w erden, um a uf 200 die ein »L« bilden (. Abb. 2.8, mittleres Bild);
Spermien zu kommen (7 Abschn. 2.11.1 ). nicht gezählt wird es, wenn der Großteil des
Kopfes auf der oberen oder rechten mittleren
Grenzlinie liegt (. Abb. 2.8 ,rechtes Bild).
2.7.3 A
nwendung des Hämozytome-
ter-Rasters Anmerkung
Eine große Anzahl kopfloser Spermienschwänze (»pinheads«)
oder Spermienköpf e ohne S chwänze muss dokumentier t
5 ezählt
G werden nur intakte Spermien (mit werden. Falls nötig, kann die Konzentration genau wie bei der
Kopf und Schwanz). Spermienkonzentration bestimmt werden (7 Abschn. 2.8al-);
5 ein
ObSpermium gezählt wird, hängt von der ternativ kann im Nativpräparat die P rävalenz in Relation zur
Lokalisation des Kopfes ab; die Schwanzlage ist Spermienkonzentration bestimmt werden (7 Abschn. 2.17.6).
unwichtig. Die Grenze eines jeden Quadrates
ist durch die mittlere der drei Linien gekenn-
zeichnet; also wird ein Spermium gezählt,
wenn der Großteil des Kopfes zwischen den
2.7 • Spermienanzahl
35 2
Kasten 2.7 Fehler beim Bestimmen der Spermienzahl

Die Präzision der errechneten Sper- N±1,96×√N (oder N ± annähernd mien gezählt werden, liegt der SE
mienanzahl ist abhängig von der 2×√N). bei 20 (√400), und das 95% CI be-
Anzahl der gezählten Spermien. Bei Wenn 100 Spermien gezählt trägt 360–440 (400±40).
der Poisson-Verteilung entspricht werden, liegt der SE bei 10 (√100), Die Stichprobenfehler kann am
der Standardfehler (SE) einer Zäh- und das 95% CI beträgt 80–120 besten als Prozentzahl der Zählung
lung (N) seiner Quadratwurzel (√N), (100±20).Wenn 200 Spermien ge- angegeben werden: 100×(√N/N).
und das 95%-Konfidenzintervall zählt werden, liegt der SE bei 14 Die Prozentzahlen sind . Tab. 2.2 zu
(CI) für die Anzahl der Spermien (√200), und das 95% CI beträgt entnehmen.
im Ejakulatvolumen ist annähernd 172–228 (200±28).Wenn 400 Sper-
Pflege der Zählkammer

2.7.4 2.7.6 D
ie Notwendigkeit, eine
ausreichende Anzahl an
Die Hämozytometer-Zählkammern dürfen nur mit Spermien zu zählen
speziellen dicken Deckgläsern angewendet werden
(Dicke Nummer 4, 0,44 mm). Um S tichprobenfehler zu r eduzieren, m uss eine
5 Hämozytometerkammer
Die und das Deckglas gewisse Anzahl a n S permien g ezählt w erden (a m
werden nach Gebrauch mit Wasser gereinigt besten eine G esamtzahl v on mindest ens 400 a us
und anschließend mit einem Papiertuch gut Doppelbestimmungen von annähernd 200), 7 Kas-
abgetrocknet, weil jedes getrocknete Residuum ten 2.7 und . Tab. 2.2 .
die erneute Beladung behindern kann. Wenn Anmerkung
die Rasteroberfläche gründlich abgerieben Die Werte sind alle Ungefährangaben, da die Konfidenzinter-
wird, bleiben keine Spermienreste von der vor- valle nicht immer symmetrisch um die S chätzwerte verteilt
herigen Probe zurück. sind. Die exakten 95%-Konfidenzintervalle, basierend auf der
Poisson-Verteilung, betragen 361–441bei einer Zählung von
5 iederverwendbare
W Kammern und Deckglä-
400; 81,4–121 bei einer Zählung von 100; 4,80–18,4 bei einer
ser werden über Nacht in Desinfektionslösung Zählung von 10; 0,03–5,57 bei einer Zählung von 1; und 0,00–
eingeweicht (7 Abschn. 2.4 ),um eine Kontami- 3,70 bei einer Zählung von 0.
nation mit potenziell infektiösen Bestandteilen
des Ejakulats zu vermeiden. Kommentar
Wenn zu w enige Spermien ausgezählt w erden, er-
hält man ein unsicher es Ergebnis ( 7 Abschn. 4.1
1 ,)
2.7.5Diluen
t zur Ejakulatverdünnung wodurch sich Konsequenz en für die Diag nose und
Therapie er geben können ( 7 Abschn. 14.2 Das ).
. 1 0 g5Natriumbikarbonat (NaHCO3) und 10 ml kann unvermeidbar sein, wenn Spermien für einen
35%iges (Volumen/Volumen) Formalin werden therapeutischen Z weck benötigt w erden und die
in 1000 ml Aqua dest. aufgelöst. Spermienanzahl sehr gering ist (7 Abschn. 5.1).
2. allsF gewünscht, 0,25 g Trypanblau (Farbindex
23859) oder 5 ml gesättigtes (>4 mg/ml) Gen- Kommentar
tianaviolett (Farbindex 42555) hinzufügen, um Wenn das Ejakulat volumen gering ist und w eniger
die Spermienköpfe farblich besser hervorzu- Spermien als empfohlen ausgezählt werden, ist die
heben. Präzision des erhalt enen Wertes signifikant niedri-
3. agerung
L bei 4 °C. Falls sich Kristalle bil- ger. Wenn w eniger als 200 Spermien pr o Doppel-
den, die Lösung vor Gebrauch durch einen bestimmung ausgezählt w erden, muss der Stich-
0,45-µm-Filter passieren. probenfehler wie in . Tab. 2.2 angegeben werden.
. Tab. 2.2 Gerundete Stichprobenfehler (%) in . Tab. 2.2 Fortsetzung

Bezug auf die Anzahl gezählter Spermien
Gesamtzahl (N) Stichprobenfehler
2 Gesamtzahl (N) Stichprobenfehler
(%)
(%)
350 5,3
1 010
400 5
2 70,7
450 4,7
3 57,7
500 4,5
4 50
5 44,7
6 40,8 2.8 Routine

-Zählverfahren
7 37,8
8 35,4 Die Verdünnungen 1 + 4 (1:5) und 1+ 19 (1:20) sind

für unterschiedliche Spermienkonzentrationen bis
9 33,3
zu einer Anzahl v on 200 S permien in einem o der
10 31,6 allen der Rasterquadrate 4, 5 und 6 des Hämozyto-
15 25,8 meters geeignet (. Tab. 2.3 und 7 Kasten 2.8 ).
20 2 ,4 Anmerkung
Diese errechneten Konzentrationen können nur grobe Schät-
25 20
zungen sein, da nur sehr w enige Spermien ausgezählt w er-
30 18,3 den und die Volumenbestimmung nicht exakt sein könnt e.
Die Konzentrationen, die man aus unverdünnten Präparaten
35 16,9 bestimmt, schwanken im Vergleich zu den Konz entrationen
40 15,8 zwischen 30% und 130%, die man aus einererdünnten
v Probe
in einer Zählkammer erhält.
45 14,9
50 14,1
55 13,5
2.8.1e
Bstimmung der erforderlichen
60 12,9 Verdünnung
65 12,4
0
7 21
Die V erdünnung der E jakulatprobe, die f ür eine
exakte Messung der Spermienanzahl nötig ist, wird
75 11,5
mittels eines unverdünnten Ejakulatausstriches er-
80 11,2 mittelt. Hierbei handelt es sic h normalerweise um
85 10,8 das Nativpräparat (7 Abschn. 2.4.2 ),welches bereits
für die Motilitätsbeurteilung verwendet wurde.
90 10,5
5 ntersucht
U wird eines der Nativpräparate
95 10,3 (Herstellung wie in 7 Abschn. 2.4.2 ),um die
100 10 Anzahl der Spermien pro HPF bei 200- oder
400facher Vergrößerung abzuschätzen.
150 8,2
5 HPF
Ein entspricht ungefähr 16 nl bei 200fa-
200 7,1 cher Vergrößerung oder 4 nl bei 400facher
250 6,3 Vergrößerung (7 Kasten 2.9 ).
300 5,8
5 ennWSpermien zu erkennen sind, werden
diese gezählt, dann wird die notwendige Ver-
2.8 • Routine-Zählverfahren
37 2
Kasten 2.8 Wie 200 Spermien pro Doppelbestimmung in den zentralen 3 Rasterquadraten des
Neubauer-improved-Hämozytometer erreicht werden
Bei 100 Spermien pro Hauptge- die Probe 1+ 4 (1:5)verdünnt wird, zentralem Rasterquadrat. Bei einer
sichtsfeld (HPF) auf 4 nl (7 Kas- wird der Hintergrund reduziert und empfohlenen Verdünnung von 1 + 1
ten 2.9) im Nativpräparat ergibt sich die Spermienanzahl sinkt auf eine (1:2) wird der Hintergrund reduziert
eine theoretische Menge von 25 Menge von 500 pro Rasterquadrat, und die Spermienanzahl sinkt auf
Spermien pro nl (25.000 pro µl oder so dass sich immer noch ein akzep- 125 pro Rasterquadrat; das ergibt
25.000.000 pro ml). Da das zentrale tabel niedriger Stichprobenzähler eine Summe von 375 in allen 3
Rasterquadrat (Nr. 5) der Neubau- ergibt. Rasterquadraten (Nr. 4, 5 und 6), so
er-improved-Zählkammer 100 nl Bei nur 10 Spermien pro HPF dass man ebenfalls einen akzep-
fasst, ergibt sich eine errechnete im Nativpräparat ergibt sich eine tabel niedrigen Stichprobenfehler
Spermienanzahl von 25.000. Wenn Menge von 2,5 pro nl und 250 pro erhält.
Kasten 2.9 Volumen pro Hauptgesichtsfeld von einem 20 μm tiefen Nativpräparat
Das
Ejakulatvolumen pro mikro- ser der Okularlinsenöffnung durch trägt 4.064.962 µm2 oder ungefähr
skopischem Blickfeld ist abhängig die Vergrößerung der Objektivlinse 4 nl.
von der Fläche des Blickfeldes (πr2, geteilt wird. Bei einer 20fachen Objektiv-
wobei π ungefähr 3,142 beträgt und Bei einer 40fachen Objektiv- vergrößerung und einer 10fachen
r der Radius des mikroskopischen vergrößerung und einer 10fachen Okularvergrößerung bei einer
Blickfeldes ist) und der Kammer- Okularvergrößerung mit einer Öffnung von 20 mm ergibt sich ein
tiefe (20,7 μm im Nativpräparat). Der Öffnung von 20 mm ergibt sich ein Blickfelddurchmesser von ungefähr
Durchmesser des mikroskopischen Blickfelddurchmesser von ungefähr 1.000 μm (20 mm/20). In diesem
Blickfeldes kann mit einem Objekt- 500 μm (20 mm/40). In diesem Fall Falle ist r = 500 µm, r2= 250.000 µm2,
mikrometer gemessen oder errech- ist r = 250 µm, r2= 62.500 µm2, πr2= πr2 = 785.500 µm2 und dasVolumen
net werden, indem der Durchmes- 196.375 µm2 und dasVolumen be- beträgt 16.259.850 µm2 oder 16 nl.
dünnung gewählt (. Tab. 2.3) und danach wie Anmerkung

in 7 Abschn. 2.8.2 fortgefahren. Bei zu wenigen Spermien pro Blickfeld in der gewählten Ver-
dünnung muss ein zweites Präparat in einer niedrigeren Ver-
5 ennWkeine Spermien zu erkennen sind, wird dünnung angef ertigt w erden. Bei zu vielen überlappenden
die zweite Doppelbestimmung des Nativpräpa- Spermien pro Blickfeld in der gewählt en Verdünnung muss
rates untersucht. Wenn erneut keine Spermien ein neues Präparat in höherer Verdünnung angefertigt wer-
zu finden sind, wird wie in 7 Abschn. 2.9 vor- den.
gegangen.
Anmerkung
Wenn eine 1 + 19(1:20)-Verdünnung nicht ausr eichend ist,
Anmerkung
muss eine 1+ 40(1:50)-Verdünnung hergestellt werden.
Leukozyten-Pipetten und aut omatische P ipetten, die auf
Luftverdrängung b asieren ( »Air-displacement-Pipetten«)
sind zu ungenau für v olumetrische Verdünnungen v on vis-
kösem Ejakulat, daher sollt en nur »P ositive-displacement- Kommentar
Pipetten« (dire kt verdrängendes Dosiersystem) verwendet Bei niedriger Spermienanzahl im erst en Nativprä-
werden. parat ( <4 pro HPF bei 400facher Vergrößerung: ca.
6/ml) ist eine exakt e Angabe der Spermienan-
1 × 10
Anmerkung
zahl eventuell nicht nötig (7 Abschn. 2.10).
Für diagnostische Zwecke sollte das zu analy sierende Ejaku-
latvolumen 50 µl nicht unterschreiten, um Pipettierfehler zu
vermeiden, die bei geringen Volumina auftreten.
. Tab. 2.3 Benötigte Verdünnungen und ihre Herstellung, empfohlene Zählkammern und zu zählende Rasterquad-
rate
2 Spermien pro
Blickfeld bei
Spermien pro
Blickfeld bei
Notwendige
Verdünnung
Ejakulat (μl) Diluent (μl) Kammer Zu zählende
Rasterquad-
400facher 200facher Ver- rate
Vergrößerung größerung
> 101 > 404 1:20(1+ 19) 50 950 Neubauer Nr. 5, 4, 6

improved
16–100 64–100 1:5(1+ 4) 50 200 Neubauer Nr. 5, 4, 6

improved
2–15 8–60 1:2(1+ 1) 50 50 Neubauer Nr. 5, 4, 6

improved
<2 <8 1:2(1+ 1) 50 50 Neubauer Alle9 Raster-

improved quadrate oder
oder andere den ganzen
großvolumi- Objektträger
ge Kammer
Kommentar 5 jakulat
E gut mischen.
Für eine exakt e Bestimmung geringer Spermien- 5 ewünschtes
G Ejakulatvolumen sofort nach
konzentrationen ( <2 pro HPF bei 400facher Vergrö- dem Mischen aspirieren, sodass sich keine
ßerung: ca. 0,5 × 106/ml) müssen alle 9 R asterquad- Spermien außerhalb der Suspension absetzen
rate der Neubauer-impro ved-Kammer ausgezählt (. Tab. 2.3 ).
werden (7 Abschn. 2.11.1 oder
) es muss eine groß- 5 jakulat
E außen von der Pipettenspitze wischen,
volumige Ein wegkammer mit F luoreszenzdetek- ohne die Pipettenöffnung zu berühren.
tion verwendet werden. 5 Ejakulatmenge
Die in das Diluent abgeben
und dabei die Pipettenspitze durch Aspiration
und Exprimierung des Fixans durchspülen.
2.8.2o
Vrbereitung der Verdünnungen 5 jakulat
E erneut gut mischen und 2. Verdün-
und Beladung der nung für Doppelbestimmung anfertigen, dann
Hämozytometerkammer wie oben beschrieben fortfahren.
5 erste
Die Verdünnung gründlich mittels Vorte-
5 Hämozytometeroberfl
Die äche wird durch xen für 10 Sekunden bei maximaler Geschwin-
Anhauchen leicht befeuchtet. digkeit mischen. Dann sofort ungefähr 10 μl
5 s Deckglas
Da auf der Zählkammer sichern, der fixierten Suspension entnehmen, um ein
indem es fest auf die Kammersäulen gedrückt Absetzen der Spermien zu verhindern.
wird. Irisierender Glanz (Newton-Ringe) zwi- 5 Pipettenspitze
Die berührt vorsichtig die unte-
schen den 2 Gläsern bestätigt die richtige Posi- re Kante einer der Zählkammern im Bereich
tion des Deckglases. Je mehr Newton-Ringe der V-förmigen Kerbe.
zu erkennen sind, desto besser der Halt; wenn 5 angsam
L den Kolben der Pipette drücken,
nur ein oder zwei Ringe zu erkennen sind, damit die Kammer durch Kapillarkraft befüllt
kann das auf Probleme von Unterschieden in wird. Das Deckglas sollte während der Befül-
der Kammertiefe hinweisen. lung nicht bewegt werden, damit die Kammer
5 ositive-displacement-Pipette
P benutzen, um weder überfüllt wird (wenn das Deckglas sich
die Abgabe der korrekten Menge an Diluent in zu bewegen scheint), noch zu wenig befüllt wird
2 Verdünnungsfläschchen zu gewährleisten. (wenn Luft einen Teil der Kammer besetzt).
39 2
5 2.Die
Verdünnung wie oben beschrieben mi- Rasterquadrat (Nr. 5 in . Abb. 2.7) Reihe für
schen und 10 μl für die Doppelbestimmung Reihe beurteilen.
entnehmen, um die 2. Zählkammer des Hämo- 5 ortfahren,
F bis mindestens 200 Spermien
zytometers wie oben beschrieben zu füllen. gesichtet wurden und eine komplette Reihe
5 as Hämozytometer
D horizontal für mindes- (aus 5 größeren Teilquadraten) ausgezählt
tens 4 Minuten bei Raumtemperatur in einer wurde. Es müssen immer komplette Reihen
Feuchtkammer (z.B. nasses Filterpapier in ausgezählt werden, niemals in der Mitte einer
einer abgedeckten Petrischale) lagern, um ein Reihe auἀ ören. Wenn keine 200 Spermien in
Austrocknen zu verhindern. Die immobilisier- allen 5 Reihen des zentralen Rasterquadrates
ten Zellen werden in dieser Zeit auf das Raster gesichtet werden können, muss in den Reihen
sedimentieren. (bestehend aus 4 größeren Teilquadraten) von
den angrenzenden Rasterquadraten (Nr. 4 und
Anmerkung 6 in . Abb. 2.7 )weitergezählt werden.
Manche Zählk ammern sind mit M attglas-Säulen ausgestat-
5 Zahl
Die der ausgezählten Reihen bis zum Er-
tet, bei denen keine Newton-Ringe zu erkennen sind. In die-
sem Fall müssen die Säulen mit ca. 1,5 µl Wasser befeuchtet
reichen von 200 Spermien muss dokumentiert
werden, damit das Deckglas gut anhaf ten kann (Brazil et al . werden, und die gleiche Anzahl an Reihen in
2004a); es muss aber darauf geachtet werden, dass kein Was- der anderen Kammer des Hämozytometers
ser in die Zählkammer gelangt. ausgezählt werden.
5 ahl Z
der Spermien und ausgezählten Reihen
Anmerkung
mit Hilfe eines Laborcounters festhalten.
Die An wendung v on Hämo zytometer-Klammern, um das
Deckglas in Position zu halten, sorgt für eine konstante Tiefe 5 uwendung
Z zur 2. Zählkammer des Hämozy-
(Christensen et al. 2005). tometers und Doppelbestimmung in derselben
Zahl an Reihen (gleiches Volumen) wie bei der
Anmerkung ersten Probe, auch wenn nicht 200 Spermien
Bei sehr viskösen P roben k ann das Ejakulat in der Verdün- erreicht werden.
nungslösung aggregieren, wenn man 5–10 Sekunden zu spät
mischt. In diesem Fall muss die verdünnte Probe sofort nach
5 umme S und Differenz der beiden Ergebnisse
der Zugabe des Ejakulats in das F ixans für 10 Sekunden mit- errechnen.
tels Vortexen gemischt werden. 5 rmitteln,
E ob die Differenz akzeptabel ist,
mittels . Tab. 2.4 oder . Abb. 14.1(dort wird
die maximale Differenz zwischen 2 Zählungen
dargestellt, die in 95% der Proben nur wegen
2.8.3e
Bstimmung der Spermienzahl des Stichprobenfehlers zu erwarten ist).
in den Zählkammern 5 ennWdie Differenz akzeptabel ist, wird die
Konzentration errechnet (7 Abschn. 2.8.4 ).
Die S permienzahl s ollte i n b eiden K ammern d es Wenn die Differenz zu groß ist, müssen zwei
Hämozytometers b estimmt w erden. W enn b ei- neue Verdünnungen, wie in 7 Abschn. 2.8.2
de W erte a usreichend üb ereinstimmen, gil t die beschrieben, vorbereitet werden und die Zäh-
Probe als r epräsentativ f ür das ga nze E jakulat lungen wiederholt werden (7 Kasten 2.10 ).
(7 Abschn. 2.4.1 ). 5 urchschnitt
D der Spermienkonzentration bis
5 eurteilung
B des Hämozytometers unter dem auf eine Stelle nach dem Komma runden.
Phasenkontrastmikroskop bei 200- oder 5 permiengesamtzahl
S pro Ejakulat errechnen
400fac her Vergrößerung. (7 Abschn. 2.8.7 ).
5 indestens
mung auszählen, um einen akzeptabel niedri- Anmerkung
Wenn w eniger als 200 Spermien in den R asterquadraten 4,
gen Stichprobenfehler zu erhalten (7 Kasten 2.7
5 und 6 gesicht et werden, dar f nicht in den Quadrat en 1, 2,
und . Tab. 2.2 ). 3, 7, 8 oder 9 weitergezählt werden, da sich das Volumen je-
5 uerst Z in der einen Zählkammer des Neu- der Reihe in diesen Quadraten von den Rasterquadraten 4, 5
bauer- improved-Hämozytometers das zentrale und 6 unterscheidet (7 Abschn. 2.7.2In).diesem Fall müssen
Anmerkung
. Tab. 2.4 Akz
eptable Differenz zwischen zwei Selten können bei einer sehr inhomogenen P robe selbst
Doppelbestimmungen für eine gegebene Summe nach einer 3. Doppelbestimmung nicht akz eptable Unt er-
schiede auf treten. I n diesem F all muss der M ittelwert aus
2 Summe Akzeptable Differenz*
allen ausgezählt en P roben ermitt elt und der Vorfall doku-
144–156 42 mentiert werden.
157–16
9 25
170–182 26
e
Brechnung der Spermienkon-
2.8.4
183–1
96 27 zentration im Ejakulat
97–211
1 28
Es wird vorgeschlagen, die Spermienkonzentration
212–2
26 29
zu errechnen und zu do kumentieren. Obwohl die
2 7–242 30 Konzentration k ein sp ezifisches M aß f ür die H o-
423–258 31 denfunktion ist, st eht sie denno ch in Rela tion zu
Fertilisation und Schwangerschaftsraten.
25
9–274 32
Die Konzentration er gibt sic h a us der Anzahl
275–292 33 der S permien (N) g eteilt d urch das V olumen, in
293–309 34 dem sie g efunden wur den; d .h. das V olumen der
310–328 35
Anzahl der ausgezählten Reihen (n) der untersuch-
ten D oppelbestimmungen (je weils 20 nl in jedem
329–346 36 Rasterquadrat Nr. 4, 5 und 6) multipliziert mit dem
347–366 37 Verdünnungsfaktor. So ergibt sich C = (N/n)×(1/20)
367–385 38 × Verdünnungsfaktor.
Bei einer 1 + 4(1:5)-Verdünnung, b ei der die
386–406 39
Rasterquadrate 4, 5 und 6 ausgezählt wurden, erhält
407–426 40 man eine K onzentration v on C = (N/n)×(1/20)×5
427–448 41 Spermien p ro n l = (N/n)×(1/4) S permien p ro nl
(oder 106 pro ml Ejakulat).
449–470 41
Bei einer 1 + 19(1:20)-Verdünnung, b ei der die
47
1–492 43 Rasterquadrate 4, 5 und 6 ausgezählt wurden, erhält
493–515 44 man eine Konzentration von C = (N/n)×(1/20)×20
Spermien pro nl = (N/n) Spermien pro nl (oder 106
516–538 45
pro ml Ejakulat).
539–562 46 Bei einer 1+ 49(1:50)-Verdünnung, bei der die
563–587 47 Rasterquadrate 4, 5 und 6 ausgezählt wurden, erhält
* Basierend auf dem gerundeten 95%-Konfidenzinter-
man eine Konzentration von C = (N/n)×(1/20)×50
vall. Spermien pro nl = (N/n)×2,5 Spermien pro nl (oder
106 pro ml Ejakulat).
zwei niedriger e Verdünnungen angesetzt und ausgezählt

werden. Falls eine 1+ 1(1:2)-Verdünnung notwendig wird, wie 2.8.5 e
Brechnungsbeispiele
in 7 Abschn. 2.11 fortfahren.
Beispiel 1: B ei einer 1 + 19(1:20)-Verdünnung ent-

Anmerkung
Eine K ammer z weimal auszählen oder beide K ammern mit
hält die 1. D oppelbestimmung 201 Spermien in 7
einer Probe aus einer einzigenVerdünnung befüllen gilt nicht Reihen und die 2. D oppelbestimmung 2 45 Sper-
als echt e Wiederholungsprobe, da so kein Stichpr obenfeh- mien in 7 Reihen. Die S umme (201 + 245) beider
ler, Mischfehler oder Verdünnungsfehler ausfindig gemacht Werte er gibt 4 46 in 1 4 Reihen und die Differenz
werden kann.
(245-201) beträgt 4 4. A us . Tab. 2.4 geh t hervor,
41 2
Kasten 2.10 Vergleich der Doppelbestimmungen

DerUnterschied zwischen zwei Größere Differenzen weisen aus den zwei ähnlichsten Werten
unabhängigen Zählungen liegt auf einen Zähl- oder Pipettierfehler ermitteln.)
erwartungsgemäß bei Null mit hin oder können durch ein schlecht Diebeschriebene Anleitung
einer Standardabweichung gleich gemischtes Ejakulat bedingt sein, gilt für die Auszählung von Sper-
der Quadratwurzel aus der Sum- wodurch es zu ungleichmäßigen mien und Peroxidase-positiven
me der beiden Zählungen. Daher Verteilungen in der Zählkammer Zellen (7 Abschn. 2.18). Für die
sollte allein zufallsbedingt (N1-N2)/ oder auf dem Objektträger kommt. Zählung von CD45-positiven Zel-
[√(N1+N2)]<1,96 sein, um eine Wenn die Differenz größer als len (7 Abschn. 3.2) und unreifen
95%-Konfidenzgrenze einhalten zu akzeptabel ist, müssen die ersten Keimzellen (7 Abschn. 2.19 sollten
)
können. beiden Werte verworfen werden bereits gefärbte Präparate verwen-
Wenn die Differenz kleiner ist und zwei neue Ejakulatverdünnun- det werden.
oder dem angegebenen Wert aus gen hergestellt und ausgezählt Mit diesen 95%-Konfidenzinter-
. Tab. 2.4 oder 2.5 entspricht, kann werden. (Keine 3. Probe auszählen vall-Grenzwerten werden ungefähr
die Schätzung akzeptiert und die und den Mittelwert aus den 3 Wer- 5% der Doppelbestimmungen
Konzentration aus dem Mittelwert ten ermitteln oder den Mittelwert zufallsbedingt außerhalb der er-
errechnet werden. laubten Grenze liegen.
dass dieser Wert den er warteten nur durch Zufall Spermien in 15 Reihen (Rasterquadrate 5, 4 und 6).
bedingten U nterschied (4 1) üb erschreitet. D aher Die Summe (98 + 114) beider Werte ergibt 212 in 30
müssen zwei neue Verdünnungspräparate angelegt Reihen und die Differenz (114-98) b eträgt 16. Aus
werden. . Tab. 2.4 geht hervor, dass dieser Wert geringer ist
Beispiel 2: B ei einer 1 + 19(1:20)-Verdünnung als der nur durch Zufall bedingte Unterschied (29).
enthält die 1. Doppelbestimmung 220 Spermien in Also können die Werte akzeptiert werden.
4 Reihen und die 2. D oppelbestimmung 218 Sper- Die K onzentration der D oppelbestimmung
mien in 4 Reihen. Die S umme (220 + 218) beider mit einer 1 + 19(1:20)-Verdünnung b eträgt C =
Werte er gibt 438 in 8 Reihen und die Differenz (N/n)×1,0 Spermien pro nl, d. h. (212/30)×1,0= 7,07
(220-218) beträgt 2. Aus . Tab. 2.4 geht hervor, dass Spermien/nl oder 7,1 × 106 S permien p ro ml E ja-
dieser Wert g eringer ist als der n ur d urch Z ufall kulat (a uf 1 S telle nac h dem K omma g erundet).
bedingte Unterschied (41). Also können die Werte Da w eniger als 400 S permien g ezählt wur den,
akzeptiert werden. muss der S tichprobenfehler f ür 2 12 Spermien a us
Die K onzentration der D oppelbestimmung . Tab. 2.2 angegeben werden (ungefähr 7%).
mit einer 1 + 19(1:20)-Verdünnung b eträgt C = Anmerkung
(N/n)×1,0 Spermien pro nl, d. h. (438/8)×1,0= 54,75 In diesem Beispiel wur de die P robe zu hoch v erdünnt, da
Spermien/nl oder 55 × 106 Spermien pro ml Ejaku- weniger als 200 Spermien in den Rasterquadraten 5, 4 und
lat (auf 1 Stelle nach dem Komma gerundet). 6 gefunden wur den; eine 1 + 4(1:5)-Verdünnung wäre geeig-
neter gewesen.
Anmerkung
Bei 1+ 19(1:20)-Verdünnungen und den ausgezählt en Raster- Beispiel 4: Bei einer 1 + 4(1:5)-Verdünnung enthält
quadraten 4, 5 und 6 ist die Konz entration leicht zu err ech- die 1. Doppelbestimmung 224 Spermien in 4 Rei-
nen. Die Anzahl der gezählten Spermien geteilt durch die An- hen u nd d ie 2. D oppelbestimmung 268 Spermien
zahl aller beur teilten Reihen er gibt die Spermienkonz entra-
in 4 Reihen. Die Summe (224 + 268) beider Werte
tion in 106/ml. Im Beispiel oben ist der Rechenweg (220 + 218)/
(4 + 4)= 438/8= 55 × 10 6 Spermien/ml Ejakulat. ergibt 492 in 8 Reihen und die Differenz (268-224)
beträgt 44. Aus . Tab. 2.4 geht hervor, dass dies er
Beispiel 3: B ei einer 1 + 19(1:20)-Verdünnung ent- Wert den er warteten n ur d urch Z ufall b edingten
hält die 1. D oppelbestimmung (r eplicate 1) 98 Unterschied (43) überschreitet. Daher müssen zwei
Spermien in 1 5 Reihen (R asterquadrate 5, 4 und neue Verdünnungspräparate angelegt werden.
6) und die 2. D oppelbestimmung (replicate 2) 114
Beispiel 5: Bei einer 1+ 4(1:5)-Verdünnung ent- 2.8.8 Un

terer Referenzwert für die
hält die 1. D oppelbestimmung 224 S permien in 8 Spermiengesamtzahl
Reihen und die 2. D oppelbestimmung 2 13 S per-
2 mien in 8 Reihen. Die S umme (22 4 + 213) beider Der untere Referenzwert für die S permiengesamt-
Werte er gibt 437 in 16 Reihen und die Differenz zahl liegt bei 39 × 106 Spermien/Ejakulat (5. Perzen-
(224-213) beträgt 11. Aus . Tab. 2.4 geht hervor, dass tile, 95% CI 33-46 × 10 6 ).
dieser Wert g eringer ist als der n ur d urch Z ufall
bedingte Unterschied (41). Also können die Werte
akzeptiert werden. 2.9 NiedrigeSpermienzahl:
Die Konzentration der Doppelbestimmung mit Kryptozoospermie und
einer 1+ 4(1:5)-Verdünnung beträgt C = (N/n)×(1/4) vermutete Azoospermie
Spermien pro nl o der (437/16)/4= 6,825 Spermien/
nl oder 6,8 × 106 S permien p ro ml E jakulat (auf 1 Wenn k eine S permien in b eiden N ativpräparaten
Stelle nach dem Komma gerundet). gefunden werden können, kann eine Azoospermie
Anmerkung vermutet w erden. Ob wohl v orgeschlagen wur de,
Bei 1+ 4(1:5)-Verdünnungen ist die Konzentration auch leicht die D efinition zu ä ndern (S harif 2000; Ezeh u .
zu erre chnen, aber die Anzahl der gezählt en Spermien ge - Moore 2001), bleibt der Begriff »Azoospermie« eine
teilt dur ch die Anzahl aller beur teilten Reihen muss noch Beschreibung des Ejakulates, anstatt eine Erklärung
zusätzlich dur ch 4 get eilt w erden. I m Beispiel oben ist der
des U rsprungs o der eine B asis f ür Diagnos e und
Rechenweg [(224 + 213)/(8 + 8)]/4 = (437/16)/4= 27,3/4= 6,8 × 106
Spermien/ml Ejakulat. Therapie. Es wir d allg emein a nerkannt, dass der
Begriff »Azoospermie« nur verwendet wird, wenn
keine Spermien im S ediment einer zentrifugierten
Probe gefunden werden (Eliasson 1981).
2.8.6Un
terer Referenzwert für die Es sollte jedoch beachtet werden,
Spermienkonzentration 5 Spermien
ob im Pellet gefunden werden oder
nicht, von der Zentrifugationszeit und -ge-
Der untere Referenzwert für die Spermienkonzen- schwindigkeit abhängt (Lindsay et al. 1995;
tration liegt bei 15 × 106 Spermien/ml (5. Perzentile, Jaffe et al. 1998) und davon, wie gründlich das
95% CI 12–16 × 10 6 ). Pellet untersucht wird,
5 die
dassZentrifugation bei 3000 g für 15 Minu-
ten nicht alle Spermien aus einer Probe pelle-
2.8.7 e
Brechnung der tiert (Corea et al. 2005) und
Spermiengesamtzahl im Ejakulat 5 nach
dass der Zentrifugation die Motilität ver-
loren gehen (Mortimer 1994a) und die Kon-
Es wird vorgeschlagen, die Spermiengesamtzahl zu zentration unterschätzt werden kann (Cooper
errechnen und zu do kumentieren, da sie ein M aß et al. 2006).
für die Leistungsfähigkeit des Hodens Spermien zu
produzieren und für die Durchgängigkeit der ablei- Wie mit einer Probe umgegangen wird, ist abhän-
tenden Samenwege ist. Man errechnet die Gesamt- gig davon, ob bloße subjektive Daten über das Vor-
zahl durch Multiplikation der Spermienkonzentra- handensein und zur M otilität v on S permien a us-
tion mit dem Gesamtvolumen des Ejakulates. reichend sind, oder ob eine exakte Bestimmung der
Spermienzahl benötigt wird (7 Abschn. 2.11 ).
2.10 • Wenn eine exakte Bestimmung einer niedrigen Spermienzahl nicht notwendig ist
43 2
2.10 Wenn eine exakte Bestimmung 5 en gesamten
D Objektträger systematisch Ge-
einer niedrigen Spermienzahl sichtsfeld für Gesichtsfeld durchsuchen. In
nicht notwendig ist einer Ecke beginnen und entlang der X-Achse
zur gegenüberliegenden Seite weitergehen;
Wenn die S permienanzahl p ro HPF im ini tialen dann ein Feld in Richtung Y-Achse bewegen
Nativpräparat niedr ig ist (0–4 S permien pro HPF und die gesamte X-Achse zurück durchsuchen.
bei 400fac her Vergrößerung oder 0–16 b ei 200fa- In diesem Zick-Zack-Verfahren fortfahren, um
cher Vergrößerung), gib t es mehr ere M öglichkei- das gesamte Aliquot komplett und systema-
ten. tisch abzusuchen (. Abb. 2.9). Mit den Augen
auf dem Objektträger bleiben, wenn das Ge-
sichtsfeld gewechselt wird.
2.10.1e
Kine weiteren Maßnahmen 5 ei einer
B 20fachen Objektivvergrößerung und
ergreifen einer 10fachen Okularvergrößerung mit einer
20 mm Öffnung hat das mikroskopische Ge-
Bei weniger als 4 Spermien pro HPF bei 400fac her sichtsfeld einen Durchmesser von ungefähr
Vergrößerung (z.B. <1 × 106/ml) ist es für den klini- 1000 μm (7 Kasten 2.9 ).So müssen ungefähr
schen Gebrauch in den meisten Fällen ausreichend, 484 Gesichtsfelder (22 × 22)pro 22 × 22 mm
die Spermienkonzentration als <2 × 106 /ml anzuge- Deckglas untersucht werden.
ben (unter B erücksichtigung des ho hen Stichpro- 5 as Vorhandensein
D von Spermien in einer der
benfehlers bei niedriger Spermienanzahl) und zu beiden Doppelbestimmungen zeigt eine Kryp-
dokumentieren, ob motile Spermien gesehen wur- tozoospermie an.
den oder nicht. 5 Abwesenheit
Die von Spermien in beiden
Doppelbestimmungen lässt eine Azoospermie
vermuten.
2.10.2Un
tersuchung von
zentrifugierten Proben, um Anmerkung
Viele Tischzentrifugen, die 15-ml-Röhrchen fassen, err eichen
Spermien zu finden
nicht 3000 G; daher muss eine Hochgesch windigkeitszentri-
fuge benutzt werden, die 1,5–2,0-ml-Röhrchen fasst. Das Eja-
Wenn k eine S permien in b eiden N ativpräparaten kulat muss vor Aliquot-Entnahme gut gemischt worden sein.
gefunden w erden, ka nn das E jakulat zentrifugiert
werden, um zu beurteilen, ob überhaupt Spermien Anmerkung
in einer größeren Probe vorhanden sind. Das Dur chsuchen der Objektträger k ann bis zu 10 M inuten
dauern, da die Proben einen starken Hintergrund haben wer-
5 jakulat E gut mischen (7 Kasten 2.3 ).Wenn die
den.
Probe viskös ist, muss die Viskosität zunächst
reduziert werden wie in 7 Abschn. 2.3.1 Verzö-
, Anmerkung
gerte Liquifizierung beschrieben. Bei der Z entrifugation von Proben für die assistier te Repro-
5 1 ml Ejakulat entnehmen und bei 3000 g für 15 duktion k ann es nötig w erden, die gesamt e Ejakulatpr obe
Minuten zentrifugieren. und den g rößten Anteil des Pellets zu unt ersuchen (z.B. vier
10-µl-Aliquots des Pellets), um Spermien zu finden.
5 en Überstand
D abnehmen und das Spermien-
Pellet in den ungefähr 50 μl des verbleibenden
Seminalplasmas resuspendieren. Kommentar
5 eweils J 10 μl des Pellets auf jeden der 2 Objekt- Das F ehlen bew eglicher Spermien im unt ersuch-
träger geben und mit einem 22 × 22 mm Deck- ten Aliquot muss nicht unbedingt bedeut en, dass
glas abdecken. So entstehen 2 Nativpräparate nirgendwo im Ejakulat bew egliche Spermien v or-
von 20 μm Tiefe (7 Kasten 2.4 ). handen sind.
5 eideBObjektträger unter dem Phasenkontrast-
mikroskop bei 200- oder 250facher Vergröße-
rung untersuchen.
50 mm / 1000 μm = 50 Felder
24 mm / 1000 μm
= 24 Felder
1200 Gesamtfelder
. Abb. 2.9 Den gesamten Objektträger nach motilen Spermien absuchen. Dieses umfasst eine Untersuchung von 1200
HPF bei 200facher Vergrößerung bei einem 24 × 50 mm Deckglas, und ungefähr 484 HPF bei 200facher Vergrößerung bei
einem 22 × 22 mm Deckglas
Kommentar einer Ecke beginnen und entlang der X-Achse

Da durc h Z entrifugation nicht alle Spermien pel- zur gegenüberliegenden Seite weitergehen;
letiert we rden, k ann mitt els dieser M ethode nicht dann ein Feld in Richtung Y-Achse bewegen
die Gesamtspermienzahl bestimmt werden. Für die und die gesamte X-Achse zurück durchsuchen.
Quantifizierung 7 Abschn. 2.11.1 oder 2.11.2beach- In diesem Zick-Zack-Verfahren fortfahren, um
ten. das gesamte Aliquot komplett und systema-
tisch abzusuchen (. Abb. 2.9). Mit den Augen
auf dem Objektträger bleiben, wenn das Ge-
Un
2.10.3 tersuchung von nicht sichtsfeld gewechselt wird.
zentrifugierten Proben, um 5 ei einer
B 20fachen Objektivvergrößerung und
bewegliche Spermien zu finden einer 10fachen Okularvergrößerung mit einer
20 mm Öffnung hat das mikroskopische Ge-
Wenn nac h mo tilen S permien g esucht wir d (z.B . sichtsfeld einen Durchmesser von ungefähr
nach einer Vasektomie), darf die Samenprobe nicht 1000 μm (7 Kasten 2.9 ).So müssen ungefähr
mit Diluent verdünnt werden o der b ei hoher G e- 1200 Gesichtsfelder (24 × 50) pro 24 × 50 mm
schwindigkeit zentrifugiert werden. In diesem Fall Deckglas untersucht werden.
kann nur ein Aliquot des unverdünnten Ejakulats
untersucht werden. Anmerkung
Das Dur chsuchen der Objektträger k ann bis zu 10 M inuten
5 jakulatE gut mischen (7 Kasten 2.3 ).
dauern, da die Proben einen starken Hintergrund haben.
5 40 μl Aliqout entnehmen und mit einem
24 × 50 mm Deckglas abdecken. So entsteht ein
Nativpräparat von 33 μm Tiefe (7 Kasten 2.4 ). Kommentar
5 en Objektträger
D bei 200- oder 250facher Ver- Wenn keine motilen Spermien im unt ersuchten
größerung unter dem Phasenkontrastmikro- Aliquot gefunden w erden, bedeutet das nicht un-
skop untersuchen. bedingt, dass in der gesamt en Ejakulatprobe keine
5 en gesamten
D Objektträger systematisch Ge- motilen Spermien vorhanden sind.
sichtsfeld für Gesichtsfeld durchsuchen. In
2.11 • Wenn eine genaue Bestimmung auch bei wenigen Spermien notwendig ist
45 2
2.11 Wenn eine genaue Bestimmung
auch bei wenigen Spermien Kasten 2.11 Erzielen von 200 Spermien
notwendig ist pro Doppelbestimmung in allen 9
Rasterquadraten des Neubauer-improved-
Dieser Abschnitt beschreibt Methoden, mit denen Hämozytometers
eine Bestimmung niedriger Spermienkonzent- Bei 2 Spermien pro HPF auf 4 nl im initialen Nativ-
ration a uch o hne Z entrifugation mög lich ist. Die präparat ergibt sich theoretisch eine Anzahl von 0,5
Alternative zur Pelletierung von Spermien ist eine Spermien pro nl (500 Spermien pro µl oder 500.000
Spermien pro ml).
niedrige Verdünnung des Ejakulats, um so ein grö- Da alle 9 Rasterquadrate der Neubauer-im-
ßeres Volumen zu untersuchen. proved-Zählkammer zusammen 900 nl fassen,
Eine Präzision von 20% ist akzeptabel, wenn es ergibt sich ein Inhalt 450 Spermien. Bei einer
um Untergrenzen der Quantifizierung (lower limits empfohlenen 1+ 1(1:2)-Verdünnung wird der Hinter-
of qu antification = L LQ) g eht (Shah e t a l. 2000). grund und die Spermienzahl auf 225 pro Kammer
reduziert, so dass der Stichprobenfehler immer
Bei der U ntersuchung des k ompletten zen tralen noch akzeptabel ist.
Rasterquadrates (Nr. 5 in . Abb. 2.7) des Neubauer-
improved-Hämozytometers ka nn t heoretisch eine
Konzentration v on 250.000 S permien p ro ml mi t
einem S tichprobenfehler v on 20% g efunden w er- von ungefähr 200) gezählt werden (7 Kasten 2.7 und
den, w enn das H ämozytometer mi t 1 + 1(1:2)-ver- . Tab. 2.2 ).
dünntem Ejakulat befüllt wurde. Wenn alle 9 R as- 5 jakulat
E gut mischen (7 Kasten 2.3 ).
terquadrate un tersucht w erden, ka nn mindest ens 5 uot
Aliqentnehmen und 1+ 1 (1:2) mit Di-
eine Spermienkonzentration von 27.800 pro ml luent verdünnen (7 Abschn. 2.7.5 unter
) Be-
gezählt werden. Großvolumige Einweg-Zählkam- rücksichtigung der Vorsichtsmaßnahmen
mern, die 25 µl fassen, können verwendet werden, aus 7 Abschn. 2.8.2 .
um Spermienkonzentrationen von 1.000 Spermien 5 1Eine
+ 1(1:2)-Verdünnung bei Proben mit
pro ml bei demselben Stichprobenfehler zu messen weniger als 2 Spermien pro HPF im initialen
(Cooper et al. 2006). Bei 1+ 1(1:2)-verdünntem Eja- Nativpräparat (. Tab. 2.3) ist für mehrere Sper-
kulat, wie hier empfohlen, entsprechen diese Werte mienkonzentrationen angemessen, wobei der
einer unverdünnten Spermienkonzentrationen von obere Grenzwert bei 200 Spermien im Hämo-
500.000 p ro ml , 55.600 und 2.000 p ro ml . D en- zytometer liegt (7 Kasten 2.11 ).Zwischen 1 und
noch können so gering verdünnte Ejakulatproben 9 Rasterquadraten müssen ausgezählt werden.
einen starken Hintergrund aufweisen. Die Unter-
suchung von großvolumigen Kammern kann bis zu Anmerkung
Dieser Wert ist nur eine g robe S chätzung, da sehr w enige
10–20 Minuten da uern. Z um s chnellen N achweis
Spermien ausgezählt w erden und die Volumina ungenau
von Spermien kann zur Erleichterung eine Fluores- sein könnten.
zenzfärbung verwendet werden (7 Abschn. 2.11.1.1).
chführung
Dur
2.11.1Die
Bestimmung einer niedrigen 1. wei
Z Aliquots aus dem Ejakulat mit Diluent
Spermienzahl im gesamten 1+ 1 (1:2) wie oben beschrieben verdünnen.
Neubauer-improved-Hämozyto- . 2 eide
B Hämozytometerkammern mit je einer
meter (Phasenkontrast-Mikro- verdünnten Doppelbestimmung befüllen.
skopie) . 3 asDHämozytometer horizontal für mindes-
tens 4 Minuten bei Raumtemperatur in einer
Um den S tichprobenfehler gering zu hal ten, muss Feuchtkammer (z.B. nasses Filterpapier in
eine g ewisse Z ahl v on S permien ( am b esten e ine einer abgedeckten Petrischale) aufbewahren,
Gesamtzahl v on 400 a us D oppelbestimmungen um ein Austrocknen zu verhindern. Die im-
. Tab. 2.5 Akzeptable Unterschiede zwischen . Tab. 2.5 Fortsetzung

zwei Zählungen für eine bestimmte Summe: niedrige
Konzentrationen Summe Akzeptable Differenz*
2 Summe Akzeptable Differenz* 516–538 45
35–40 12 539–562 46
41–47 13 563–587 47
48–54 14 * basierend auf dem 95%-Konfidenzintervall
55–62 15
63–70 16
mobilisierten Zellen werden währenddessen
1
7–79 17
auf dem Raster sedimentieren.
80–89 18 . 4 asDHämozytometer unter dem Phasenkon-
90–98 91 trastmikroskop bei 200- oder 400facher Ver-
größerung untersuchen.
99–109 20
5. indestens
110–120 21 mung auszählen, um einen akzeptabel niedri-
121–131 2 gen Stichprobenfehler zu erhalten (7 Kasten 2.7
132–143 23 und . Tab. 2.2 ).
6. uerst
Z die eine Zählkammer Rasterquadrat für
144–156 42
Rasterquadrat untersuchen und fortfahren, bis
157–16
9 25 mindestens 200 Spermien gesichtet wurden
170–182 26 und eine komplette Reihe ausgezählt wurde.
Es müssen immer komplette Rasterquadrate
183–1
96 27
ausgezählt werden, niemals in der Mitte einer
97–211
1 28 Rasterquadrates auἀ ören.
212–2
26 29 . 7 ieDAnzahl der ausgezählten Rasterquadrate
bis zum Erreichen von 200 Spermien muss
2 7–242 30
dokumentiert werden. Die gleiche Anzahl
423–258 31 muss auch in der anderen Kammer des Hämo-
25
9–274 32 zytometers ausgezählt werden.
275–292 33
8. Anzahl der Spermien und der ausgezählten
Rasterquadrate mit Hilfe eines Laborcounters
293–309 34
festhalten.
310–328 35 9. uswertung
A der 2. Zählkammer des Hämo-
329–346 36 zytometers und Doppelbestimmung in der-
selben Anzahl an Rasterquadraten (gleiches
347-366 37
Volumen) wie bei der ersten Probe, auch wenn
367–385 38 nicht 200 Spermien erreicht werden.
386–406 39 10.umme
S und Differenz der beiden Ergebnisse
errechnen.
407–426 40
1. 1 mitteln,
Er ob die Differenz akzeptabel ist, mit-
427–448 41 tels . Tab. 2.5 (Erweiterung von . Tab. 2.4 um
449–470 42 niedrigere Spermienanzahl) oder . Abb. 14.1 .
47
1–492 43
(Dort wird die maximal erlaubte Differenz
zwischen 2 Zählungen dargestellt, die in 95%
493–515 44
47 2
der Proben nur wegen des Stichprobenfehlers mit dem Vermerk versehen: »Zu wenige Spermien
zu erwarten ist.) für eine exakte Konzentrationsbestimmung gezählt
12. enn
W die Differenz akzeptabel ist, wird die (< 56.000/ml)«.
Konzentration errechnet. Wenn die Differenz
zu groß ist, müssen zwei neue Präparate, wie Kommentar
oben beschrieben, vorbereitet werden und Wenn keine Spermien in einem Aliquot gefunden
die Doppelbestimmungen wiederholt werden werden können, bedeut et dies nicht, dass im ge -
(7 Kasten 2.10 ). samten Ejakulat keine Spermien vorhanden sind.
3. 1 urchschnitt
D der Spermienkonzentration bis
auf eine Stelle nach dem Komma runden. erechnungsbeispiele
B
4. 1 permiengesamtzahl
S pro Ejakulat errechnen. Beispiel 1: B ei einer 1 + 1(1:2)-Verdünnung en t-
hält die 1. D oppelbestimmung 200 S permien in 2
erechnung
B niedriger Spermienkonzen- Rasterquadraten und die 2. D oppelbestimmung
trationen im Ejakulat 250 S permien in 2 R asterquadraten. D ie S umme
Die Konzentration ergibt sich aus der Anzahl der (200 + 250) b eider W erte er gibt 45 0 in 4 R aster-
Spermien (N) g eteilt durch das V olumen, in dem quadraten und die Differenz (250-200) b eträgt 50.
sie g efunden wur den, d .h., das V olumen der An- Aus . Tab. 2.5 g eht h ervor, d ass d ieser Wert d en
zahl aller a usgezählten R asterquadrate (n) der erwarteten nur durch Zufall bedingten Unterschied
untersuchten D oppelbestimmungen (w obei das (42) üb erschreitet. D aher m üssen zw ei neue V er-
Volumen eines R asterquadrates 100 nl b eträgt) dünnungspräparate angelegt werden.
multipliziert mi t dem V erdünnungsfaktor. S o er - Beispiel 2: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ent-
gibt sich C = (N/n)×(1/100) × Verdünnungsfaktor. hält die 1. D oppelbestimmung) 210 Spermien in 3
Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ergibt sich einer Rasterquadraten und die 2. D oppelbestimmung
Konzentration C = (N/n)×(1/100)×2 Spermien pro 200 S permien in 4 R asterquadraten. Die S umme
nl = (N/n)×(1/50) Spermien pro nl. (210 + 200) beider Werte ergibt 410 in 6 Rasterqua-
Wenn alle 9 R asterquadrate in jeder Z ählkam- draten und die Differenz (210-200) beträgt 10. Aus
mer des Hämozytometers ausgezählt wurden, wird . Tab. 2.5 geht hervor, dass dieser Wert geringer ist
die G esamtzahl der S permien d urch das G esamt- als der nur durch Zufall bedingte Unterschied (40).
volumen beider Kammern (1,8 µl) geteilt und mit Also können die Werte akzeptiert werden.
dem Verdünnungsfaktor (2) m ultipliziert, um die Die Konzentration der Proben mit einer
Konzentration von Spermien pro µl zu erhalten (in 1+ 1(1:2)-Verdünnung b eträgt C = (N/n)×1/50
Tausend pro ml Ejakulat). Spermien pro nl , d .h. (4 10/6)×50 = 1,37 Spermien/
nl oder 1,4 × 106 S permien p ro ml E jakulat (auf 1
ensitivität
S der Methode Stelle nach dem Komma gerundet).
Bei w eniger al s 200 S permien p ro Z ählkammer Beispiel 3: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ent-
liegt der Stichprobenfehler über 5%. Wenn weniger hält die 1. D oppelbestimmung 120 S permien in
als 400 S permien in b eiden Z ählkammern gefun- allen 9 R asterquadraten und die 2. D oppelbestim-
den w erden k önnen, m uss der S tichprobenfehler mung 140 S permien in allen 9 R asterquadraten.
für die gezählte Spermienzahl angegeben werden Die S umme (120 + 140) b eider W erte er gibt 260
(. Tab. 2.2 ). in 18 Rasterquadraten und die Differenz (140-120)
Wenn w eniger als 25 S permien p ro K am- beträgt 20. A us . Tab. 2.5 geht hervor, dass dies er
mer g ezählt w erden, liegt die K onzentration b ei Wert geringer ist als der nur durch Zufall bedingte
<56.000 S permien pro ml. Das ist die Untergrenze Unterschied (32). Also können die Werte akzeptiert
der Quantifizierung (LLQ) für einen Stichproben- werden.
fehler v on 20%, w enn alle 9 R asterquadrate des Wenn alle 9 R asterquadrate b eider Z ählkam-
Neubauer-improved-Hämozytometers ausgezählt mern (Gesamtvolumen 1,8 µl) ausgezählt wurden,
wurden und eine 1 + 1(1:2)-Verdünnung b enutzt ist die Spermienkonzentration der Probe mit einer
wurde ( Cooper a t al. 2 006). D ie S permienanzahl 1 + 1(1:2)-Verdünnung C = (N/1,8)×2 Spermien pro
µl = (260/1,8)×2= 288,8 Spermien/µl oder 290 × 103

Spermien p ro ml E jakulat (auf 1 S telle nac h dem Kasten 2.12 Erreichen von 200 Spermien
Komma g erundet). D a w eniger als 400 S permien pro Doppelzählung in einer 100 μm tiefen,
2 gezählt wur den, m uss der S tichprobenfehler f ür großvolumigen Einweg-Zählkammer
260 S permien a us . Tab. 2.2 a ngegeben w erden Wenn nur 1 Spermium pro HPF auf 4 nl im initialen
(ungefähr 6%). Nativpräparat zu finden ist, ergibt sich theoretisch
Beispiel 4: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ent- eine Menge von 0,25 Spermien pro nl (250 pro µl
oder 250.000 pro ml).
hält die 1. Doppelbestimmung 10 Spermien in allen
Eine großvolumige Zählkammer fasst 25 μl, so-
9 Rasterquadraten und die 2. Doppelbestimmung 8 dass sich 6.250 Spermien in ihr finden ließen. Eine
Spermien in allen 9 R asterquadraten. D a weniger 1+ 1(1:2)-Verdünnung würde den Hintergrund und
als 25 Spermien gezählt wurden, liegt die K onzen- die Spermienanzahl auf 3.125 pro Kammer reduzie-
tration b ei <56.000/ml; es wir d do kumentiert »18 ren, so dass immer noch ein akzeptabel niedriger
Stichprobenfehler vorliegt.
Spermien wurden in der Doppelbestimmung g e-
funden, zu wenige für eine exakte Konzentrations-
bestimmung (< 56.000/ml)«.
Beispiel 5: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung wer- aus D oppelbestimmungen v on un gefähr 200) g e-
den in k einer der D oppelbestimmung S permien zählt werden (7 Kasten 2.7 und . Tab. 2.2 ).
gefunden. D a w eniger als 25 S permien g ezählt 5 jakulatE gut mischen (7 Kasten 2.3 )
wurden, liegt die Konzentration bei < 56.000/ml. 5 uot
Aliqentnehmen und 1+ 1 (1:2) mit Hoechst
Es wir d do kumentiert: »K eine S permien wur den 33342 Bisbenzimid Fluorochrom enthaltendem
in der Doppelbestimmung gefunden, zu wenige für Diluent (1 mg/l) verdünnen (7 Abschn. 2.7.5 )
eine exakte Konzentrationsbestimmung ( < 56.000/ und dabei die Sicherheitsvorschriften aus Ab-
ml)«. schnitt 2.8.2. beachten.
erechnung
B der Spermiengesamtzahl Eine 1 + 1(1:2)-Verdünnung b ei P roben mi t w e-
im Ejakulat niger als 2 Spermien in der initialen B eurteilung
Es wird vorgeschlagen, die Spermiengesamtzahl zu (. Tab. 2.3) ist f ür unterschiedliche Spermienkon-
errechnen und zu do kumentieren, da sie ein M aß zentrationen geeignet, bis zu einer Obergrenze von
für die Leistungsfähigkeit des Hodens, Spermien zu 200 S permien inn erhalb der g esamten Z ählkam-
produzieren, und f ür die Dur chgängigkeit der a b- mer (7 Kasten 2.12 ).
leitenden Samenwege ist. M an erhält die G esamt-
zahl durch Multiplikation der Spermienkonzentra- chführung
Dur
tion mit dem Gesamtvolumen des Ejakulates. 1. wei
Z Aliquots der Ejakulatprobe 1+ 1 (1:2) mit
Diluent, wie oben beschrieben, verdünnen.
2.edeJ der beiden Zählkammern mit je 25 μl der
Er
2.11.2fassung einer niedrigen verdünnten Doppelbestimmungen befüllen.
Spermienzahl in großvolumigen 3. asDHämozytometer horizontal für 10–15
Einweg-Zählkammern Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur in
(Fluoreszenzmikroskopie) einer Feuchtkammer (z.B. nasses Filterpapier
in einer abgedeckten Petrischale) aufbewah-
Die Verwendung von großvolumigen, 100 µm tieren, um ein Austrocknen zu verhindern. Die
fen Z ählkammern ka nn die Sensitivität der K on- immobilisierten Zellen werden währenddessen
zentrationsbestimmung erhö hen (C ooper et al . auf dem Raster sedimentieren.
2006). Das großvolumige Hämozytometer hat zwei . 4 asDHämozytometer unter einem Fluores-
100 µm tiefe Kammern, von denen jede 25 µl fasst. zenzmikroskop und einem entsprechendem
Um den S tichprobenfehler zu r eduzieren, m uss dichroitischen Spiegel und Farbfilter bei 250fa-
eine gewisse Anzahl a n Spermien (am besten 400 cher Vergrößerung untersuchen.
49 2
5. indestens
M 200 Spermien pro Doppelbestim- Anmerkung
Spermien sind als helle fluoreszierende Punkte (kondensierte
mung auszählen, um einen akzeptabel niedri-
Zellkerne) zu erkennen im Gegensatz zu Leukozyten und Zel-
gen Stichprobenfehler zu erhalten (7 Kasten 2.7 len, die keine Spermien sind, welche eine diffuse Fluoreszenz
und . Tab. 2.2 ). (bedingt durch größere Zellkerne) aufweisen (Zinaman et al.
6. uerst
Z die eine Zählkammer Gesichtsfeld für 1996).
Gesichtsfeld untersuchen. In einer Ecke begin-
nen und entlang der X-Achse zur gegenüber- Anmerkung
Wenn man sich bezüglich des F luoreszenzsignals unsicher
liegenden Seite weitergehen; dann ein Feld in ist, k ann auf ein Phasenkontrastmikroskop gewechselt wer-
Richtung Y-Achse bewegen und die gesamte den, in dem der Spermienschwanz zu sehen ist.
X-Achse zurück durchsuchen. In diesem Zick-
Zack-Verfahren fortfahren, um das gesamte
Aliquot komplett und systematisch abzu- erechnung
B niedriger Spermienkonzen-
suchen (. Abb. 2.9). Mit den Augen auf dem trationen im Ejakulat
Objektträger bleiben, wenn das Gesichtsfeld Die Konzentration ergibt sich aus der Anzahl der
gewechselt wird. Spermien (N) g eteilt durch das Volumen der An-
. 7 ieDAnzahl der ausgezählten Gesichtsfelder bis zahl aller ausgezählten mikroskopischen Gesichts-
zum Erreichen von 200 Spermien muss do- felder (n), wobei das Volumen eines Gesichtsfeldes
kumentiert werden. Die gleiche Anzahl muss (v) wie in 7 Kasten 2.13 berechnet wird, multipli-
auch in der anderen Kammer des Hämozyto- ziert mit dem Verdünnungsfaktor. So ergibt sich C
meters ausgezählt werden. = (N/n)×(1/v) × Verdünnungsfaktor.
8. Anzahl der Spermien und der ausgezählten Bei 250facher Vergrößerung ergibt sich ein Ge-
Gesichtsfelder mit Hilfe eines Laborcounters sichtsfeldvolumen v on 80 nl ( 7 Kasten 2.13 );bei
festhalten. einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ergibt sich so eine Kon-
. 9 uwendung
Z zur 2. Zählkammer des Hämozy- zentration von C = (N/n)×(1/80)×2 Spermien pro
tometers und Doppelbestimmung in derselben nl = (N/n)×(1/40) Spermien pro nl (10 6 Spermien
Anzahl an Gesichtsfeldern (gleiches Volumen) pro ml Ejakulat).
wie bei der ersten Probe, auch wenn nicht 200 Bei 400fac her V ergrößerung er gibt sic h ein
Spermien erreicht werden. Gesichtsfeldvolumen von 20 nl (7 Kasten 2.13 ).Bei
10.umme
S und Differenz der beiden Ergebnisse einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ergibt sich so eine Kon-
errechnen. zentration von C = (N/n)×(1/20)×2 Spermien pro
1. 1 mitteln,
Er ob die Differenz akzeptabel, ist mit- nl = (N/n)×(1/10) Spermien pro nl (10 6 Spermien
tels . Tab. 2.5 (Erweiterung von . Tab. 2.4 um pro ml Ejakulat).
niedrigere Spermienanzahl) oder . Abb. 14.1 . Wenn die g esamte Fläc he b eider Z ählkam-
(Dort wird die maximal erlaubte Differenz mern des Hämozytometers ausgezählt wurde, wird
zwischen 2 Zählungen dargestellt, die in 95% die G esamtzahl der S permien d urch das G esamt-
der Proben nur wegen des Stichprobenfehlers volumen b eider Kammern (50 µl) g eteilt und mi t
zu erwarten ist.) dem Verdünnungsfaktor (2) m ultipliziert, um die
12. enn
W die Differenz akzeptabel ist, wird die Konzentration von Spermien pro µl zu erhalten (in
Konzentration errechnet. Wenn die Differenz Tausend pro ml Ejakulat).
zu groß ist, müssen zwei neue Präparate, wie
oben beschrieben, vorbereitet werden und ensitivität
S der Methode
die Doppelbestimmungen wiederholt werden Bei w eniger al s 200 S permien p ro Z ählkammer
(7 Kasten 2.10 ). liegt der Stichprobenfehler über 5%. Wenn weniger
3. 1 urchschnitt
D der Spermienkonzentration bis als 400 S permien in b eiden Z ählkammern gefun-
auf eine Stelle nach dem Komma runden. den w erden k önnen, m uss der S tichprobenfehler
4. 1 permiengesamtzahl
S pro Ejakulat errechnen. für die gezählte Spermienzahl angegeben werden
(. Tab. 2.2 ).
Kasten 2.13 Gemessenes Volumen pro HPF in einer 100 μm tiefen, großvolumigen Einweg-
Zählkammer
2 Das
Ejakulatvolumen pro mikro- errechnet werden, indem man den und das Volumen beträgt 19.637.500
skopischem Gesichtsfeld ist ab- Durchmesser der Okularlinsenöff- µm3 oder ungefähr 20 nl.
hängig von dem Flächeninhalt nung durch die Vergrößerung der Bei einer 25fachen Objektiv-
des Gesichtsfeldes (πr2, wobei π Objektivlinse teilt. und einer 10fachen Okularvergröße-
ungefähr 3,142 und r der Radius des Bei einer 40fachen Objektiv- rung mit einer Öffnung von 25 mm
mikroskopischen Gesichtsfeldes ist) und einer 10fachen Okularvergröße- ergibt sich ein Gesichtsfeld-Durch-
und der Kammertiefe (in diesem Fall rung mit einer Öffnung von 20 mm messer von ungefähr 1.000 μm (25
100 µm). ergibt sich ein Gesichtsfeld-Durch- mm/25). In diesem Fall ist r = 500
Der Durchmesser eines mikro- messer von ungefähr 500 μm (20 µm, r2 = 250.000 µm2 ,πr2 = 785.500
skopischen Gesichtsfeldes kann mm/40). In diesem Fall ist r = 250 µm2 und das Volumen beträgt
entweder mit dem Objektmikro- µm, r2 = 62.500 µm2 ,πr2 = 196.375µm2 78.550.500 µm3 oder ungefähr 80 nl.
meter gemessen werden oder
Wenn weniger als 25 Spermien pro Kammer ge- feldern und die Differenz (230-200) beträgt 30. Aus
zählt w erden, liegt die K onzentration b ei < 2.000 . Tab. 2.5 geht hervor, dass dieser Wert geringer ist
Spermien p ro ml; das ist die U ntergrenze der als der nur durch Zufall bedingte Unterschied (41).
Quantifizierung (LLQ) für einen Stichprobenfehler Also können die Werte akzeptiert werden.
von 20%, wenn gesamte Zählkammer (25 µl) ausge- Die Konzentration der Proben mit einer
zählt wurde und eine 1+ 1(1:2)-Verdünnung benutzt 1+ 1(1:2)-Verdünnung b eträgt C = (N/n)×(2/v)
wurde (Cooper et al. 2006). Die Spermienanzahl ist Spermien p ro n l. W enn v = 20 nl en tspricht (b ei
mit dem V ermerk zu v ersehen: »Z u w enige Sper- 400facher V ergrößerung, 7 Kasten 2.13 ),ist C =
mien f ür eine exak te K onzentrationsbestimmung (430/800)×(2/20) = 0,0538 Spermien/nl oder 54000
gezählt (< 2.000/ml)«. Spermien p ro ml E jakulat (auf 1 S telle nac h dem
Komma gerundet).
Kommentar Beispiel 3: B ei einer 1 + 1(1:2)-Verdünnung
Wenn keine Spermien im unt ersuchten Aliquot zu enthält die 1. D oppelbestimmung 50 S permien in
finden sind, bedeutet dies nicht unbedingt, dass im der g esamten Z ählkammer un d die 2. Do ppelbe-
gesamten Ejakulat keine Spermien vorhanden sind. stimmung 70 Spermien in der gesamten Zählkam-
mer. Die S umme (50 + 70) beider Werte ergibt 120
erechnungsbeispiele
B in 2 Kammern und die Differenz (70-50) 20. A us
Beispiel 1: Bei einer 1 + 1(1:2)-Verdünnung enthält . Tab. 2.5 geht hervor, dass dieser Wert geringer ist
die 1. D oppelbestimmung 2 10 S permien in 300 als der nur durch Zufall bedingte Unterschied (21).
Gesichtsfeldern u nd d ie 2 . D oppelbestimmung Also können die Werte akzeptiert werden.
300 Spermien in 300 G esichtsfeldern. Die S umme Wenn das gesamte Gebiet beider Zählkam-
(210 + 300) beider Werte ergibt 510 in 600 Gesichts- mern (Gesamtvolumen 50 µl) ausgezählt wurde,
feldern und die Differenz (300-210) beträgt 90. Aus ist die Spermienkonzentration der Probe mit einer
. Tab. 2.5 geht hervor, dass dieser Wert den erwar- 1 + 1(1:2)-Verdünnung C = (N/50)×2 Spermien pro
teten nur durch Zufall bedingten Unterschied (44) µl = (120/50)×2 = 4,8 Spermien/µl 4.800 S permien
überschreitet. D aher m üssen neue V erdünnungs- pro ml Ejakulat (auf 1 Stelle nach dem Komma ge-
präparate angelegt werden. rundet). Da weniger als 400 Spermien gezählt wur-
Beispiel 2: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ent- den, muss der Stichprobenfehler für 120 Spermien
hält die 1. D oppelbestimmung 200 S permien in aus . Tab. 2.2 angegeben werden (ungefähr 10%).
400 G esichtsfeldern und die D oppelbestimmung Beispiel 4: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung ent-
230 Spermien in 400 G esichtsfeldern. Die S umme hält die 1. Doppelbestimmung 20 S permien in der
(200 + 230) beider Werte ergibt 430 in 600 Gesichts- gesamten Z ählkammer un d die 2. Do ppelbestim-
2.12 • Zählung von Zellen, die keine Spermien sind
51 2
mung 18 Spermien in der g esamten Z ählkammer. der Beurteilung der peroxidasepositiven Zellen be-
Da weniger als 25 Spermien gezählt wurden, liegt stimmt werden.
die K onzentration b ei <2.000 Spermien/ml. Es
wird do kumentiert: »38 S permien wur den in der
Doppelbestimmung gefunden, zu w enige f ür eine 2.12.1e
Brechnung der Konzentration
exakte Konzentrationsbestimmung (< 2.000/ml)«. von Rundzellen im Ejakulat
Beispiel 5: Bei einer 1+ 1(1:2)-Verdünnung wer-
den in k einer der D oppelbestimmung S permien Die Konzentration von Rundzellen wird relativ zu
gefunden. Da weniger als 25 Spermien gezählt wur- Spermien b erechnet, indem fixierte und g efärbte
den, liegt die Konzentration bei <2.000/ml . Es wird Ausstriche a us un verdünntem E jakulat beurteilt
dokumentiert »In der Doppelbestimmung wurden werden (7 Abschn. 2.13.2). Wenn N die Anzahl von
keine Spermien gefunden, zu wenige für eine exak- Rundzellen ist, die in der selben Anzahl v on G e-
te Konzentrationsbestimmung (< 2.000/ml)«. sichtsfeldern wie 400 S permien g ezählt wur den,
und S die Konzentration von Spermien (106 pro ml)
erechnung
B der Spermiengesamtzahl ist, dann kann die Konzentration C von Rundzellen
im Ejakulat mit der Formel C = S × (N/400) berechnet werden.
Es wird vorgeschlagen, die Spermiengesamtzahl zu
errechnen und zu do kumentieren, da sie ein M aß
für die Leistungsfähigkeit des Hodens, Spermien zu 2.12.2e
Snsitivität der Methode
produzieren und für die Durchgängigkeit der ablei-
tenden Samenwege ist. Man erhält die Gesamtzahl Wenn w eniger R undzellen als S permien in der
durch M ultiplikation der S permienkonzentration vorliegenden P robe g ezählt w erden (z.B . < 400),
mit dem Gesamtvolumen des Ejakulates. übersteigt der Stichprobenfehler 5%. In diesem Fall
wird der Stichprobenfehler für den entsprechenden
Wert angegeben ( . Tab. 2.2). Wenn weniger als 25
Zählung von Zellen, die keine
2.12 Rundzellen gezählt werden, wird die S permienan-
Spermien sind zahl mit dem Vermerk versehen: »Zu wenige Rund-
zellen f ür eine exak te Konzentrationsbestimmung
Das Vorhandensein von Zellen, die keine Spermien gezählt«.
sind, kann auf einen testikulären Schaden (unreife
Keimzellen), einen pa thologischen Prozess in den
ableitenden Samenwegen (abgeschilferte Epithel- 2.12.3e
Brechnungsbeispiele
zellen) o der eine En tzündung der akzess orischen
Drüsen (Leukozyten) hinweisen. Die Anzahl der Beispiel 1: Die 1. D oppelbestimmung en thält 2 1
Zellen im E jakulat, die k eine Spermien sind (E pi- Rundzellen auf 200 S permien und die 2. D oppel-
thelzellen, isolierte Spermienköpfe und -s chwänze bestimmung 39 R undzellen a uf 200 S permien.
sowie »Rundzellen« = Keimzellen und Leukozyten), Die S umme (2 1+ 39) beider Werte er gibt 60 und
kann im fixierten Nativpräparat mittels Hämozyto- die Differenz (39-21) beträgt 18. Aus . Tab. 2.5 geht
meters wie b ei der S permienzählung, a bgeschätzt hervor, dass dieser Wert den erwarteten nur durch
werden ( 7 Abschn. 2.8.3). Allerdings ist die E jaku- Zufall b edingten U nterschied (1 5) üb erschreitet.
latprobe, die für die Spermienzählung adäquat ver- Daher müssen die Ergebnisse verworfen und neue
dünnt wurde, für die Zählung von anderen Zellen Berechnungen durchgeführt werden.
oft zu hoch verdünnt, es sei denn, sie liegen in einer Beispiel 2: Die 1. Doppelbestimmung enthält 24
hohen Anzahl v or. Die P rävalenz von Rundzellen Rundzellen auf 200 S permien und die 2. D oppel-
in Relation zu S permien ka nn mi ttels der g efärb- bestimmung 36 Rundzellen auf 200 S permien. Die
ten Präparate berechnet werden ( 7 Abschn. 2.12.1 ). Summe (2 4 + 36) b eider Werte er gibt 60 und die
Alternativ ka nn die K onzentration a uch währ end Differenz (36-24) beträgt 12. Aus . Tab. 2.5 geht her-
vor, dass dieser Wert geringer ist als der nur durch
Zufall bedingte Unterschied (15). Also können die zentanteils normaler und abnormaler Formen
Werte akzeptiert werden. (7 Abschn. 2.15.2 )
Bei 60 Rundzellen auf 400 S permien und einer 5 ergleich
V der Doppelbestimmungsergebnisse
2 Spermienkonzentration von 70 × 106 pro ml ist die zur Beurteilung der Abweichungen. Bei akzep-
Konzentration der R undzellen C = S × (N/400) tabler Abweichung Fortsetzen der Kalkulation,
Zellen pro ml = 70 × 106 ×(60/400)=10,5 × 106 Zellen bei zu hoher Abweichung Wiederholung der
pro ml oder 10× 106 Zellen pro ml (auf 1 Stelle nach Analyse.
dem Komma gerundet). Da weniger als 400 Zellen
gezählt wurden, muss der Stichprobenfehler für 60
Zellen aus . Tab. 2.2 angegeben werden (ungefähr 2.13.1Das
Konzept normaler Spermien
13%).
Die variable Morphologie menschlicher Spermien
Kommentar macht die B eurteilung s chwierig, a ber die s org-
Wenn die Konzentration von Rundzellen einen Wert fältige Analyse von Spermien aus dem w eiblichen
von 1 × 10 6 pro ml überschre itet, sollte die Ursache reproduktiven Trakt, insbesondere im postkoitalen
für das v ermehrte Vorkommen mitt els P eroxida- endozervikalen Mukus (Fredricsson u. Björk 1977;
se-Aktivität ( 7 Abschn. 2.18oder
) Leukozytenmar- Menkveld et al. 1990) sowie von der Oberfläche der
kern (7 Abschn. 3.2) geklärt werden und die exakte Zona pellucida (Menkveld et al . 1991; Liu u. Baker
Konzentration angegeben we rden. Es ist möglich, 1992a) (. Abb. 2.10) hat dazu beigetragen, das Aus-
unreife Keimzellen in gut gefärbt en Präparaten zu sehen eines p otenziell f ertilisierungsfähigen (und
identifizieren (7 Abschn. 2.19 ). damit morphologisch normalen) Spermiums zu de-
finieren. Durch die strikte Anwendung bestimmter
Kommentar Kriterien a uf die S permienmorphologie k onnten
Die Gesamtzahl der Rundz ellen im Ejakulat k ann Korrelationen zwischen dem Prozentsatz normaler
den Schweregrad einer Entzündung oder den Sper- Spermienformen und einig er F ertilitätsparameter
mienzustand widerspiegeln. M an erhält sie durc h (Zeit bis zum Eintritt einer S chwangerschaft [time
Multiplikation der Konz entration der Rundz ellen to pregnancy: TTP], Schwangerschaftsraten in vivo
mit dem Volumen des gesamten Ejakulates. und in vitro) nachgewiesen werden, die für die Pro-
gnose der F ertilität hilfreich sein können (Eggert-
Kruse et al. 1996; Jouannet et al. 1988; Toner et al.
2.13 Spermienmorphologie 1995; Coetzee et al. 1998; Menkveld et al. 2001; Van
Waart et al. 2001; Garrett et al. 2003; Liu et al. 2003).
Die B estimmung der S permienmorphologie um- Die zugr unde lieg ende Philos ophie des K las-
fasst die f olgenden S chritte (die det ailliert in den sifikationssystems, das hier b eschrieben wir d, ha t
folgenden Unterabschnitten beschrieben werden): das Z iel, n ur diejenig en S permien als no rmal zu
5 ertigen
Anf eines Ausstrichs des Ejakulates auf identifizieren, die der p otenziell f ertilisierungsfä-
dem Objektträger (7 Abschn. 2.13.2 ) higen Subpopulation von Spermien, die im endo-
5 fttrocknen,
Lu Fixieren und Färben des Objekt- zervikalen M ukus nac hgewiesen w erden k önnen,
trägers (7 Abschn. 2.14 ) entsprechen. B ei An wendung dies er Ric htlinie
5 edecken B des Objektträgers mit einem Deck- wird die S pannweite des P rozentanteils no rmaler
glas, wenn er für eine längere Zeit aufbewahrt Spermien sowohl für fertile als auch infertile Män-
werden soll (7 Abschn. 2.14.2und 2.14.2 .5) ner zwischen 0 und 30% lieg en, wobei nur wenige
5 eurteilung
B des Objektträgers mit Hellfeld- Proben üb er 25% normale Spermien hinaus kom-
optik bei 1000facher Vergrößerung mit Ölim- men (Menkveld et al. 2001). Dieser an sich niedrige
mersion (7 Abschn. 2.15und 2.16 ) Wert wird unweigerlich zu niedrigen Untergrenzen
5 yse
Analvon rund 200 Spermien pro Durch- führen. In der Tat sind Referenz- und Grenzberei-
gang zur Bestimmung des Prozentanteils nor- che v on 3–5% N ormalformen s owohl in S tudien
maler Formen (7 Abschn. 2.15.1 oder) des Pro- zur In-vitro-Fertilisation (Coetzee et al. 1998), in-
2.13 • Spermienmorphologie
53 2
. Abb. 2.10a–c Morphologisch »normale« Spermien. a, b Shorr-Färbung von Spermien der Zona pellucida in vitro. c
Papanicolaou-Färbung von Spermien aus dem postkoitalen endozervikalen Mukus. Sehr wenige Defekte am Spermienkopf,
Mittelstück oder Halsstück werden beobachtet. Schwänze dürfen gebogen, aber nicht scharf anguliert sein (a, b: Repro-
duziert von Liu et al. (2003) mit Erlaubnis der European Society of Human Reproduction and Embryology. c: mit Erlaubnis
reproduziert von Menkveld u. Kruger 1990)
trauterinen I nsemination (Van Waart et al . 2001) o

Vrbereitung des
2.13.2
und In-vivo-Fertilität (Van der Merwe et al . 2005) Ejakulatausstriches
nachgewiesen.
Die men schliche Z ona p ellucida s elektiert Die rasche Zugabe von Fixans zum Ejakulat erlaubt
ebenfalls eine Subpopulation morphologisch ähnli- keine adäquate Darstellung der S permien, da ihr e
cher Spermien, wenngleich diese von der Zona be- Morphologie d urch dena turierte S eminalproteine
vorzugten Spermien eine deutlich höhere Variabili- verfälscht wird. Für die morphologische Analyse
tät der F ormen aufweisen (Liu et al . 1990; Ga rrett wird üb licherweise zunäc hst ein l uftgetrockneter
et al. 1997). Der Prozentanteil motiler Spermien im Ausstrich vorbereitet, der da nn fixiert und g efärbt
Ejakulat von Vätern, die eine überwiegend von der wird. Aller dings f ührt dies es P rozedere zu mo r-
Zona »bevorzugte« Spermienmorphologie aufwei- phologischen Artefakten, da das Lufttrocknen von
sen, ist ebenfalls niedrig (7–25%) (Liu et al. 2004). Ejakulatausstrichen mit folgenden Veränderungen
assoziiert ist:
S SS
a b
. Abb. 2.11a, b Ejakulatausstrichmethodenfür die Spermienmorphologie. a Fahnenausstrichmethode für unverdünntes

Ejakulat. Ein Ejakulattropfen (S) verteilt sich entlang der Rückkante des aufgesetzten Objektträgers und wird vorwärts über
den anderen Objektträger ausgezogen, um den Ausstrich anzufertigen. b Pipettenmethode für gewaschene Ejakulatproben.
Ein Tropfen der Spermiensuspension (SS) wird durch eine horizontal aufgelegte Pipette (P) über die Oberfläche des Objekt-
trägers ausgezogen
5 eränderungen
V der Spermiendimensionen: ge- Normale
Ejakulatproben
trocknete, fixierte und gefärbte Spermien sind Hierbei wir d ein Aliq uot des E jakulates üb er die
kleiner als lebendige Spermien im Ejakulat gesamte Oberfläche des Objektträgers mit der Aus-
(Katz et al. 1986), strichmethode verteilt (. Abb. 2.11a und Abb. 2.12 ).
5 xpansion
E immaturer Spermienköpfe (Soler et 1. Reinigen Sie zunächst die Oberflächen der
al. 2000) und beiden mattierten Objektträger durch starkes
5 erlustV der osmotisch sensitiven zytoplasma- Rubbeln mit fusselfreiem Reinigungspapier.
tischen Tropfen (Abraham-Peskir et al. 2002; 2. eschrift
B en Sie den Objektträger auf der mat-
Cooper et al. 2004), wenngleich große Mengen tierten Fläche mit den Identifikationsangaben
von überschüssigem residualen Zytoplasma (z.B. Identifikationsnummer, Datum) mit
zurückbehalten werden. einem Bleistift mit mittelharter Mine (HB oder
Nr. 2).
Zwei oder mehr Ausstriche sollten von der frischen 3. ragen
T Sie ein 5–10-µl-Aliquot des Ejakulates,
Ejakulatprobe für den Fall angefertigt werden, dass in Abhängigkeit von der Spermienkonzen-
Probleme mit der F ärbung auftreten oder ein Ob- tration, auf ein Ende des Objektträgers auf.
jektträger zerb richt. Die Anal yse er folgt als D op- Nehmen Sie ein zweiten Objektträger und
pelbestimmung, vorzugsweise an jedem der beiden ziehen Sie den Tropfen entlang der Oberfläche
Objektträger, da durchaus erhebliche Unterschiede des Objektträgers (. Abb. 2.11a und Abb. 2.12 ).
zwischen den Ob jektträgern in der S permienmor- Wenn es sich um einen nicht mattierten Ob-
phologie vorliegen können. jektträger handelt, dann können mit diesem
5 as Ejakulat
D gut mischen (7 Kasten 2.3 ). insgesamt von beiden Enden des Objektträgers
5 ofortS ein Aliquot entnehmen, um den Sper- aus 4 verschiedene Ausstriche ausgezogen
mien keine Möglichkeit zu geben, in der Sus- werden.
pension zu sedimentieren. 4. assen
L Sie die Objektträger an der Luft trock-
5 rneutesE Mischen der Probe vor Entnahme nen und färben Sie wie in 7 Abschn. 2.14be-
des nächsten Aliquots. schrieben.
5 nterschiedliche
U Ausstrichmethoden können
in Abhängigkeit von den Bedingungen zur An- Anmerkung
Bleistiftbeschriftung bleibt beim F ixieren und F ärben stabil,
wendung kommen (. Abb. 2.11).
Tinte und einige Permanentmarker dagegen nicht.
2.13 • Spermienmorphologie
55 2
. Abb. 2.12 Vorbereitung eines normalen Ejakulatausstrichs. Um ein Gefühl für die Bewegung zu bekommen, platzieren
Sie den Ausstreichobjektträger in einem 45°-Winkel und bewegen Sie ihn, bis Sie Kontakt mit dem Ejakulattropfen bekom-
men (linker Bildabschnitt), der entlang der Objektträgerkante verläuft (mittlerer Bildabschnitt). Ziehen Sie den Ausstreich-
objektträger langsam zurück (ungefähr während einer Sekunde) entlang der gesamten Länge des Objektträgers, um den
gewünschten Ausstrich anzufertigen (rechter Bildabschnitt) (Fotos freundlicherweise überlassen von C. Brazil)
Anmerkung roben
P mit geringen Spermienkonzen-
Lassen Sie den Ejakulattr opfen nicht länger als ein paar S e-
trationen
kunden auf dem Objektträger liegen, bev or Sie ihn ausstr ei-
chen. Bei geringen Spermienkonzentrationen (<2 × 106 /ml)
konzentrieren Sie die Probe:
Anmerkung 1. entrifugieren
Z Sie die Probe bei 600 g für 10
Vergewissern Sie sich, dass Sie mit dem zweiten Objektträger Minuten.
den Tropfen ausziehen und nicht ausschieben. 2. tfernen
En Sie den Überstand.
. 3 esuspendieren
R Sie das Pellet in einem Rest
Die Quali tät des A usstriches (mög lichst g eringes des Überstandes durch sanftes Pipettieren.
Überlagern der S permien a uf dem Ob jektträger) 4. ersuchen
V Sie, die höchstmögliche Spermien-
hängt ab: konzentration zu erreichen, die allerdings
5 om Volumen
v des Ejakulates und der Sper- nicht 50 × 106 /mlüberschreiten sollte.
mienkonzentration: je weniger Spermien, 5. ehandeln
B Sie die Probe dann wie eine norma-
desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass le Probe.
sie einander überlagern;
5 om Winkel
v des aufliegenden, ausziehenden Anmerkung
Zentrifugation k ann die Spermienmorpholog ie v erändern
Objektträgers (Hotchkiss 1945): je kleiner der
und muss dokumentiert werden.
Winkel, desto dünner der Ausstrich;
5 on der v Geschwindigkeit des Ausstreichens
(Eliasson 1971): je rascher die Bewegung, desto isköse
V Ejakulatproben
dicker der Ausstrich. Manchmal ist es aufgrund einer erhöhten Ejakulat-
viskosität schwierig, einen guten Ausstrich anzufer-
Beginnen Sie mit einem Volumen von 10 µl, einem tigen. Die erhöhte Viskosität kann zu ungleichmä-
Winkel von 45° und einer A usstrichzeit von 1 Se- ßig dic ken A usstrichen f ühren. V isköse E jakulat-
kunde. Diese Parameter können, wenn nötig, vari- proben können entweder wie schlecht liquifizierte
iert werden, um die Überlagerung von Spermien zu Proben behandelt oder gewaschen werden.
reduzieren (Menkveld et al . 1990). Die A usstrich- Anmerkung
methode funktioniert gut, wenn die Viskosität des Diese Prozeduren können die Spermienmorpholog ie verän-
Ejakulates niedrig ist. Für sehr visköse Ejakulate ist dern und müssen dokumentiert werden.
sie ungeeignet (. Abb. 2.12).
eBi geringen Spermienkonzentrationen
(<2 × 106/ml), viskösen oder zellreichen Ejakulaten
oder b ei co mputerunterstützter M orphologieana-
lyse (7 Abschn. 3.5.4 können
) unterschiedliche Vor-
gehensweisen sinnvoll sein.
aschen
W von zellreichen oder viskösen Kommentar
Ejakulaten und Reduzieren von Die Hintergrundfärbung beim Ausstrich kann redu-
Hintergrundartefakten für die ziert werden, indem man die Ejakulatpr obe länger
2 computerunterstützte Spermienmor- als 30 M inuten liquifizieren lässt, bev or der A us-
phometrie strich angefertigt wird.
Zellen und gr ößere zus ammenhängende P arti-
kel im E jakulat (wie in visk ösen P roben) k önnen
dazu führen, dass die S permien mit ihren Köpfen 42.1 ärbemethoden
F
an Ecken aufliegen und ihre Beurteilung erschwert
wird. Dies e P roben k önnen wie f olgt g ewaschen Wenn die A usstriche l uftgetrocknet sind , s ollten
werden: sie fixiert und g efärbt werden, um die D etails der
. 1 erdünnen
V Sie ein Aliquot des Ejakulates Spermien darzustellen. Die Verwendung der Papa-
(0,2–0,5 ml, abhängig von der Spermienkon- nicolaou-, der Shorr- oder der Diff-Quik-Färbung
zentration) mit 10 ml normaler Kochsalzlö- wird empfohlen.
sung (0,9 g Natriumchlorid, NaCl, auf 100 ml Alle drei Methoden färben in der A uflichtmi-
destilliertes Wasser) bei Raumtemperatur. kroskopie den S permienkopf s chwach blau in der
2. entrifugieren
Z Sie bei 800 g für 10 Minuten. Akrosomenregion und dunkelblau in der postakro-
. 3 ekantieren
D Sie den Überstand. somalen Region. Das Mittelstück kann eine gewisse
. 4 esuspendieren
R Sie das Pellet mit dem rest- Rotfärbung zeigen, und der S chwanz ist en tweder
lichen Überstand (typischerweise 20–40 μl) blau oder rötlich gefärbt. Überschüssiges residuales
durch sanftes Pipettieren. Zytoplasma, das gewöhnlich hinter dem Kopf und
5. ertigen
F Sie den Ausstrich an, indem Sie um das Mittelstück herum lokalisiert ist, wird pink
5–10 μl der Spermiensuspension mit einer oder r ot (P apanicolaou-Färbung) o der r ötlich-
Pasteurpipette auf einem Objektträger aus- orange (Shorr-Färbung) angefärbt.
streichen (. Abb. 2.11b).
6. Analysieren Sie den Objektträger mit einem Kommentar
Phasenkontrastmikroskop bei 400facher Ver- Rasche Färbemethoden, bei denen einTropfen Ejaku-
größerung, um sicherzustellen, dass der Aus- lat einem Fixans und einer F ärbung bereits auf dem
strich gleichmäßig verteilt ist. Objektträger beigemengt werden, sind kommerziell
. 7 berprüfen
Ü Sie, ob wenigstens 40 Spermien erhältlich. Diese sind jedoch nicht empf ehlenswert,
bei 400fac her Vergrößerung ohne Verklum- da sie aufgrund der fehlenden gleichmäßigen Aus-
pung oder Überlagerung vorhanden sind. strichtechnik der Spermien auf dem Objektträger
8. rocknen
T Sie den Objektträger an der Luft und eine Beurteilung der Spermiendetails, die für die hier
färben Sie wie in Abschnitt 2.14 beschrieben. beschriebene Klassifikation der Spermienmorpholo-
gie Voraussetzung sind, nicht erlauben.
Anmerkung
Wenn zu viele Spermien auf dem Objektträger sich überla-
gern, fertigen Sie einen neuen Ausstrich mit einem kleineren
Aliquot der Ejakulatprobe an. 4.1
2.1 raditionelle
T Fixierung und
sequentielle Färbung
Anmerkung
Wenn zu we nige Spermien auf dem Objektträger sind, ferti- Dieser Prozess besteht aus den folgenden Schritten:
gen Sie einen neuen A usstrich mit einem g rößeren Aliquot
der Ejakulatprobe an. – Ethanol umdie Zellen zu fixieren und
gleichzeitig zu dehydrieren;
Anmerkungen
Das Waschen der Probe kann die Spermienmorphologie ver- – ufstei-
A zurschrittweisen Rehydrierung
ändern und muss dokumentiert werden. gende bzw. der fixierten Ausstriche, um eine
absteigende Färbung mit dem wasserlös-
Ethanolreihe lichen Haematoxylin zu ermög-
lichen
2.14 • Färbemethoden
57 2
– Destillier
tes zurRehydrierung getrockneter
Wasser Ausstriche, um eine Färbung mit Kasten 2.14 Einbettmedien
dem wasserlöslichen Haemato-
Objektträger können eingebettet oder nicht ein-
xylin zu ermöglichen;
gebettet (mit oder ohne Deckglas) mikroskopiert
– Haemat
oxylin umden Kern blau zu färben werden. Das Einbetten der Objektträger erlaubt
eine langfristige Aufbewahrung, so dass eine er-
– eitungs-
L umungebundenes nukleäres
neute Beurteilung, falls erforderlich, möglich ist,
wasser Haematoxylin zu entfernen
sowie die Nutzung in der internen Qualitätskont-
– erdünnte
v umnichtspezifisch gebundenes rolle. Der Refraktionsindex (RI) der Einbettmedien
Salzsäure Färbemittel aus dem Zytoplasma nach dem Trocknen (1,50–1,55) ist ähnlich wie der
(HCl) zu entfernen (entfärben) von Glas (1,50–1,58). Die beste optische Qualität
wird mit der Ölimmersionsmikroskopie erreicht
– eitungs-
L um den Säuregehalt zu reduzie- (ähnlicher RI 1,52).
wasser ren und den Kern wieder blau
zu färben
– cott-Lösung
S umdie Blaufärbung des Kernes
wieder herzustellen (falls Lei- träger, die mit der Papanicolaou-Technik gefärbt
tungswasser nicht ausreichend wurden, k önnen la ngfristig ein gebettet und f ür
ist) zukünftige Verwendung in internen Qualitätskon-
– Ethanol umdie Ausstriche zu dehydrie- trollprogrammen aufgehoben werden. Wenn sie im
ren und die Färbung mit dem Dunkeln gelagert werden, sind sie f ür Monate bis
Ethanol-löslichen Orange G/ Jahre stabil.
EA-50 zu ermöglichen
Die f olgende M ethode wur de v erwendet, um
– Orange
G umdas Zytoplasma pink zu die Bildtafeln von Objektträgern in diesem Manual
färben anzufertigen, die in E thanol-unlöslichem Einbett-
– A-50
E (Poly- um das Zytoplasma pink zu medium eingedeckt wurden.
chrom) färben
– ufstei-
A um die gefärbten Ausstriche Reagenzien
gende bzw. schrittweise zu dehydrieren für 1. apanicolaou-Färbebestandteile:
P Kommerziell
absteigende die Verwendung von Ethanol- erhältlich oder 7 Kap. 11, 7 Abschn. 11.10 .
Ethanolreihe löslichen Einbettmedien . 2 erdünnte
V Salzsäure (HCl): Fügen Sie 1,0 ml
– ylen
X zurVerwendung von Ethanol- konzentrierter Salzsäure zu 200 ml des 70%
löslichem Einbettmedium (v/v) Ethanols hinzu.
. 3 ylen:
X Ethanol, 1+ 1 (1 : 2): Mischen Sie gleiche
Anteile 100% Ethanol und Xylen.
4.2 aPpanicolaou-Färbung für die

2.1 Anmerkung
Xylen ist ein gesundheitsschädliches A gens und sollt e nur
Spermienmorphologie
unter einer Dunstabzugshaube verwendet werden.
Die P apanicolaou-Färbung erla ubt eine gu te F är- Anmerkung

bung von Spermien und a nderen Z ellen. Sie färbt Ausstriche sollten mindestens 4 Stunden luftgetrocknet wer-
das Akrosom und die p ostakrosomale Region des den. Sie können bis zu 1Woche aufbewahrt werden, bevor sie
Kopfes, das üb erschüssige r esiduale Z ytoplasma, fixiert und gefärbt werden.
das Mittelstück und das Hauptstück an. Die mo-

difizierte Färbetechnik, die hier b eschrieben wird,
ist nachweislich für die Analyse der Spermienmor- ixierung
F der luftgetrockneten
phologie und die B eurteilung imma turer Keim- Ejakulatausstriche
zellen sowie anderer Zellen ( 7 Bildtafeln 1–14) ver- 1. Ein
tauchen der Objektträger in 95% (v/v)
wendbar. Ro utineverfahren wur den mo difiziert, Ethanol für mindestens 15 Minuten.
um ohne Äther (als Fixa ns) oder Xylen (zum Ein-
betten) zu arbeiten (ESHRE/NAFA 2002). Objekt-
ärbung
F der fixierten Ejakulatausstriche ehandlung
B der gefärbten Ausstriche
Die Objektträger werden sukzessive eingetaucht in: vor dem Einbetten
Es gibt zwei Ar ten von Flüssigkeiten f ür das Ein-
2 1.Ethanol 80% (v/v) 30 ekunden
S betten der P räparate: E thanol-lösliche und E tha-
2.Ethanol 50% (v/v) 30 ekunden
S
nol-unlösliche Einbettmedien.
5 erwendenV Sie Ethanol-lösliches Einbett-
3.Aquadest 30 ekunden
S
medium direkt auf den noch mit Ethanol be-
4.Harris-Haematoxylin 4 iM
nuten feuchteten Objektträgern.
5.Aquadest 30 ekunden
S 5 ür die F Ethanol-unlöslichen Einbettmedien
werden die Objektträger direkt nach Schritt 19
6.Verdünnte Salzsäure 4- bis 8-mal eintau-
(Salzsäure, 0,25%) chen*
unter einer Dunstabzugshaube wie folgt be-
arbeitet:
7.Kaltes Leitungswasser 5 iM
nuten 1. Xylen : Ethanol, 1+ 1 (1 : 2): ü
f r 1 Minute
S 2.Xylen 100%: für 1 Minute
S
Entfernen Sie einen nac h dem a nderen Objektträ-
10. Ethanol 95% (v/v) mindestens 15 Minuten
ger aus dem Xylenbad und lassen Sie nur ein kurzes
11.
Orange G 1 iM
nute Ablaufen f ür 1–2 S ekunden zu . D er Ob jektträger
S sollte noch feucht sein, wenn er eingebettet wird.
S
Einbetten
der gefärbten
S Ejakulatausstriche
15.Polychrom, EA-50 30 ekunden
S 1. eben
G Sie zwei oder drei Tropfen des Einbett-
mediums auf den Objektträger.
16.Ethanol 95% 30 ekunden
S
2. tzieren
Pla Sie ein Deckglas (24 × 50 mm oder
S 24 × 60 mm sind am einfachsten zu handha-
S ben) direkt auf dem Ausstrich.
9.
1 Ethanol 99% 30 ekunden
S
3. ositionieren
P Sie das Deckglas von einer der
Längsseiten mit Kontakt zum Einbettmedium,
* Einmal Eintauchen für jeweils ca. 1 Sekunde
sodass Lufteinschlüsse vermieden werden.
4. allsF notwendig, drücken Sie sanft auf das
Deckglas, um Luftblasen zu den Ecken zu
Anmerkung
Ethanolfixierung deh ydriert Z ellen. Deshalb brauchen A us- manövrieren.
striche, die direkt von der Fixierung in 95% Ethanol in die Fär- 5. ischen
W Sie überschüssiges Xylen unterhalb
bung genommen w erden, nur 10 Sekunden in 80% Alkohol , des Objektträgers weg.
während A usstriche, die nach der F ixierung luf tgetrocknet 6. assen
L Sie den eingebetteten und eingedeckten
sind, deutlich länger (2–3 Minuten) in 50% Ethanol verbleiben
Objektträger waagerecht in einem entspre-
müssen.
chenden Ständer oder auf einem absorbieren-
Anmerkung den Papier für 24 Stunden unter einer Dunst-
Bei Schritt 6 beginnen Sie zunächst mit 4-mal Eintauchen und abzugshaube trocknen.
fahren fort, bis die Ergebnisse zufriedenstellend sind. Es han-
delt sich hierbei um einen kritischen Schritt, da die Dauer des
Entfärbens erheblich das endgültige Färbeergebnis beein-
flusst. Wird dieser Schritt ausgelassen, werden die Spermien
4.3
2.1 Shorr-F
ärbung für die
und der Hintergrund dunkel. Eine Erhöhung der Eintauchvor- Spermienmorphologie
gänge färbt Spermien und Hintergrund schwächer.
Die S horr-Färbung lief ert v ergleichbare P rozent-
Anmerkung anteile normaler Spermien wie die Papanicolaou-
Die Objektträger können mit oder ohne Einbettung beurteilt Färbung (Meschede et al. 1993).
werden.
2.14 • Färbemethoden
59 2
Reagenzien 4.4
2.1 cShnellfärbemethoden für die
1. arris-Haematoxylin:
H Papanicolaou Nr. 1. Spermienmorphologie
2. horr-Lösung:
S Fertig kaufen oder selber her-
stellen wie folgt: Lösen Sie 4 g Shorr-Pulver in Schnellfärbemethoden s ind i nsbesondere f ür L a-
220 ml warmem 50% Ethanol. Lassen Sie die bore sinnvoll, die die Er gebnisse a m Tag der E ja-
Lösung abkühlen, fügen Sie 2,0 ml Eisessig im kulatanalyse b enötigen. E s g ibt verschiedene F är-
Abzug hinzu und filtrieren. besets (K ruger et al . 1987). Einige Ausstriche, die
3. erdünnte
V Salzsäure: 25 ml Eisessig zu 75 ml mit S chnellfärbemethoden gefärbt wurden, haben
95% (v/v) Ethanol hinzugeben. eine hohe Hintergrundfärbung und eine geringere
4. Ammo nium-Alkohol: Fügen Sie 5 ml von 25% Qualität als die mit Papanicolaou gefärbten.
(v/v) Ammoniumhydroxid zu 95 ml 75% (v/v)
Ethanol hinzu. Reagenzien
1. asDDiff-Quik-Schnellfärbekit besteht aus:
ixierung
F der luftgetrockneten a. Fixierreagenz (Triarylmethan-Färbemittel,
Ejakulatausstriche aufgelöst in Methanol)
Tauchen Sie die Objektträger in verdünnte Salzsäu- . b ärbelösung
F 1 (eosinophiles Xanthen)
re oder 75% (v/v) Ethanol für 1 Stunde. c. ärbelösung
F 2 (basophiles Thiazin)
2. Fixa
ns: 1,8 mg Triarylmethan, aufgelöst in
ärbung
F der fixierten Ejakulatausstriche 1000 ml 95% (v/v) Ethanol, optional
Sukzessives Eintauchen der Objektträger in: 3. Fixa
ns: Methanol 95% (v/v), optional
1.Fließendes Leitungs- 12-bis 15-maleintauchen* ixierung

F der luftgetrockneten
wasser Ejakulatausstriche
2.Haematoxylin 1–2Minuten Tauchen S ie die Ob jektträger in T riarylmethanfi-
xans (wie im Diff-Quik-Kit b eigefügt o der herge-
3.Fließendes Leitungs- 12-bis 15-maleintauchen*
wasser stellt wie oben angegeben) für 15 Sekunden ein oder
in 95% Methanol allein für 1 Stunde. Überschüssige
4.Ammonium-Alkohol 10maleintauchen
Lösung a blaufen lass en, indem die Ob jektträger
5.Fließendes Leitungs- 12-bis 15-maleintauchen* senkrecht a uf einem a bsorbierenden Papier a bge-
wasser
stellt werden.
6.Ethanol 50% (v/v) 5 iM
nuten
7.Shorr-Färbung 3–5Minuten ärbung

F der fixierten Ejakulatausstriche
Sukzessives Eintauchen der Objektträger in:
nuten

nuten 1.Schnellfärbelö- 10 ekunden
S
sung 1
10.Ethanol85% (v/v) 5 iM
nuten
2.Schnellfärbelö- 5 ekunden
S
* Einmal eintauchen für jeweils ca. 1 Sekunde
sung 2
3.Fließendes Lei- 10- bis 15-mal,um überschüs-

Anmerkung
tungswasser sige Farbe abzuspülen
Die Objektträger können eingebettet oder uneingebettet mi-
kroskopisch beurteilt werden.
erschüssige
Üb Flüssigkeit bei jedem Schritt ablau-
Einbetten
der gefärbten fen lass en, indem die Ob jektträger s enkrecht a uf
Ejakulatausstriche einem absorbierenden Papier platziert werden.
Siehe 7 Abschn. 2.14.2 »Behandlung
, der gefärbten Anmerkung
Ausstriche vor dem Einbetten« und »Einbetten der Die Objektträger können eingebettet oder uneingebettet mi-
gefärbten Ejakulatausstriche«. kroskopisch beurteilt werden.
Anmerkung Hals, M ittelstück, H auptstück und Endstück, die

Liegt eine hohe H intergrundfärbung v or, dann sollt e ein Ali-
jedoch in der p raktischen üb lichen mo rphologi-
quot des Ejakulat es gewaschen so wie ein neuer Objektträger
schen Beurteilung keine Relevanz besitzt und des-
vorbereitet und gefärbt w erden. Waschen kann die Spermien-
2 wegen im Folgenden keine Anwendung findet.). Da
morphologie beeinträchtigen und muss dokumentiert werden.
der Schwanz mit einem Lichtmikroskop schwer zu
sehen ist, k önnte ma n s agen, die Z elle s etzt sic h
Einbetten
der gefärbten zusammen a us K opf (und H als) und S chwanz
Ejakulatausstriche (Mittelstück und S chwanz). Um als no rmal einge-
Siehe 7 Abschn. 2.14.2 »Behandlung
, der gefärbten stuft zu werden, muss ein Spermium sowohl einen
Ausstriche vor dem Einbetten« und »Einbetten der normalen Kopf als a uch einen no rmalen Schwanz
gefärbten Ejakulatausstriche«. aufweisen. Alle grenzwertigen Formen sollten als
abnormal betrachtet werden.
5 er Kopf D sollte glatt, mit regelmäßigen Kon-
2.15 eBurteilung der gefärbten turen und allgemein von ovaler Form sein. Es
Präparate sollte eine klar abgegrenzte Akrosomregion
vorhanden sein, die 40–70% des Kopfbereiches
Bei gefärbten Präparaten sollte mindestens ein umfasst (Menkveld et al. 2001). Die Akro-
×100 Ölimmer sions-Hellfeld-Objektiv und w e- somregion sollte keine großen Vakuolen und
nigstens ein ×10 Okular verwendet werden. Klarere nicht mehr als zwei kleine Vakuolen enthalten,
Bilder werden mit einem Fluid mit ähnlichem Re- die nicht mehr als 20% des Spermienkopfes
fraktionsindex ( RI) d er Z ellen ( von ungefähr 1,5) einnehmen sollten. Die Postakrosomalregion
und des Glas es (1,50–1,58) erreicht, w enn dies es sollte keine Vakuolen enthalten.
zwischen der L inse und dem nic ht ein gebetteten 5 as Mittelstück
D sollte schlank, regelmäßig und
Präparat oder dem Deckglas verwendet wird. Hier- etwa von derselben Länge wie der Spermien-
für eignet sic h no rmalerweise I mmersionsöl (RI kopf sein. Die Hauptachse des Mittelstücks
1,52). Ein bettmedien ha ben einen ähnlic hen Re- sollte in einer Linie mit der Hauptachse des
fraktionsindex (1,50–1,55; 7 Kasten 2.14 ). Spermienkopfes verlaufen. Residuales Zyto-
plasma wird lediglich dann als Anomalie
betrachtet, wenn übermäßig viel davon vor-
Klassifizierung der normalen
2.15.1 handen ist, d.h. wenn mehr als ein Drittel der
Spermienmorphologie Spermienkopfgröße davon eingenommen wird
(Mortimer u. Menkveld 2001).
Die Beurteilung der Spermienmorphologie ist mit 5 er Schwanz D sollte ein einheitliches Kaliber
zahlreichen Schwierigkeiten behaftet, die durch feh- über seine gesamte Länge aufweisen, dünner
lende Ob jektivität, Variation in der I nterpretation als das Mittelstück und etwa 45 μm lang sein
oder schlechtes Abschneiden in der ext ernen Qua- (ca. 10fache Kopflänge). Er kann eine Schleife
litätskontrolle verursacht werden (7 Abschn. 7.13.2 ). mit sich selbst bilden (. Abb. 2.10c), darf je-
Die hier em pfohlene M ethode ist ei ne ein fache doch keinen scharfen Winkel als Hinweis auf
Unterscheidung in no rmal/abnormal mi t der Op- einen Geißelbruch aufweisen.
tion, die Abweichungen von der Norm genau zu
lokalisieren. Die nac hfolgenden K riterien s ollten Kommentar
Anwendung finden bei der Beurteilung der norma- Bei dieser Beur teilungstechnik ist die F orm des
len Morphologie der Spermien (Kruger et al. 1986; Spermienkopfes wichtiger als seine Gr öße, es sei
Menkveld et al. 1990; Coetzee et al. 1998). Der ange- denn, diese ist eindeutig abnormal.
gebene Referenzbereich (7 Abschn. 2.17.3 ist) nur va-
lide, wenn die angegebene Technik verwendet wird. Kommentar
Spermien bestehen aus einem Kopf, Hals, Mit- Bei der Unterscheidung normal und abnormal gro-
telstück und Schwanz (Anmerkung: Die WH O ßer Spermienköpf e k ann ein Okular-M ikrometer
kennt im Or iginal auch die U nterteilung in K opf, nützlich sein.
2.15 • Beurteilung der gefärbten Präparate
61 2
Kommentar eine a bnormale D NA a ufweisen. M orphologische
Die Kopfausmessung v on 77 Papanicolaou-gefärb- Defekte sind mit einer erhöhten DNA-Fragmen-
ten Spermien (gefärbt entsprechend des Protokolls tierung (Gandini et al. 2000), einer erhöhten I n-
aus 7 Abschn. 2.14.2und als normal klassifiziert zidenz str uktureller Chr omosomenaberrationen
nach den hier angegebenen K riterien), die mit (Lee et al. 1996), immaturem Chromatin (Dadoune
einem c omputergestützten S ystem ausgemessen et al. 1988) und Aneuploidie (Devillard et al. 2002;
wurden (Variationskoeffizient für wiederholte Mes- Martin et al . 200 3) assoziiert. Daher wird der B e-
sungen 2–7%) ergab die folgenden Maße: mediane urteilung der Kopfform besondere Bedeutung bei-
Länge 4,1 µm, 95% CI 3,7–4,7; mediane Br
eite 2,8 µm, gemessen, wenngleich auch der Spermienschwanz
95% CI 2,5–3,2; medianesVerhältnis Länge zu Breite (Mittelstück und Schwanz) beurteilt wird.
1,5, 95% CI 1,3–1,8. Die folgenden Defektkategorien sollten Beach-
tung finden (. Abb. 2.13):
Kommentar 5 Kopfdefekte: groß oder klein, kegelförmig,
Die M ittelstück-Ausmessung v on 7 4 P apanicola- birnenförmig, rund, amorph, vakuolisiert
ou-gefärbten Spermien (gefärbt entspre chend des (mehr als zwei Vakuolen oder > 20%des
Protokolls aus 7 Abschn. 2.14.2
undals normal klas- Kopfbereichs werden von ungefärbten Vaku-
sifiziert nach den hier angegebenen K riterien), die olenbereichen eingenommen), Vakuolen in
mit demselben computergestützten System ausge- der Postakrosomalregion, kleine oder große
messen wurden, ergab die folgenden Maße: media- Akrosomenbereiche (<40% oder > 70%des
ne Länge 4,0 µm, 95% CI 3,3–5,2; mediane Breite 0,6 Kopfbereiches), doppelte Köpfe oder jegliche
µm, 95% CI 0,5–0,7. Kombination all dessen.
5 Hals- und Mittelstückdefekte: asymmetri-
Kommentar scher Ansatz des Mittelstücks am Kopf, dick
Aufgerollte Schwänze (> 360°; . Abb. 2.13 m)
kön- oder unregelmäßig, scharf gebogen, abnormal
nen ein H inweis auf eine Nebenhodendy sfunktion dünn oder jegliche Kombination all dessen.
sein (Pelfrey et al. 1982). 5 Schwanzdefekte: kurz, mehrfach vorhanden,
gebrochen, glatte Haarnadelkurven, scharf ab-
Die B eurteilung einer no rmalen S permienmor- gewinkelte Kurven, unregelmäßige Breite, auf-
phologie kann am besten erfolgen, wenn man die gerollt oder jegliche Kombination all dessen.
feinen Formvariationen beim gesamten Spermium 5 Überschüssiges residuales Zytoplasma (ex-
erlernt (normale/grenzwertige Spermienköpfe und cess residual cytoplasm: ERC): Dies wird asso-
-schwänze; siehe 7 Abschn. 2.16, Tafel 1–12 und die ziiert mit abnormalen Spermien, die aus einem
Kommentare dazu). fehlerhaften Spermatogeneseprozess hervorge-
hen. Spermien, die charakterisiert sind durch
große Mengen unregelmäßig gefärbten Zyto-
Klassifikation der abnormalen
2.15.2 plasmas (≥ ein Drittel der Spermienkopfgrö-
Spermienmorphologie ße), die häufig assoziiert sind mit fehlerhaften
Mittelstücken (Mortimer u. Menkveld 2001),
Humane Sa menproben en thalten S permien mi t sind abnormal. Dieser abnormale Überschuss
verschiedensten Fehlbildungen. E ine fehlerhafte an Zytoplasma sollte nicht Zytoplasmatröpf-
Spermatogenese und einig e N ebenhodenpatho- chen genannt werden (Cooper 2005).
logien werden gewöhnlich mit einem erhöhten
Prozentsatz abnormal geformter Spermien in Ver- Kommentar
bindung g ebracht. Die mo rphologischen D efekte Zytoplasmatröpfchen (membrangebundene Vesi-
treten üb licherweise k ombiniert a uf. A bnormale kel auf dem M ittelstück im Ber eich des Kopf-Hals-
Spermien verfügen im Allgemeinen in Abhängig- Übergangs) sind normaler Bestandt eil ph ysiolo-
keit v on der Ar t der Ano malietypen üb er ein g e- gisch arbeit ender menschlicher Spermien. Sind
ringeres Fertilisierungspotential und k önnen auch sie angeschwollen, so können sie sich entlang der
A. Kopfdefekte
2 (a)
langgezogen
(b)
piriform
(c)
rund
(d)
amorph
(e)
vakuolisiert
(f)
kleines
Akrosom
kein
klein
Akrosom
B. Hals- und Mittelstückdefekte C. Schwanzdefekte D. Überschüssiges

residuales
Zytoplasma
(g) (h) (i) (j) (k) (l) (m) (n)
abgeknickter asymmetrisch verdickter dünner zu kurz gebogen geringelt > ein Drittel des
Halsansatz Ansatz Ansatz Kopfes
. Abb. 2.13 Schematische Zeichnungen einiger abnormaler Formen menschlicher Spermien (modifiziert nach Kruger et al.
1993, reproduziert mit Erlaubnis von MQ Medical)
Länge des M ittelstücks ausbreiten, wie dur ch Pha- A

bbildungen zur
2.16
senkontrast-, Differenzialinterferenzkontrast- und Spermienmorphologie
Röntgenmikroskopie lebender Z ellen im Ejakulat,
im Zervikalmukus und im M edium zu beobacht en Alle mikroskopischen Bildtafeln 1–14 wurden nach
ist (Abraham-Peskir et al. 2002; Fetic et al. 2006). der s trikten A nwendung d er o ben g eschilderten
strengen morphologischen Kriterien beurteilt. Die
Kommentar Analyse d er S permienmorphologie i st su bjektiv
Zytoplasmatröpfchen sind osmotisch empfindlich und ganz b esonders s chwierig zu st andardisieren.
und bleiben bei r outinemäßigen L ufttrocknungs- Sie ziel t a uf die a rtifizielle U nterscheidung zwi-
prozeduren nicht gut erhalt en ( Chantler u . Abra- schen normalen und abnormalen Zellen, und zwar
ham-Peskir 2004; Cooper et al. 2004). Sie sind in ge- auf der B asis einer V ielzahl v on Cha rakteristika
färbten Präparaten nicht deutlich zu erkennen und von S permienköpfen und -s chwänzen. Die B ild-
können dor t als k leine A usdehnungen des M ittel- tafeln wur den v on einem einzig en Exp erten, Dr .
stücks erscheinen. Z ytoplasmatröpfchen sind w e- Thinus Kruger, analysiert. Die Analysen wurden
niger als ein Dritt el so g roß wie der Spermienkopf unterfüttert mi t zus ätzlichen K ommentaren, um
in fixierten und gefärbt en Präparaten (Mortimer u. eine Einhei tlichkeit der B eschreibungen aller A b-
Menkveld 2001) und werden nicht als abnormal be- normalitäten sicherzustellen.
trachtet.
2.16 • Abbildungen zur Spermienmorphologie
63 2
. Tab. 2.6 Erläut
erungen, die in den Kommentaren . Tab. 2.6 Fortsetzung
zu den Bildtafeln 1–14Verwendung finden
kein Akrosom ehlendes
f Akrosom
< 40%acr weniger als 40% des Spermienkop-
fes sind vom Akrosom eingenom- klein Kopfgröße
men Makrophage phagozytierender Leukozyt
> 70%acr mehr als 70% des Spermienkopfes Monozyt agranulärer Leukozyt
sind vom Akrosom eingenommen
nichtbeurteilt wegen Überlagerung oder
> einDrittel abnormales Zytoplasma (mehr als schlechtem Fokus
ein Drittel der Kopfgröße) (ERC =
excess residual cytoplasm) normal denenim endozervikalen Mukus
ähnlich
< einDrittel abnormalesZytoplasma (weniger
als ein Drittel der Kopfgröße) (ERC) P
A vac Vakuole in der postakrosomalen
Region
> 2vac mehrals 2 Vakuolen
Pinhead keinSpermium; kein Chromatin
abgeflacht Basis des Spermienkopfes nicht vorhanden
oval
piriform Kopfform (. Abb. 2.13b)
abnormal selbsterklärend
polymorph polymorphkernigerLeukozyt
amorph Kopfform (. Abb. 2.13d)
rund Kopfform (. Abb. 2.13c)
Ansatz der Ansatz des Schwanzes ist zu
einer Seite der Längsachse des Seitenbild Spermiumvon der Seite gesehen
Kopfes verschoben
Spermatide immature Keimzelle
bacilli Bakterien
Spermatozyte immature Keimzelle
CD Zytoplasmatropfen
langgestreckt Kopfform
geringelt selbsterklärend
überlappend Überlagerungder Köpfe durch
defekt selbsterklärend Schwänze
degenerieren- selbsterklärend umgeschla- der Schwanz ist um sich selbst

der Leukozyt gen nach oben gebogen
degenerieren- selbsterklärend vac Vakuole

des Spermium
zulang selbsterklärend
dick selbsterklärend
Zytoplasma entweder überschüssiges residua-
doppelt selbsterklärend les Zytoplasma oder Zytoplasma-
tropfen, abhängig von der Größe
epitheliale aus dem männlichen duktalen
Zelle System
ERC überschüssigesresiduales Zyto-

plasma (excess residual cytoplasm) Gegenüber j eder f arbigen B ildtafel findet sich
falls PP O.K. nicht das gesamte Hauptstück des
eine Tabelle, die die M orphologieanalyse eines je-
Spermiums ist in der Abbildung zu den a bgebildeten S permiums b eschreibt. Die T a-
sehen (aber falls es normal wäre, belle gibt an, ob die Kopfform normal oder abnor-
würde das gesamte Spermium als mal ist, gib t Detailangaben zu den K opfabnorma-
normal beurteilt) litäten zusätzlich zur Form. Sie gibt Informationen
Fokus außerhalbdes Fokus (nicht be- darüber, ob das Mittelstück oder Halsstück normal
urteilt) in der Form ist und ob d as S permium insgesamt
gebogen unnatürlichscharfe Abknickung als normal a ngesehen w erden ka nn. Weitere rele-
(siehe Abb. 2.13 g und j) vante Anmerk ungen sind un ter »K ommentare«
irreg unregelmäßig in den Umrissen aufgeführt. Die Kommentare sind in der . Tab. 2.6
genauer erläutert.
2
65 2
orphologiebeurteilung
M der Spermien in Bildtafel 1
Sper- Kopfform Andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommentare

mium mentare zum Kommentare Kommentare klassifikation
Kopf
1 normal normal normal fallsPP O.K.
14 normal normal normal fallsPP O.K

2
67 2
Morphologiebeurteilung der Spermien auf Bildtafel 2
Sper- Kopfform Andere Kom- Mittelstück Kom- Hauptstück Gesamtspermien- Kommen-

mium mentare zum mentare Kommentare klassifikation tare
Kopf
1 abnormal dick doppelt abnormal
2 abnormal irreg abnormal Seitenbild
3 abnormal piriform gebogen,irreg, abnormal > ein Drittel
ERC
4 abnormal abnormal
5 abnormal piriform abnormal
6 abnormal abnormal
7 abnormal abnormal
8 abnormal dick abnormal
9 abnormal Ansatz abnormal
10 abnormal abnormal
12 abnormal piriform gebogen abnormal
13 abnormal >2 vac, PA vac abnormal
15 abnormal piriform dick,ERC abnormal > ein Drittel
16 abnormal piriform ERC abnormal > ein Drittel
17 normal P
A vac abnormal
18 abnormal dick,Ansatz abnormal
91 abnormal abnormal abnormal
2
2
2 abnormal abnormal
2
3 abnormal abnormal
42 normal > 2vac dick abnormal
25 abnormal dick,gebogen abnormal
27 abnormal > 70%acr dick abnormal
31 abnormal piriform dick abnormal
32 abnormal klein dick abnormal
33 abnormal klein dick abnormal
34 abnormal ERC abnormal > ein Drittel
2
69 2
Sper- Kopfform Andere Kommen- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kom-

mium tare zum Kopf Kommentare Kommentare klassifikation mentare
1 abnormal langgestreckt dick abnormal

2 abnormal abnormal
3 abnormal irreg abnormal
4 abnormal rund abnormal
6 abnormal langgestreckt abnormal
8 abnormal amorph dick abnormal
9 abnormal rund dick abnormal
10 abnormal langgestreckt irreg, dick abnormal
11 – – 2 ellen
Z
12 abnormal >2 vac, PA vac abnormal
14 normal P
A vac abnormal
15 – – Pinhead
16 abnormal klein abnormal
17 abnormal groß abnormal
18 normal dick abnormal
20 abnormal > 2vac Ansatz abnormal
2
1 normal > 70%acr abnormal
2 abnormal > 70%acr abnormal
2
3 abnormal <40% acr, klein abnormal
2
2
2
7 abnormal <40% acr, > 2vac irreg abnormal
2
8 normal > 2vac abnormal

34 abnormal < 40%acr dick abnormal

36 – – Pinhead
2
71 2
M der Spermien auf Bildtafel 4
Sper- Kopfform Andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtsper- Kommen-

mium mentare zum Kommentare Kommentare mienklassifika- tare
Kopf tion
1 abnormal abgeflacht dick abnormal
2 normal dick,gebogen abnormal
7 abnormal irreg abnormal
9 normal Ansatz,gebogen abnormal
11 abnormal P
A vac abnormal
13 abnormal <40% acr, > 2vac dick abnormal
14 normal irreg abnormal
15 normal Ansatz abnormal
17 normal Ansatz,dick abnormal
18 normal dick,zu lang abnormal
91 normal < 40%acr Ansatz abnormal
2
0 normal < 40%acr irreg abnormal
2
73 2
Sper- Kopfform andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtsper- Kommen-

mium mentare zum Kommentare Kommentare mienklassifika- tare
Kopf tion
1 abnormal ERC abnormal > ein Drittel
2 normal gebogen normal abnormal
3 abnormal > 70%acr umgeschlagen abnormal
5 normal dick umgeschlagen abnormal
6 abnormal P
A vac geringelt abnormal
7 normal normal
8 normal doppelt abnormal
9 abnormal geringelt abnormal
10 abnormal gebogen, geringelt abnormal

Ansatz
11 normal dick gebogen abnormal

2
75 2
Sper- Kopfform Andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommen-

mium mentare zum Kommentare Kommentare klassifikation tare
Kopf
1 normal < 40%acr dick normal abnormal
3 normal normal
6 nichtklassifizierbar abnormales
Spermium
7 abnormal dick geringelt abnormal
8 Epithelzelle
9 normal dick,Ansatz abnormal
12 degenerie-
rende Mak-
rophage?
13 polymorph
15 normal normal
16 abnormal < 40%acr abnormal
17 abnormal rund nichtgesehen abnormal freier Kopf?
91 normal normal
20 normal normal fallsPP O.K.
21 abnormal abgeflacht abnormal
2 bacilli
42 normal dick geringelt abnormal
25 abnormal amorph abnormal
26 Spermatide
27 polymorph
2
77 2
Sper- Kopf- Andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommen-

mium form mentare zum Kommentare Kommentare klassifikation tare
Kopf
1 normal 2 ac
v normal
2 normal normal
4 normal normal
7 normal vacan Ober- normal

fläche
8 normal CD normal < einDrittel
9 abnormal dick,ERC abnormal > ein Drittel
10 normal normal
11 normal P
A vac umgeschlagen abnormal
13 normal P
A vac abnormal
14 normal P
A vac abnormal
71 normal normal
91 normal dick kurz abnormal
2 abnormal und
r abnormal
2
3 abnormal und
r abnormal
42 normal normal
25 Spermien-
kopf in Zy-
toplasma?
26 normal normal
27 normal keinAkrosom geringelt abnormal
28 normal normal
30 normal P
A vac abnormal
Fortsetzung
Sper- Kopf- Andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommen-

2 mium form mentare zum
Kopf
Kommentare Kommentare klassifikation tare
31 abnormal langgestreckt, abnormal

PA vac
33 normal normal
35 abnormal dick gebogen abnormal
39 normal normal
40 normal normal
41 normal normal
43 normal < 40%acr abnormal
44 nichtfokussiert nichtbe-
urteilt
47 normal normal

79 2
Sper- Kopfform Andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommen-

2 mium mentare zum
Kopf
1 normal normal normal
2 normal > 2vac normal abnormal
5 normal normal
9 normal normal
10 normal normal
11 normal P
A vac abnormal
12 normal normal
15 abnormal amorph defekt abnormal
17 abnormal > 70%acr dick,ERC abnormal > einDrittel
18 normal normal
91 Pinhead
20 normal normal
21 normal P
A vac abnormal
2 abnormal langgestreckt dick,ERC abnormal > ein Drittel
23 abnormal abgeflacht dick abnormal
2
5 abnormal und
r abnormal
2
2
2
8 normal >2 vac, > 70% abnormal
acr
2
9 abnormal abnormal

81 2
Sper- Kopfform Andere Kommen- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommentare

2 mium tare zum Kopf Kommentare Kommentare klassifikation
2 überlappend nichtbeurteilt
4 normal normal alls
f PP O.K.
f PP O.K.
6 normal > 70%acr Ansatz abnormal
8 normal > 70%acr Ansatz abnormal
9 abnormal P
A vac abnormal
01 normal > 2vac dick abnormal
11 abnormal dick,ERC abnormal > ein Drittel
12 abnormal dick,Ansatz, abnormal > ein Drittel
ERC

17 abnormal langgestreckt, 3 abnormal
vac, PA vac
81 normal normal
91 abnormal vac> 20% abnormal
21 normal P
A vac abnormal
2 abnormal amorph gebogen abnormal
23 abnormal langgestreckt doppelt abnormal
42 abnormal P
A vac abnormal
2
27 normal normal
34 normal dick dick,geringelt abnormal
35 abnormal 1eite
S nicht oval abnormal
83 2
Sper- Kopfform andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtspermien- Kommen-

2 mium mentare zum
Kopf
4 normal normal
6 abnormal piriform ERC gebogen abnormal > ein Drittel
7 normal normal
8 normal normal
9 normal 3 vac abnormal
11 abnormal langgestreckt, gebogen abnormal

< 40%acr
12 Monozyt
13 polymorph
14 polymorph
15 Monozyt
18 normal normal
91 normal normal
2

f PP O.K.
23 abnormal langgestreckt dick gebogen abnormal
42 überlappend nichtbe-
urteilt
2
6 abnormal amorph dick, ERC abnormal > ein Drittel
29 abnormal P
A vac abnormal

85 2
Fortsetzung

Kopf
urteilt
urteilt
35 abnormal amorph,kein dick abnormal

Akrosom
37 abnormal piriform dick doppelt abnormal
41 abnormal dick gebogen abnormal
43 normal 2vac, < 40%acr abnormal
4 normal normal
45 abnormal dick, ERC abnormal > ein Drittel

2
87 2

Kopf
3 normal dick umgeschlagen abnormal
4 normal normal
5 abnormal >2 vac, < 40%acr dick abnormal
6 normal umgeschlagen abnormal
8 normal umgeschlagen abnormal
9 abnormal >70% acr, lang- abnormal

gestreckt
31 normal < 40%acr dick abnormal
15 abnormal langgestreckt dick abnormal
18 normal normal
91 normal abnormal
2 normal > 70%acr umgeschlagen abnormal
23 normal normal
42 normal normal
25 polymorph
26 normal normal
27 normal normal
29 Monozyt
30 polymorph
31 Monozyt
32 polymorph
33 Monozyt
2
89 2
Sper- Kopfform andere Kom- Mittelstück Hauptstück Gesamtsper- Kommentare

mium mentare zum Kommentare Kommentare mienklassifika-
Kopf tion
2 abnormal abnormal
f PP O.K.
7 nichtfokussiert dick nichtbeurteilt
9 degenerieren-
der Leukozyt
11 abnormal rund geringelt abnormal
12 normal normal
13 abnormal langgestreckt gebogen abnormal
15 polymorph
91 normal doppelt abnormal
23 normal normal
42 abnormal abnormal Pinhead
25 abnormal amorph gebogen abnormal
26 abnormal amorph dick,gebogen abnormal
31 normal gebogen Überlappung nichtbeurteilt
32 normal dick,gebgen abnormal
35 normal gebogen abnormal
36 polymorph
37 polymorph
38 polymorph
2
91 2
Zelle Zelltyp
1 Makrophage
2 abnormalesSpermium
3 Zytoplasma
5 Spermatozyt
7 abnormales Spermium? Loser Kopf auf Zytoplasma?
8 Zytoplasma
9 sichteilende Spermatide
10 Spermatozyt
11 degenerierende Spermatide
12 Spermatide
14 sichteilende Spermatozyte
15 Zytoplasma
17 sichteilende Spermatozyte
91 Zytoplasma
21 Spermatide
2 phagozytierende Makrophage
23 Spermatozyte
42 Zytoplasma
2
93 2
Zelle Zelltyp
1 Makrophage
3 (sichteilende) Spermatide
4 (sichteilende) Spermatide
5 Zytoplasma
6 nichtklassifizierbar
8 degenerierende Spermatide?
11 Makrophage
16 Makrophage
2.17 A
nalyse eines liche Prozentwert morphologisch normaler
Ejakulatausstriches Spermien dokumentiert. Wenn der Unter-
schied zu hoch ist, muss die Messung mit
2 2.17.1e
Burteilung der normalen demselben Objektträger wiederholt werden
Spermienmorphologie (7 Kasten 2.6 ).
5 okumentieren
D Sie die durchschnittliche Pro-
Es ka nn a usreichend s ein, den An teil no rmaler zentzahl normaler Formen in ganzen Zahlen-
Spermien zu b estimmen. M it dies em P aradigma werten.
zur B estimmung der S permienmorphologie w er-
den die f unktionellen Regio nen eines S permiums Anmerkung
Analysien Sie nur v ollständige Spermien, die dur ch
betrachtet. Es ist unnö tig, zwis chen den v erschie-
das Vorhandensein eines Kopf es und eines S chwanzes
denen Variationen der Kopfgröße, den verschiede- (7 Abschn. 2.7.3defi
) niert sind , da auch nur v ollständige
nen Formen der M ittelstücke und der D efekte des Spermien bei der Bestimmung der Spermienkonz entration
Schwanzes zu unterscheiden. berücksichtigt werden. Zählen Sie keine unreifen Keimzellen
Jedes a uswertbare S permium in syst ematisch (runde Spermatiden).
ausgewählten Ausschnitten des je weiligen Objekt-
Anmerkung
trägers wird morphologisch beurteilt, um eine s e-
Beurteilen Sie sich überlappende/überlagernde Spermien
lektive Auswertung von ausgewählten Spermien zu und solche, die mit dem Kopf auf der Seite liegen, nicht.
vermeiden. Diese können nicht korr ekt beur teilt w erden. I n einem
5 erten W Sie den Objektträger im Hellfeld bei guten A usstrich sollt en diese auch gar nicht v orkommen
einer ×1000 Vergrößerung mit Immersionsöl (7 Abschn. 2.13.1können
), aber vorkommen, wenn Zelldebris
oder größere grobkörnige Ejakulatbestandteile vorliegen
aus.
wie z.B. in viskösem Ejakulat. Diese P roben sollten zunächst
5 erten W Sie jedes Spermium in jedem Blick- gewaschen werden, und die A usstriche sollten vor dem Fär-
feld aus, wobei Sie unter dem Mikroskop von ben vorbeurteilt werden.
Blickfeld zu Blickfeld wandern.
5 erten W Sie mindestens 200 Spermien in
Doppelbestimmung aus, um einen akzepta-
bel niedrigen Beurteilungsfehler zu erzielen A
rbeitsbeispiel
2.17.2
(7 Kasten 2.5 ).
5 ählen Z Sie die Anzahl normaler und abnorma- Beispiel 1: Der Prozentsatz morphologisch norma-
ler Spermien mit Hilfe eines Laborzählers aus. ler Spermien in der Doppelbestimmung von je 200
5 iederholen
W Sie die Beurteilung von wenigs- Spermien sind 18 und 9. Der aufgerundete Mittel-
tens 200 Spermien, vorzugsweise auf dem wert ist 14% und die Differenz 9%. Von . Tab. 2.1ist
Objekttträger zur Doppelbestimmung, alter- abzulesen, dass bei einem Mittelwert von 14% eine
nativ auf demselben Objektträger. Differenz von 7% als zufällig g egeben zu er warten
5 ergleichen
V Sie die Prozentanteile der Normal- ist. Da die bestimmte Differenz höher ist, m üssen
formen von zwei unabhängigen Analysen. die Ergebnisse verworfen und die Objektträger neu
5 alkulieren
K Sie den Durchschnitt und die in einer Doppelbestimmung analysiert werden.
Unterschiede zwischen den Prozentanteilen Beispiel 2: D er P rozentsatz mo rphologisch
der Normalformen der Doppelbestimmung. normaler S permien in der D oppelbestimmung
5 estimmenB Sie die Akzeptanz der Unterschie- von 200 S permien sind 10 und 1 4. D er Dur ch-
de nach . Tab. 2.1oder 7 Kap. 14 . , Abb. 14.2 . schnittswert beträgt 12% und die Differenz 4%. I n
(Diese zeigen jeweils die maximalen Unter- der . Tab. 2.1ist abzulesen, dass bei einem Durch-
schiede zwischen zwei Prozentangaben, die schnittwert v on 12% eine Differenz b is zu 7% zu
alleine aufgrund eines Probenfehlers in 95% erwarten ist. Da die bestimmte Differenz unter die-
der zu analysierenden Proben auftreten.) sem Wert liegt, ka nn das Er gebnis v erwertet und
5 ennWder Unterschied zwischen den Prozent- der Mittelwert dokumentiert werden, in diesem
angaben akzeptabel ist, wird der durchschnitt- Fall 12% normale Formen.
2.17 • Analyse eines Ejakulatausstriches
95 2
2.17.3Un
terer Referenzbereich 2.17.5A
rbeitsbeispiel
Der un tere Ref erenzbereich f ür no rmale F ormen Von 200 Spermien, die mittels eines 6fach-Zählers
liegt bei 4% (5te Perzentile, 95% CI 3,0–4,0). in der ersten Z ählung ausgezählt wurden, sind 42
Spermien normal und 158 abnormal. Von den 158
Kommentar abnormalen Spermien haben 140 Kopfdefekte, 102
Die Gesamtzahl morphologisch normaler Spermien Mittelstückdefekte und 30 H auptstückdefekte s o-
im Ejakulat hat eine biolog ische Signifikanz. Diese wie 44 überschüssiges residuelles Zytoplasma. Die
wird dur ch die Multiplik ation der Gesamtzahl der Ergebnisse der Doppelbestimmung 2 ergeben 36
Spermien im Ejakulat mit dem Prozentsatz der Nor- normale und 164 abnormale Spermien, von denen
malformen bestimmt. 122 Kopfdefekte, 108 M ittelstückdefekte und 22
Hauptstückdefekte a ufweisen s owie 36 mi t üb er-
schüssigem residuellen Zytoplasma.
e
Bstimmung der abnormalen
2.17.4 Für die Beurteilung der Validität der Daten wer-
Spermienmorphologie den nur die Normalformen der Doppelbestimmung
verwendet. Zählung 1 weist 21% normale Spermien
Die K ategorisierung aller a bnormalen S permien- aus und die Zählung 2 18%. Der Mittelwert beträgt
formen ist möglicherweise für die Diagnostik oder 20% (exakt 19,5%, aufgerundet auf 20%), die Diffe-
Forschung von Vorteil. Falls dies gewünscht wird, renz b eträgt 3%. Die . Tab. 2.1weist aus, dass b ei
so sind die Defekte zu dokumentieren und der Pro- einem M ittelwert von 20% eine Differenz v on b is
zentsatz der K opf- (%H), M ittelstück- (%M) o der zu 8% als zufällig erwartet wird. Da die vorliegende
Hauptstückdefekte (%P) sowie des üb erschüssigen Differenz darunter liegt, wir d das Er gebnis akzep-
residuellen Zytoplasmas (%C) zu kalkulieren. tiert und die Mittelwerte dokumentiert:
Ein Mehrfach-Zähler sollte verwendet werden, Normale Formen (42 + 36)/400= 20%, abnor-
mit je weils einer T aste f ür normale und einer f ür male Kopfformen (140 + 122)/400= 66%, Mittel-
abnormale Spermien sowie jeweils einer Taste für stückdefekte (102 + 108)/400= 53%, abnormale
die vier verschiedenen Kategorien der Abweichun- Hauptstücke (30 + 22)/400= 13% un d d er P rozent-
gen (H, M, P , C). Ein s olcher Z ähler erla ubt es, satz v on üb erschüssigem r esiduellen Z ytoplasma
nicht nur jedes S permium einmal zu zäh len, son- (44 + 36)/400= 20%.
dern jede Abweichung separat zu zählen. Anmerkung
5 on der V endgültigen Gesamtanalyse von 400 Diese Kategorieren addieren sich nicht auf 100% auf, da jede
Spermien wird der Prozentsatz normaler und Abnormalität separat dokumentier t wir d und einige Sper-
abnormaler Spermien (beide Zahlen sollten mien Mehrfachdefekte aufweisen.
zusammen 100% ergeben) bestimmt sowie der
Prozentsatz für jede Kategorie der Abweichun-
gen, z.B. %H, %M, %P und %C (diese Zahlen Kommentar
addieren sich nicht auf 100%). Eine noch detaillier tere Analy se der abnormalen
5 er Prozentsatz
D von Spermien in den ver- Spermien, die mit v erschiedenen I ndizes die Zahl
schiedenen abnormalen Kategorien wird er- der Abnormalitäten in jeder Reg ion pro abnorma-
mittelt, indem die Gesamtzahl der abnormalen lem Spermium erfassen, wird in 7 Abschn. 3.1.1vor-
Spermien eines spezifischen Defektes geteilt gestellt.
wird durch die Gesamtzahl der normalen und
abnormalen Spermien ×100. Diese Zahlen
können auch verwendet werden, um Mehr- e
Burteilung spezifischer
2.17.6
fach-Anomalieindizes (7 Abschn. 3.1 zu ) be- Spermiendefekte
stimmen.
Gelegentlich haben viele S permien einen spezi-
fischen s trukturellen D efekt. Z um B eispiel k ann
die Ausbildung des Akr osoms f ehlen, s o dass ein multinukleären S permatiden v erwechselt w erden,
Defekt des kleinen runden Kopfes bzw. eine Globo- färben sich jedoch eher bläulich im Gegensatz zu
zoospermie resultieren. Wenn die Basalplatte nicht den eher p inkfarbenen S permatiden ( Johanisson
2 an den N ukleus gegenüber dem Akr osom b ei der et al. 2000). Die Kerngröße kann ebenfalls bei der
Spermiation bindet, dann wird der S permienkopf Identifikation helfen: Der Kern eines Monozyten
absorbiert und nur Spermienschwänze sind im Eja- weist eine große Variabilität in der K erngröße auf,
kulat nachweisbar (Pinheads). von annähernd 7 µm für Lymphozyten bis zu über
Anmerkung 15 µm f ür M akrophagen. Dies e G rößenangaben
Pinheads (freie Schwänze) werden nicht als Kopf defekte ge- sind nur Richtwerte, da die Degeneration und die
wertet, da sie kein Chromatin oder Kopfstrukturen aufweisen. Zellteilung die Größe des Kerns verändern.
Es gibt verschiedene andere Techniken für die
Anmerkung Quantifizierung v on L eukozyten im E jakulat. D a
Weil Pinheads (freie Schwänze) und freie Köpfe nicht als Sper-
Peroxidase-positive G ranulozyten die hä ufigste
mien gezählt we rden (ein Spermium hat definitionsgemäß
einen Kopf und einen S chwanz, 7 Abschn. 2.7.3werden
), sie Form der L eukozyten im E jakulat da rstellen, ist
auch nicht als Spermienabnormalität angesehen. als Ro utineverfahren der A ssay zur B estimmung
der P eroxidaseaktivität f ür das ini tiale S cree-
Männer, deren Spermien in ihrer Gesamtheit einen ning nützlich (Wolff 1995; Johanisson et al . 2000)
dieser D efekte a ufweisen, s ind n ormalerweise i n- (7 Abschn. 2.18.1 ).
fertil. Diese Fälle sind rar, aber sie sollten zuverläs- Darüber hinaus können L eukozyten mit Hilfe
sig identifiziert und korrekt dokumentiert werden. der zei taufwendigen und t euren I mmunhistoche-
Deshalb w erden s olche sp ezifischen Spermiende- mie gegen Leukozyten- und Spermienantigene dif-
fekte auch entsprechend festgehalten, z.B. als f reie ferenziert werden (Homyk et al. 1990; Eggert-Kruse
Spermienköpfe, Pinheads (freie Schwänze), fehlen- et al. 1992) (7 Abschn. 3.2 ).
des Akrosom.
Wenn viele s olcher D efekte v orliegen, da nn
kann ihr e P rävalenz in B ezug a uf die G esamtheit 2.18.1e
Zlluläre Peroxidase-Färbung
der Spermien festgestellt werden. Wenn N der Zahl mit Ortho-Toluidin
der Z ellen mit Defekten entspricht und innerhalb
der 400 analysierten Spermien gezählt wird und S Dieser Test g eht schnell, ist p reiswert, und er ist
die K onzentration der S permien ist (10 6 pro ml), nützlich b eim i nitialen S creening a uf G ranulozy-
dann ist die Konzentration (106 pro ml) der Defekte ten.
wie folgt zu berechnen: C = S × (N/400).
rinzip
P
Traditionell w erden L eukozyten im men schli-
2.18 e
Burteilung der Leukozyten im chen E jakulat nac h hist ochemischer A ufarbei-
Ejakulat tung z ur D arstellung d es P eroxidaseenzyms, d as
charakteristisch für G ranulozyten ist, a usgezählt
Leukozyten, v or allem p olymorphkernige L euko- (. Abb. 2.14). Diese Technik hat den Vorteil, relativ
zyten (PMN, N eutrophile), sind in den meist en einfach durchführbar zu s ein, aber sie ka nn nicht
menschlichen E jakulaten v orhanden (T omlinson die folgenden Zellformen erkennen:
et al . 1 993; J ohanisson et al . 2000). S ie k önnen 5 tivierte
ak polymorphkernige Leukozyten, die
manchmal in der Papanicolaou-Färbung von Sper- bereits ihre Granula freigesetzt haben und
matiden und Spermatozyten im Ausstrich differen- 5 ndere a Leukozytenformen, wie z.B. Lympho-
ziert werden (7 Abschn. 2.14.2 ).Die Differenzierung zyten, Makrophagen und Monozyten, die kei-
basiert auf der unterschiedlichen Anfärbung, der ne Peroxidase enthalten.
Kerngröße und der F orm (Johanisson et al . 2000)
(7 Bildtafel 6, 10, 11, 12, 13, 14). Polymorphkerni- Der Test kann sinnvoll sein bei der Unterscheidung
ge L eukozyten k önnen mo rphologisch leic ht mi t polymorphkerniger L eukozyten v on P eroxidase-
2.18 • Beurteilung der Leukozyten im Ejakulat
97 2
Anmerkung
Die Internationale Agency for Research on Cancer (IARC 1982)
hat festgestellt, dass Ortho-Toluidin aus praktischen Gründen
als k arzinogen für den M enschen eingestuf t w erden sollt e.
Deshalb sollten entsprechende Sicherheitsmaßnahmen ein-
gehalten werden (7 Kap. 9).
chführung
Dur
1. ischen
M Sie die Ejakulatprobe gut (7 Kas-
ten 2.3 ).
. 2 ehmen
N Sie ein 0,1 ml Aliquot des Ejakulates
. Abb. 2.14 eroxidase-positive
P und -negative Zellen im und mischen Sie mit 0,9 ml der Gebrauchslö-
menschlichen Ejakulat. Ein Peroxidase-positiver Granulozyt sung (1 + 9(1:10)Verdünnung).
(P) (braune Färbung) und eine Peroxidase-negative Rund- . 3 ortexen
V Sie die Spermiensuspension sanft für
zelle (N). Maßstabsbalken 10 μm (Mikroskopische Aufnahme
freundlicherweise überlassen von T.G. Cooper)
10 Sekunden und inkubieren Sie bei Raum-
temperatur für 20–30 Minuten. Alternativ
kann die Lösung auch kontinuierlich mit
freien multinukleären Spermatiden (Johanisson et einem Schüttler gerüttelt werden.
al. 2000). Der Assay basiert auf der Publikation von 4. Dur
chmischen Sie erneut die Ejakulatprobe
Nahoum u. Cardozo (1980). Ein entsprechendes Kit vor der Entnahme des Aliquots für die Dop-
ist kommerziell verfügbar. pelbestimmung und mischen Sie mit der Ge-
brauchslösung wie zuvor beschrieben.
Reagenzien
1. hosphatpuff
P er, 67 mmol/l, pH 6,0: Lösen Sie
9,47 g Sodiumhydrogenphosphat (Na2 HPO4 ) estimmung
B der Peroxidase-positiven
in 1000 ml destilliertem Wasser und 9,08 g Zellzahl im Hämozytometer
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2 PO4 )in . 1 achN 20 bis 30 Minuten mischen Sie die Sper-
1000 ml destilliertem Wasser. Fügen Sie die miensuspension erneut und befüllen jede Seite
Lösungen zusammen (ca. 12 ml Na2 HPO4 - des Hämozytometers mit einer der Doppelbe-
Lösung zu 88 ml KH2 PO4-Lösung), bis der pH stimmungsproben.
bei 6,0 liegt. 2. assen
L Sie das Hämozytometer horizontal für
2. esättigte
G Ammoniumchlorid (NH4 Cl)-Lö- mindestens 4 Minuten bei Raumtemperatur in
sung herstellen: Fügen Sie 250 g NH4 CLzu einer feuchten Kammer ruhen (z.B. wasserge-
1000 ml destilliertem Wasser hinzu. tränktes Filterpapier in einer bedeckten Petri-
3. Dis
odiumethylendiamintetraacetic-Säure schale), um ein Austrocknen zu verhindern
(Na2EDTA) 148 mmol/l: Lösen Sie 50 g/l in und den Zellen die Möglichkeit zu geben, sich
Phosphatpuffer (pH 6,0) wie unter Schritt 1 zu setzen.
vorbereitet. 3. Anal
ysieren Sie die Probe unter einem Phasen-
4. ubstrat:
S Lösen Sie 2,5 mg O-Toluidin in 10 ml kontrastmikroskop mit einer ×200 oder ×400
von 0,9% (9 g/l) Salzlösung. Vergrößerung.
5. ydrogenperoxidase
H (H2 O2) 30% (v/v): wie 4. ählen
Z Sie wenigstens 200 Peroxidase-positive
vorgegeben. Zellen in jeder Probe, um einen akzeptablen
6. ebrauchslösung:
G Fügen Sie zu 9 ml O-Tolu- Zählfehler zu erreichen (7 Kasten 2.7 und
idin-Substrat 1 ml gesättigte NH4 Cl-Lösung, . Tab. 2.2). Peroxidase-positive Zellen sind
1 ml 148 mmol/l Na2EDTA und 10 μl der 30% braun angefärbt, während Peroxidase-negative
(v/v) H2 O2 und mischen Sie gut. Diese Lösung Zellen ungefärbt sind (. Abb. 2.14).
kann bis zu 24 Stunden nach Vorbereitung 5. ntersuchen
U Sie eine Kammer, Quadrat für
verwendet werden. Quadrat, und setzen Sie die Zählung fort, bis
wenigstens 200 Peroxidase-positive Zellen aus- Für eine 1 + 9(1:10)-Verdünnung, ist die K on-
gewertet wurden und ein komplettes Zählnetz zentration C= (N/n)×(1/100)×10 Zellen p ro nl =
(25 Quadarate) analysiert wurde. Die Zählung (N/n)×(1/10) Zellen p ro nl . D eshalb wir d (N/n)
2 muss ein komplettes Zählnetz erfassen und durch 10 geteilt, um die Konzentration der Peroxi-
sollte nicht in der Mitte gestoppt werden. dase-positiven Zellen pro nl (106 Zellen pro ml) zu
6. otieren
N Sie die Zahl der Quadrate, die er- bestimmen.
forderlich waren, um wenigstens 200 Per- Wenn alle n eun Z ählkammern in jeder K am-
oxidase-positive Zellen auszuzählen. Dieselbe mer des Hämozytometers ausgezählt wurden, wird
Zahl wird in der zweiten Kammer ausgezählt die G esamtzahl der P eroxidase-positiven Z ellen
werden. durch das G esamtvolumen b eider K ammern (1,8
. 7 otieren
N Sie die Zahl der Peroxidase-positiven µl) geteilt und multipliziert mit dem Verdünnungs-
Zellen und die Zahl der Quadrate mit dem fakter (10), um die Konzentration der Zellen pro µl
Laborzähler. (tausend Zellen pro ml) zu erhalten.
8. echseln
W Sie zur zweiten Kammer des Hämo- Anmerkung
zytometers und führen Sie die Doppelbestim- Dieses Vorgehen k ann v erwendet w erden, um die Konz en-
mung durch mit derselben Zahl an Quadraten, tration der Rundzellen zu ermitteln, wenn die Gesamtzahl der
auch wenn weniger als 200 Peroxidase-positive gezählten Rundz ellen (P eroxidase-positiv und -negativ) für
die Kalkulation als N eingesetzt wird.
Zellen gefunden werden.
9. alkulieren
K Sie die Summe und die Differenz
der beiden Zählergebnisse Peroxidase-positi- ensitivität
S der Methode
ver Zellen. Falls weniger als 200 Peroxidase-positive Zellen
10.estimmen
B Sie die Akzeptanz des Zählfehlers in der Z ählkammer sin d, d ann ü berschreitet der
aus der Differenz entsprechend . Tab. 2.5 oder Zählfehler 5%. Wenn weniger als 400 P eroxidase-
. Abb. 14.1. (Hier wird der maximale Unter- positive Zellen in allen Quadraten beider Kammern
schied zwischen zwei Zählungen gezeigt, wie gefunden werden, wird der Zählfehler für die Zahl
er in 95% der Proben allein wegen des Pipet- der gezählten Zellen dokumentiert (. Tab. 2.2 ).
tierfehlers zu erwarten ist.) Wenn weniger als 25 Peroxidase-positive Zellen
11. enn
W die Differenz akzeptabel ist, kalkulieren in jeder Kammer gezählt werden, beträgt die Kon-
Sie die Konzentration. Wenn der Unterschied zentration <277.000 Z ellen/ml; dies ist der un tere
zu hoch ist, bereiten Sie eine neue Verdünnung Grenzwert der Quantifizierung bei einem Zählfeh-
vor und wiederholen Sie die Doppelbestim- ler von 20%, wenn alle neun Quadrate der Neubau-
mung (7 Kasten 2.10 ). er-improved-Kammer ausgezählt werden und eine
12.eben
G Sie die mittlere Konzentration der Per- 1+ 9(1:10)-Verdünnung verwendet wird (Cooper
oxidase-positiven Zellen an und runden Sie et al. 2006). I n diesem Fall wird die Z ahl der P er-
auf zwei volle Zahlen auf. oxidase-positive Z ellen mi t dem K ommentar »zu
13.alkulieren
K Sie die Gesamtzahl Peroxidase- wenig Zellen f ür eine korrekte Konzentrationsbe-
positiver Zellen pro Ejakulat (siehe Kommen- stimmung (< 277.000/ml)« dokumentiert.
tar 7 Abschn. 2.18.1 »Referenzwerte«).
,
Kommentar
Kalkula
tion der Konzentration der Das Fehlen von Peroxidase-positiven Zellen in dem
Peroxidase-positiven Zellen im Ejakulat untersuchten Aliquot bedeutet nicht notwendiger-
Die K onzentration P eroxidase-positiver Z ellen weise, dass in der gesamt en P robe keine v orhan-
im E jakulat entspricht der Z ahl (N) g eteilt d urch den sind.
das Volumen der g esamten Zahl (n) der Quadra te
der Z ählkammer, die für die Do ppelbestimmung rbeitsbeispiele
A
ausgezählt wurden (wobei das Volumen der Z ähl- Beispiel 1: In einer 1+ 9(1:10)-Verdünnung werden
kammer 100 nl beträgt), multipliziert mit dem Ver- im ersten Zählergebnis 60 Peroxidase-positive Zel-
dünnungsfaktor. len in neun Quadra ten gefunden, während in der
2.18 • Beurteilung der Leukozyten im Ejakulat
99 2
zweiten B estimmung 90 P eroxidase-positive Z el- wenig Zellen f ür eine korrekte Konzentrationsbe-
len in neun Quadraten gezählt werden. Die Summe stimmung (< 277.000/ml)« dokumentiert.
der Werte (60 + 90) ist 150 in 18 Quadraten und die
Differenz (90 − 60) ist 30. In . Tab. 2.5 ist er sicht- erenzwerte
Ref
lich, dass die Differenz die er wartete zufällige Ab- Es gibt aktuell keinen Referenzbereich für Peroxi-
weichung übersteigt (24), sodass das Ergebnis ver- dase-positive Zellen im Ejakulat fertiler Männer.
worfen und eine neue D oppelbestimmung durch- Bei f ehlender E videnz b ehält dies es M anual den
geführt werden muss. bisherigen k onsensualen G renzwert v on 1,0 × 106
Beispiel 2: In einer 1+ 9(1:10)-Verdünnung wer- Peroxidase-positiven Zellen bei.
den im ersten Zählergebnis 204 Peroxidase-positi-
ve Zellen in fünf Quadraten gefunden, während in Kommentar
der zw eiten B estimmung 198 P eroxidase-positive Die Gesamtzahl Peroxidase-positiver Zellen im Eja-
Zellen in fünf Quadraten gezählt werden. Die Sum- kulat kann die Schwere einer Entzündung reflektie-
me der W erte (20 4 + 198) ist 40 2 in 10 Quadra ten ren ( Wolff 1995) und wir d durch die Multiplik ation
und die Differenz (204 – 198) ist 6. In . Tab. 2.5 ist der Konzentration der Peroxidase-positiven Zellen
ersichtlich, dass die Differenz kleiner ist als die er - mit dem Volumen des Gesamtejakulates berechnet.
wartete zufällige Abweichung (39), s odass das Er -
gebnis akzeptiert wird. Kommentar
Die K onzentration der P eroxidase-positiven Berichte über Grenzwerte für Peroxidase-positive
Zellen in dieser Probe mit einer 1+ 9(1:10)-Verdün- Zellen bei fertilen Männern reichen von 0,5 × 106 bis
nung b eträgt C = (n/n)×(1/10) Zellen pro nl o der 1,0 × 106 PMN Leukozyten pro ml oder von 1× 106 bis
(402/10)/10 = 4,02 Zellen/nl oder 4,0 × 108 -Zellen 2 × 106 Gesamtleuko zyten pr o ml ( Wolff 1995). Frü-
pro ml (aufrunden auf zwei volle Zahlen). here A usgaben dieses M anuals haben 1 × 106 Leu-
Beispiel 3: In einer 1+ 9(1:10)-Verdünnung wer- kozyten pr o ml als Gr enzwert für eine L eukozyto-
den im ersten Zählergebnis 144 Peroxidase-positive spermie angenommen. Einige fanden diesen Wert
Zellen in neun Quadra ten g efunden, währ end in zu niedrig ( Wolff 1995), während andere ihn für zu
der zw eiten B estimmung 16 2 P eroxidase-positi- hoch hielten (Sharma et al. 2001; Punab et al. 2003),
ve Z ellen in neun Quadraten gezählt werden. Die jeweils in Abhängigkeit von den zu beur teilenden
Summe der Werte (144 + 162) ist 306 in 18 Quadra- Endpunkten (Samenqualität, Er gebnisse der I n-vi-
ten, und die Differenz (162 – 144) ist 18. In . Tab. 2.5 tro-Fertilisierung, Vorhandensein v on Bakt erien,
ist ersichtlich, dass die Differenz kleiner ist als die Spermienreaktion auf reaktive Sauerstoffradikale).
erwartete zufällige Abweichung (39), sodass das Er-
gebnis akzeptiert wird. Kommentar
Wenn alle neun Quadra te a usgezählt w erden, Exzessiv erhöht e L eukozytenwerte im Ejakulat
beträgt die K onzentration f ür die P robe b ei einer (Leukozytospermie, Pyospermie) können mit Infek-
1 + 9(1:10)-V erdünnung C = (N/1,8)×10 Zellen p ro tionen und schlecht er Spermienqualität asso ziiert
µl = (306/1,8)×10= 1700 Zellen pro µl oder 1,7× 106 sein.
Zellen pro ml (aufrunden auf zwei volle Zahlen).
Wenn w eniger a ls 4 00 Z ellen a usgezählt w urden, Kommentar
beträgt der Zählfehler für 306 Zellen entsprechend Leukozytenabhängige S chädigungen v on Sper-
. Tab. 2.2 (ungefähr 6%). mien hängen v on der Gesamtzahl der L eukozyten
Beispiel 4: I n einer 1 + 9(1:10)-Verdünnung im Ejakulat und der Zahl der Leukozyten relativ zur
werden im Zählergebnis keine Peroxidase-positive Spermienzahl ab.
Zellen in beiden Zählungen gefunden. Wenn weni-
ger als 25 Peroxidase-positive Zellen in allen neun Kommentar
Quadraten gefunden werden, beträgt die K onzen- Leukozyten können die Spermienmotilität und
tration <277.000 p ro ml; die Z ahl der P eroxidase- die DNA-I ntegrität der Spermien dur ch oxidativen
positiven Z ellen wir d mi t dem K ommentar »zu Stress beeinträchtigen ( 7 Abschn. 4.1 Allerdings
).
ist das A usmaß der S chädigung durch eine L euko- 2.20 estung
T auf Spermienantikörper
zyteninfiltration v on Faktoren abhäng ig, die nicht
aus der Samenpro be abgeleit et we rden können, Wenn Spermien Agglutinationen zeigen (z.B. be-
2 wie z.B . die Ursache , der Z eitpunkt und die ana- wegliche Spermien heften Kopf zu K opf, Schwanz
tomische L okalisation der L eukozyteninfiltration, zu Schwanz aneinander oder zeigen gemischte For-
ebenso wenig wie die Beschaffenheit der Leukozy- men) ( 7 Abschn. 2.4.4 ),dann können Spermien-
ten und ihr Aktivitätsstatus ( Tomlinson et al. 1993; antikörper die Ursache sein.
Aitken u. Baker 1995; Rossi u. Aitken 1997).
Kommentar
Spermienantikörper können auch ohne Spermien-
92.1 e
Burteilung unreifer Keimzellen agglutinationen vorliegen; umgekehrt können Ag-
im Ejakulat glutinationen durch andere Faktoren als Spermien-
antikörper verursacht werden.
Unreife K eimzellen umfass en r unde S permatiden
und S permatozyten, a ber n ur s elten S permatogo- Kommentar
nien im E jakulat. Diese können im g efärbten Eja- Die alleinige An wesenheit v on Spermienantikör-
kulatausstrich nachgewiesen werden, können aber pern ist nicht ausr eichend, um die Diag nose einer
schwer v on En tzündungszellen, die deg eneriert Autoimmunerkrankung gegen Spermien zu stellen.
sind, unterschieden werden. Es ist notwendig zu zeigen, dass die Spermienanti-
Spermatiden und S permatozyten können nor- körper ernsthaft mit der Spermienfunktion int erfe-
malerweise v on L eukozyten im E jakulatausstrich rieren; dies wird üblicherweise mit dem Spermien-
durch die P apanicolaou-Färbung un terschieden Mukus-Penetrationstest gemacht ( 7 Abschn. 3.3 ).
werden (Johanisson et al. 2000) ( 7 Abschn. 2.14.2 ). Antikörper können darüber hinaus mit der Z ona-
Die I dentifizierung ka nn d urch die F ärbung, die Bindung und der Akrosomreaktion interferieren.
Kerngröße und -f orm ( 7 Bildtafeln 6, 10, 11, 12, 13
und 14), das Fehlen von intrazellulärer Peroxidase Anti-Spermien-Antikörper (ASAs) im Ejakulat ge-
(7 Abschn. 2.18) und das Fehlen von leukozytenspe- hören fast ausschließlich zu den beiden Immunglo-
zifischem An tigen ( 7 Abschn. 3.2 )erfolgen. Mul- bulinklassen IgA und IgG. IgM-Antikörper werden
tinukleäre Spermatiden können morphologisch aufgrund ihrer erheblichen Größe im Ejakulat sehr
leicht mi t p olymorphkernigen L eukozyten v er- selten gefunden. IgA-Antikörper können eine grö-
wechselt werden, die eine eher pinke Färbung an- ßere k linische Rele vanz b esitzen als I gG-Antikör-
nehmen im Gegensatz zu den mehr b läulich ange- per (Kremer u. Jager 1980). Beide Klassen können
färbten PMN-Leukozyten (Johanisson et al. 2000). auf S permien o der in b iologischen Fl üssigkeiten
Runde Spermatiden können mit spezifischen Fär- mit en tsprechenden S creeningtests nac hgewiesen
bungen f ür die Akr osomentwicklung (C outure et werden.
al. 1976), f ür L ektine ( 7 Abschn. 4.4.1 oder
) spezi- 5 permienantikörpertests
S (»direkte Tests«).
fische A ntikörper (H omyk et al . 1990; Ezeh e t al . Zwei direkte Tests werden hier beschrieben:
1998) iden tifziert w erden. Die K erngröße ka nn der gemischte Antiglobulin-Reaktions-(MAR-)
ebenfalls bei der Identifizierung helfen; Spermato- Test (Übersicht bei Bronson et al. 1984) und
gonien (s ehr s elten im E jakulat zu s ehen) ha ben der Immunobead-(IB-)Test (Bronson et al.
einen ca. 8 µm gr oßen N ukleus, S permatozyten 1982; Clarke et al. 1982, 1985). Der MAR-Test
haben einen Nukleus von ca. 10 µm und Spermati- (siehe unten) wird mit frischem Ejakulat
den von ungefähr 5 µm Diese Größenangaben sind durchgeführt, der IB-Test mit gewaschenen
nur Richtgrößen, da Degeneration und Mitosen die Spermien. Die Ergebnisse von zwei Tests stim-
Größe der Zellkerne beeinflussen. men nicht immer überein (MacMillan u. Baker
1987; Scarselli et al. 1987; Meinertz u. Bronson
1988; Hellstrom et al. 1989), allerdings stim-
men die Ergebnisse des IB-Tests sehr gut mit
2.20 • estung
101 2
den Immobilisationstests zur Bestimmung von Dergemischte Antiglobulin-Re-
2.20.1
Serumantikörpern überein. Die experimen- aktions-Test
tellen Protokolle des IB- und des MAR-Tests
können variieren, aber beide Tests werden mit Der gemischte Antiglobulin-Reaktions-(MAR-)
dem Mikroskop ausgewertet. Die Immunopar- Test ist ein p reiswerter, s chneller und s ensitiver
tikel heften sich an die motilen und immotilen Screening-Test (Rajah et al. 1992), bietet allerdings
Spermien mit oberflächengebundenen Anti- weniger I nformationen a ls d er d irekte I mmuno-
körpern; der Prozentsatz motiler Spermien mit bead-Test (7 Abschn. 2.20.2 ).
gebunden Partikeln wird dokumentiert. Beim MAR -Test wir d ein s ogenannter »B rid-
5 ntispermienantikörper-Tests
A in spermien- ging«-Antikörper (An ti-IgG o der An ti-IgA) v er-
freien Flüssigkeiten, wie z.B. Seminalplasma, wendet, um die a ntikörperbeschichteten P artikel
Blutserum und verflüssigtem Zervikalmukus mit un gewaschenen S permien v on E jakulat mi t
(»indirekte Tests«). Bei diesen Tests werden die Oberflächen-IgG oder -IgA in Kontakt zu bringen.
verdünnten, hitzeinaktivierten Flüssigkeiten, Der d irekte IgG- u nd IgA-MAR-Test w ird durch-
bei denen Antikörper (ASAs) vermutet wer- geführt, indem f risches, un behandeltes E jakulat
den, mit antikörperfreien Spenderspermien, mit Latexpartikeln (beads) gemischt wird oder in-
die vom Seminalplasma gereinigt wurden, dem gewaschene Erythrozyten mit menschlichem
inkubiert. Jegliche ASAs in der verdächtigen IgG oder IgA gemischt werden Zu der Suspension
Flüssigkeit werden spezifisch an die Spen- werden An tiseren g egen H umanplasmaproteine
derspermien binden, die dann wiederum in (Anti-IgG u . An ti-IgA) g egeben. Die B ildung g e-
einem direkten Test (wie oben beschrieben) mischter A gglutinationen zwis chen den P artikeln
analysiert werden. Um verlässliche Ergebnisse und mo tilen S permien zeig en das V orhandensein
zu erzielen, ist es wichtig, der Spermienanti- von IgG- oder IgA-Antikörpern auf den Spermien
körperinteraktion ausreichend Zeit für die an. (Agglutinationen zwischen den L atexpartikeln
Reaktion zu geben, denn es kann durchaus dienen als p ositive K ontrolle f ür die An tikörper-
bis zu 10 Minuten dauern, bis gemischte Ag- Antigen-Erkennung).
glutinationen sichtbar werden. Jedoch sollte
man ebenfalls nicht außer acht lassen, dass mit Dur
chführung
zunehmender Zeit die Spermienmotilität ab- 1. ischen
M Sie die Ejakulatprobe gut (7 Kasten
nimmt – und der Test ist von dem Vorhanden- 2.3).
sein der motilen Spermien abhängig. 2. tnehmen
En Sie zwei Aliquots mit je 3,5 μl des
Ejakulates und geben Sie es auf einen separa-
Anmerkung ten Objektträger.
Die beiden hier beschriebenen ASA- Tests sind kommer ziell
3. erwenden
V Sie jeweils einen Objektträger mit
erhältlich. Beide sind abhängig von der Anwesenheit motiler
Spermien. Wenn nur unzure ichend motile Spermien v orlie-
3,5 µl ASA-positivem Ejakulat und einen mit
gen, kann der indire kte Test für S eminalplasma oder Blutse - 3,5 μl ASA-negativem Ejakulat als Kontrolle bei
rum verwendet werden. jedem direkten Test. Dieses Ejakulat sollte von
Männern mit und ohne Spermienautoantikör-
Anmerkung per stammen, die entsprechend im MAR-Test
Zytotoxische Antikörper, die die Spermien abt öten oder die
bereits getestet worden waren. Alternativ kön-
Spermienmotilität hemmen, können mit diesen Assays nicht
nachgewiesen werden. nen positive Spermien durch die Inkubation
mit antikörperhaltigem Serum hergestellt wer-
den (7 Abschn. 2.20.3 ) .
4. ügen
F Sie 3,5 μl IgG-beschichtete Latexpartikel
zu jedem Test- und Kontrollejakulat und mi-
schen Sie mit der Pipettenspitze.
5. ügen
F Sie 3,5 μl Antiserum gegen humanes lichst geringen Zählfehler zu erreichen (7 Kas-
IgG zu jeder Ejakulat-Partikel-Mischung und ten 2.5 ).
mischen Sie gut mit der Pipettenspitze. 3. erechnen
B Sie den Prozentsatz motiler Sper-
2 6. edecken
B Sie mit einem Deckglas (22 × 22 mien mit anhaftenden Partikeln.
mm) um eine Tiefe von ca. 20 μm herzustellen . 4 okumentieren
D Sie die Immunglobulinklassen
(7 Kasten 2.4 ) . (IgG oder IgA) und die Lokalisation der Bin-
7. assen
L Sie den Objektträger horizontal für 3 dung der Latexpartikel an die Spermien (Kopf,
Minuten bei Raumtemperatur in einer feuch- Mittelstück, Hauptstück). Ignorieren Sie Bin-
ten Kammer (z.B. auf einem wassergesättigten dungen an der Schwanzspitze.
Filterpapier in einer zugedeckten Petrischale)
ruhen, um ein Austrocknen zu verhindern. Anmerkung
Wenn 100% motile Spermien nach 3 Minuten gebunden sind,
8. eurteilen
B Sie die Präparate mit einem Pha-
dann wird das als Testergebnis dokumentiert und keine Wie-
senkontrastmikroskop mit einer Vergößerung derholung nach 10 Minuten durchgeführt.
von ×200 oder ×400 nach 3 Minuten und
erneut nach 10 Minuten. Anmerkung
. 9 iederholen
W Sie den Vorgang mit IgA- anstelle Wenn weniger als 100% der motilen Spermien nach 3 M inu-
von IgG-beschichteten Partikeln und Anti- ten gebunden sind , dann wir d der Objektträger nach 10 M i-
nuten erneut ausgelesen.
IgA-anstelle der Anti-IgG-Antikörper.
Anmerkung
Wenn die Spermien nach 10 Minuten immotil sind, dann wird
eurteilung
B der Wert nach 3 Minuten als Ergebnis dokumentiert.
Wenn S permien a uf i hrer O berfläche Antikörper
haben, d ann w erden d ie L atexpartikel a n ihnen
haften. Die beweglichen Spermien werden sich ini- erenzwerte
Ref
tial mi t einig en w enigen o der G ruppen v on a n- Derzeit gibt es k eine Referenzwerte für Spermien-
haftenden Partikeln bewegen. Letztlich können die antikörper im MAR -Test f ür die E jakulate fertiler
Agglutinationen so massiv werden, dass eine Bewe- Männer. Bei noch fehlender zusätzlicher Evidenz
gung der S permien erheb lich ein geschränkt wir d. behält dies es M anual die K onsensusempfehlung
Spermien, die keine Antikörper haben, werden frei bei, den Grenzwert bei 50% antikörpergebundener
zwischen den Partikeln hindurchschwimmen. motiler Spermien anzusetzen.
Das Z iel des A ssays ist die B estimmung des
Prozentsatzes mo tiler S permien mi t a nhaftenden Kommentar
Partikeln. Ein übliches Problem mit nichtprogres- Die Spermienpenetration in den Z ervikalmukus
siven Spermien besteht darin, dass sie nahe an den und die I n-vivo-Befruchtung scheinen sig nifikant
Partikeln lieg en, a ber nic ht a n ihnen ha ften. Ob beeinträchtigt zu sein, w enn 50% oder mehr der
die P artikel g ebunden sind , ka nn üb erprüft wer- motilen Spermien Antikörperbindungen aufweisen
den, indem man ganz leicht das Deckglas mit einer (Abshagen et al . 1998). Partikelbindungen, die nur
Pipettenspitze anstößt: Die B ewegung der P artikel die Spermiensch wanzspitze betr effen, sind nicht
synchron mit den aktiven Spermien zeigt eine posi- mit einer Fertilitätseinschränkung verbunden und
tive Bindung an. können auch bei f ertilen M ännern gefunden w er-
1. ewerten
B Sie nur die beweglichen Spermien den (Chiu u. Chamley 2004).
und bestimmen Sie den Prozentsatz der moti-
len Spermien, die zwei oder mehr anhaftende
Latexpartikel haben. Ignorieren Sie Schwanz- Derdirekte Immunobead-Test
2.20.2
spitzenbindungen.
2. ewerten
B Sie mindestens 200 motile Spermien Dieser Assay ist wesentlich zeitaufwendiger als der
in jeder Doppelbestimmung, um einen mög- MAR-Test, lief ert aller dings a uch I nformationen
über la rvierte An tikörper, die d urch b estimmte
2.20 • estung
103 2
maskierende Seminalplasmakomponenten von den . Tab. 2.7 Wie viele Spermien für den Immunobead-
Spermien entfernt werden. Test verwendet werden
Im dir ekten I mmunobead-(IB-)Test werden
Partikel, die mi t kovalentgebundenen Kaninchen- Spermien- Spermien- Erforderliches
konzentra- motilität Ejakulatvolumen
Immunglobulinen gegen humanes I gG oder IgA
tion (PR) ( %) (ml)
beschichtet sind, direkt mit gewaschenen Spermien (106/ml)
gemischt. Die P artikelbindung des a ntihumanen
50 – 0,2
IgG o der I gA a n mo tile S permien zeigt das V or-
handensein von IgG- oder IgA-Antikörpern auf der 21-50 > 40 0,4
Spermienoberfläche an. 21-50 < 40> 10 0,8
10-20 > 40 1,0

Reagenzien
1. Dulbeccos Glucose-Phosphat-Pufferlösung 10-20 < 40> 10 2,0
(PBS) – bovines Serumalbumin (BSA) oder < 10> 5 > 10 > 2,0
Tyrodes BSA-Lösung: siehe 7 Abschn. 11.2und
11.9 .
2.Puffer I: Fügen Sie 0,3 g der Cohnfraktion
V-BSA zu 100 ml Dulbeccos PBS oder Tyrodes . 2 ipettieren
P Sie die geforderte Ejakulatmenge in
Medium hinzu. ein Zentrifugationsröhrchen und füllen Sie die
3.Puffer II: Fügen Sie 5 g der Cohnfraktion V- Probe auf 10 ml mit Puffer I auf.
BSA zu 100 ml der Dulbeccos-PBS oder Tyro- 3. entrifugieren
Z Sie bei 500 g für 5–10 Minuten.
des-Medium hinzu. . 4 ekantieren
D und verwerfen Sie den Überstand
4. trieren
Fil Sie die Lösungen durch jeweils einen von den gewaschenen Spermien.
0,45-µm-Filter und wärmen Sie diese auf . 5 esuspendieren
R Sie vorsichtig das Spermien-
25–35 °C vor Gebrauch an. pellet mit 10 ml frischem Puffer I.
6. entrifugieren
Z Sie erneut bei 500 g für 5–10
Minuten.
orbereitung
V der Immunobeads 7. ekantieren
D und verwerfen Sie den Über-
1. ürFjeden Immunobeadtyp (IgG, IgA) fügen stand.
Sie 0,2 ml der Partikelstammlösung zu 10 ml . 8 esuspendieren
der Puffer-I-Lösung in jeweils separate Zentri- pellet mit 0,2 ml Pufferlösung II.
fugationsröhrchen hinzu.
2. entrifugieren
Z Sie bei 500 g oder 600 g für Anmerkung
Aliquots, die größer als 1 ml sind, benötigen 3 Waschvorgän-
5–10 Minuten.
ge.
. 3 ekantieren
D und verwerfen Sie den Überstand
der gewaschenen Immunobeads. Anmerkung
4. Resuspendieren Sie vorsichtig die Partikel in Proben mit geringer Spermienmotilität (z.B . 10% oder weni-
0,2 ml Puffer II. ger) können keine eindeutigen Er gebnisse bringen. I n die -
sem Fall ziehen Sie den indir ekten Immunobead-Test in Be -
tracht (7 Abschn. 2.20.3).
orbereitung
V der Spermien
Die Summe der er forderlichen Spermien für diese
Assays wir d a nhand der S permienkonzentration chführung
Dur
und -beweglichkeit bestimmt, wie in . Tab. 2.7 ge- ASA-positive S permien und ASA -negative S per-
zeigt. mien s ollten b ei jedem T est als K ontrollen ein-
1.ischen
M Sie die Ejakulatprobe gut (7 Kas- geschlossen w erden. Die E jakulate s ollten v on
ten 2.3 ). Männern mit und ohne Spermienantikörper, die
in v orausgegangenen I mmunobead-Tests nac hge- Kommentar

wiesenen wurden, verwendet werden. Die Diag nose einer immunolog ischen I nfertilität
1. tzieren
Pla Sie 5 μl der gewaschenen Spermien- wird gest ellt, w enn 50% oder mehr der motilen
2 suspension auf einem Objektträger. Spermien (pr ogressiv und nichtpr ogessiv motil)
2. ereiten
B Sie separate Objektträger mit 5 μl der adhärente P artikel aufw eisen (Barratt et al . 1992).
ASA-positiven Spermien und 5 μl der ASA-ne- Partikelbindungen, die nur die Spermiensch wanz-
gativen Spermien vor. spitze betreffen, sind nicht mit einer F ertilitätsein-
. 3 ügenF Sie 5 μl der Anti-IgG Immunobead-Sus- schränkung v erbunden und können auch bei f er-
pension neben jeden Spermientropfen hinzu. tilen Männern gefunden w erden (Chiu u. Chamley
4. ischen
M Sie jeweils die IgG-Immunobeads 2004).
und den Spermientropfen mit der Pipetten-
spitze.
5. tzieren
Pla Sie ein 22 × 22-mm-Deckglas auf Derindirekte Immunobead-Test
2.20.3
dem gemischten Tropfen, um eine Tiefe von
ca. 20 μm zu erreichen (7 Kasten 2.4 ). Der indir ekte I mmunobead-Test wir d v erwendet,
6. eben
H Sie den Objektträger waagerecht für um Antispermienantikörper in hitzeinaktivierten,
3–10 Minuten in einer feuchten Kammer bei spermienfreien F lüssigkeiten ( Serum, H odenflüs-
Raumtemperatur auf (z.B. auf einem wasserge- sigkeit, S eminalplasma o der B romelain-verdünn-
tränkten Filterpapier in einer bedeckten Petri- ter Zervikalmukus) nachzuweisen. Antikörperfreie
schale). Warten Sie nicht länger als 10 Minuten Spenderspermien nehmen An ti-Spermienantikör-
bis zur Analyse des Objektträgers, da die Bin- per auf, die in den getesteten Flüssigkeiten vorhan-
dung der Immunobeads signifikant während den sind und w erden dann im dir ekten Immuno-
der Inkubation abnimmt (Gould et al. 1994). bead-Test analysiert.
7. eurteilen
B Sie die Objektträger mit einem
Phasenkontrastmikroskop bei einer ×200 oder Reagenzien
×400 Vergrößerung. Siehe 7 Abschn. 2.20.2 (Reagenzien für den direkten
8. eurteilen
B Sie nur motile Spermien, die mit IB-Test).
einem oder mehr Partikeln gebunden sind, wie Falls Zervikalmukus getestet werden soll, be-
in 7 Abschn. 2.20.1 »Beurteilung«
, beschrieben. reiten S ie 10 IU/ml B romelain, ein »B road-speci-
Ignorieren Sie Schwanzspitzenbindungen. ficity« p roteolytisches Enzym (EC 3.4.22.3 2) v or
9.nterpretieren
I Sie den Test wie in (7 Kasten 2.2 ).
7 Abschn. 2.20.1 »Referenzwerte«
, beschrieben.
10. iederholen
W Sie die Prozedur mit der Anti- orbereitung
V der Immunobeads
IgA-Immunobead-Suspension. Siehe 7 Abschn. 2.20.2 »Vorbereitung
, der Immu-
nobeads«
Ammerkung
Um sicher zu sein, dass alle Bindungen innerhalb von 10 Mi-
orbereitung
V der Spenderspermien
nuten beur teilt we rden, sollt en die P räparate schritt weise
vorbereitet werden. Siehe 7 Abschn. 2.20.2 ,»Vorbereitung der Sper-
mien«
erenzwerte
Ref orbereitung
V der zu testenden
Derzeit gibt es k eine Referenzwerte für Spermien- Flüssigkeiten
antikörper im IB-Test für die Ejakulate fertiler 1. enn
W Zervikalmukus getestet werden soll, ver-
Männer. Bei noch fehlender zusätzlicher Evidenz dünnen Sie 1+ 1(1:2) mit 10 IU/ml Bromelain,
behält dies es M anual die K onsensusempfehlung mischen Sie mit einer Pipettenspitze und inku-
bei, den G renzwert b ei 5 0% pa rtikelgebundener bieren Sie bei 37 °C für 10 Minuten. Wenn die
motiler Spermien anzusetzen. Liquefizierung vollständig ist, zentrifugieren
2.20 • estung
105 2
Sie bei 2000 g für 10 Minuten. Verwenden Sie Immunobead-
Test
den Überstand sofort für den Test, oder frieren 1. ühren
F Sie den IB-Test, wie in 7 Abschn. 2.20.2 ,
Sie ihn bei −70 °C ein. »Durchführung« beschrieben, mit den flüssig-
2.naktivieren
I Sie jegliches Complement im keitsinkubierten Spenderspermien durch.
gelösten Zervikalmukus, Serum, Seminalplas- 2. eurteilen
B und interpretieren Sie den
ma oder Hodenflüssigkeit durch Erhitzen auf Test wie in 7 Abschn. 2.20.1 »Beurteilung«
,
56 °C für 30–45 Minuten. und 7 Abschn. 2.20.1 »Referenzwerte«
, be-
3. erdünnen
V Sie die hitzeinaktivierte Probe schrieben.
1 + 4(1:5)mit Puffer II (z.B. 10 μl der zu unter-
suchenden Stammlösung mit 40 µl Puffer II).
4. chließen
S Sie bekannte positive und nega-
tive Proben, z.B. Serum von Männern mit
und ohne Antispermienantikörpern, wie im
indirekten Immunobead-Test jeweils nach-
gewiesen, als Kontrollen bei jedem indirekten
Test ein. Männer, die eine Vasektomie haben
durchführen lassen, können als eine Quelle
für Serum dienen, falls sie positiv sind (> 50%
bewegliche Spermien mit Partikelbindung,
ausschließlich der Spermienschwanzspitzen-
bindung).
Inkuba
tion der Spenderspermien mit
den zu testenden Flüssigkeiten
1. ischen
M Sie 50 μl der gewaschenen Spender-
spermiensuspension mit 50 μl der 1 + 4(1:5)
verdünnten zu testenden Flüssigkeiten.
2.nkubieren
I Sie bei 37 °C für eine Stunde.
3. entrifugieren
Z Sie bei 500 g für 5–10 Minuten.
4. ekantieren
stand.
. 5 esuspendieren
pellet mit 10 ml frischem Puffer I.
6. entrifugieren
Z Sie erneut bei 500 g für 5–10
Minuten.
7. ekantieren
stand.
8. iederholen
W Sie die Schritte 5, 6 und 7.
. 9 esuspendieren
pellet mit 0,2 ml Puffer II.
107 3
akultative
F Untersuchungen
3.1 Index für multiple Spermiendefekte – 109
3.1.1 Errechnen der Indizes für multiple morphologische Defekte – 109
3.1.2 Beispiel– 109
3.2 Panleukozyten-Marker CD45 – 110

3.2.1 rinzip
P – 110
3.2.2 Reagenzien– 111
3.2.3 Durchführung – 112
Vorbereitung des Samens – 112
Anfertigen der Spermienausstriche – 112
Antikörper-Inkubation – 112
Färbung und Einbettung – 112
Beurteilung der CD45-positiven Zellen – 112
Errechnen der CD45-Zell-Konzentration im Ejakulat – 113
Beispiele – 113
Referenzbereiche – 113
3.3 Interaktionen zwischen Zervikalschleim und Spermien – 114

3.3.1 n-vivo-Test
I (postkoital) – 114
Ziel – 114
Timing – 114
Instruktionen für die Patienten – 114
Die Untersuchung des Vaginalsekretes – 115
Die Untersuchung der Mukusprobe – 115
Interpretation – 115
3.3.2 n-vitro-Tests
I – 116
3.3.3 ereinfachter
V In-vitro-Test – 117
Beobachtungen – 117
Beurteilung – 118
3.3.4 aKpillar-Test – 118
Materialien – 118
Untersuchung der Flachkapillare – 119
Interpretation – 120
3.4 Biochemische Marker zur Testung der Funktion der akzessorischen
Geschlechtsdrüsen – 120
3.4.1 Die Bestimmung von Zink im Seminalplasma – 121
Hintergrund – 121
Prinzip – 121
Reagenzien – 121
Berechnung – 122
Unterer Referenzbereich – 122
3.4.2 Bestimmung der Fruktose aus dem Seminalplasma – 122
Hintergrund – 122
Prinzip – 122
Reagenzien – 122
Berechnung – 123
3.4.3 Bestimmung der neutralen α-Glukosidase im Seminalplasma – 124
Hintergrund – 124
Prinzip – 124
Reagenzien – 124
Berechnung – 125
3.5 Computerassistierte Spermienanalyse – 126

3.5.1 Einführung– 126
3.5.2 Verwendung der CASA zur Bestimmung der Spermienmotilität – 126
Probenvorbereitung – 127
CASA-Terminologie – 127
3.5.3 CASAzur Bestimmung der Spermienkonzentration – 128
3.5.4 oCmputergestützte Untersuchung der Spermienmorphologie (CASMA) – 129
3.1 • Index für multiple Spermiendefekte
109 3
ests, die in
T diesem Kapitel erläutert werden, sind Diese Defekte werden mit Hilfe eines L aborcoun-
nicht als Ro utineuntersuchungen zu v erstehen, ters gezählt, wobei für jeden D efekt eine Taste ge-
können a ber f ür die Diagnostik o der F orschung wählt wird. Steht dieses Zählgerät nicht zur Ver-
wertvolle Hinweise liefern. fügung, ist die V erwendung einer S trichliste auch
möglich (. Tab. 3.1).
5 er MAI D entspricht dem Mittelwert aller er-
3.1 Inde
x für multiple fassten Defekte pro Spermium. Alle Kopf-,
Spermiendefekte Mittelstück- und Schwanzdefekte gehen mit
in die Kalkulation ein. Die morphologischen
Morphologisch abnormale S permatozoen ha ben Kriterien, die hier Anwendung finden, stam-
häufig multiple Defekte (Kopfdefekte, Mittelstück- men von David et.al. (1975) und wurden 2000
defekte und S chwanzdefekte o der Kombinationen von Auger u. Eustache modifiziert. Sie weichen
daraus). Eine detaillierte Ermittlung des Indexes von der aktuellen Empfehlung dieses Manuals
bietet eine genauere Aussage als die einfache Aus- (7 Abschn. 2.15.1und 2.15.2 ab.
)
wertung der mo rphologischen Defekte in P rozent 5 er TZI D entspricht im Wesentlichen dem
(Jouanet et al . 1988; A uger et al . 2001). W erden MAI, umfasst allerdings bis zu vier Defekte
neben den morphologisch normal geformten Sper- pro Spermium: Kopfdefekt, Mittelstückdefekt,
matozoen a uch alle D efekte und D efektkombina- Schwanzdefekt und den überdimensionalen
tionen ermittelt, lässt sich rechnerisch darstellen, Zytoplasmarest und gibt den errechneten
wie viele Defekte jedes einzelne Spermium im Mit- Mittelwert der Defekte pro Spermium an. Die
tel hat. morphologischen Kriterien entsprechen die-
Drei I ndizes st ehen f ür das Erk ennen der de- sem Manual.
taillierten Defekte zur Verfügung: 5 ür die F Ermittlung des SDI wird die Gesamt-
5 ndexI der multiplen Anomalitäten (MAI) zahl der Defekte durch die Gesamtzahl der
(Jouannet et al. 1988) Spermien (also nicht nur die abnormalen
5 eratozoospermieindex
T (TZI) (Menkveld u. Spermien) geteilt. Er lässt verschiedene Kate-
Kruger, 1996; Menkveld et al. 2001) gorien von Kopfdeformationen einfließen, der
5 ndexI der Spermiendeformationen (SDI) (Axis Mittelstückdefekt und der Schwanzdefekt wer-
et al. 1996 2004) den jedoch nicht weiter kategorisiert, sondern
jeweils als ein Defekt angegeben. Grundsätz-
Diese Indizes zeigen Korrelationen mit der In-vivo- lich liegen hier wieder die morphologischen
Fertilitätsrate (MAI und TZI) (Jouannet et al. 1988; Kriterien dieses Manuals zugrunde.
Slama et al . 200 2; Menkveld et al . 2001) sowie der
In-vitro-Fertilitätsrate (SDI) (Aziz et al. 1996) und
helfen bei der Diagnostik pa thologischer Prozesse 3.1.2e
Bispiel
(Auger et al. 2001; Aziz et al. 2004).
Zweimal 200 S permien sind mit Hilfe eines 6-Tas-
ten-Laborcounters a nalysiert w orden. D abei sind
3.1.1 Err
echnen der Indizes für in der er sten Anal yse 4 2 S permien als mo rpho-
multiple morphologische logisch no rmal und 1 58 als a bnormal k lassifiziert
Defekte worden. I n den 1 58 abnormalen S permien b efan-
den sic h 140 K opfdefekte, 102 M ittelstückdefekte,
Jedes abnormale Spermium wird darauἀ in unter- 30 Schwanzdefekte und 4 4 Spermien wiesen zyto-
sucht, ob es einen K opfdefekt, M ittelstückdefekt plasmatische Reste auf. In der Doppelbestimmung
oder Schwanzdefekt hat oder Kombinationen dar- sind da nn 36 N ormalformen und 16 4 a bnormale
aus. Gleichzeitig werden die Spermatozoen erfasst, Formen gefunden worden. Die abnormalen For-
die einen Z ytoplasmatropfen in einer G röße v on men ha tten 122 K opfdefekte, 108 M ittelstückde-
mehr als ein Drittel des Spermienkopfes aufweisen. fekte, 22 S chwanzdefekte und 36 zyt oplasmatische
110 Kapitel 3 • Fakultative Untersuchungen
. Tab. 3.1 Erre
chnen der Indizes von multiplen Spermiendefekten
MAI TZI* SDI
Maximalwert 4,00 3,00
Nennermenge abnormale abnormale alleSpermien

3 Spermien Spermien
A)
( Anzahl gezählter Spermien 200 200 200
- normal geformte Spermien (N) 46 46 46
- normal geformte Spermien (%) 23 23 23
(B)Anzahl defekter Spermien (200–46) 154 154 154
(1) Anzahl der Kopfdefekte (MAI, SDI) oder Anzahl der 284 154 212
Spermien mit ≥1 Kopfdefekt (TZI)
(2) Anzahl der Mittelstückdefekte (MAI) oder Anzahl 54 52 52

der Spermien mit ≥1 Mittelstückdefekt (TZI, SDI)
(3) Anzahl der Schwanzdefekte (MAI) oder Anzahl der 54 46 46

Spermien mit ≥1 Schwanzdefekt (TZI, SDI)
(4) Anzahl der Spermien mit übergroßem Zytoplas- 41 41 41

maresttropfen
(C) Gesamtdefekte MAI: (1)+(2)+(3)= (C) 392
(D) Gesamtdefekte TZI, SDI: (1)+(2)+(3)+(4)= (D) 266 32

4
Kalkulation des Index C/B D/B D/A
ndex-Ergebnis
I 2,55 1,7
2 1,62
* Diese Beschreibung des TZI beruht auf der Originalpublikation (Menkveld et al. 2001), dem Manual der ESHRE (Euro-
pean Society of Human Reproduktion and Embryology) und NAFA (Nodic Association for Andrology) (ESHRE/NAFA
2002) und beschreibt Index-Ergebnisse von 1 bis 4. Hier liegt der Unterschied zu dem vorangehenden WHO-Labor-
handbuch (WHO 1999), in dem Index-Ergebnisse von 1 bis 3 beschrieben wurden, weil der exzessive Zytoplasmarest
nicht separat, sondern als Mittelstückdefekt gezählt wurde.
Reste. Der TZI wurde ermittelt, indem die Summe Polymorphkernige Leukozyten ohne Granula, bzw.
aller Defekte (140 + 102 + 30 + 4 + 122 + 108 + 22 + Zellen ohne Peroxidase wie L ymphozyten, Mono-
36 = 604) durch die Anzahl der mo rphologisch ab- zyten und M akrophagen können dagegen nur mit
normalen Spermien (158 + 164 = 322) geteilt wurde: Hilfe der imm unzytochemischen F ärbung er fasst
TZI = 604/322 = 1,88. werden. Dies e imm unochemischen F ärbemetho-
Die. Tab. 3.2 zeigt MA - und TZI-Er gebnisse den sind deu tlich t eurer und zei taufwendiger als
von Patienten aus Kinderwunschzentren und Män- die Peroxidasefärbung, bieten aber eine exakte Dif-
nern, die innerhalb der letzten 3 Jahre ein Kind ge- ferenzierung von Leukozyten zu Stammzellen.
zeugt haben.
3.2.1 rPinzip
3.2 aPnleukozyten-Marker CD45
Humane L eukozyten zeig en CD45-An tigen-Ex-
Leukozyten werden im Ortho-Toluidin-Test pressionen, w elche sic h mi t einem sp ezifischen
(7 Abschn. 2.18.1) anhand der Peroxidase detektiert. monoklonalen Antikörper detektieren lassen.
3.2 • Panleukozyten-Marker CD45
111 3
. Tab. 3.2 Spermiendef
ekt- Indizes von fertilen und infertilen Paaren
Fertile Paare Infertile Paare

MAI1 TZI2 MAI3 TZI2
Mittelwert 1,94 1,81 1,58 1,51
Standardabweichung SD 0,37 0,3 0,2 0,2
Minimum 1,12 1,26 1,04 1,17
Maximum 3,9 2,64 2,38 2,07
Prozentile
5 1,44 1,27
10 1,51 1,7
4 1,34 1,33
25 1,67 1,44
50 1,88 1,81 1,58 1,54
57 2
,14 ,72
1
90 2,44 1,86
95 2,65 1,94
N 4930 103 994 107

1 Nichtpublizierte Daten von J Auger, Paris, unter Verwendung der morphologischen Klassifikation nach David (David
et al. 1975, modifiziert von Auger u. Eustache 2000)
2 Menkveld et al. 2001
3 Jorgensen et al. 2001, unter Verwendung der morphologischen Klassifikation nach David (David et al. 1975; modifiziert
von Auger u. Eustache 2000)
Durch Modifikation des primären Antikörpers las- Laborfilters mit einer Porengröße von 0,45 μm
sen sic h v erschiedene I soformen des CD45-An ti- filtrieren.
gens nachweisen, die wieder um spezifisch für den 5. Fixierung: entweder mit purem Aceton oder
Zelltyp (Monozyt, Makrophage, B- oder T-Zellen) mit einem Aceton-Methanol-Formalin-Ge-
sind, wenn diese genaue Differenzierung im Fokus misch (95 ml Aceton mit 95 ml reinem Metha-
des Interesses steht. nol mischen und 10 ml 37%iges (v/v) Formalin
hinzufügen.
6. rimär-Antikörper:
P ein monoklonaler Anti-
3.2.2 Reagenzien körper gegen CD45-Leukozytenantigene, pro-
duziert in der Maus.
. 1 Dulb ecco’s Phosphat-Puffer (7 Abschn. 11.2 ) 7. ekundär-Antikörper:
S ein Anti-Maus-Rabbit-
2.TBS-Puffer, pH 8,2 (7 Abschn. 11.8 ) Immunglobulin. Die Verdünnung hängt vom
3. etramisol-Hydrochlorid
T (entspricht Levami- Antikörper-Titer ab.
sol) 1,0 mol/l: 2,4 g Levamisol in 10 ml Aqua 8. Alkalische Phosphatase: ein antialkalischer
bidest lösen. Phosphatase-Komplex (APAAP).
4. ubstrat:
S 2 mg Naphthol-AS-MX-Phosphat in 9. arbstoff
F nach Harris (Harris’s Hämatoxylin)
9,7 ml TBS-Puffer pH 8,2 geben. Dazu 0,2 ml (7 Abschn. 11.10 ).
Dimethylformamid und 0,1 ml des 1,0 molaren
Levamisols. Kurz vor Gebrauch 10 mg Fast
Red TR Salz dazugeben und mit Hilfe eines
3.2.3 Dur
chführung
orbereitung
V des Samens
1. menprobe
Sa gut mischen (7 Abschn. 2.3 )
2.0,5 ml der Samenprobe mit 2,5 ml DPBS mi-
schen.
3 3. satz
An bei 500 g 5 Minuten zentrifugieren,
Überstand verwerfen und das Sediment erneut
mit dem ca. fünffachen des Pellets mit DPBS
resuspendieren.
4. entrifugieren
Z 5 Minuten bei 500 g.
5. enDVorgang wiederholen und das Sediment . Abb. 3.1 eukozyten
L im Ejakulat. CD45-enthaltende
so mit DPBS resuspendieren, dass ca. 50 Mil- Zellen (Leukozyten) färben sich rot an (Foto von RJ Aitken
lionen Spermien pro ml vorhanden sind. zur Verfügung gestellt)
nfertigen
A der Spermienausstriche 6.10 μl des APAAPs in den markierten Kreis
. 1 eweils
J 5 μl der Spermiensuspension für die pipettieren.
Doppelbestimmung auf 2 Objektträger aus- 7. Stunde
1 in der feuchten Kammer bei Raum-
streichen und an der Luft trocknen lassen. temperatur inkubieren lassen.
2. usstriche
A entweder 10 Minuten in absolutem 8. TBS-W aschvorgang zweimal und wieder über-
Aceton oder für 90 Sekunden in einem Ace- schüssiges TBS abfließen lassen.
ton-Ethanol-Formalin-Gemisch fixieren. 9. jektträger
Ob mit 10 μl Naphthol Phosphat
3. weimal
Z mit TBS waschen, dann das TBS ab- Substrat für 20 Minuten in der feuchten Kam-
fließen lassen. mer bei Raumtemperatur inkubieren.
4. usstriche
A direkt mit den Antikörpern be-
handeln oder in Aluminiumfolie gewickelt bei Anmerkung
Um die I ntensität der Reaktion zu st eigern, ist es auch mög-
–70 °C für spätere Analysen lagern.
lich, die I nkubation mit dem S ekundärantikörper und dem
APAAP jeweils 15 Minuten zu wiederholen.
ntikörper-Inkubation
A
1. itM Hilfe eines Fettstiftes auf jedem Objekt-
träger einen Kreis mit einem Durchmesser von ärbung
F und Einbettung
ca. 1 cm markieren. In diesen Kreis 10 μl des 1. obald
S die Ausstriche eine rötliche Färbung
primären Antikörpers geben. zeigen, wird die Reaktion durch das Waschen
2. jektträger
Ob 30 Minuten bei Raumtemperatur mit TBS (zweimalig) beendet.
in einer feuchten Kammer (eine Petrischale 2. usstriche
A danach für einige Sekunden in
mit einem nassen Zellstoff ausgelegt) inkubie- Hämatoxylin nach Harris färben und in Aqua
ren, um das Austrocknen zu verhindern. Auf dest tauchen. Anschließend mit Eindeck-Me-
waagerechte Lage achten. dium konservieren.
3. weimal
Z mit TBS waschen, TBS sorgfältig ab-
fließen lassen. eurteilung
B der CD45-positiven Zellen
4.10 μl des Sekundärantikörpers auf den mar- 1. asDgefärbte Areal des Ausstriches wird im
kierten Bereich pipettieren und 30 Minuten Hellfeld mit dem 20er oder 40er Objektiv be-
in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur trachtet. CD45-positive Zellen (Leukozyten)
inkubieren lassen. färben sich rot an (. Abb. 3.1)
. 5 weimal
Z mit TBS waschen, überschüssiges 2. DieCD45-positiven Zellen werden parallel zu
TBS abfließen lassen. den Spermien erfasst, bis pro Ausstrich 200
Spermien gezählt sind, um die Fehlerquote so
3.2 • Panleukozyten-Marker CD45
113 3
gering wie möglich zu halten (7 Kasten 2.7 und » Zu wenig Zellen für eine akkurate Ermittlung der
. Tab. 2.2 ). Konzentration«.
. 3 ürFdas Zählen der CD45-positiven Zellen und
der Spermien einen Laborcounter verwenden. eispiele
B
4. enDzweiten Objektträger für die Doppelbe- Beispiel 1: I n dem er sten Du plikat w erden 20
stimmung ebenso auszählen. CD45-positive Z ellen p ro 200 S permatozoen und
5. DieSumme und die Differenz der beiden Aus- im zweiten 40 CD45-positive Zellen pro 200 S per-
zählungen der CD45-positiven Zellen ermit- matozoen e rmittelt. D ie S umme d er b eiden A us-
teln. wertungen ist 60(20 + 40) und die Differenz beträgt
. 6 erprüfen,
Üb ob aus den Ergebnissen der Dop- 20(40–20). Die . Tab. 2.5 zeigt, dass dies e D op-
pelbestimmung der Mittelwert gebildet werden pelwerte zu s ehr differieren und die B ildung des
darf (. Tab. 2.5 oder . Abb. 14.1 ).(Mit Hilfe Mittelwertes nicht erlauben. Die b eiden Duplikate
dieser Tabellen lässt sich ermitteln, ob die müssen erneut ausgewertet werden.
Abweichung zwischen den Einzelmessungen Beispiel 2: D er Ausstrich 1 zeigt 25 CD45-po-
gering genug ist, um innerhalb des 95%-Ver- sitive Z ellen und das Du plikat 35 CD45-p ositive
trauensbereiches zu liegen.) Zellen pro 200 Spermien. Die Summe der Doppel-
7.st die
I Differenz akzeptabel, wird die Konzen- bestimmung ist 60(25 + 35) und die Differenz be-
tration errechnet (s.u.). Ist die Differenz zu trägt 10(35–25). Der Blick auf die . Tab. 2.5 zeigt,
groß, muss die Auszählung beider Duplikate dass diese Werte gemittelt werden dürfen, da die
wiederholt werden. (7 Kasten 2.10 ). Abweichung gering genug ist.
8. ittlere
M CD45-Konzentration ermitteln. 60 CD45-p ositive Z ellen p ro 400 S permato-
. 9 ieDabsolute Anzahl der CD45-positiven Zel- zoen und einer S permienkonzentration v on 70
len pro Ejakulat wird ermittelt. Millionen p ro ml , er gibt C = S × (N/400) = 70
Million/ml × ( 60/400) = 10,5 Millionen CD45-po-
sitive Zellen/ml Ejakulat.
echnen
Err der CD45-Zell-Konzentration Da w eniger als 400 CD45-p ositve Z ellen g e-
im Ejakulat zählt wur den, m uss der Z ählfehler f ür 60 Z ellen
Die Rela tion der CD45-p ositiven Z ellen zu de n aus der . Tab. 2.2 abgelesen werden. Dieser beträgt
Spermatozoen dient als Grundlage für die Er rech- in diesem Fall ca. 13%.
nung der Konzentration. Die Spermienkonzentra-
tion wird mit Hilfe des Hämozytometers ermittelt. erenzbereiche
Ref
Wenn N die Anzahl der CD45-positiven Zellen in Für CD45-positve Zellen im Ejakulat fertiler Män-
demselben Areal des A usstriches ist, in dem 400 ner existiert zurzeit kein definierter Normalbereich.
Spermatozoen gezählt werden, und S ist die S per- Der Normbereich von ≤1,0 Millionen peroxidase-
mien-Konzentration in Million pro ml, dann lautet positiver Z ellen pro Milliliter Ejakulat kann nicht
die F ormel f ür die K onzentration CD45-positiver einfach übernommen werden, da mit der Peroxida-
Zellen C = S × (N/400). se-Reaktion die Granulozyten detektiert, nicht aber
die Gesamtheit der Leukozyten erfasst wird.
ensitivität
S der Methode Anmerkung
Beinhaltet die Sa menprobe w eniger CD45-positi- Die absolute Leukozytenzahl (Gesamtleukozyten pro Ejaku-
ve Zellen als S permien, also weniger als 400, wir d lat) spiegelt möglicher weise am besten den S chweregrad
möglicherweise die Fehlergrenze von 5% überstie- entzündlicher Prozesse wider ( Wolff 1995). Die absolut e An-
zahl CD45-positiv er Z ellen im Gesamt ejakulat wir d dur ch
gen. In dem Fall wird der Z ählfehler, der sic h mit
Multiplikation der Konz entration CD45-positiver Z ellen mit
Hilfe der . Tab. 2.2 und der Anzahl ausgewerteter dem Ejakulatvolumen ermittelt.
Zellen ermitteln lässt, dokumentiert.
Befinden sich weniger als 25 CD45-positive Zel-
len pro 400 S permatozoen in dem P räparat, wird
der B efund mit folgendem Hinweis kommentiert:
3.3 In
teraktionen zwischen Weiteren sind M essungen des Ö strogens aus dem
Zervikalschleim und Spermien Serum oder des luteinisierenden Hormons aus dem
Urin oder Serum sowie Ultraschalluntersuchungen
Zervikaler M ukus ist n ur f ür eine limi tierte Z eit der Ovarien geeignete Hilfsmittel.
im weiblichen Zyklus durchgängig für Spermien. In Wichtig ist der st andardisierte Z eitpunkt der
der Mitte des Zyklus begünstigt Östrogen die Mu- Mukusuntersuchung: Dies er s ollte 9–1 4 S tunden
3 kusviskosität und s omit die P enetration der S per- nach dem Koitus analysiert werden.
matozoen. Die Dauer der erhöhten Penetrationsbe-
reitschaft im Mukus variiert von Frau zu Frau, zeigt Instruktionen
für die Patienten
aber a uch b isweilen indi viduelle S chwankungen Die Patienten müssen über den ide alen Zeitpunkt
von einem Zyklus zum nächsten. des P ostkoitaltests inf ormiert w erden und s ollten
Anmerkung folgende Hinweise erhalten:
I 7 Kap. 12sind Details zur Gewinnung, Lagerung und
m 1. asDPaar sollte 2 Tage vor dem Postkoitaltest
Untersuchung der charakteristischen Eigenschaften des Mu- keinen Geschlechtsverkehr haben; wobei der
kus zu finden. Mann auch auf die Masturbation verzichten
sollte.
Kommentar 2. erDGeschlechtsverkehr sollte in der Nacht vor
Für M änner, denen die Ejakulat gewinnung durc h dem geplanten Labortest stattfinden.
Masturbation nicht möglich ist, dient der Postkoi- . 3 Die Verwendung von Gleitmitteln ist nicht
taltest ( 7 Abschn. 3.3.1als) Alternative, um einige erlaubt und auch eine Intimdusche oder ein
Informationen zur Spermienqualität zu erhalten. Vollbad nach dem Koitus ist nicht gestattet.
Duschen hingegen ist möglich.
4. DieFrau sollte sich am Morgen nach dem
3.3.1In-viv
o-Test (postkoital) Koitus in die Klinik begeben.
Ziel
Sinn und Z weck des P ostkoitaltests ist es, die An- Dur
chführung
zahl der ak tiven Spermatozoen im Z ervikalmukus 1. Ein
fettfreies Spekulum wird vaginal einge-
zu er mitteln und A ussagen üb er die Üb erlebens- führt.
fähigkeit zu erla ngen (S obrero u . MacLeod 1962), 2. itM
einer Tuberkulinspritze ohne Nadel, einer
bzw. üb er die Spermieneigenschaften einige Stun- Pipette oder ähnlichem zunächst so viel des
den nach dem Koitus (Reservoir-Eigenschaften des Vaginalfluids wie möglich aus dem posterioren
Mukus) (Moghissi 1976). Diese Informationen sind Vaginalbogen aspirieren.
wichtig, um die A uswirkung eines p ositiven Anti- 3. itM
einer neuen Spritze oder einem Katheder
körpertiters gegen Spermien, unabhängig ob dieser so viel Vaginalmukus wie möglich aus dem
bei der F rau o der dem M ann nac hgewiesen wur- endozervikalen Kanal gewinnen.
den, zu beobachten. 4. EinenTeil des Mukus auf einen Objektträger
geben und mit einem Deckglas (22 × 22 mm)
iming
T bedecken. Die Auszähltiefe dieser Präparation
Der ide ale Z eitpunkt f ür den P ostkoitaltest ist s o kann durch Verwendung von Silikonfetten
kurz w ie m öglich v or d em E isprung. Wichtig i st, oder einer speziellen Vaseline (7 Kasten 3.1 ),
dass d ie O vulation n och n icht s tattgefunden h at. die Glaspartikel mit einem Durchmesser von
Klinische B efunde wie die K enntnisse üb er die 100 μm beinhalten, standardisiert werden
Länge vorangehender Zyklen, die Messung der ba- (Drobnis et al. 1988).
salen Körpertemperatur, das Betrachten der Mu- 5. Die
Untersuchung des Mukus erfolgt bei
kuskonsistenz und der Vaginalzytologie helfen da- 400facher Vergrößerung im Phasenkontrast.
bei, den o ptimalen Z eitpunkt zu b estimmen. D es
3.3 • Interaktionen zwischen Zervikalschleim und Spermien
115 3
etwa 32%) und s ollte en tsprechend do kumentiert
Kasten 3.1 Präparation einer Vaseline- werden.
Mischung Die Spermienmotilität im Zervikalmukus wird
Eine im Vorfeld erstellte Vaseline-Mischung kann in die folgenden Kategorien eingeteilt:
bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur gelagert 5 R: progressive
P Motilität
werden. Wachs, mit einem Schmelzpunkt von 5 P: nichtprogressive
N Motilität
48–66 °C, wird in einem Laborgefäß geschmolzen 5 immotile
IM: Spermien
und mit Hilfe eines Glasstabes mit Vaseline ver-
mischt (Mischungsverhältnis 1Teil Wachs plus 2
Teile Vaseline). Sobald sich die Bestandteile homo- Die An wesenheit p rogressiv mo tiler S permien ist
genisiert haben, sollte die Masse leicht abkühlen der aussagekräftigste Hinweis auf eine intakte Zer-
und in eine 3-ml- oder 5-ml-Spritze (ohne Nadel) vixfunktion.
gefüllt werden, solange sie noch warm ist. Ist die
Mischung erstarrt, wird eine 18er Kanüle mit einem
Rundschliff auf die Spritze gesteckt.
terpretation
In
5 er Test
D ist negativ, wenn keine Spermien im
Mukus gefunden werden.
5 Anwesenheit
Die von progressiv motilen Sper-
Anmerkung
Eine zuverlässige Aussage lässt sich nur fällen, wenn die matozoen nach 9–14 Stunden im endozervika-
Mukusprobe von guter Qualität und frei von Kontamination len Mukus, auch wenn es sich um vereinzelte
durch Blut ist. handelt, spricht gegen eine immunologische
Infertilität beim Patienten, bzw. bei der Patien-
Untersuchung
Die des Vaginalsekretes tin (Oei et al. 1995).
In der Reg el sterben Spermatozoen in der V agina 5 efinden
B sich Verklumpungen nichtprogressi-
innerhalb v on 2 S tunden a b. Es ist sinn voll, mi t ver Spermien im Mukus, handelt es sich vor-
Hilfe eines Feuchtpräparates das Vaginalsekret dar- aussichtlich um Spermienantikörper, entweder
auἀ in zu untersuchen, ob tatsächlich Ejakulat dort um zervikale Antikörper oder um welche, die
nachzuweisen ist. der Patient gegen seine Spermien gebildet hat.
Anmerkung
Die
Untersuchung der Mukusprobe Ist das Ergebnis des initialen Postkoitaltests negativ oder ab-
Die Anzahl der S permien, die im un teren Teil des normal, sollte eine Wiederholung erfolgen.
Zervixkanals zu finden ist, hängt von der Zeitdif-
ferenz zwis chen G eschlechtsverkehr und M ukus- Kommentar
entnahme ab. Zwei bis drei Stunden nach dem Koi- Befinden sich postkoital keine Spermien im Mukus,
tus befindet sich hier im S chnitt eine hohe Anzahl sollte das Paar erneut auf die Wichtigkeit der intra-
akkumulierter Spermatozoen. vaginalen Ejakulation hingewiesen werden.
Die Anzahl dies er S permien lässt sic h zwa r
nicht exakt ermitteln, aber durch die Umrechnung Kommentar
von g esehenen S permien p ro mikr oskopisches Ein negativ er Test k ann auch auf grund eines
Blickfeld do ch gu t er fassen ( 7 Kasten 3.2 ).Ange- schlechten Timings entst ehen. Findet der P ostkoi-
geben wir d die Anzahl der S permatozoen p ro µl taltest nicht im Optimum des M enstruationszyklus
Mukus. statt, k ann er negativ ausfallen, ob wohl auf der
omitS wäre eine Zählung von 10 Spermien in weiblichen S eite kein F ertilitätsproblem v orliegt.
einem mikroskopischen Blickfeld bei Verwendung Die Z yklen mancher P atientinnen biet en nur für 1
der beschriebenen optischen Apparaturen und der bis 2 Tage die M öglichkeit eines gut dur chführba-
erstellten 100-µm-P räparation g leichbedeutend ren P ostkoitaltests. S ollte sich der Z eitpunkt der
mit 10 S permatozoen p ro 20 nl, was wieder um Ovulation nicht korrekt ermitteln lassen, ist unter
umgerechnet 500 Spermatozoen pro µl entspricht. Umständen eine mehrfache Wiederholung des
Eine niedrige Anzahl von Spermien lässt den Zähl- Postkoitaltests innerhalb eines M enstruationszy-
fehler groß werden (in dies em Beispiel liegt er b ei klus not wendig. Alt ernativ k ann auch ein I n-vitro-
Test erfolgen.
Kasten 3.2 Mikroskopische Volumenuntersuchung einer 100 μm tiefen Mukus-Präparation

Das
Mukusvolumen in einem mikro- ablesen oder durch Division des mit einer Apertur von 20 mm weist
skopischen Feld ist abhängig von Durchmessers der Okularöffnung ein mikroskopisches Blickfeld einen
der Feldgröße (Лr2, wobei Л 3,142 durch die Vergrößerung des Objek- Durchmesser von ungefähr 500 μm
und r der Radius des mikroskopi- tivs. Eine Blickfeldgröße, betrachtet (20 mm/40) auf. Somit lautet die
3 schen Feldes ist) und von der Kam- durch ein 40er Objektiv, wird als Rechnung Radius r = 250 µm,
mertiefe (hier 100 µm). Der Durch- »high power field« bezeichnet und r2 = 62.500 µm2, Лr2= 196.375 µm2.
messer eines mikroskopischen mit HPF abgekürzt. Umgerechnet auf das Volumen
Feldes lässt sich mit Hilfe eines BeiVerwendung eines 40er entsprechen 196.375 µm2 91.637.500
speziellen Mikroskopmikrometers Objektivs und einem 10er Okular µm3 oder aufgerundet 20 nl.
Kommentar Kommentar
Um die Diag nose der gest örten Z ervikalfunktion Donogener Z ervikalschleim k ann sehr gut v on
als Ursache der Infertilität zu stellen, sind mehr ere Frauen gewonnen werden, die sich in Vorbereitung
negative P ostkoitaltests, die mit einem optimalen zur assistierten Befruchtung befinden.
Timing durchgeführt worden sein sollten, nötig. Ist eine I nsemination geplant, dar f die Ent-
nahme des Mukus selbst verständlich nur v or dem
Eingriff geschehen. Als Spender-Z ervikalschleim
3.3.2In-vitr
o-Tests ist der, durch Gonadotropin hormonell stimulier te,
wie auch aus einem natürlichen Zyklus stammende
Der I n-vitro-Penetrationstest ist ein wic htiges Mukus geeignet.
Hilfsmittel, um Aussagen zur Interaktion zwischen
Spermien und Z ervikalschleim zu erhalten. In der Kommentar
Regel kommt dieser Test nach mehreren negativen Um die Mukusqualität zu st eigern, ist es möglich,
Postkoitaltests zum Ein satz. S eine A ussagekraft den Frauen für einen Zeitraum von 7–10Tagen Ethi-
lässt sich noch steigern, indem er in einer Kreuzre- nyl-Östradiol zu geben (7 Abschn. 12.2.1).
aktion gleichzeitig mit einem Spenderejakulat und
einem S pendermukus als K ontrolle d urchgeführt Kommentar
wird. Gleichzeitig erhält man eine I dee, wie signi- Zervikalschleim v on F rauen, die z wecks Eiz ellrei-
fikant sich vorhandene Antikörper, unabhängig ob fung Clomif en erhalt en, sollt e nicht als Kontr oll-
auf männlicher oder weiblicher Seite, auf die Funk- Mukus eingesetzt werden, da der antiöstrogene
tion auswirken. Effekt auf die Zervix den Test beeinflussen könnte.
5 oll die S Qualität verschiedener Zervikalmuku-
sproben getestet werden, ist der Einsatz einer 5 gesetzt
Ein wird humaner Zervikalschleim, der
einzelnen, normozoospermen Ejakulatprobe in der Zyklusmitte entnommen wurde.
sinnvoll. 5 m sicher
U zu stellen, dass äußere Einflusse wie
5 ollenS verschiedene Ejakulatproben getestet Temperaturschwankungen oder Dehydratation
werden, muss der Mukus einer Frau eingesetzt nicht die Spermienqualität und damit die Aus-
werden, wobei er von guter Qualität und zum wertung des Testes beeinflussen, sollte der Test
richtigen Zykluszeitpunkt entnommen sein innerhalb 1 Stunde nach Ejakulatgewinnung
sollte. erfolgen.
5 er pH-Wert
D des Mukus aus dem endozer-
Anmerkung vikalen Kanal wird mit Hilfe eines Messstrei-
I 7 Kap. 12
m sind Details zur Gewinnung, Lagerung und Be-
fens (Bereich pH 6,0–10,0) in situ oder direkt
urteilung von Zervikalschleim aufgeführt.
nach der Mukusentnahme bestimmt. Erfolgt
die pH-Messung in situ, muss sichergestellt
117 3
werden, dass wirklich im endozervikalen Ka- 2. schließend
An wird ein Tropfen Nativejakulat
nal gemessen wird und nicht extrazervikaler an den Deckglasrand pipettiert, sodass dieser
Mukus, dessen pH-Wert deutlich niedriger ist. über Kapillarkräfte bis an den Mukus gelangt
Auch sollten Kontaminationen durch Vaginal- und eine klare Schnittgrenze zwischen Mukus
sekret vermieden werden, das, genauso wie und Ejakulat zu beobachten ist.
extrazervikaler Mukus, einen niedrigen pH- 3. erDObjektträger wird waagrecht in eine
Wert besitzt. feuchte Kammer (z.B. eine Petrischale, in die
5 permien
S reagieren empfindlich auf die pH- ein befeuchtetes Zellstoffpapier gelegt wird)
Wert-Änderungen, die durch den Mukus gegeben, um das Austrocknen zu vermeiden.
hervorgerufen werden. Während ein basischer Die Inkubationszeit beträgt 30 Minuten bei
Zervikalschleim die Spermienmotilität an- 37 °C.
regen kann, hemmt ein saurer pH-Wert die . 4 ieDSchnittpunkte zwischen Ejakulat und
Spermien in ihrer Beweglichkeit. Ein extrem Mukus werden mit dem Mikroskop in Phasen-
basisches Milieu (pH >8,5) wiederum stresst kontrastoptik und 400fac her Vergrößerung
die Spermatozoen stark und sie könnten ab- untersucht.
sterben. Für die Migration und die Überle-
bensdauer der Spermatozoen liegt der ideale eobachtungen
B
pH-Wert bei pH 7,0–8,5, was exakt dem pH- Folgende Punk te k önnen b eobachtet und s ollten
Wert eines normalen Zervikalschleims in der notiert werden:
Zyklusmitte entspricht. 1. nnerhalb
I weniger Minuten kommt es zur
5 ährend
W die Penetrationsfähigkeit der Sper- Ausbildung fingerartig aussehender Kanäle im
mien bei pH-Werten zwischen 6,0 und 7,0 Seminalplasma, die in den Mukus einströmen.
kaum abnimmt, leidet die Spermienmotilität Hierbei handelt es sich um eine physikalische
stark bei einem pH-Milieu unter 6,5. Häufig Reaktion zwischen den Körperflüssigkeiten,
werden Spermien-Zervikal-Tests bei einem die genauso auch bei einer azoospermen
pH-Wert unter 7,0 gar nicht erst durchgeführt. Ejakulatprobe zu beobachten wäre (Perloff u.
Steinberger 1963; Moghissi et al. 1964).
Anmerkung . 2 Die meisten Spermien nutzen diese fingerar-
Alternativen zu Zervikalschleim wie boviner Mukus oder syn-
tigen Kanäle, um von dort leichter in den
thetische Ersatzgele haben nicht die gleiche A ussagekraft
wie der In-vitro-Test, der mit humanem Mukus durc hgeführt
Mukus zu penetrieren. Häufig sind zunächst
wird. Dennoch lässt sich mit H ilfe dieser Ersatzst offe eine einzelne Spermatozoen zu beobachten, die
eventuell zu beobacht ende Veränderung der Spermienmo - sich einen Weg in den Mukus bahnen und von
tilität in viskösen M edien gut beobacht en (Neuwinger et al . vielen weiteren Spermien gefolgt werden.
1991, Ivic et al. 2002).
3. indS die Spermien erst einmal in den Mukus
gelangt, schwärmen sie in alle Richtungen aus.
Wenige bewegen sich in das Seminalplasma
eVreinfachter In-vitro-Test
3.3.3 zurück; die meisten bewegen sich solange im
Mukus, bis sie auf einen Widerstand treffen,
Dur
chführung sei es ein Leukozyt oder ein zelluläres Frag-
1. EinTropfen Zervikalschleim auf einen Ob- ment.
jektträger geben und mit einem Deckglas von 4. permatozoen
S können eine Wegstrecke von
22 × 22 mm bedecken. Die Kammertiefe dieses 500 μm (das entspricht in etwa 10 Spermien-
Präparats kann mit Hilfe von Silikonfett oder längen) oder mehr im Mukus zurücklegen.
einer Wachs-Vaseline-Mischung validiert wer- 5. erDProzentsatz motiler Spermatozoen sollte
den (7 Kasten 3.1), die Glaspartikel mit einem erfasst werden und auch untersucht werden,
Durchmesser von 100 μm beinhaltet (Drobnis wie viele davon progressiv motil sind.
et al. 1988).
eurteilung
B mukusgefüllten K apillare b ewegen k önnen. Die
Die B eurteilung des v ereinfachten I n-vitro-Tests hier im B uch b eschriebene M ethode basier t a uf
hat sub jektiven Cha rakter, w eil eine S tandardisie- dem Originaltest von Kremer.
rung in der B etrachtung der Phä nomene ka um
möglich ist. Konsequenterweise darf dieser Test nur Ma
terialien
als qualitativer Test zur Beurteilung der Spermien- Nach Austestung zahlreicher Kapillaren hat sich die
3 Zervikalschleim-Interaktion b etrachtet w erden. Verwendung einer Flac hkapillare mit einem inne-
Trotzdem bietet er einige wertvolle Informationen. ren Durchmesser von 0,3 mm und einer Länge von
1.Normaler Befund: Die Spermien wandern 5 cm a m meist en b ewährt und wir d s omit em p-
in den Mukus ein, mehr als 90% davon sind fohlen.
motil und zeigen auch eine progressive Motili- EineKremer-Test-Messskala (. Abb. 3.2 ), die
tät. Bei diesem Befund kann eine Problematik dazu dient, die Penetrationsweite der Spermato-
in der Spermien-Zervikalschleim-Interaktion zoen a bzulesen, lässt sic h f olgendermaßen s elbst
ausgeschlossen werden. herstellen.
2.Eingeschränkt normaler Befund: Die Sper- 1. ufAeinen Objektträger werden drei abge-
matozoen wandern zwar in den Mukus ein, schnittene Böden eines kleinen Zentrifugen-
dringen aber weniger als 500 μm (ca. 10 Sper- gefäßes mit einem Radius von ca. 3,5 mm ge-
mienlängen) darin ein. Hier ist eine Problema- klebt. Diese Böden sollen das Ejakulat für den
tik der Spermien-Zervikalschleim-Interaktion Kremer-Test aufnehmen.
wahrscheinlich. 2. Einzweiter Objektträger wird auf den ersten
3.Pathologischer Befund: Wenn (1) die Sper- geklebt, wobei es wichtig ist, dass der zweite
mien gar nicht erst in den Mukus eindringen 1,5 cm kürzer ist, da die Böden der Zentri-
können oder (2) sie es zwar können, aber fugengefäße um ca. 5 mm frei bleiben sollen.
sofort immotil werden oder (3) nur Spermien Diese Distanz ist wichtig, um der Kapillarkraft
mit einer lokalen Beweglichkeit (kein Raum- zu umgehen, die das Ejakulat zwischen die
gewinn) zu beobachten sind. Ob die pha- beiden Objektträger ziehen würde.
lanxartig aussehenden Kanäle ausgebildet sind 3. EinZentimetermaß wird seitlich auf den Ob-
oder nicht, spielt eine untergeordnete Rolle. jektträger befestigt.
Wenn die Spermien die Kanäle nicht verlassen
können oder miteinander agglutinieren, liegt chführung
Dur
mit aller Wahrscheinlichkeit eine Antikörper- 1.e 100 μl
J verflüssigtes Ejakulat, das nicht älter
Problematik vor. als 1 Stunde nach Ejakulation sein sollte, wird
in jeweils eins der aufgeklebten Zentrifugen-
Kommentar gefäßböden pipettiert.
Liegt ein patholog ischer Befund v or, g ibt der ge - 2. ervikalmukus
Z wird durch Aspiration in 3
kreuzte In-vitro-Test mit Spenderejakulat und zu Kapillaren gefüllt. Luftblasen stören die Penet-
testendem Mukus so wie Spendermukus und zu ration und müssen vermieden werden.
testendes Ejakulat den H inweis, ob die P roblema- 3.eweils
J ein Ende jeder Kapillare wird mit Hilfe
tik auf männlicher oder weiblicher Seite des Paares von Knetmasse oder anderer Abdichtmassen
liegt. verschlossen. Es ist so viel Verschlussmaterial
nötig, dass am offenen Ende der Kapillare der
Mukus leicht austritt.
3.3.4Kapillar-
Test . 4 ieDKapillare wird so auf den Objektträger
platziert, dass das offene Ende im Ejakulat mit-
Der Kapillar-Test stammt ursprünglich von Kremer tig eintauchen kann und sich mit rund 0,5 cm
(1965) und ist im Verlauf der letzten Jahre mehrfach im Ejakulat befindet.
modifiziert worden. Das Prinzip dieses Tests ist, zu 5. erDAnsatz wird in horizontaler Position in
beobachten, wie sich die Spermien innerhalb einer die feuchte Kammer (eine mit feuchtem Zell-
119 3
5 mm
Reservoir
1 0
6 5 4 3 2
Plombe Mukus Samen
. Abb. 3.2 remer-Test-Messskala
K
stoff ausgefüllte Petrischale; verhindert die einer Fokussierebene betrachtet (mit einem
Austrocknung) gegeben und für 2 Stunden bei 10er Objektiv; man spricht von einem »low-
37 °C inkubiert. power-field« = LPF) und der Mittelwert aus
. 6 achN Beendigung der Inkubationszeit wird den gezählten Spermien gebildet. Die Bedeu-
die Kapillare mikroskopisch mit dem 10er tung dieser ermittelten Spermienanzahl wird
Objektiv im Phasenkontrast betrachtet. mit Hilfe eines Rankingsystems (. Tab. 3.3 )
Im 7 Abschn. 3.3.4 »Untersuchung
, der Flach- ermittelt. Für die Klassifikation der Penetra-
kapillare« (s.u.) wird die Untersuchung näher tionsdichte dient die höchste Spermienanzahl,
beschrieben. unabhängig ob diese an der 4,5- oder der
7. erDAnsatz wird erneut in den Inkubator ge- 1,0-cm-Marke gefunden wird.
geben und nach 24 Stunden darauἀ in unter- 3.Migrationsgradient: Definiert die errechnete
sucht, ob noch motile Spermien im Mukus der Abnahme der Spermiendichte zwischen der
Kapillare zu finden sind. 1,0- und der 4,5-cm-Marke. Ausgedrückt wird
diese Abnahme mit der der Differenz in dem
tersuchung
Un der Flachkapillare Rankingsystem.
Nach Beendigung der zweistündigen Inkubations- 4.Motile Spermatozoen. Es werden die Sper-
zeit werden die er reichte Wegstrecke, die Penetra- mien mit Vorwärtsbewegung erfasst; nach der
tionsdichte, der M igrationsgradient und die An- zweistündigen Inkubationszeit, aber auch nach
wesenheit progressiv motiler Spermien untersucht. 24 Stunden.
1.Migrationsgradient: Die Entfernung zwischen
dem offenen Kapillarende und dem am weites- Beispiel 1: Bei der 1-cm-Marke befinden sich zwi-
ten entfernt befindlichen Spermiums wird mit schen 51–100 Spermien pro Blickfeld und bei 4,5 cm
Hilfe des Zentimetermaßes abgelesen. 6–10. Der Migrationsgradient beträgt 3 (Ranking-
2.Penetrationsdichte: Die Kapillare wird bei ziffer 6 minus Rankingziffer 3 = 3).
1 cm und bei 4,5 cm untersucht und dort wird Beispiel 2: Die Penetrationsdichte bei 1 cm be-
jeweils die Anzahl der Spermatozoen in einem trägt 2 1–50 S permatozoen p er B lickfeld und b ei
Blickfeld erfasst. Es werden 5 Blickfelder in 4,5 cm finden sich 51–100 Spermatozoen. Der Mi-
. Tab. 3.3 ankingsystem
R für die Spermien-
Infektionen k önnen die P roduktion einig er
Penetrationsdichte dieser M arker v orübergehend s enken, a ber a uch
Langzeitschäden des Epithels sind m öglich, die
Mittlere Spermienanzahl pro Rankingziffer trotz einer medika mentösen B ehandlung ir rever-
Blickfeld
sibel sein können und eine andauernde Reduktion
0 1 der S ekretion her vorrufen k önnen (C ooper et al .
3 0–5 2 1990a; von der Kammer et al. 1991).
5 Die sekretorische Kapazität der Prostata: Der
6–10 3
Gehalt an Zink, Zitronensäure (Möllering u.
11–20 4 Gruber, 1966) oder Saure Phosphatase (Heite
21–50 5 u. Wetterauer 1979) im Ejakulat steht im direk-
ten Zusammenhang mit der Prostatafunktion.
51–100 6
Auch ist die Korrelation zwischen den einzel-
> 100 7 nen Markern gut. Die Methode zur Zink-
bestimmung ist detailliert im 7 Abschn. 3.4.1
aufgeführt.
grationsgradient ist Null, da es sic h nicht um eine 5 Die sekretorische Kapazität der Samenbla-
Reduktion, sondern um eine S teigerung der S per- sen: Der Fruktosegehalt einer Samenprobe
mienanzahl handelt (von R ankingziffer 5 zu R an- spiegelt die sekretorische Funktion der Samen-
kingziffer 6). blasen zuverlässig wider. Dieser Assay wird
im 7 Abschn. 3.4.2 beschrieben.
terpretation
In 5 Die sekretorische Kapazität des Neben-
Die Ergebnisse werden nach Blick in die . Tab. 3.4 hodens: L-Carnitin, Glycerophosphocholin
als negativ, mäßig oder gut klassifiziert. (GPC) und die Neutrale Alpha-Glukosidase
sind gebräuchliche Marker zur Überprüfung
der Nebenhodenfunktion. Die Neutrale Al-
3.4 BiochemischeMarker zur pha-Glukosidase hat sich als spezifischer und
Testung der Funktion der sensitiver Marker im Vergleich zu GPC oder
akzessorischen L-Carnitin herausgestellt (Cooper et al. 1990a).
Geschlechtsdrüsen Die Alpha-Glukosidase im Seminalplasma
besitzt zwei Isoformen, zum einen die neutrale
Eine reduzierte Spermienqualität ka nn ihre Ursa- Form, die stärker vertreten ist und ausschließ-
che in einer fehlerhaften testikulären Produktion lich vom Nebenhoden stammt, und die weni-
haben, g enauso k ommen jedo ch p osttestikuläre ger ausgeprägt vorkommende saure Form, die
Ursachen währ end der P assage im N ebenhoden überwiegend aus der Prostata stammt. Eine
in Frage oder eine fehlerhafte Sekretion der akzes- recht leicht durchführbare Methode der Al-
sorischen Dr üse. Um die F unktion der akzess ori- pha-Glukosidase-Messung aus dem Seminal-
schen Geschlechtsdrüsen zu überprüfen, bietet sich plasma wird im 7 Abschn. 3.4.3 erklärt.
die Messung ihr er S ekrete a n. M it Z itronensäure,
Zink, Ga mma-Glutamyl-Transpeptidase und die Kommentar
Saure Phosphatase stehen Marker für die Messung Addiert man die Er gebnisse aller M arker-Assays
der Prostatafunktion zur Verfügung; mit Fruktose eines Patienten und multiplizier t diese Konzentra-
und Prostaglandine lässt sich die Funktion der Sa- tion mit dem Gesamtvolumen des Ejakulates, erhält
menblasen überprüfen, während freies L-Carnitin, man den Gesamt gehalt der Geschlechtsdrüsen-
Glycerophosphocholin (GPC) und die N eutrale marker. Dieser spiegelt einen guten Überblick über
α-Glukosidase geeignete Marker für die Nebenho- die allgemeine Funktion der akzessorischen Drüsen
denfunktion darstellen. eines Patienten wider (Eliasson 1975).
3.4 • Biochemische Marker zur Testung der Funktion der akzessorischen Geschlechtsdrüsen
121 3
. Tab. 3.4 K
lassifi kation der Kapillartest-Ergebnisse
Migrations- Höchste Penetra- Migrations- Überlebensdau- Klassifi-

distanz (cm) tionsdichte (Anzahl gradient von 1 er progressiver kation
der Spermien in zu 4.5 cm (als Spermien im
einem mikroskopi- Rankingziffer) Mukus (in Stun-
schen Blickfeld bei 1 den)
oder 4,5 cm)
1 0 - - negativ
<3 oder < 10 oder >3 oder 2 schwach
4,5 und > 50 und <3 und > 24 gut
Alleanderen Kombinationen der eTstergebnisse mittel
Die Bestimmung von Zink im

3.4.1 2. ink-Standard
Z (100 µmol/l): 0,144 g
Seminalplasma ZnSO4 × 7H2O in 50 ml Aqua dest lösen.
Diesen Ansatz 100fach verdünnen (1 ml plus
Hin
tergrund 99 ml Aqua dest) und in Aliquots bei –20 °C
Für die photometrische Bestimmung von Zink steht aufbewahren.
ein kommerzieller Kit zur Verfügung, der auch für 3. tandardkurve:
S die 100-µmol/l-Aliquots (siehe
die M essung des Z inkgehalts in S eminalplasma Punkt 2) mit Aqua dest so verdünnen, dass 5
eingesetzt werden kann. Die b eschriebene Metho- Standardlösungen mit einem Zinkgehalt von
de basiert auf Johnson u. Elilasson (1987) und wur- 80, 60, 40, 20 und 10 µmol/l entstehen.
de von Cooper et al. 1991 dahingehend modifiziert, 4. arbreagenz:
F 4 Anteile der Farbreagenz »A«
dass ein Pho tometer für 96-well-Mikrotiterplatten werden mit einem Anteil der Farbreagenz »B«
mit einer Sensitivität von 4 µmol/l verwendet wird. vermischt. Für eine komplette 96-well-Mikro-
Trotzdem kann nach wie vor ein Photometer ver- titerplatte werden ungefähr 25 ml benötigt.
wendet w erden, das K üvetten mi t einer K apazität Nach Vermischen ist die Farblösung für 2 Tage
von 1 oder 3 ml liest. In dies em Fall müssen die stabil, wenn sie bei Raumtemperatur aufbe-
Volumina des Seminalplasmas und der Reagenzien wahrt wird oder für 1 Woche bei Lagerung im
proportional a ngepasst w erden und en tsprechend Kühlschrank.
muss die Umrechnung erfolgen. 5. ürFeine interne Qualitätskontrolle werden
Kontrollproben, bestehend aus gepooltem
rinzip
P Seminalplasma, mitgeführt (7 Abschn. 3.4.1 ,
Zink wir d d urch 2-(5-B romo-2-Pyridylazo-)5- »Durchführung«, Schritt 1)
(N-propyl-N-Sulfoporypylamino-)Phenol (5-B r-
PAPS) gebunden. Während dieser Reaktion findet Dur
chführung
ein Farbumschlag statt. 1. DieEjakulate werden nach der Spermienana-
5-Br-PAPS + Z n2* → 5-Br-PAPS-Zn-Komplex, lyse 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert und
welcher Licht der Wellenlänge 560 nm absorbiert. anschließend dekantiert. Das spermienfreie
Seminalplasma wird bei –20 °C bis zur Durch-
Reagenzien führung des Assays gelagert. Überschüssiges
1. asDkommerzielle Zink-Kit ist gut geeignet; Seminalplasma kann gut für die Anfertigung
daraus jedoch nur die beiden Farbreagenzien eines Pools zwecks interner Qualitätskontrolle
»A« (zwei 60-ml-Flaschen) und »B« (zwei gesammelt werden.
30-ml-Flaschen) verwenden. 2. ürFden Assay werden die Seminalplasmen der
Patienten und die für die interne Qualitätskon-
trolle aufgetaut und gut mit Hilfe eines Vortex- 5. Die

ermittelte Zinkkonzentration der Probe
Mixers gemischt. wird mit dem Volumen des Ejakulates in ml
3. usAjeder Seminalplasma-Probe wird in einer multipliziert, um den Gesamtzinkgehalt des
Doppelbestimmung eine Verdünnung von Ejakulates zu errechnen.
je 5 μl der Probe und 300 μl Aqua dest an-
gefertigt. Dazu wird eine Positive-Displace- terer
Un Referenzbereich
3 ment-Pipette (eine Pipette mit einem direkt Der un tere Ref erenzbereich f ür Z ink im E jakulat
verdrängenden Dosiersystem)verwendet und liegt bei 2,4 µmol in der Gesamtprobe (Cooper et al.
1,5-ml-Reaktionsgefäße. Diese Verdünnung 1991 und unveröffentlichte Daten von TG Cooper).
muss wieder gut gemischt werden (für 5 Se-
kunden per Vortex-Schüttler).
. 4 eweils
J 40 μl der Probenverdünnung aus dem 3.4.2e
Bstimmung der Fruktose aus
3. Schritt wird in eine Vertiefung der Mikroti- dem Seminalplasma
terplatte pipettiert, inklusive eines Leerwertes
(40 μl Aqua dest), der Qualitätskontrollen und Hin
tergrund
der Standardverdünnungen. Die beschriebene Methode basiert auf Karvonen u.
5.edeJ verwendete Vertiefung der Mikrotiter- Malm (1955) und wurde f ür die V erwendung v on
platte wird mit 200 μl der Farbreagenz gefüllt. Spektralphotometer, die für 96-well-Mikrotiten-
Der Ansatz wird für 5 Minuten auf einem spe- platten konzipiert sind und eine Sensitivität von 74
ziellen Rüttler für Mikrotiterplatten gemischt. µmol/l (Cooper et al . 1990a) b esitzen, modifiziert.
. 6 erDFarbumschlag wird bei einer Wellenlänge Trotzdem kann nach wie vor ein Photometer ver-
von 560 nm im Spektralphotometer gemessen, wendet w erden, das K üvetten mi t einer K apazität
wobei das Ergebnis des Blanks (das Aqua dest von 1 o der 3 ml, liest. I n dies em F all m üssen die
mit der Farblösung) von den gemessenen Wer- Volumina des Seminalplasmas und der Reagenzien
ten abgezogen werden muss. proportional a ngepasst w erden und en tsprechend
muss die Umrechnung erfolgen.
erechnung
B
1. DieMessergebnisse der Proben werden an- rinzip
P
hand der Messergebnisse der Standardlösun- Unter der W irkung eines niedr igen pH-W ertes
gen, deren Zinkkonzentration ja definiert ist, kombiniert mit einem Hitzeeinfluss, bildet Frukto-
in mmol/l umgerechnet. se in der Gegenwart von Indol einen Farbkomplex.
2. roben,
P deren Absorptionsmesswert höher als
der des höchsten Standards ist, müssen erneut Reagenzien
gemessen werden, nachdem sie stärker ver- Für die B estimmung der F ruktose sind k ommer-
dünnt wurden (Aqua dest zur Verdünnung zielle K its er werbbar. Al ternativ k önnen die Re a-
verwenden). genzien folgendermaßen hergestellt werden:
3. mUdie Zinkkonzentration der Proben in 1. eproteinisierungs-/Enteiweißungsreagenz
D 1
mmol/l zu ermitteln, müssen die Ergebnisse (63 µmol/l ZnSO4): 1,8 g ZnSO4 7H2O werden
mit dem Faktor 61 multipliziert werden, da in 100 ml Aqua dest gelöst.
vorab eine Verdünnung der Proben (5 µl plus 2. teiweißungsreagenz
En 2 (1 mol/l NaOH): 0,4 g
300 µl Aqua dest) stattgefunden hat. NaOH in 100 ml Aqua dest lösen.
4. Dieeinzelnen Messergebnisse der Duplikate . 3 arbreagenz
F (Indol 2 µmol/l) in Benzoat 16
dürfen nicht mehr als 10% voneinander ab- µmol/l zur Konservierung): 200 mg Benzoe-
weichen, um gemittelt werden zu dürfen säure in 90 ml Aqua dest in einem Wasserbad
(Differenz der Probenmesswerte geteilt durch von 60 °C unter ständigem Rütteln lösen. Da-
Mittelwert der Probenmesswerte) × 100 ≤10%). rin anschießend 25 mg des Indols geben und
mit Aqua dest auf final 100 ml auffüllen. Die
123 3
Lösung mit einem Laborfilter mit einer Poren- . 7 ,5 ml
0 konzentrierte Salzsäure (32% v/v HCl)
größe von 0,45 μm filtern. in jedes Reagenzglas geben und vor dem Mi-
4. ruktose-Standard
F (2,24 mmol/l): 40 mg D- schen alle Röhrchen gemeinsam sorgfältig mit
Fruktose in 100 ml Aqua dest lösen. Aliquotie- einer elastischen Laborabdichtfolie verschlie-
ren und bei 4 °C oder eingefroren lagern. ßen. Diese Arbeitsschritte müssen unter dem
5. tandardkurve:
S Den 2,24-mmol/l-Standard so Laborabzug durchgeführt werden.
verdünnen, dass weitere Standardlösungen von . 8 enDAnsatz 20 Minuten bei 50 °C im Wasser-
1,12, 0,56, 0,28 und 0,14 mmol/l entstehen. bad inkubieren, anschließend mischen und für
6. ürFdie interne Qualitätskontrolle werden ge- 15 Minuten in Eiswasser lagern.
poolte Seminalplasmen eingesetzt (s.u. Schritt 1). 9. usAjedem Reagenzglas mit Hilfe einer Posi-
tive-Displacement-Pipette 250 μl auf die
Dur
chführung 96-well-Mikrotiterplatte übertragen. Auch
1. ach
N Erstellung des Spermiogramms wird das dieser Arbeitsschritt sollte unter dem Abzug
Ejakulat für 10 Minuten bei 1000 g abzentri- erfolgen.
fugiert. Der Überstand, das Seminalplasma, 10.mUdas Spektralphotometer vor Schäden
wird bis zum Assay bei –20 °C gelagert. Über- durch die Salzsäure zu schützen, sollte auf die
schüssiges Seminalplasma kann gut für die Mikrotiterplatte vor dem Ablesen transparen-
Anfertigung eines Pools zwecks interner Qua- te, elastische Abdichtfolie platziert werden.
litätskontrolle gesammelt werden. 1. 1 erDFarbumschlag wird bei einer Wellenlänge
2. Am Tag der Assayerstellung werden die sper- von 470 nm gemessen, wobei das Ergebnis des
mienfreien Seminalplasmen sowie ein Aliquot Leerwertes von den gemessenen Werten abge-
des Kontrollpools aufgetaut. zogen werden muss.
3. DiePatientenproben und die Kontrollproben
werden verdünnt, indem 5 μl dieser Semi- erechnung
B
nalplasmen mit 50 μl Aqua dest in ein 1,5 ml 1. Die
Fruktosekonzentration der Proben wird
Zentrifugengefäß zusammengefügt werden. ermittelt, indem die gemessene Absorption
Empfohlen wird die Verwendung einer Posi- mit den Absorptionswerten der Standardkurve
tiv-Displacement-Pipette und zum Mischen (mmol/l) verglichen wird.
der Proben ein Vortex. Es müssen jeweils 2 2. esswerte,
M die höher als der höchste Stan-
Proben zwecks Doppelbestimmung angefertigt dardmesswert sind, müssen wiederholt wer-
werden. den. Dafür ist vorab eine größere Verdünnung
4. teiweißung:
En 12,5 μl des Zinksulfats (63 mit Aqua dest nötig.
µmol/l ZnSO4) wird zu den 55 μl der Pro- 3. Die
Ergebnisse werden mit dem Verdünnungs-
benverdünnung pipettiert, dann 12,5 μl des faktor 16 (5 μl Probe plus 75 μl Wasser und
Natriumhydroxids (0,1 mol/l NaOH). Ansatz Enteiweißungsreagenzien) multipliziert, um
gut mischen, dann 15 Minuten bei Raumtem- die Fruktosekonzentration (mmol/l) der un-
peratur inkubieren. Anschließend erfolgt die verdünnten Probe zu erhalten.
Zentrifugation bei 8000 g für 5 Minuten. 4. Die
einzelnen Messergebnisse der Duplikate
5.eweils
J 50 μl des Überstandes werden in ein dürfen nicht mehr als 10% voneinander ab-
Reagenzglas überführt. Gleichzeitig wird für weichen, um gemittelt werden zu dürfen
den Leerwert ein Reagenzglas mit 50 μl Aqua (Differenz der Probenmesswerte geteilt durch
dest gefüllt und jeweils 50 μl der Standardlö- Mittelwert der Probenmesswerte) × 100 ≤10%).
sungen werden ebenfalls übertragen (an Dop- 5. Die
ermittelte Fruktosekonzentration wird mit
pelbestimmung denken). dem Volumen des Ejakulates multipliziert, um
6.n jedes
I Reagenzglas wird 50 μl des Indols den Gesamtfruktosegehalt (in µmol) der Probe
pipettiert; Proben anschießend mischen. zu erhalten
terer
Un Referenzbereich Zugabe v on N atriumcarbonat eine G elbfärbung
Der un tere Ref erenzbereich f ür F ruktose b eträgt annimmt.
13 µmol im Gesamt-Ejakulat (Cooper et al. 1991 und
trophenol-α-glucopyranoside α−−-Glucosidayse
p-ni −−−−−−→ p-Ni-
unpublizierte Daten von TG Cooper). Na2 CO3
trophenol −−−→ Komplex, der Licht der Wellenlän-
ge 405 nm absorbiert
3
Kommentar
Ein niedriger Fruktosegehalt ist charakteristisch für
Obstruktionen im Duc tus ejaculatorius, der bilat e- Reagenzien
ralen kongenitalen Aplasie des Vas deferens (de la Für die B estimmung der ep ididymalen neu tralen
Taille et al. 1998; Daudin et al. 2000; von Eckardstein Alpha-Glukosidase im Seminalplasma sind Kits im
et al. 2000), partielle retrograde Ejakulation und An- Handel erhäl tlich. Es s ollten jedo ch n ur die K its
drogenmangel. verwendet werden, die SDS und Castanospermine
enthalten. Al ternativ k önnen die Re agenzien je-
doch auch selbst hergestellt werden.
3.4.3e
Bstimmung der neutralen 1.Puffer 1 (0,2 mol/l Phosphat, pH 6,8): 4,56 g
α-Glukosidase im K2 HPO4 × 3H2O in 100 ml Aqua dest lösen.
Seminalplasma Dann 2,72 g KH2 PO4 separat in 100 ml Aqua
dest lösen. Beide Lösungen so miteinander
Hin
tergrund vermischen, bis ein pH-Wert von 6,8 erreicht
m
I Seminalplasma befindet sic h s owohl ein neu- ist.
trales α-Glukosidase Isoenzym, welches aus dem 2.Puffer 2: 1 g SDS in 100 ml von Puffer1 geben.
Nebenhoden st ammt, als a uch das s aure I soen- Das SDS fällt bei kühleren Temperaturen aus,
zym, das in der P rostata g ebildet wird. D as s aure die Präzipitation löst sich jedoch bei Wärme-
α-Glukosidase Isoenzym kann durch SDS (Sodium zufuhr.
Dodecyl S ulfate) inhib iert w erden (P aquin et al . 3. arbreagenz
F 1 (für das Stoppen der Reaktion,
1984), damit das neutrale Isoenzym gemessen wer- 0,1 mol/l Natrium Carbonat): 6,20 g Na2 CO3 ×
den k ann. D iese n eutrale α- Glukosidase s piegelt H2O in 500 ml Aqua dest lösen.
die F unktionsfähigkeit des N ebenhodens wider . 4. arbreagenz
F 2: 0,1 g SDS in 100 ml der Farb-
Um die S ensitivität der Messmethode zu st eigern, reagenz 1 lösen.
werden C astanospermine als I nhibitoren ein ge- 5. p-Nitrophenol Glukopyranosid-Substrat
setzt und dabei helfen, die unspezifischen Reaktio- (PNPG) (5 mg/ml): 0,1 g des PNGP in 20 ml
nen der Probe erkennen, damit sie rechnerisch von Puffer 2 geben und die Lösung auf eine Wär-
dem Messergebnis abgezogen werden können. Die meplatte mit Magnetrührer bei ca. 50 °C für
beschriebene Methode ist f ür Spektralphotometer rund 10 Minuten stellen. Es stellt kein Problem
konzipiert w orden, die 96-w ell-Mikrotiterplatten dar, wenn sich wenige verbleibende Kristalle
lesen und eine S ensitivität von 1,9 mU/ml aufwei- nicht auflösen. Für die gesamte Dauer des As-
sen (Cooper et al. 1990b). Trotzdem kann nach wie says wird diese Lösung bis zum Gebrauch bei
vor ein Photometer verwendet werden, das Küvet- 37 °C aufbewahrt und kann für spätere Assays
ten mit einer Kapazität von 1 ml oder 3 ml liest. In nicht mehr verwendet werden.
diesem Fall müssen die Volumina des Seminalplas- . 6 ucosidase
Gl Inhibitor für die Leerwertbestim-
mas und der Re agenzien p roportional a ngepasst mung der Seminalplasmen (Castanospermine,
werden u nd e ntsprechend m uss d ie Umrechnung 10 mmol/l): 18,9 mg Castanospermine in 10 ml
erfolgen. Aqua dest lösen. Zur Herstellung der Arbeits-
lösung wird eine 10fache Verdünnung herge-
rinzip
P stellt, sodass 1mmol/l entsteht. Diese sollten in
Glukosidase wandelt das syn thetische Glukopyra- 1,0 ml Aliquots bei –20 °C gelagert werden.
nosid-Substrat zu p-N itrophenol um, w elches b ei 7. PNP -Standard (5mmol/l): 69,5 mg PNP wer-
den in 100 ml Aqua dest gelöst, wobei zu
125 3
beachten ist, dass die Lösung nur in Wärme er der Inkubation sind entscheidend für die
zustande kommt. Hat sich das PNP vollständig Messergebnisse.
gelöst, ist die Lösung entweder in Braunglas- 7. ach
N 2 Stunden wird die Reaktion durch das
behältern oder in einfachen Flaschen, die mit Aufpipettieren von 1,0 ml Farbreagenz 1 auf
Aluminiumfolie umwickelt werden, bei 4 °C alle Proben. Mischen ist wichtig.
aufzubewahren. Diese Standardlösung hat eine 8. 0 μl
25 der Proben und des Standards werden
Haltbarkeit von 3 Monaten. auf die 96-well-Mikrotiterplatte transferiert.
8. stellen
Er der Standardkurve (innerhalb der 9.nnerhalb
I von 60 Minuten wird die Mikro-
letzten Stunde der Inkubationszeit): 400 μl der titerplatte im Spektralphotometer mit einer
5 mmol/l PNP-Stocklösung in einen 10-ml- Wellenlänge von 405 nm abgelesen, das Reak-
Kolben pipettieren und mit Farbreagenz 2 bis tionsgefäß mit dem Aqua dest dient dabei der
zur Markierung auffüllen, sodass eine finale Leerwert-Bestimmung.
Konzentration von 200 µmol/l PNP entsteht.
Anschließend werden diese 200 mmol/l so mit erechnung
B
Farbreagenz 2 verdünnt, dass 160, 120, 80 und 1. DiePNP-Konzentration der Proben wird mit
40 µmol/l entstehen. der der Standardkurve verglichen und entspre-
9. epoolte
G Seminalplasmen dienen als inter- chend lassen sich die gemessen Absorptions-
ne Qualitätskontrolle (s.u. 7 Abschn. 3.4.3 , werte in µmol/l ermitteln.
»Durchführung«, Schritt 1). 2. iegen
L Messwerte von Proben oberhalb der
Messwerte des höchsten Standards, muss die
Dur
chführung Messung mit der verdünnten Probe (hierfür
1. ach
N Erstellung des Spermiogramms wird das Puffer 1 verwenden) wiederholt werden.
Ejakulat für 10 Minuten bei 1000 g abzentri- . 3 erDKorrekturfaktor 0,6194 (siehe Anmer-
fugiert. Der Überstand, das Seminalplasma, kung) wird mit den Ergebnissen multipliziert,
wird bis zum Assay bei –20 °C gelagert. Über- um die Aktivität der Neutralen Glukosidase in
schüssiges Seminalplasma kann gut für die unverdünnten Proben näher zu kommen.
Anfertigung eines Pools zwecks interner Qua- 4. DieSubstrataktivität (IU/l) der Castanosper-
litätskontrolle gesammelt werden. mine wird von den Messwerten abgezogen,
2. Am Tag der Assayerstellung werden die sper- um die unspezifischen Reaktionen rechnerisch
mienfreien Seminalplasmen, sowie ein Aliquot zu eliminieren.
des Kontrollpools aufgetaut. 5. Dieeinzelnen Messergebnisse der Duplikate
3. onVden Patientenproben werden in einer dürfen nicht mehr als 10% voneinander ab-
Doppelbestimmung 15 μl in ein 1,5-ml-Zentri- weichen, um gemittelt werden zu dürfen
fugenröhrchen gegeben. Für die Bestimmung (Differenz der Probenmesswerte geteilt durch
des Leerwertes wird 15 Aqua dest verwendet Mittelwert der Probenmesswerte) × 100 ≤10%).
(Doppelbestimmung immer beachten) und die 6. erDkorrigierte Messwert der Probe wird mit
Kontrollproben werden 4-mal pipettiert. Die dem Volumen des Ejakulats multipliziert, um
Verwendung einer Positiv-Displacement-Pi- die Glukosidase-Aktivität (mU) der Gesamt-
pette wird empfohlen. probe zu ermitteln.
4. u zwei
Z der vier Kontrollproben wird 8 μl der
1mmol/l Castanospermine pipettiert. Anmerkung
Die Einheit IU = Internationaler Unit ist definiert als die Gluko-
5.100 μl der auf 37 °C vorgewärmten PNPG-
sidase-Aktivität, die 1 µmol PNP pro Minute bei einer Tempe-
Substratlösung wird in jedes Reaktionsgefäß ratur von 37 °C entstehen lässt. Der Korrekturfaktor ist nötig,
pipettiert. da bei diesem A ssay 15 µl Seminalplasma in einem Gesamt-
. 6 Dies e werden gut gemischt, am besten mit volumen v on 1.115 µl über einen Z eitraum v on 120 Minuten
Hilfe eines Vortex, und für 2 Stunden bei 37 °C eingesetzt w erden. Der Korrekturfaktor errechnet sich fol-
gendermaßen: (1115/15)/120 = 0,6194.
inkubiert. Die exakte Temperatur und Zeitdau-
terer
Un Referenzbereich ten Anal yse f ür die S permienmotilität und S per-
Der untere Ref erenzbereich f ür die neu trale α-G- mienkonzentration erläutert. Im 7 Abschn. 3.5.4 ist
lukosidase liegt bei 20 mU pro Ejakulat (Cooper et ein Kommentar zum Status der computerassistier-
al. 1991 und unveröffentlichte Daten von TG Coo- ten Analyse der Spermienmorphologie zu finden.
per).
3 3.5.2 e
Vrwendung der CASA zur
3.5 o
Cmputerassistierte Bestimmung der
Spermienanalyse Spermienmotilität
3.5.1 Einführung Während die p rozentuale Einteilung der M otilität

meist unglaubwürdig ist, da der Computer immoti-
Bislang galt die co mputerassistierte Spermienana- le Spermien von Zellpartikeln gleicher Größe nicht
lyse (CASA) zur K onzentrationsbestimmung als zu un terscheiden w eiß, sind hin gegen die CASA -
unzuverlässig, w eil die S ysteme nic ht e indeutig Systeme f ür kinetis che M essungen der S permien
zwischen Spermien und Z ellresten o der Partikeln gut geeignet.
unterscheiden konnten (ESHRE, 1998). Technolo- Viele Faktoren können Einfluss auf die CASA-
gische Er neuerungen, in sbesondere die V erwen- Auswertung nehmen, wie z.B. die Probenvorberei-
dung v on D NA-Fluoreszenz-Farbstoffen und Al- tung, die Bildfrequenz, die Spermienkonzentration
gorithmen zur D etektion der S permienschwänze, und die Tiefe der Zählkammer (Davis u. Katz 1992;
offerieren eine zuverlässigere Konzentrationsbe- Mortimer 1994a, b; Kraemer et al. 1998). Trotzdem
stimmung, b zw. M otilitätsbestimmung (Z inaman lassen sic h r eproduzierbare M esswerte erz ielen,
et al . 1996; Ga rrett et al . 200 3) als b isher. D amit wenn die f olgenden I nstruktionen (D avis u . K atz
könnte die CASA in den Ro utineablauf integriert 1992) und die Ric htlinien f ür den G ebrauch v on
werden. Vorausgesetzt, sie wird mit Sorgfalt ausge- CASA-Systemen (M ortimer et al . 1 995; ES HRE
übt und die Richtigkeit der CASA-System-Auswer- 1998) beachtet werden.
tungen wird durch Qualitätskontrollen überwacht Für die Untersuchung der Spermienbeweglich-
(7 Kap. 7 ). keit sollten mindestens 200 mo tile Spermien ana-
Mittlerweile b ieten mehr ere Fir men CASA - lysiert werden. Das bedeutet, dass hierfür deutlich
Systeme an. Diese Systeme erfassen die Spermien- mehr S permien det ektiert w erden müssen. S ollen
motilität, die Kinetik und die Spermienkonzentra- die S permien nac h ihr em B ewegungstyp ka tego-
tion. Einige b esitzen Module f ür die mo rphologi- risiert w erden o der a ndere M esswerte b estimmt
sche Analyse. CASA-Systeme haben gegenüber der werden, sind s o viele T racks zu a nalysieren, dass
manuellen Analyse den Vorteil, dass sie mi t einer mindestens 200 motile Spermien, besser noch 400,
hohen Präzision arbeiten und q uantitative Aussa- erfasst werden. Die Anzahl sollte dann für alle Pro-
gen der kinetis chen P arameter (V orwärtsbeweg- ben standardisiert werden.
lichkeit, h yperaktivierte M otilität, Cha rakteristik Das CASA-System sollte mit einem Computer-
ausgesuchter Zellen) machen können. programm v erknüpft w erden, das in der L age ist,
Einige S tudien lass en erk ennen, dass es eine die D aten zu o rdnen und st atistisch auszuwerten.
signifikante Rela tion zwis chen der S permienkon- Die S treuung vieler der M otilitätsparameter lässt
zentration p lus p er CASA g emessene Cha rakte- sich nic ht durch eine Ga uß’sche Verteilungskurve
ristiken der p rogressiv motilen Spermien und der darstellen, s odass der M edianwert, der g eeigneter
Fertilitätsrate gibt. Das gilt in vitro als auch in vivo, ist als der M ittelwert, am besten die zen trale Ten-
als auch für die Konzeptionsdauer (Liu et al. 1991a; denz eines jeden P arameters a ufzeigen ka nn. F ür
Barratt et al . 1993; Irvine et al . 1994; K rause 1995; die statistische Auswertung bedarf es der Umwand-
Dennelly et al. 1998: Larsen et al. 2000; Garrett et al. lung einzelner Spermatozoen-Messwerte in mathe-
2003; Shibahara et al. 2004). Im 7 Abschn. 3.5.2 und matische Zahlen.
3.5.3 wird die Durchführung der computergestütz-
3.5 • Computerassistierte Spermienanalyse
127 3
Dur
chführung qualitätskontrolliert sein wie die M otilitätsbestim-
Für jedes CASA -System gibt es eig ene Einstellun- mung (7 Abschn. 2.5.2). Die Proben können entwe-
gen, die Einfluss a uf die M esswerte nehmen und der direkt analysiert werden o der vorab als Film-
somit optimiert werden sollten. Die vom Hersteller sequenz auf ein V ideoband, einer D VD oder CD-
vorgegebenen S ettings s ollten k ontrolliert und s o ROM aufgenommen werden. Diese Methode bietet
variiert werden, dass die gemessenen Werte logisch den Vorteil, dass eine Standardisierung und die Im-
erscheinen und reproduzierbar sind. Wichtig ist die plementierung von kontrollierten Prozessen deut-
Verwendung einer Kontrolle, wie z.B. einer Video- lich besser etabliert werden kann ( 7 Abschn. 14.5 ).
aufnahme (7 Abschn. 14.5 ).Diverse Autoren haben In der R egel g ibt die H erstellerfirma Empfehlun-
Diskussionsbeiträge f ür eine allg emeine S etting- gen, wie die Filma ufnahmen er stellt w erden k ön-
auswahl veröffentlicht (Davis u. Katz 1992; Morti- nen und w elche L ichteinstellungen den gr ößten
mer 1994b; ESHRE 1998). Kontrast zwis chen den S permienköpfen und dem
Hintergrund bieten.
robenvorbereitung
P Es herrscht Uneinigkeit darüber, wie lange der
Für die CASA werden die Samenproben vorbereitet Weg d er Spermien b eobachtet w erden s oll, d amit
wie in 7 Kap. 2 beschrieben. Da die S permienmo- eine sichere Aussage gefällt werden kann. Eine Se-
tilität von Temperaturschwankungen beeinflusst kunde scheint jedoch für eine einfache CASA-Aus-
wird, ist eine in terne Wärmeplatte des CASA-Sys- wertung ausreichend zu sein (Mortimer 1994b).
tems, die konstant eine Temperatur von 37 °C hält,
obligat. Für die Bestimmung der Spermienkonzen- ASA-Terminologie
C
tration und der v erschiedenen Motilitätscharakte- Für die P arameter, die v on der CASA g emessen
ristiken wir d die Sa menprobe un verdünnt ein ge- werden, gibt es eine Standard-Terminologie. Als
setzt. M essungen sind mög lich b ei K onzentratio- Illustration sind dies e Parameter in der . Abb. 3.3
nen zwischen 2 × 106 S permien/ml b is 50 × 106 /ml zu finden.
(Garrett et al. 2003). 1. CL V – curvilinear velocity (µm/s) – »Spur-
Proben m it h öheren Konzentrationen ( größer geschwindigkeit«: Die in einer bestimmten
als 50 Millionen/ml) s ollten v erdünnt w erden, da Zeit gemessene zurückgelegte Geschwindigkeit
die miteinander kollidierenden Spermatozoen feh- des Spermienkopfes entlang seiner tatsächlich
lerhafte M essergebnisse lief ern. Die V erdünnung zurückgelegten kurvilinearen Bahn, wie sie
sollte mi t S eminalplasma dess elben P atienten er - sich in zwei Dimensionen im mikroskopischen
folgen. Blickfeld darstellt.
1. Ein Teil des Ejakulates wird für 6 Minuten bei 2. SLV– straight-line velocity (µm/s) – »Progres-
16000 g zentrifugiert, um spermienfreies Se- sivgeschwindigkeit«: Die in einer bestimmten
minalplasma zu gewinnen. Zeit zurückgelegte Strecke des Spermienkopfes
2. asDOriginalejakulat wird so mit dem Semi- wird in einer gedachten Linie von der Start-
nalplasma verdünnt, dass eine Konzentration position bis zur Endposition gemessen.
von unter 50 Millionen Spermien/ml entsteht. 3. APV– average path velocity (µm/s) – »Pfadge-
schwindigkeit«: Die in einer bestimmten Zeit
Spezielle Ein weg-Zählkammern, mi t ein er Z ähl- gemessene räumliche Wegstrecke wird, rech-
tiefe v on 20 µm er geben zu verlässige Er gebnisse. nerisch geglättet durch den Algorithmus des
Diese Z ählkammern besitzen zwei Areale; zwecks CASA-Systems, in Geschwindigkeit umgerech-
Doppelbestimmung s ollten b eide f ür ei ne P robe net. Da die Algorithmen von verschiedenen
gefüllt und a usgewertet w erden. Es s ollten st ets CASA-Systemen unterschiedlich sein können,
möglichst viele der Z ählfelder untersucht werden: sind Vergleiche in den VAP-Ergebnissen nicht
6 Felder pro Kammer, also 12 Zählfelder pro Probe möglich.
liefern ein zu verlässiges Er gebnis. I n jeder K am- 4. ALH – amplitude of lateral head displacement
merseite sollten mindestens 200 motile S permien (µm) »seitliche Kopfauslenkung«: Die Größe
ausgewertet werden. Dies es System muss genauso der lateralen Kopfauslenkung entlang seines
VCL
Kurvenförmige
Wegstrecken
3 VAP
ALH
Durchschnittlichen
Wegstrecken
MAD
VSL
Geradlinige Wegstrecken
. Abb. 3.3 Standard
terminologie der per CASA gemessenen Variablen
mittleren Bewegungspfades wird berechnet. des Spermienkopfes entlang der kurvenlinea-

Diese seitliche Kopfauslenkung kann entwe- ren Bahn pro Zeiteinheit.
der als Maximalwert oder als Mittelwert der
Lateralbewegung berechnet werden. Auch für Anmerkung
Die verschiedenen CASA-Systeme arbeiten mit unt erschied-
ALH-Berechnungen liegen für jedes CASA-
lichen mathematischen Algorithmen, um die einz elnen Va-
System unterschiedliche Algorithmen zugrun- riablen zu errechnen. Über die Vergleichbarkeit der Systeme
de, sodass Vergleiche zwischen verschiedenen untereinander gibt es noch keine verlässlichen Aussagen.
CASA-Systemen nicht möglich sind.
5. LIN– linearity (ohne Einheit) – »Linearität«:
Dieser Wert ist ein Maß für die Gestrecktheit
der kurvilinearen Bahn, VSL/VCL. 3.5.3A
C SA zur Bestimmung der
6. OBW – wobble (ohne Einheit) – »Flattrigkeit«, Spermienkonzentration
»Seitenausschlag«: Rechnerisches Maß für die
Oszillation des Spermiums anhand des wirk- Mit Hilfe von DNA-Fluoreszenz-Farbstoffen lassen
lich zurückgelegten Weges im Vergleich zur sich p er CASA die K onzentration und der p ro-
rechnerisch geglätteten Laufbahn, VAP/VCL. zentuale An teil mo tiler S permien zu verlässig er -
7. TRS – straightness (ohne Einheit) »Linearitäts- mitteln, sofern die Technik präzise eingesetzt wird
index«: Maß für die Gestrecktheit des gemittel- (Garrett et al. 2003). So sollte zum Beispiel bei der
ten Weges, VSL/VAP. Verwendung von Einwegkammern darauf geachtet
8. CFB – beat-cross frequency (Hz) – »Kopf- werden, dass mehr ere Ar eale der K ammer un ter-
schlagfrequenz«. Das Maß für die mittlere sucht werden und darauf geachtet wird, die von der
Rate, in der der kurvilineare Pfad den gemit- Einfüllseite entfernt liegenden Bereiche mit einzu-
telten Pfad kreuzt. beziehen, d a d avon a uszugehen i st, d ass s ich d ie
9. MAD – mean angular displacement (Grad) Spermien nicht homogen verteilen werden (Doug-
– »mittlere Richtungsabweichung«: Mittlerer las-Hamilton et al. 2005b). Ein Gegenvergleich mit
Wert für den Winkel der Richtungsänderung Hilfe eines Hämozytometers ist notwendig.
3.5 • Computerassistierte Spermienanalyse
129 3
Spermienkonzentrationen zwischen 2 × 106 pro einflusst die technische Schwierigkeit des CASMA-
ml und 50 × 106 pro ml sind auf diese Art ermittel- Systems, Spermienköpfe von Zellpartikeln gleicher
bar (Garrett et al., 2003). Höher konzentrierte Pro- Größe nic ht un terscheiden zu k önnen, in sbeson-
ben müssen verdünnt werden. dere b ei g ering k onzentrierten P roben die Er geb-
Anmerkung nisse (Garrett u. Baker 1995; Menkveld et al . 1997;
CASA-Instrumente det ektieren und zählen fluoreszierende Coetzee et al. 1999a, b). Das Problem der automati-
Spermienköpfe. Um zu erfahren, ob die Spermien wirklich in- sierten Analyse ist, dass es k eine Möglichkeit gibt,
takt sind (zum Beispiel ob Spermienkopf und S chwanz nicht Artefakte oder Fehler in der Probenpräparation zu
getrennt voneinander sind), ist eine mikroskopische Kontrol-
kompensieren. Selbst kleine Abweichungen in der
le zwingend notwendig.
Hintergrundfärbung des morphologischen Aus-
strichpräparates k önnen da für s orgen, dass das
System ein Spermium falsch charakterisiert oder es
3.5.4o
Cmputergestützte gar nicht als s olches identifizieren kann. Auf diese
Untersuchung der Art und Weise wird das Gesamtergebnis verfälscht.
Spermienmorphologie (CASMA) Genau wie b ei der ma nuellen A uswertung
der S permienmorphologie, m üssen a uch hier die
Prinzipiell h at d ie c omputergestützte S permien- Arbeitsabläufe und Instrumente standardisiert und
analyse das P otential ob jektive und r eproduzier- überwacht w erden, da mit v ergleichbare und v er-
bare Ergebnisse zu lief ern. Mittlerweile sind k om- lässliche Er gebnisse erziel t werden k önnen. W ie
merziell e rwerbbare S ysteme a uf d em M arkt, d ie die Ejakulatprobe vorbereitet werden kann, um den
eine Quantifizierung des S permienkopfes und des Hintergrund f ür die CAS MA-Aufnahme zu r edu-
Mittelstücks, und mög licherweise a uch des S per- zieren, wird im 7 Abschn. 2.13.2 »Waschen
, von zell-
mienschwanzes v ersprechen. D efekte des S per- reichen oder viskösen Ejakulaten« erläutert. Ist die
mienschwanzes und deren Einfluss auf die Motili- Spermienkonzentration niedrig (<2 × 106 ), sollte
tät lassen sich direkter über die Motilitätsmessung die Probe durch Z entrifugation angereichert w er-
und deren Variablen im CASA-System ermitteln. den. D er Arb eitsschritt wird im 7 Abschn. 2.13.2 ,
Grundsätzlich k lassifizieren die meist en CASMA- »Proben mit geringen S permienkonzentrationen«
Systeme die Spermienköpfe sowie die Mittelstücke erklärt.
in die Kategorie normal oder abnormal und ermit- Anmerkung
teln einen Mittelwert über die Dimensionen dieser Das Zentrifugieren der P robe kann Effekte in der M orpholo-
Bestandteile. Gleichzeitig geben sie Auskunft üb er gie bewirken und muss daher vermerkt werden.
reguläre o der elli ptische F ormen und mess en, in
Abhängigkeit vom Ergebnis der Laborfärbung, das Zwei S tudien zeigt en, dass es signifikante Bezie-
Areal des Akrosoms. hungen zwis chen CAS MA-Ergebnissen und F er-
Automatisierte Systeme haben ein noch größe- tilitätsendpunkten gibt. C oetzee et al . (200 3) fand
res Potential für eine objektive, präzise und repro- heraus, dass das morphologische Er gebnis auto-
duzierbare Anal yse als ma nuelle S ysteme ( Menk- matisierter Anal ysen eine signifikante Voraussa-
veld et al . 1990). A bweichungen in P räzision und ge über die Wahrscheinlichkeit der Fertilitätsrate
Reproduzierbarkeit k önnen un ter 7% (Ga rrett u . in vi tro, s owie üb er die W ahrscheinlichkeit einer
Baker 1995) betragen, was g eringer ist als die A b- Schwangerschaft treffen kann. Garrett et al. (2003)
weichungen der ma nuellen Anal ysen einer v er- konnte zeig en, dass die P rozentzahl g efundener
sierten L aborkraft. Dies e Rep roduzierbarkeit und morphologischer K öpfe, die denen a n der Z ona
Präzision d er c omputerassistierten S permienmor- Pellucida (»zo na-preferred«,%Z) g ebundenen g li-
phologieauswertung (CASMA) wird durch unglei- chen, zus ammen mi t den V SL-Werten (»P rogres-
che Einstellungen wie zum Beispiel bei der Fokus- sivgeschwindigkeit«) signifikant und una bhängig
sierung, der L ichtzufuhr, der P robenvorbereitung voneinander mi t der na türlichen S chwanger-
und der L aborfärbung des A usstrichs g efährdet schaftsrate einer gr oßen G ruppe sub fertiler P aare
(Lacquet et al. 1996; Menkveld et al. 1997). Auch be- in Beziehung steht. Der Zusammenhang zwischen
den beiden Parametern (%Z und VSL) und Fertili-

tät b estätigte s ich k onstant u nd e s f and s ich k ein
oberer Grenzwert, ab dem keine weitere Steigerung
der S chwangerschaftsrate zu b eobachten g ewesen
wäre. Es sind w eitere S tudien zur F ertilitätsrate
mit größeren Teilnehmerzahlen nötig, um die B e-
3 stimmung der Spermienmorphologie mit Hilfe der
CASA zu verbessern.
Möglicherweise nehmen a utomatisierte S yste-
me in der Quali tätskontrolle einen g ewissen S tel-
lenwert ein, a ber b evor sie im k linischen B ereich
ihren Einsatz finden, sind weitere Studien nötig.
131 4
orschungsrelevante
F
Methoden
4.1 Reaktive Sauerstoffradikale – 133
4.1.1 Einleitung– 133
4.1.2 ROS-Bestimmungin Spermiensuspensionen – 133
Prinzip – 133
Reagenzien – 134
Opsonisierung des Zymosan – 134
Bestimmung spontaner ROS-Produktion – 134
FMLP-Provokationstest in Leukozyten – 135
Zymosan-Provokationstest in Leukozyten – 135
PMA-Provokationstest für Bestimmung der ROS-Produktion von
Leukozyten und Spermien – 135
Ergebnisse – 135
4.2 Humane Spermien-Oozyten-Interaktionstests – 135

4.3 Humaner Zona-pellucida-Bindungstest – 135
4.4 Beurteilung der Akrosomreaktion – 136
4.4.1 luoreszensverfahren
F zur Bestimmung der Akrosomreaktion – 136
Reagenzien – 136
Einfaches Waschen der Spermien – 137
Behandlung der gereinigten Spermienpräparation – 137
Abstrichpräparation – 137
PSA-FITC-Färbung – 137
Bewertung – 137
Quantitative Bestimmung der Akrosomreaktion – 137
4.4.2 nduzierter
I Akrosomreaktionstest – 138
Reagenzien – 138
Verfahren – 138
Bewertung – 138
Qualitätskontrolle – 139
4.5 Hamster-Oozyten-Penetrationstest – 139

4.5.1 rotokolle
P – 139
Reagenzien – 139
Standardprotokoll ohne Ionophor-Stimulation – 139
Alternative Protokolle mit Kalzium-Ionophor (Ca2+) – 140
Gewinnung der Ovarien – 140
Gewinnung der Kumulusmassen – 141
Aufbereitung der Hamsteroozyten – 141
Ko-Inkubation der Gameten – 141
Analyse der Oozyten – 141
Qualitätskontrolle – 142
4.6 Spermien-Chromatin-Test – 142

4.1 • Reaktive Sauerstoffradikale
133 4
oll die Spermienfunktion
S getestet werden, sind die antioxidanten S ystemen (H arnsäure, A scorbin-
Spermien spätestens eine Stunde nach der Samen- säure, α-Tocopherol) a usgerüstet. S ind dies e v er-
probenabgabe vom Seminalplasma zu trennen, um braucht, wird die Spermienfunktion beeinträchtigt
negative Effekte von Produkten somatischer Zellen (Agarwal et al. 2004).
zu vermeiden. Dank der konstanten Verbesserung Im mä nnlichen E jakulat w erden R OS s owohl
des V erständnisses in mo lekulare M echanismen von S permien (Ai tken u . Cla rkson 1987; Al varez
der Spermienfunktion entwickeln sich immer neue et al . 1987; Iwasaki u . Gagno n 1992) als a uch v on
diagnostische Tests. Z um B eispiel zeigt en j üngste Leukozyten (Aitken u. West 1990) produziert. Das
Daten, wie wichtig die Kondensierung und Integri- Seminalplasma e nthält f reie R adikalfänger u nd
tät der nuklearen DNA für die funktionelle Kompe- antioxidante Enzyme , die in ma nchen P atienten
tenz der menschlichen Spermien ist. Zunehmende unzureichend sind ( Jones et al . 1979; Smith et al .
Evidenz weist auf eine Assoziation zwischen DNA- 1996). Die Entnahme des Seminalplasmas während
Integrität, Chr omatinorganisation in den S per- der S permienpräparation f ür assistier te Rep ro-
mien und F ertilität hin (Sak kas et al . 1998; Aitken duktionsverfahren ( 7 Kap. 5 )kann die Spermien
u. Krausz 2001; Virro et al. 2004). sensibler für oxidative Angriffe machen. Eine hohe
Ebenso wir d das b essere Verständnis der S ig- ROS-Produktion v erursacht o xidative S chäden
naltransduktionskaskaden f ür die S permienfunk- und eine v erminderte S permienfunktion s owie
tion die Entwicklung von diagnostischen Tests DNA-Schäden in M itochondrien und im Z ellkern
erlauben, die D efekte in S permien v on inf ertilen (Sawyer et al. 2003).
Männern a bklären k önnen. U m das V erständnis Spermien-Vitaltests werden häufig zur Bestim-
der biologischen B asis der mä nnlichen Infertilität mung der S permienqualität eingesetzt. Die Er geb-
zu v ertiefen, wur de eine S erie v on f unktionellen nisse solcher Tests korrelieren mit der Lipidperoxi-
Tests entwickelt, die die Fähigkeit zur Befruchtung dation in den Spermien (Gomez et al. 1998).
testen: die An bindung a n die Z ona p ellucida, die Chemolumineszenzbasierte Reagenzien (Lu-
akrosomale Exozytose und die Fusion mit der Dot- minol o der L ucigenin) k önnen zur B estimmung
termembran der Oozyte. der R OS-Produktion und Redo xaktivität mä nnli-
cher Spermien eingesetzt werden.
4.1 Reaktiv
e Sauerstoffradikale
4.1.2 ROS
-Bestimmung in
4.1.1 Einleitung Spermiensuspensionen
Die exzessive Produktion von reaktiven Sauerstoff- rinzip

P
radikalen (ROS) und die ho chaktiven zytoplasma- Ein L uminometer misst die L ichtintensität in der
tischen Enzyme wie K reatin-Phosphokinase k ön- männlichen S permienprobe, n achdem d iese m it
nen S permienabnormalitäten a ndeuten, die mi t einer c hemolumineszenten S ubstanz g emischt
Zytoplasmaresten im Mittelstück einhergehen (Rao wurde. Bei dieser Methode wird eine Mischung aus
et al. 1989; Gomez et al. 1996; Aitken et al. 2004). Luminol und Meerrettich-Peroxidase eingesetzt,
ROS sind Sauerstoffmetabolite und s chließen um die P roduktion v on W asserstoffperoxid zu
das S uperoxidanion, W asserstoffperoxid, Hydro- messen. Weitere Substanzen (z.B. Lucigenin) kön-
xyl- und Hydroperoxyl-Radikale und Stickstoffoxi- nen für die Bestimmung von ROS in gewaschenen
de ein. Bei starker Erhöhung können Sie pathologi- Spermienpräparationen eingesetzt werden (Aitken
sche Veränderungen durch oxidative S chäden der et al. 1992; McKinney et al. 1996).
zellulären L ipide, Proteine und D NA verursachen Die Substanz Formyl-Methionyl-Leucyl-Phe-
(Griveau u . L e L annou 1997; Ai tken et al . 200 3; nylalanine (FMLP) ka nn ein sp ezifisches Signal
Henkel et al . 200 4). Die meist en Z ellen sind mi t für L eukozyten g enerieren, w eil S permien k eine
enzymatischen (Superoxid-Dismutase, Glutathion- Rezeptoren f ür dies e S ubstanz ha ben (K rausz et
Peroxidase und Katalase) oder nichtenzymatischen al. 1992). Die S ignalstärke wir d d urch V ergleich
134 Kapitel 4 • Forschungsrelevante Methoden
DMSO verdünnen (ergibt 10 µmol/l Endver-

8
Log Chemoluminiszenz (c.p.m.)
dünnung).
7 7. ymosan
Z
8. elatine:
G 0,1% (1 g/l) in HBSS
6
Opsonisierung
des Zymosan
5
1. 00 mg
5 Zymosan in 10 ml HBSS eingeben.
4 2. räft
Kig mischen.
4 3. Minuten
20 in geschlossenem Gefäß kochen,
3 um Verdunstung zu vermeiden
2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5
Log Leukozytenkonzentration/ml
. 4 Minuten
5 bei 500 g zentrifugieren.
5. asDPellet mit 10 ml HBSS waschen.
6. aschschritt
W 4 und 5 wiederholen.
. Abb. 4.1 Chemilumineszenz nach Eingabe von ozoni-
7. asDPellet sorgfältig in 5 ml frisches humanes
siertem Zymosan. Es besteht eine lineare logarithmische
Korrelation zwischen Leukozytenkonzentration und chemo- Serum pipettieren.
lumineszentem Signal (Daten von RJ Aitken) 8. Minuten
20 Inkubation.
. 9 Minuten
10.ellet
P mit 10 ml HBSS waschen.
mit polynukleären Leukozytenpräparationen be- 11. aschschritte
W 9 und 10 wiederholen.
stimmt. (. Abb. 4.1 ). 12.asDPellet resuspendieren auf eine Konzentra-
Anmerkung tion von 50 mg/ml in 10 ml HBSS + 0,1% (1 g/l)
Die Genauigkeit dieser Bestimmungen wird noch diskutier t Gelatine.
(Aitken et al. 2004), aber Daten belegen eine Anwendung als 13.ei B–20 ºC bis zum Gebrauch lagern.
Spermienfunktionstest (Zorn et al. 2003; Said et al. 2004).
estimmung
B spontaner ROS-Produktion
Anmerkung
1. menprobe
Sa durchmischen (7 Kasten 2.3 und)
Ein einz elner L eukozyt generier t 100-mal mehr ROS als ein
Spermium. Deswegen hat eine Kontamination mit L eukozy- ein Aliquot mit mindestens 10 × 106 Spermien
ten einen starken Einfluss auf die Chemoluminesz enz einer pro ml entnehmen.
Spermienpräparation. 2. permien
S (7 Abschn. 5.3 in) KRM waschen
und auf exakt 10 × 106 Spermien pro ml einstel-
Reagenzien len.
. 1 ank’s
H balancierte Salzlösung (HBSS), ohne 3. 400µl der Spermienpräparation in KRM ohne
Phenolrot: siehe 7 Abschn. 11.4 . Phenolrot und ohne Luftblasen in ein Lumino-
2. rebs–Ringer-Medium
K (KRM), ohne Phenol- meter-Gefäß pipettieren.
rot: siehe 7 Abschn. 11.7 . 4. µl425 mmol/l Luminol hinzufügen.
. 3 uminol,
L 25 mmol/l: 29 mg Luminol (5-Ami- 5. µl8Meerrettich-Peroxidase (1550 IU/ml Lö-
no-2,3-Dehydro-1,4-Phthalazinedion) in 10 ml sung) hinzufügen.
Dimethyl-Sulfoxyd (DMSO) auflösen. 6. Chemilumineszenz im Luminometer 5 Minu-
4. eerrettich-Peroxidase
M (HRP) (Typ VI, 310 ten bei 37 °C bis zur Stabilisierung messen.
IU/mg Eiweiß): 5 mg (1550 IU) in 1 ml KRM
auflösen. Die ROS Produktion kann in s eminalen Leukozy-
5. FMLP (Leukozyten-spezifische Substanz, 10 ten durch Eingabe von FMLP, Zymosan oder PMA
mmol/l): 44 mg FMLP in 10 ml DMSO auflö- angeregt w erden, PMA stim uliert a ber a uch die
sen. ROS-Produktion in Spermien.
. 6 horbol-12-Myristat-13-Acetat
P (PMA), 1
mmol/l Stammlösung: 6,2 mg PMA in 10 ml
DMSO auflösen. 1 mmol/l PMA 1:100 in
4.3 • Humaner Zona-pellucida-Bindungstest
135 4
PMA
Chemiluminizenz (c.p.m., 107)
2.5 1.0
Chemiluminizenz (c.p.m., 106)

PMA
2.0 0.8
1.5 FMLP 0.6

FMLP
1.0 0.4
0.5 0.2
0.0 0.0
5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30
a Zeit (min) b Zeit (min)
. Abb. 4.2a,b Relativ
e Beiträge der Spermien- und Leukozytenpopulation zur ROS-Generation in der Zellsuspension.
a Eine Leukozytenkontamination generiert einen ROS-Schub und ein spezifisches FMLP-Signal. Die Zugabe von PMA gene-
riert eine dauerhafte intense Chemolumineszenz sowohl von Leukozyten als auch von Spermien. b Wenn keine Leukozyten-
kontamination vorliegt, fällt das FMLP Signal aus, während PMA ein ausgeprägtes Signal der Spermien auslöst (siehe auch
Krausz et al. 1992)
MLP-Provokationstest
F in Leukozyten 4.2 HumaneSpermien-Oozyten-
2 µl einer 10 mmo l/l FMLP -Lösung hinzuf ügen, Interaktionstests
um die Chemolumineszenz von Leukozyten in der
Spermiensuspension zu induzieren (. Abb. 4.2 ). Die Bindung der S permien an die Z ona p ellucida
löst die Akrosomreaktion aus, setzt lytische akroso-
ymosan-Provokationstest
Z in male Komponenten frei und ermöglicht den Sper-
Leukozyten mien, d urch eine erhö hte flagellare Ak tivität die
20 µl o zonisiertes Z ymosan ein geben, um die Zonamatrix zu d urchdringen. Um die An bindung
Chemolumineszenz von Leukozyten in der Sper- bewerten zu k önnen, können nichtvitale, nichtbe-
miensuspension z u i nduzieren. D er S ignal i st d i- fruchtbare humane Oozyten aus Obduktionen, aus
rekt p roportional zur L eukozytenkontamination chirurgisch en tfernten O varien o der er folglosen
(. Abb. 4.1 ). In-Vitro-Fertilisationsversuchen ein gesetzt w er-
den. Dies e Tests können auch mit in Salz k onser-
MA-Provokationstest
P für Bestimmung vierten Oozyten durchgeführt werden. Die Verfüg-
der ROS-Produktion von Leukozyten barkeit dies er Tests ist a ufgrund der s chwierigen
und Spermien Verfügbarkeit des h umanen Materials generell be-
1. PMA -Lösung 100-mal in DMSO zur 10 µmol/l grenzt (Yanagimachi et al. 1979; Kruger et al . 1991;
Stammlösung verdünnen. Liu u. Baker 1992b; Liu et al. 2004).
2. bwarten,
A bis FMLP- oder opsonisiertes Zy-
mosan-induziertes Signal erlischt.
3. µl4von 10 µmol/l PMA in Spermiensuspen- 4.3 HumanerZona-pellucida-Bin-
sion zur Endkonzentration von 100 nmol/l dungstest
hinzufügen, um die Chemolumineszenz der
Spermien zu stimulieren (. Abb. 4.2 ). Der H emizona-Test ist ein Z ona-pellucida-Bin-
dungstest (B urkman et al . 1988) und s etzt d urch
gebnisse
Er Mikrodissektion halb ierte Z onae p ellucidae ein.
Beurteilung des P rovokationstests zum N achweis Die zwei Hälften werden mit der gleichen Konzen-
einer Kontamination von Leukozyten. tration von Test- oder Kontrollspermien belegt. Ein
zweiter S permien-Zona-Bindungstest (L iu et al .
1988, 1989) wir d mi t fluoreszenzmarkierten Test-
spermien (z.B. Fluoreszin) und mi t Kontrollsper-
mien, die mit einem anderen Fluoreszin (z.B. Rho-
damin) gefärbt wurden, durchgeführt. Die Anzahl
der g ebundenen und nic htgebundenen S permien
wird ermittelt und als Quotient angegeben. Die Er-
gebnisse dieser Tests korrelieren mit Fertilisations-
4 raten in vitro (Liu u. Baker 2003).
Im F all einer niedr igen o der er folglosen B e-
fruchtung nach IVF, i diopathischer I nfertilität
oder Teratozoospermie können solche Tests wich- . Abb. 4.3 luoreszente
F Pisum-sativum-Agglutinin-(PSA-)
tige klinische Informationen geben (Franken et al. Färbung humaner Spermien. AI: Spermien mit proximal
1989; Liu u. Baker 1992a, 2004). Die Anbindung von fluoreszierenden Köpfen (Akrosom); AR: Spermien mit äqua-
torialen Banden oder postakrosomaler Fluoreszensfärbung
wenigen o der k einen S permien s pricht f ür e inen
sind erkennbar (Mikroskopaufnahme, zur Verfügung gestellt
Spermiendefekt. von HWG Baker)
4.4 e
Burteilung der mit fluoreszenten L ektinen wie P isum s ativum
Akrosomreaktion (Erbsen-Agglutinin) (7 Abschn. 4.4.1 oder
) Arachis
hypogaea (Er dnusslektine), o der d urch B indung
Die no rmale Akr osomreaktion b eginnt mi t der monoklonaler An tikörper g egen das akr osomale
Bindung der S permien an die Z ona p ellucida. Sie Antigen CD46 (Cross 1995) beurteilt werden.
kann an Spermien, die von der Zona pellucida ent-
fernt wur den, o der a n S permien, die in K ontakt
mit Zona pellucida Proteinen kamen, durchgeführt 4.4.1 luoreszensverfahren
F zur
werden (L iu u . B aker 1994, 1996; F ranken et al . Bestimmung der
2000). Akrosomreaktion
Wenn eine Olig oteratozoospermie b ei s onst
normalen Spermienparametern b esteht, k önnen Die M ethode wur de v on Cr oss et al . en twickelt
die Spermien eine a bnormale Akrosomenreaktion (1986) und da nach von Liu u. Baker (1988) modi-
nach f ehlerhafter B indung a n die Z ona p ellucida fiziert. D ie m odifizierte P rozedur ist einfac h und
aufweisen. Andere Spermien können eine no rma- reproduzierbar und lief ert eindeu tige Er gebnisse
le B indung, a ber a bnormale Akr osomenreaktion (. Abb. 4.3). Es ist anzuraten, eine Spermienprä-
zeigen (Liu et al. 2004). Die Durchführung dieser paration mi t vielen mo tilen S permien und o hne
Tests ist limi tiert durch die Verfügbarkeit der h u- Kontaminanten wie L eukozyten, a nderen K eim-
manen Zonae pellucidae. Zonae anderer Primaten zellen oder toten Spermien zu benutzen. Das kann
können nic ht als S urrogaten ein gesetzt w erden, durch Waschen (7 Abschn. 5.3 ),die Swim-Up-Pro-
weil die An bindung sp eziesspezifisch ist (B edford be (7 Abschn. 5.4 oder
) Dichte-Gradienten-Zentri-
1977; Liu et al. 1991b; Oehninger et al. 1993). Cal- fugation (7 Abschn. 5.5) in Abhängigkeit von der
ciumionophoren können die Akrosomreaktion in- Qualität der Probe erreicht werden.
duzieren, aber dieses Ergebnis korreliert nicht mit
der durch die Zona pellucida induzierten Reaktion Reagenzien
(Liu u. Baker, 1996). 1. isum-sativum-Agglutinin
P (PSA) gefärbt mit
Der akr osomale S tatus nac h I nduktion der Fluorescein-Isothiocyanat (FITC).
Akrosomreaktion ka nn mi ttels M ikroskop o der 2. (PSA–FITC).
Durchflusszytometrie (Fenichel et al. 1989; Henley 3. Phosphat-Puffer-Salzlösung (PBS), pH 7,4.
et al. 1994; Cooper u. Yeung 1998) nach Markierung
4.4 • Beurteilung der Akrosomreaktion
137 4
. 4 aCl,
N 0,9% (9 g/l): 0,9 g NaCl in 100 ml in PSA
-FITC-Färbung
destilliertem Wasser lösen. 1.10 ml PSA–FITC-Lösung in einen senkrechten
5. thanol
E 95% (v/v). Färbungsbecher füllen.
6. PSA-Stammlösung: 2 mg PSA–FITC in 4 ml 2. Fixier
te und luftgetrocknete Objektträger in
PBS lösen. 0,5 ml Aliquoten bei –20 °C lagern. PSA–FITC-Lösung inkubieren.
7. PSA Lösung: 0,5 ml PSA-Stammlösung in 3. EineStunde bei 4 °C stehen lassen.
10 ml PBS lösen und bei 4 °C lagern. Diese 4. itMdestilliertem Wasser jeden Objektträger
Lösung kann 4 Wochen gelagert werden. waschen und mit ethanollöslichem Medium
eindecken (7 Abschn. 2.14.2 »Behandlung
, der
Einfaches
Waschen der Spermien gefärbten Ausstriche vor dem Einbetten« und
1. menprobe
Sa durchmischen (7 Kasten 2.3 und
) 2.14.2, »Einbetten der gefärbten Ejakulataus-
ein Aliquot von ca. 0,2 ml entnehmen. striche«).
2. ufA10 ml mit 0,9% (9 g/l) Salzlösung verdün- Anmerkung
nen. Längere Färbezeiten (bis zu 18 Stunden) beeinflussen die Er-
3. ei B800 g 10 Minuten zentrifugieren. gebnisse des PSA-Tests nicht, jedoch ersch wert eine kürzere
. 4 enDgesamten Überstand bis auf 20–40 µl ent- Färbezeit (weniger als 1 Stunde) die korrekte Bewertung des
Präparates.
nehmen und verwerfen.
. 5 permienpellet
S im restlichen Überstand mit-
tels Pipette resuspendieren. ewertung
B
6. aschschritt
W 3–5 wiederholen. Die Ob jektträger un ter Fl uoreszenz-Öl-Objektiv
(Exzitationsspektrum: 45 0–490 nm) b ei 400-fa-
ehandlung
B der gereinigten cher Vergrößerung beurteilen und Spermien wie
Spermienpräparation folgt klassifizieren:
1. Dienach Swim-Up (7 Abschn. 5.4 oder ) Dich- 1. Akr osom-intakt (AI): Spermien, deren Kopf
te-Gradienten-Zentrifugation gewonnene mehr als zur Hälfte hell und gleichmäßig fluo-
Probe (7 Abschn. 5.4) in 10 ml mit Kochsalz- reszent gefärbt sind (. Abb. 4.3 ).
lösung verdünnen. 2. Akrosom-reagiert (AR): Spermien, deren
2. Minuten
10 bei 800 g zentrifugieren. akrosomale Region nur eine einzelne fluo-
. 3 enDgesamten Überstand bis auf 20–40 µl ent- reszente Strecke in äquatorialer Region oder
nehmen und verwerfen. keinerlei Fluorenzenz zeigen (. Abb. 4.3 ).
. 4 permienpellet
S im restlichen Überstand mit- 3. bnormale
A Akrosomen: alle anderen Sper-
tels Pipette resuspendieren. mien.
bstrichpräparation
A Quan
titative Bestimmung der
1. ehrere
M Spermienabstriche von etwa 1 cm Akrosomreaktion
Länge aus jeweils 5 µl der Spermienpräparation 1. itMeinem Labortischzähler die Zahl von Sper-
herstellen. mien jeder akrosomalen Kategorie bestimmen.
2. euchte
F Abstriche unter Kontrastmikroskop 2. mUProbenentnahmefehler zu reduzieren
beurteilen (×400). mindestens 200 Spermien in jedem Präparat
3. permien
S sollten gleichmäßig verteilt und bewerten (7 Kasten 2.5 ).
nicht verklumpt vorliegen. 3. enDDurchschnitt der Differenzen zwischen
4. DieObjektträger an der Luft trocknen lassen. den Prozentraten der Akrosom-reagierten
5. Minuten
30 in 95% (v/v) Ethanol fixieren. Spermien in den unterschiedlichen Präparaten
6. neut
Er an der Luft trocknen lassen. berechnen.
4. DieAkzeptabilität der Differenzen mit Hilfe
von . Tab. 2.1 oder . Abb. 14.2 bestimmen.
(Hier ist die akzeptable Differenz zwischen
zwei Prozentwerten zu finden, die aufgrund
zufälliger Probenentnahmefehler zu erwarten 4. ittels

M Dichtegradienten-Zentrifugation eine
ist.) motile Spermienpräparation in frisch ange-
5. ennW die Differenz akzeptabel ist, die durch- setzter Hams-F10-HSA-Lösung vorbereiten.
schnittlichen Prozentraten der Akrosom-rea- Diese muss frei von Kontaminanten wie Leu-
gierten Spermien dokumentieren. Wenn die kozyten, unreifen Keimzellen und toten Sper-
Differenz zu hoch ist, Bestimmung wiederho- mien sein (7 Abschn. 5.5 ).
len (7 Kasten 2.6 ). 5. ehrfache
M Proben und Kontrollproben von je-
6. ürFdie Dokumentation die Prozentrate der weils 1 ml in Röhrchen pipettieren (Spermien-
4 Akrosom-reagierten Spermien auf glatte Zah- konzentration von 1 × 106 motilen Spermien
len auf/abrunden. pro ml).
6. DieSpermiensuspensionen über 3 Stunden
bei 37 °C in 5% (v/v) CO2 inkubieren, um die
4.4.2Induzier
ter Akrosomreaktions- Kapazitation zu induzieren (Kappe der Probe
test lösen, um Gasaustausch zu ermöglichen).
Wenn kein CO2-Inkubator zu Verfügung steht,
Die a krosomale R eaktion ist e in e xozytotischer kann man ein Hepes-gepuffertes Medium
Prozess, d er n ach B indung d er S permien a n d ie benutzen (7 Abschn. 11.1, 7 Kommentar 1 (die
)
Zona p ellucida v or der S permienpenetration und Kappen sollen dann verschlossen sein) und bei
Fusion mit der Oozyte stattfindet. Ein Kalziumein- 37 °C inkubieren.
strom ist ass oziiert mit dem B eginn der p hysiolo- 7. µl10A23187-Stammlösung (1 mmol/l) in alle
gischen Akrosomreaktion. Ein Kalziumionophor Verumproben geben (Endkonzentration: 10
kann den Kalziumeinstrom induzieren. Hierdurch µmol/l).
kann die K ompetenz v on ka pazitierten S permien 8. u den
Z Kontrollproben 10 µl DMSO geben.
zur Initiierung der Akrosomreaktion getestet wer- 9. AlleProben bei 37 °C für 15 Minuten inkubie-
den (Aitken et al . 1993). Dieser Test wird deshalb ren.
auch als K alzium-Ionophor-(ARIC-)Test b ezeich- 10.onVjeder Probe ein kleines Aliquot zur Be-
net. Bevor dieser Test routinemäßig eingesetzt wer- stimmung der Motilität entnehmen.
den kann, müssen noch weitere Studien zur Evalu- 11. Die
Reaktion mit 100 µl 3% (v/v) Glutaralde-
ierung durchgeführt werden. hyd oder 70% (v/v) Ethanol beenden.
12. Die
fixierten Spermien auf vorgereinigte Ob-
Reagenzien jektträger transferieren und an der Luft trock-
1. ams-F-10-Medium
H (7 Abschn. 11.4 mit
) 3,5% nen lassen.
(35 g/l) humanem Albuminserum (HSA). 13.permien
S mit fluoreszierenden Proben färben
2. iggers-,
B Whitten- und Whittingham-(BWW-) (7 Abschn. 4.4.1 »PSA-FITC-Färbung«).
,
Stammlösung: 7 Abschn. 11.1 . 4. 1 Die Proben im Fluoreszenzmikroskop bei
3. Dimethyl-Sulfoxid (DMSO). 400facher Vergrößerung (Öl-Objektiv) bei
. 4 onophore
I A23187, 1 mmol/l Stammlösung: 450–490 nm Exzitationsanregung beurteilen.
5,23 mg A23187 in 10 ml DMSO einlösen. 15. Die
Prozentrate der akrosom-reagierten Sper-
5. utaraldehyd
Gl 3% (v/v), oder Ethanol 70% mien in den Verum-Proben (Test%AR) und
(v/v). Kontrollproben (Kontrolle%AR) bestimmen.
erfahren
V ewertung
B
. 1 30–60 Minuten die Samenprobe verflüssigen 1. Die
Akrosomreaktion nach Ionophor-Eingabe
lassen. (ARIC) ist Test%AR minus Kontrolle%AR.
2. asDKapazitationsinduzierende Hams-F-10- 2. Die
Normaldifferenz ist ca. 15% AR.
HSA-Medium frisch für jeden Test ansetzen. 3. erte
W unter 10% AR werden als auffällig be-
. 3 edium
M auf 37 °C vorwärmen, am besten in wertet.
einem Inkubator (5% (v/v) CO2 ).
4.5 • Hamster-Oozyten-Penetrationstest
139 4
. 4 erte
W zwischen 10% AR und 15% AR weisen
auf eine abnormale Spermienfunktion hin. Kasten 4.1 Ovulationsinduktion bei
5. ontrollwerte
K über 15% weisen auf eine spon- Hamstern
tane frühzeitige AR hin. Die gesetzlichen Bestimmungen für die Behand-
lung lebender Tieren sind einzuhalten. Passende
Aliquote von Serumgonadotropinen (PMSG) von
Qualitä
tskontrolle schwangeren Stuten und humanem Choriongona-
dotropin (hCG) vorbereiten und bei –20 °C lagern.
1. Einepositive Kontrolle (eine Samenprobe, die Immature Hamsterweibchen oder adulte Hamster
in vorhergehenden Tests eine deutliche Iono- am Tag 1 des Estruszyklus intraperitoneal mit 30 IU
phor-Induktion zeigte (>15% AR), sollte bei PMSG injizieren. Nach 48–72 Stunden 40 IU hCG i.p.
jedem Test eingesetzt werden. injizieren. Dazu die Tiere am Rücken fixieren und
2.edes
J Mal sollte eine neue Färbelösung vorbe- die Bauchhaut mit einer Hand hochziehen, mir der
anderen Hand die Hormone im Bauchraum mit
reitet werden und ein Kreuzvergleich mit der einer 1-ml-Spritze und einer Injektionskanüle (21
alten Lösung und bekannt positiven Kontroll- Gauge) injizieren. Die Nadel auswechseln, um zu
spermien durchgeführt werden, um sicher zu vermeiden, dass sie stumpf wird und Unannehm-
stellen, dass die Färbung korrekt durchgeführt lichkeiten für die Tiere entstehen.
wurde.
4.5 Hamster-
Oozyten-Penetrations- Kalziums und die zyt oplasmatische Alkalinisie-
test rung. Ein di valentes K ation ka nn b eide P rozesse
induzieren (Ai tken et al . 1993), weshalb wir dies e
Die Fusion humaner Spermien mit Hamster-Oozy- Methode als Al ternative zur I onophor-Simulation
ten ist funktionell mit der Fusion des Spermiums nachfolgend beschreiben.
und der vi tellinen M embran v ergleichbar, da sie
von der Plasma membran üb er der äq uatorialen
Region der Akromosom-reagierten Spermien aus- 4.5.1 rPotokolle
geht.
Der Hamster-Oozyten-Penetrationstest (HOP) Reagenzien
oder S permienpenetrationstest un terscheidet sic h 1. WW-Stammlösung:
B 7 Abschn. 11.1 .
von der p hysiologischen S ituation dad urch, dass 2. yaluronidase
H (300–500 IU/mg).
keine Zona pellucida vorhanden ist. Ein Standard- 3. rypsin
T Typ I (10.000 BAEE U/mg).
protokoll für diesen Test ist nachfolgend beschrie- 4. achs
W (Schmelzpunkt 48–66 °C).
ben. 5. etroleum-Gelatine.
P
Anmerkung 6. ineralisches
M Öl.
Der kon ventionelle Hamst er-Oozyten-Test hängt v on der 7. ona-freie
Z Hamster-Oozyte: kann gekauft oder
spontanen Ak rosomreaktion ab , we shalb die Testspermien nach induzierter Superovulation der Hamster
für lange Zeit präinkubiert werden müssen. erhalten werden (7 Kasten 4.1 ).
Da diese P rozedur weniger effizient als der biolog ische
8. Dimethyl-Sulfoxid (DMSO).
Prozess ist und unt erschiedliche M echanismen bet eiligt
sind, wur den häufig falsch-negativ e Er gebnisse bericht et, 9.onophore
I (für alternative Protokolle) 1
bei denen M änner, dere n Spermien ein negativ es Er gebnis mmol/l Stammlösung: 5,23 mg Ionophore
im HOP-Test er zielten, er folgreich humane Oo zyten in vitro A23187in 10 ml DMSO lösen.
oder in viv o befrucht en konnt en ( WHO 1986). Trotz dieser
Einschränkung verschafft dieser Test Informationen über das
tandardprotokoll
S ohne Ionophor-
Fusionspotential der kapazitierten Spermienköpfe.
Stimulation
Zwei der wic htigsten M echanismen, w elche die 1. menprobe
Sa durchmischen (7 Kasten 2.3 ).
Akrosomenreaktion nac h S permien-Zona-pellu- . 2 ichte-Gradienten-Zentrifugation
D
cida-Interaktion a ndeuten, sind der Z ufluss des (7 Abschn. 5.5 oder
) Swim-up-Verfahren zur
Spermienaufbereitung durchführen.
3. enDgrößten Teil des Überstandes vom Sper- 6. 1,25

und 2,5 µl A23187-Stammlösung (1
mienpellet abheben und verwerfen. mmol/l) zu separaten Proben geben (damit
4. asDPellet sorgfältig resuspendieren entstehen 1-ml-Aliquots mit einer finalen Kon-
und die Spermienkonzentration bestim- zentration von 1,25 oder 2,5 µmol/l).
men 7 Abschn. 2.7 und 2.8 ). 7. DieSpermien mit dem Ionophor 3 Stunden bei
. 5 ieDSpermienkonzentration in ca. 0,5 ml Me- 37 °C inkubieren.
dium auf 10 × 106 pro ml einstellen. . 8 Minuten
6. ufA45°-Winkel stellen, um die Oberfläche zu 9. enDÜberstand entfernen und das Pellet sorg-
4 vergrößern. fältig mit der Pipette entnehmen.
. 7 permiensuspension
S 18–24 Stunden bei 37 °C 10.onzentration
K der motilen Spermien bestim-
und 5% (v/v) CO2 zur Induktion der Kapazita- men.
tionsreaktion inkubieren (die Kappe lösen, um 11.ufA3,5× 106 motile Spermien per ml in fri-
Gasaustausch zu erlauben). Wenn kein CO2 - schem BWW einstellen. Zuverlässige Ergeb-
Inkubator vorhanden ist, kann ein Hepes-ge- nisse können mit Spermienkonzentrationen
puffertes Medium (7 Abschn. 11.1, 7 erster Kom- bis 1 × 106 motile Spermien pro ml erzielt wer-
mentar) benutzt werden, dann Reagenzgläser den (Aitken u. Elton 1986).
schließen und bei 37 °C inkubieren. 12.permien
S mit Mineralöl bedecken, wie
8. DieReagenzgläser 20 Minuten senkrecht stel- in 7 Abschn. 4.5.1 »Standardprotokoll
, ohne
len, um immotile Spermien sedimentieren zu Ionophor-Stimulation«, Schritt 11beschrieben.
lassen. Anmerkung
9. usAdem oberen Drittel des Überstandes mo- Die Do sis-Antwort-Kurve f ür I onophor i st i ndividuell u nter-
tile Spermien aspirieren, ohne die toten Sper- schiedlich, aus diesem Grund wir d empfohlen, die Resultate
mien an der Grenzfläche zu berühren, und in nach Inkubation mit z wei Ionophor-Konzentrationen zu be -
stimmen.
neues Reagenzglas geben.
10.onzentration
K auf 3,5× 106 Spermien pro ml
Medium einstellen. ewinnung
G der Ovarien
1. 1 itM einer hochwertigen Pipette 50–150 µl der . 1 Die Tiere nach den von der zuständigen Kom-
Spermiensuspension entnehmen und langsam mission zur Pflege und Handhabung von Tie-
in eine Petrischale geben. Mit einer Einweg- ren genehmigten Richtlinien einschläfern und
pipette vorgewärmtes, in CO2 äquilibriertes maximal 18 Stunden nach der hCG-Injektion
Mineralöl auf den Tropfen geben, ohne die die Ovarien entnehmen.
Spermiensuspension zu bewegen. Das Öl muss 2. DieHamster auf den Rücken legen und Bauch-
die Spermientropfen komplett bedecken. haare mit 95% (v/v) Ethanol anfeuchten.
3. auchhaut
B und Muskeln mit Pinzetten greifen
lternative
A Protokolle mit und mit der Schere einschneiden, um Gebär-
Kalzium-Ionophor (Ca2+ ) mutter und Eierstöcke freizulegen.
1. Einemotile Spermienpräparation durch . 4 aare
H von Pinzette und Schere mit 95% Etha-
Dichte-Gradienten-Zentrifugation wie nol (v/v) entfernen.
in 7 Abschn. 5.5 vorbereiten.
. 5. arm
D aus dem Bauchraum ziehen, um die Ge-
2. usAder Grenze der 80%-Fraktion des Dichte- bärmutterhörner freizulegen.
Gradienten-Mediums das Pellet entnehmen 6. EinGebärmutterhorn mit Pinzetten greifen
und in 8 ml BWW geben. und hochheben, um die Tuba, den Eierstock
. 3 Minuten
5 bei 500 g zentrifugieren. und das Ovarialband freizulegen.
4. enDÜberstand entfernen und das Pellet sorg- 7. enDdistalen Teil des Gebärmutterhorns
fältig mit Pipetten resuspendieren. greifen und die Spitze der Gebärmutter ab-
5. permienkonzentration
S im Pellet bestimmen schneiden. Das Ovar abschneiden und in eine
) auf 5 × 106 motile
(7 Abschn. 2.7 und 2.8 und Petrischale mit warmem BWW legen.
Spermien per ml in frischem BWW einstellen. 8. asDzweite Ovar analog entnehmen.
4.5 • Hamster-Oozyten-Penetrationstest
141 4
einer Stereolupe die Auflösung der Zona be-
Kasten 4.2 Vorbereitung der Glaspipetten urteilen. Sobald diese aufgelöst ist, die Oozy-
Ein Glaskapillarröhrchen oder eine Pasteurpipette ten entnehmen.
mit beiden Händen an den Glasenden greifen und 6. DieOozyten mindestens 3-mal in BWW wa-
über einem Bunsenbrenner vor- und zurückdrehen, schen.
sodass eine homogene Erwärmung gewährleistet 7. Dieisolierten Oozyten auf 37 °C erwärmen
ist. Wenn das Glas zu schmelzen beginnt, die En-
und in die Spermiensuspension legen. Alterna-
den auseinanderziehen. Die ausgezogenen Enden
passend bei gewünschter Dicke (ca.1 mm) trennen. tiv können die Oozyten bis zu 24 Stunden bei
Das andere Ende mittels Schlauch auf eine 1 ml 4 °C gelagert werden.
Spritze aufsetzen.
o-Inkubation
K der Gameten
1. DieZona-freien Hamsteroozyten in Tropfen
ewinnung
G der Kumulusmassen mit jeweils 5 Oozyten/Tropf verteilen (d.h. für
1. varien
O unter einem Dissektionsmikroskop 20 Oozyten pro Samenprobe 4 Aliquote mit 5
betrachten, um die von Kumuluszellen einge- Oozyten/Tropf vorbereiten).
schlossenen Eizellen im geschwollenen Anteil 2. ruppen
G von 5 Oozyten auf der Glaspipette
des Eileiters zu lokalisieren. mit sehr wenig Medium beladen, um die Sper-
2. DieEileiter festhalten und den geschwollenen miensuspension nicht deutlich zu verdünnen.
Teil mit einer 21 Gauge Nadel punktieren. Die 3. DiePipettenspitze in die Mitte der Spermien-
frisch gesprungenen Eizellen werden freige- suspension bringen und die Oozyten langsam
setzt. verteilen. Ein positiver Druck soll erhalten
. 3 Die gesamte Flüssigkeit mit der Nadel ent- bleiben (immer leichten Überdruck erzeugen),
fernen und die Tuben leicht mit der Pinzette um zu vermeiden, dass Mineralöl in die Pipet-
quetschen, um alle Eizellen mitsamt Kumuli te oder Lufttropfen in die Spermiensuspension
zu entnehmen gelangen.
. 4 erschüssiges
Üb Öl von der Pipette abwischen.
5. chritt
S 3 wiederholen, bis alle Oozyten in die
ufbereitung
A der Hamsteroozyten Spermiensuspension transferiert wurden.
1. Die
Kumuluszellen mit Nadel und Zange in 6. DiePipette sorgfältig nach Oozytentransfer in
eine hohle oder flache Schale mit 0,1% (1 g/l) BWW spülen, um eine Kreuzkontamination
Hyaluronidase (300–500 IU/ml) im warmen, der Spermien zu vermeiden.
CO2 -gepufferten BWW geben. 7. DieGameten 3 Stunden bei 37 °C in 5% (v/v)
2. itMAlufolie als Lichtschutz bedecken und CO2 inkubieren.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 8. ozyten
O aus den Öltropfen nehmen und das
Unter einer Stereolupe die Separation der Ku- Öl vollständig von der Pipette abwischen, be-
muluszellen von den Eizellen beurteilen. vor die Oozyten in BWW transferiert werden.
3. itM
einer Glaspipette (7 Kasten 4.2 die
) Oozy- 9. ozyten
O mit Hilfe der Glaspipette in BWW
ten aus der Hyaluronidase in frisches warmes spülen, um alle lose anhaftenden Spermien
BWW transferieren. abzuwaschen.
4. Die
Oozyten zweimal in warmen gepufferten
BWW spülen: Dies kann in einer Multi-Well-
Schale oder Spot-Schale durchgeführt werden. nalyse
A der Oozyten
Zwischen jedem Oozytentransfer die Pipette in 1. ierVWachs-Petroleum-Gelatinensäulen
BWW spülen. (7 Kasten 3.1) an die vier Ecken zur Unterstüt-
5. Die
Oozyten in 0,1% (1g/l) Trypsin (10000 IU/ zung des Deckglases (22 × 22 mm, Dicke 1,5,
ml) ca. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubie- 0,17 mm) aufstellen.
ren, um die Zona pellucida zu entfernen. Mit
4.6 Spermien-
Chromatin-Test
Es gibt mehrere Methoden, um Spermienchromatin

und DNA zu t esten. Farbstoffe werden eingesetzt,
die a n H istone (Anilin B lau) o der Nukleinsäuren
(Akridin Orange, Chromomyzin) binden und wer-
den da nach hist ologisch o der mi ttels Dur chfluss-
zytometrie analysiert. Neuere Methoden schließen
4 die D etektion v on D NA-Strang-Brüchen mi ttels
verschiedener Strategien (TUNEL, ISEL, TdT-Mar-
kierung, RAMAM et c.) ein. Die Er gebnisse dieser
. Abb. 4.4 Phasen-Kontrast-Aufnahme einer zonafreien
Tests korrelieren miteinander (Chohan et al. 2006)
Hamsteroozyte, die humane Spermien enthält. Die breiten und mit der Spermienmorphologie, -motilität und
Pfeile zeigen dekondensierte Spermienköpfe im Ooplasma. -vitalität. S ie k önnen zus ätzliche I nformationen
Die dünnen Pfeile zeigen Spermien auf der Oozytenober- über F ertilisationsraten mi t S tandard-IVF und
fläche, die nicht penetrierten (Nachdruck aus Aitken et al. möglicherweise sp ontanen S chwangerschaftsraten
(1983) mit freundlicher Genehmigung von Springer Science
+ Business Media)
geben. D er S permien-Chromatin-Struktur-Test
(SCSA) ka nn F ertilisationsversagen in vi tro und
in vivo voraussagen (Evenson u. Wixon 2006). Es
2. Einenkleinen Tropfen mit Oozyten in BWW ist noch nicht klar, ob eine Korrelation dieser Test-
in die Mitte der 4 Säulen legen. ergebnisse mit Fehlgeburten und anderen Schwan-
3. eckglas
D vorsichtig auf die Wachsäulen legen gerschaftskomplikationen existiert.
und vorsichtig herunterdrücken, um die Oozy-
ten zu immobilisieren. Das ist erforderlich, um
eine optimale Analyse der dekondensierten
Spermienköpfe durchführen zu können.
. 4 ennW nötig mehr BWW zugeben, um das
Deckgläschen zu fluten und damit ein Zer-
quetschen der Oozyten zu vermeiden.
5. DieEizellen unter einem Phasenkontrastmik-
roskop bei 200facher Vergrößerung analysie-
ren.
6. DieSpermienzahl (dekondensierte Köpfe und
Schwanz) auszählen (. Abb. 4.4 ).
7. DieProzentraten der Oozyten, die mindestens
von einem Spermium penetriert wurden, und
die Zahl der Spermien pro penetrierter Oozyte
bestimmen.
8. erücksichtige
B jedes Spermium, das nach Wa-
schen an der Oozyte haftet, da dies Auskunft
gibt, wie viel Spermien die Akrosomenreak-
tion durchlaufen haben.
Qualitä
tskontrolle
Die Tests sind mi t einer p ositiven K ontrollprobe
mit bekannter > 50% Penetration durchzuführen.
143 II
Spermienpräparationen
Kapitel 5 Spermienpräparationstechniken – 145
Kapitel 6 Kryokonservierung von Spermien – 153

145 5
Spermienpr
äparationstechniken
5.1.1 Wann ist das Abtrennen der Spermien vom Seminalplasma
sinnvoll – 146
5.1.2 M
ethodenwahl – 146
5.1.3 Effizienz der Spermienseparation vom Seminalplasma und von
infektiösen Organismen – 147
5.2 Generelle Prinzipien der

Spermienpräparationstechniken – 147
5.3 Einfaches Waschen – 147
5.3.2 Durc
hführung – 148
5.4 Direkter Swim-up – 148

5.4.2 Durc
hführung – 149
5.5 Diskontinuierlicher Dichtegradient – 149

5.5.2 Dur
chführung – 150
5.6 Präparation von HIV-infizierten Spermienproben – 150

5.7 Präparation testikulärer und epididymaler Spermien – 150
5.7.1 Enz
ymatische Methode – 151
5.7.2 Mechanische Methode – 151
5.7.3 erarbeitung
V der Spermiensuspension zur intrazytoplasmatischen
Spermieninjektion – 151
5.8 Präparation von retrograden Spermienproben – 151

5.9 Präparation von mit technischer Hilfe gewonnenen
Ejakulatproben – 152
146 Kapitel 5 • Spermienpräparationstechniken
Einleitung
5.1 Präparation mit einer großen Anzahl von morpho-
logisch normalen und motilen Spermien notwen-
Die Abtrennung der Spermien vom Seminalplasma dig. So können die Spermien von Debris, anderen
ist f ür eine V ielzahl von Anwendungsmöglichkei- enthaltenen Zellen oder toten Spermien abgetrennt
ten, wie z.B. für diagnostische Tests, zur Aufarbei- werden. D ie Verdünnung d es Ejakulates m it Kul-
tung, für eine Insemination und auch für assistierte turmedium und a nschließender Z entrifugation
reproduktive Techniken (ART) erforderlich. Wenn wird b ei no rmozoospermen P roben ha uptsäch-
Funktionstests an Spermien durchgeführt werden, lich für die IUI v erwendet (Boomsma et al. 2004).
ist es en tscheidend, dass die S permien innerhalb Für P roben mi t einem o der mehr eren a bnormen
einer Stunde nach Ejakulation vom Seminalplasma Ejakulatparametern ist es sinnvoller einen Dichte-
5 abgetrennt werden. Diese Vorgehensweise limitiert
Schäden a n d en S permien, d ie m öglicherweise
gradienten oder direkten Swim-up durchzuführen
(siehe z.B. Morshedi et al . 200 3). Zur Abtrennung
durch Produkte von anderen im Ejakulat enthalte- der Spermien vom Ejakulat scheint bei suboptima-
nen Zellen verursacht werden. len Proben die Verwendung von Glaswolle-Säulen
ebenso effektiv wie ein Dichtegradient (Rhemrev et
Kommentar al. 1989; Johnson et al. 1996).
Die A uszählung zu w eniger Spermien wird
zu einem unsicher en Er gebnis führ en (siehe
auch 7 Abschn. 14.1.1Dies
). kann Folgen für die 5.1.2 M
ethodenwahl
Diagnostik und auch für die Therapie haben
(7 Abschn. 14.2Wenn
). nur sehr wenige Spermien Die W ahl der r ichtigen S permienpräparations-
für einen Therapieversuch vorhanden sind, ist ein technik ist a bhängig von der E jakulatprobe (siehe
ungenaues Ergebnis jedoch nicht zu vermeiden. Canale et al . 1994). D er direkte Swim-up wird oft
verwendet, w enn die E jakulatproben no rmwertig
Kommentar sind. Bei Fällen von schwerer Oligo-, Terato- oder
Wenn weniger Ejakulatvolumen als empfohlen ver- Asthenozoospermie wird eher der Dic htegradient
wendet wird und weniger Spermien als empfohlen verwendet, da dies er den Anteil motiler Spermien
gezählt we rden, wird auch die Genauigkeit der erhöht. Dichtegradienten können auch individuell
ermittelten Werte signifikant re duziert. Wenn w e- modifiziert werden, z.B. kann das Gesamtvolumen
niger als 400 Spermien ausgezählt w erden, sollt e der Gradientenlösungen reduziert werden um die
der Stichprobenfehler für die Anzahl der gezählten Migrationsdistanz der Spermien zu verringern und
Zellen notiert werden (7 Tab. 2.2). dadurch die Anzahl der gewonnenen motilen Sper-
mien zu erhö hen. B ei ho her Viskosität der P robe
kann die Z entrifugationszeit verlängert und s omit
Wann ist das Abtrennen der
5.1.1 die Ausbeute an motilen Spermien verbessert wer-
Spermien vom Seminalplasma den.
sinnvoll Jedes Labor sollte die Zentrifugationsgeschwin-
digkeit und -zei t für die A usbildung eines s oliden
Obwohl das S eminalplasma den S permien bei der Spermienpellets indi viduell a ustesten. W enn die
Penetration des zervikalen Mukus hilft (Overstreet Proben nur g eringe Mengen a n Spermien enthal-
et al. 1980), können einige der Komponenten (z.B. ten, ka nn es no twendig s ein, die Z entrifugations-
Prostaglandin, Z ink) den Ein tritt einer S chwan- geschwindigkeit oder -zeit so anzupassen, dass die
gerschaft n egativ b eeinflussen. Dies gil t vor allem maximale Anzahl von Spermien gewonnen werden
bei S chwangerschaften nach intrauteriner Insemi- kann. D aher ist es uner lässlich, die v erwendeten
nation (IUI) o der I n-vitro-Fertilisation (IVF), da Zeiten oder Geschwindigkeiten vor der klinischen
hier die na türlichen B arrieren umgangen werden. Anwendung g enau auszutesten. Die W ahl der g e-
Für die dir ekte k linische An wendung ist die A b- eigneten P räparationsmethode ka nn d urch einen
trennung des Seminalplasmas zum Erhalt einer Funktionstest der präparierten Spermien wie z.B.
5.3 • Einfaches Waschen
147 5
den zo nafreien H amster-Eizellen-Penetrationstest Spermieninjektion (ICSI), die In-vitro-Fertilisa-
überprüft werden (7 Abschn. 4.5 ). tion (IVF), die a rtifizielle Insemination (AI) o der
für den in tratubaren K eimzellentransfer (ga mete
intrafallopian tra nsfer: GIFT) ist es no twendig,
Effizienz
5.1.3 der ein h umanes S erumalbumin zu v erwenden w el-
Spermienseparation vom ches hochrein und frei von viraler, bakterieller und
Seminalplasma und von Prion-Kontamination ist. Dieses spezifische hoch-
infektiösen Organismen reine h umane S erumalbumin ist k ommerziell er -
hältlich. Nutzt man einen I nkubator, der b ei einer
Die Effektivität einer S permienselektionstechnik Temperatur von 37 °C mit Umgebungsatmosphäre
wird durch die a bsolute S permienanzahl, die G e- betrieben wird, sollte das Medium mit Hepes oder
samtzahl der mo tilen S permien und a uch d urch einem ähnlichen Puffer versetzt s ein und n ur mit
die Menge an morphologisch normalen und moti- gut verschlossenem Röhrchendeckel ink ubiert
len Spermien ausgedrückt. Die gewonnene Menge werden. Dies dien t der Ein stellung des o ptimalen
an mo tilen S permien ist b eim S wim-up g eringer pH-Wertes in dem die S permien üb erleben k ön-
(<20%) als b eim Dichtegradient ( >20%) (siehe Ng nen. Wenn im Inkubator eine Atmosphäre von 5%
et al. 1992). Bei diesen beiden Methoden kann die (v/v) CO2 bei 37 °C herrscht, sollte das verwendete
Menge von kontaminierenden Seminalplasma- Medium mit Natriumbicarbonat oder einem ähn-
komponenten in der S permienaufbereitung sehr lichen Puffer v ersetzt s ein. Dies es M edium wir d
unterschiedlich s ein. B jörndal et al . (20 05) konn- immer mit geöffnetem Röhrchendeckel inkubiert,
ten zeig en, dass Z ink, v on der P rostata s ekretier- so dass ein r egelgerechter Gas austausch zur Ein-
ter M arker der löslic hen S eminalplasmakompo- stellung des g eeigneten pH-W ertes st attfinden
nenten, b ei der S wim-up-Methode zei tabhängig kann. Die B eachtung dieser Vorgaben sichert den
in das üb erschichtete Medium diffundieren kann. richtigen pH-Wert zum Überleben der Spermien.
Somit war die endgültige Zinkkonzentration bei Der finale Verbleib der a ufgearbeiteten S permien
der S wim-up-Präparation hö her als b eim Dic hte- gibt s omit das g eeignete Puffersystem v or. Z um
gradienten. Beispiel ka nn ein S permienfunktionstest n ur in
Ejakulatproben k önnen inf ektiöse S ubstanzen einem Medium stattfinden, das die Spermienkapa-
enthalten. D aher s ollte das L aborpersonal jede zitation unterstützt. Dazu muss Natriumbicarbonat
Probe als p otentiell inf ektiös b ehandeln. K eine (25 mmol/l) enthalten sein.
Spermienpräparationstechnik ka nn zu 100% die Ejakulatproben s ollten mög lichst immer st eril
infektiösen S ubstanzen a us der Sa menprobe en t- verwendet werden (7 Abschn. 2.2.3 ).Eine sterile
fernen ( 7 Abschn. 5.6 ).Die Sicherheitsrichtlinien, Verarbeitung und sterile Materialien sind unerläss-
wie in 7 Kap. 9 geschildert, müssen daher strikt ein- lich, wenn man eine Spermienaufbereitung für die
gehalten werden. Die Sicherheit eines Labors muss therapeutische Verwendung aufarbeitet.
durch die Einhaltung der Richtlinien zur guten La-
borpraxis gewährleistet sein (WHO 2004).
5.3 EinfachesWaschen
5.2 G
enerelle Prinzipien der Einfaches W aschen r esultiert in der gr ößtmögli-
Spermienpräparationstechniken chen Anzahl v on Spermien und ist adäq uat wenn
die Ejakulatprobe von guter Qualität ist. D as ein-
Im nächsten Abschnitt werden drei einfache Präpa- fache Waschen w ird o ft b ei der P räparation v on
rationstechniken beschrieben. Für alle wird als Kul- Spermien für die IUI verwendet.
turmedium eine balancierte Salzlösung verwendet,
die mi t P roteinen und je nac h Umgebungsbedin-
gungen einem geeigneten Puffer supplementiert ist.
Für ART-Verfahren wie die in trazytoplasmatische
5.3.1 Reagenzien und die Motilität der Probe werden bestimmt

(7 Abschn. 2.5 und 2.7 ).
1. WW,B Earle’s, Hams F-10 oder humane Tu-
benflüssigkeit (HTF) (kommerziell erhältlich Anmerkung
Die Anzahl weiterer Waschschritte zur Entfernung des Semi-
oder 7 Abschn. 11.111.3
, 11.4
, und 11.6 ),supple-
nalplasmas kann reduziert werden indem man die Anzahl der
mentiert hauptsächlich mit humanem Serum- Röhrchen reduziert und das Volumen eines jeden Röhrchens
albumin (HSA) oder einem Serum wie es erhöht. Dazu muss die Gesch windigkeit und Dauer der Z en-
unten beschrieben wird. trifugation erhöht werden, z.B. 500–600 g für 8–10 Minuten.
2. HSA, hochrein und frei von viraler, bakteriel- Nur so k ann die komplett e P elletierung der Spermien ge -
währleistet werden.
ler, Prion-Kontamination und Endotoxinen.
5 3. HSA -Supplementierung: zu 50 ml Medium
300 mg HSA, 1,5 mg Natriumpyruvat, 0,18 ml
Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) und 100 mg 5.4 Dir
ekter Swim-up
Natriumbicarbonat zufügen.
4. erum-Supplementierung:
S zu 46 ml Medium Bei dieser Methode wird die Schwimmfähigkeit der
4 ml hitzedeaktiviertes (56 °C für 20 Minu- Spermien g enutzt: S ie k önnen a us dem S eminal-
ten) Patientenserum, 1,5 mg Natriumpyruvat, plasma in das K ulturmedium s chwimmen. D aher
0,18 ml Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) und wird dies e M ethode S wim-up g enannt. D as E ja-
100 mg Natriumbicarbonat hinzufügen. kulat sollte dazu v orher nicht unbedingt verdünnt
und zentrifugiert werden. Dies könnte zum peroxi-
dativen Schaden der S permienmembranen führen
5.3.2 Dur
chführung (Aitken u. Clarkson 1988). Der direkte Swim-up ist
die meist a ngewandte M ethode, um mo tile S per-
1. Die
Ejakulatprobe wird gut gemischt (7 Kas- mien a us dem E jakulat zu g ewinnen (siehe z.B .
ten 2.3 ). Mortimer 1994a, b). B eim direkten Swim-up wird
2. Diegesamte Ejakulatprobe wird 1+ 1 (1:2) mit das K ulturmedium üb er das v erflüssigte Ejakulat
Medium zur Entfernung des Seminalplasmas geschichtet, es ist a ber auch möglich, das Medium
gemischt. unter das Ejakulat zu schichten. Durch den Swim-
. 3 ieDverdünnte Suspension wird in mehrere up erhält man zwar weniger Spermien als beim ein-
Zentrifugationsröhrchen (ungefähr 3 ml pro fachen Waschen, die S elektion anhand der Motili-
Röhrchen) überführt. tät ist a ber sinnvoll, vor allem w enn der An teil an
4. entrifugiert
Z wird bei 300–500 g für 5–10 Mi- motilen Spermien im Ejakulat eher geringer ist, wie
nuten. zum Beispiel für eine IVF oder ICSI.
5. erDÜberstand wird vorsichtig aspiriert und
verworfen.
6. Dievereinigten Spermienpellets werden in 5.4.1 Reagenzien
1 ml Medium durch vorsichtiges auf- und ab-
pipettieren resuspendiert. 1. WW,B Earle’s, Ham’s F-10 oder HTF (kommer-
7. Eineweitere Zentrifugation erfolgt bei 300– ziell erhältlich oder 7 Kap. 11, 7 Abschn. 11.1 ,
500 g für 3–5 Minuten. , und 11.6 ),supplementiert hauptsäch-
11.3 11.4
8. erDÜberstand wird vorsichtig aspiriert und lich mit humanem Serumalbumin (HSA) oder
verworfen. einem Serum wie es unten beschrieben wird.
9. asDSpermienpellet wird in einem geeigne- 2. HSA, hochrein und frei von viraler, bakteriel-
ten Volumen durch vorsichtiges auf- und ler, Prion-Kontamination und Endotoxinen.
abpipettieren resuspendiert. Das geeignete 3. HSA -Supplementierung: zu 50 ml Medium
Volumen ist abhängig von der Art der finalen 300 mg HSA, 1,5 mg Natriumpyruvat, 0,18 ml
Verwendung, z.B. IUI. Die Konzentration Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) und 100 mg
Natriumbicarbonat zufügen.
5.5 • Diskontinuierlicher Dichtegradient
149 5
4. erum-Supplementierung:
S zu 46 ml Medium stanter. Für die IVF und ICSI werden die Spermien
4 ml hitzedeaktiviertes (56 °C für 20 Minu- mittels Z entrifugation des S eminalplasmas d urch
ten) Patientenserum, 1,5 mg Natriumpyruvat, den Dichtegradienten gewonnen.
0,18 ml Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) und Der G radient b esteht a us mi t S ilan üb erzo-
100 mg Natriumbicarbonat hinzufügen. gener K olloid-Kieselerde (S ilica) und erla ubt die
Separation der Z ellen a ufgrund ihr er Dic hte. Z u-
sätzlich können die motilen Spermien aktiv durch
5.4.2 Dur
chführung den G radienten s chwimmen und es f ormt sic h
ein w eiches Pellet a m B oden des Rö hrchens. D er
1. Die
Ejakulatprobe wird gut gemischt (7 Kas- zweistufige d iskontinuierliche D ichtegradient i st
ten 2.3 ). die meist g enutzte Methode. Typischerweise wir d
. 2 ml1des Ejakulates wird in ein steriles koni- auf einen unteren 80%igen (v/v) Dichtegradienten
sches Zentrifugenröhrchen von 15 ml Volumen ein 40%ig er (v/v) G radient g eschichtet. Die S per-
gegeben. 1,2 ml Kulturmedium wird über- mienseparation durch die Dic htegradient-Zentri-
schichtet. Alternativ kann das Ejakulat auch fugation isoliert die gut motilen Spermien frei von
vorsichtig mit einer Pipette unter das vorgeleg- Debris, kontaminierenden Leukozyten, anderen
te Medium geschichtet werden. enthaltenen Zellen und degenerierten Keimzellen.
3. asDRöhrchen wird vorsichtig in einem Win- Für die Ejakulatverarbeitung mittels eines Dich-
kel von 45° in den Inkubator gestellt. So wird tegradienten gibt es eine Vielzahl von kommerziell
die Oberfläche der Ejakulat-Medium-Inter- erhältlichen P rodukten. Alle P rodukte s ollten un-
phase vergrößert. Inkubiert wird für eine Stun- bedingt nach Herstellerangaben verwendet werden.
de bei 37°C. Wenn Änder ungen in der M ethodik a ngebracht
4. asDRöhrchen wird wieder in die Normalposi- sind, sollten diese durch evidenzbasierte S tudien
tion gebracht und die oberen 1 ml des Me- zuerst kontrolliert werden. Die meist en Dichtegra-
diums vorsichtig abgehoben. In diesem Über- dienten enthalten hochmolekulare Komponenten
stand sind die gut motilen Spermien enthalten. mit niedr iger O smolalität. D aher s ollte die P räpa-
5. DieProbe wird mit 1,5–2,0 ml Medium ver- ration in einen Medium erfolgen, welches isoosmo-
dünnt. tisch zur weiblichen Genitaltraktflüssigkeit ist.
6. entrifugiert
Z wird bei 300–500 g für 5 Minu-
ten. Der Überstand wird verworfen.
7. asDSpermienpellet wird in 0,5 ml Medium 5.5.1 Reagenzien
zur Analyse der Konzentration, der Gesamt-
motilität und der Progressivmotilität resuspen- 1. WW,B Earle’s, Ham’s F-10 oder HTF
diert. (7 Abschn. 2.5 und 2.7 ). (kommerziell erhältlich oder sie-
. 8 ieDaufgearbeitete Probe kann direkt für thera- , 11.4
he 7 Kap. 11, 7 Abschn. 11.111.3 , und 11.6 ),
peutische Maßnahmen oder für die Forschung supplementiert hauptsächlich mit humanem
eingesetzt werden. Serumalbumin (HSA) oder einem Serum wie
es unten beschrieben wird.
2. HSA, hochrein und frei von viraler, bakteriel-
5.5 Disk
ontinuierlicher ler, Prion-Kontamination und Endotoxinen.
Dichtegradient 3. HSA -Supplementierung: zu 50 ml Medium
300 mg HSA, 1,5 mg Natriumpyruvat, 0,18 ml
Der disk ontinuierliche Dic htegradient ga rantiert Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) und 100 mg
die S elektion der S permien mit der b esten Quali- Natriumbicarbonat zufügen.
tät und er möglicht zug leich eine s ehr gu te A b- 4. erum-Supplementierung:
S zu 46 ml Medium
trennung von anderen Z elltypen und D ebris. D er 4 ml hitzedeaktiviertes (56 °C für 20 Minu-
Dichtegradient ist einfac her zu st andardisieren als ten) Patientenserum, 1,5 mg Natriumpyruvat,
die Swim-up-Technik und die Ergebnisse sind kon-
0,18 ml Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) und Analyse der Konzentration und Motilität re-
100 mg Natriumbicarbonat hinzufügen. suspendiert (7 Abschn. 2.5 und 2.7 ).
5. erstellung
H eines isotonischen Dichte-
gradientenmediums: zu 10 ml eines 10fach
konzentrierten Kulturmediums (kommerziell 5.6 rPäparation von HIV-infizier ten
erhältlich oder siehe 7 Kap. 11, 7 Abschn. 11.1 , Spermienproben
, und 11.6 ),90 ml des Dichtegradienten-
11.3 11.4
mediums, 300 mg HSA und 3 mg Natriumpyr- Wenn in einer Ejakulatprobe der humane Immun-
uvat, 0,37 ml Natriumlactat (60% (v/v) Sirup) defizienzvirus (HIV) v orhanden ist, ka nn virale
und 200 mg Natriumbicarbonat hinzufügen. RNA und p rovirale D NA f rei im S eminalplasma
5 6. erstellung
H des Dichtegradienten mit 80%
(v/v): zu 40 ml des isotonischen Dichtegra-
und in a nderen do rt en thaltenen Z ellen nac hge-
wiesen werden. Die HIV-Rezeptoren (CD4, CCR5,
dientenmediums, 10 ml des supplementierten CXCR4) werden nicht von Spermien, sondern nur
Mediums hinzufügen. von anderen Zellen exprimiert. Daher ist der Dich-
7. erstellung
H des Dichtegradienten mit 40% tegradient gefolgt von einem Swim-up die empfoh-
(v/v): zu 20 ml des isotonischen Dichtegra- lene Technik um s o eine mög liche I nfektion des
dientenmediums, 30 ml des supplementierten nichtinfizierten P artners zu v erhindern (G illing-
Mediums hinzufügen. Smith et al. 2006; Sa vasi et al. 200 7). Diese Vorge-
Anmerkung hensweise wurde zur Abtrennung der virusinfizier-
Obwohl die isot onischen Dicht egradientenmedien of t als ten Zellen und des infizierten Seminalplasmas (im
100%, 80% und 40% (v/v) beschrieben we rden, so sind sie Dichtegradientenüberstand) v on den HIV -freien
real doch nur 90%, 72% und 36% (v/v). motilen S permien im S wim-up (a us dem Dic hte-
gradienten-Pellet) en twickelt. Die s o p räparierten
Proben sollten vor der Verwendung mittels rever-
5.5.2Dur
chführung ser Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-
PCR) überprüft werden und nur HIV-freie Proben
1. erDDichtegradient wird in einem Reagenzglas sollten für die ART verwendet werden. Die Ergeb-
präpariert. 1 ml des 40%igen (v/v) Dichtegra- nisse sind b isher viel v ersprechend, jedo ch ist es
dientenmediums über 1 ml des 80%igen (v/v) nicht a usreichend b ewiesen, dass dies e M ethode
schichten. das Risiko einer HIV-Infektion eliminieren kann.
2. DieEjakulatprobe gut mischen (7 Kasten 2.3 ). Anmerkung
3. erÜbden Dichtegradienten 1 ml der Ejakulat- Diese Technik sollte nur in sicheren Einrichtungen verwendet
probe schichten und bei 300–400 g für 15–30 werden, um das R isiko einer K reuz-Kontamination der HIV -
Minuten zentrifugieren. Es können bei Bedarf freien Proben zu minimieren (Gilling-Smith et al. 2005).
auch mehrere Röhrchen verwendet werden.
4. erDÜberstand wird so weit wie möglich ver-
worfen. 5.7 rPäparation testikulärer und
5. asDSpermienpellet wird in 5 ml des supple- epididymaler Spermien
mentierten Mediums durch vorsichtiges auf-
und abpipettieren resuspendiert (der Wasch- Die Gewinnung von Spermien aus Hodengewebe
schritt dient der Entfernung des restlichen oder dem Nebenhoden (Epididymis) erfordert eine
kontaminierenden Dichtegradientenmediums) besondere Vorgehensweise.
und bei 200 g für 4–10 Minuten zentrifugiert. Die typ ische I ndikation f ür eine ep ididymale
6. Dies
er Waschschritt wird wiederholt (Schritte Spermienaspiration ist eher die obstr uktive Azoo-
4 und 5). spermie als die testikuläre Dysfunktion. Folglich
7. asDfinale Pellet wird in supplementiertem kann bei einer Obstruktion eine hohe Anzahl an
Medium durch vorsichtiges Pipettieren zur Spermien f ür t herapeutische Z wecke g ewonnen
werden. E pididymale A spirate k önnen gu t mi t
5.8 • Präparation von retrograden Spermienproben
151 5
nur minimaler K ontamination v on Er ythrozyten 5.7.3 e
Vrarbeitung der
und a nderen da rin en thaltenen Z ellen g ewonnen Spermiensuspension zur
werden. Dies vereinfacht die Isolierung und Selek- intrazytoplasmatischen
tion mo tiler ep ididymaler S permien. Wenn viele Spermieninjektion
epididymale Spermien isoliert werden können, ist
die Dic htegradientenzentrifugation die effektivste 1. DieProbe wird gewaschen, dazu werden 1,5 ml
Methode um die S permien f ür die a nschließende Kulturmedium hinzugefügt.
Verwendung a bzutrennen ( 7 Abschn. 5.5 ).Wenn 2. DieZentrifugation erfolgt 8–10 Minuten bei
dagegen nur wenige Spermien g ewonnen werden 300 g.
können, ist ein einfac her W aschschritt sinn voll 3. erDÜberstand wird verworfen und das Pellet
(7 Abschn. 5.3 ). in 0,5 ml frischem Kulturmedium resuspen-
Testikuläre S permien w erden d urch e ine o ffe- diert.
ne Biopsie (mit o der ohne Mikrodissektion) o der 4. DieMotilität und die Anzahl der Spermien im
durch eine perkutane Nadelbiopsie gewonnen. Tes- Pellet wird abgeschätzt (Bei Proben mit sehr
tikuläre Proben sind ausnahmslos mit anderen Zel- wenigen Spermien ist es sinnvoll in einem
len und vielen Er ythrozyten kontaminiert, s odass niedrigeren Volumen zu resuspendieren).
weitere Schritte zur Isolierung einer reinen Präpa- 5. EineKulturschale wird mit 5–10 μl großen
ration v on S permien no twendig sind . Z ur I solie- Tropfen Kulturmedium befüllt.
rung der elongierten Spermatiden, die im seminife- 6. DieTropfen werden mit Mineralöl überschich-
ren Gewebe gebunden sind, werden enzymatische tet (das Öl sollte mit CO2 voräquilibriert sein).
und mechanische Methoden verwendet. Testikulä- 7. twa
E 5–10 μl der Spermiensuspension wird in
re S permien k önnen n ur f ür eine I CSI p räpariert das Kulturmedium gegeben.
werden da die Anzahl der Spermien zu niedrig und 8. Diemotilen Spermien werden an der Grenz-
die Motilität oft gering ist. schicht von Kulturmedium und Öl vorsichtig
mit einer ICSI-Pipette aspiriert.
9. Dieisolierten Spermien werden in einen Trop-
5.7.1 Enz
ymatische Methode fen mit einer viskösen Flüssigkeit, z.B. Poly-
vinylpyrrolidin (7–10% (100 g/l) in Medium)
1. asDtestikuläre Gewebe wird mit Collagenase transferiert.
(z.B. 0,8 mg von Clostridium histolyticum ,Typ
1A pro ml Medium) 1,5–2 Stunden bei 37 °C
inkubiert und alle 30 Minuten kurz gevortext. 5.8 rPäparation von retrograden
2. entrifugiert
Z wird bei 100 g für 10 Minuten Spermienproben
und das Pellet überprüft.
Bei einig en P atienten g elangt der Sa men b ei der
Ejakulation in die B lase und r esultiert s omit in
5.7.2 M
echanische Methode einer A spermie o der in einem ka um sic htbaren
Ejakulat. Um diesen Vorgang zu v erifizieren, wird
. 1 asDtestikuläre Gewebe wird in Kulturmedium Urin nach der E jakulation gewonnen und a uf das
mit Glas-Objektträgern zerkleinert bis eine Vorhandensein v on S permien üb erprüft. Wenn
feine Suspension entsteht. eine medikamentöse Therapie nicht möglich oder
2. ternativ
Al können die Zellen aus den Hoden- nicht erfolgreich ist, können die Spermien aus dem
kanälchen mit dünnen Nadeln (auf Tuberku- Urin isoliert werden. Man kann den Urin durch die
lin-Einmalspritzen), die im 90°-Winkel ge- Einnahme von z.B. Natriumbicarbonat alkalisieren.
bogen und somit parallel zur Petrischale sind, Dies erhöht die Cha nce motile Spermien im U rin
ausgestrichen werden. zu finden (Mahadevan et al. 1981).
Im Labor sollte der Patient auf folgende Punkte

hingewiesen werden:
5 uerst Z sollte uriniert werden, aber ohne dass
die Blase vollständig entleert wird.
5 anach D erfolgt die Produktion des Ejakulats
durch Masturbation in ein geeignetes Gefäß.
5 zweite
Eine Urinabgabe erfolgt nun in ein
weiteres frisches Gefäß, welches schon Kultur-
medium enthält (dies dient der zusätzlichen
Alkalisierung).
5 Das Ejakulat, wenn vorhanden, und der U rin soll-
ten analysiert werden. Da ein großes Volumen Urin
produziert wird, muss die Probe konzentriert wer-
den. Dazu wird der Urin zentrifugiert (500 g für 8
Minuten). Die konzentrierte retrograde Probe und
die antegrade Probe, wenn vorhanden, werden am
effektivsten d urch die Dic htegradienten-Methode
weiterverarbeitet (7 Abschn. 5.5 ).
5.9 rPäparation von mit technischer

Hilfe gewonnenen
Ejakulatproben
Bei Patienten mit gestörter Ejakulation oder Patien-

ten die nicht ejakulieren können, es ist möglich, eine
Ejakulatprobe durch direkte vibratorische Stimula-
tion des P enis o der d urch r ektale elek trische S ti-
mulation der akzessorischen Drüsen zu gewinnen.
Das Ejakulat von Patienten mit Rückenmarkverlet-
zungen weist oft eine hohe Spermienkonzentration
mit verringerter Motilität und Kontamination von
Erythrozyten und Leukozyten auf. Die durch Elek-
troejakulation gewonnenen Proben werden mit der
Dichtegradienten-Zentrifugation am effektivsten
aufbereitet (7 Abschn. 5.5 ).
Ungeachtet d er P räparationsmethode w eisen
diese Ejakulattypen sehr häufig einen hohen Anteil
an immotilen Spermien auf.
153 6
yokonservierung
Kr von
Spermien
6.2 Protokolle zur Kryokonservierung des Ejakulats – 156
6.2.1 Standarddurchführung – 156
Vorbereitung des GEYC-Kryoprotektivums – 156
Beimengung des Kryoprotektivums zum Ejakulat – 157
Befüllen der Plastikstraws (»Strohhalme«) der Kryokassetten – 157
Versiegeln der Kryostraws – 157
Kühlen und Einfrieren des Ejakulates in programmierbaren
Einfriergeräten – 157
Manuelles Einfrieren und Auftauen des Ejakulates – 158
Aufbewahrung der kryokonservierten Samenproben – 158
Transport von kryokonservierten Samenproben – 158
Auftauen der kryokonservierten Samenproben – 158
6.2.2 M
odifizierte Einfrierprotokolle für oligozoosperme Proben und
operativ gewonnene Spermien – 158
Modifizierte Kryoprotektiva (TGG) – 159
6.2.3 Beschrif
tung der Kryostraws und Kassetten – 159
154 Kapitel 6 • Kryokonservierung von Spermien
Einleitung
6.1 rungsschaden sein als andere Zellen. Allerdings hat
die Kryokonservierung einen s chädigenden Effekt
Die Kryokonservierung von Spermien ist ein wich- auf die men schliche Spermienfunktion, insbeson-
tiger Bestandteil der Arbeit vieler Labore, die Eja- dere die Motilität. Im Durchschnitt überleben nur
kulatanalysen d urchführen, in sbesondere in s ol- 50% der motilen Spermien das Einfrieren und Wie-
chen Laboren, die zu Fertilitätskliniken gehören. derauftauen (Keel u. Webster 1993). Die Op timie-
Die jüngere Geschichte der Kryokonservierung rung der Kryokonservierung kann diesen Schaden
von S permien r eicht b is in die spä ten 40er J ahre minimieren und kann somit die Schwangerschafts-
des 20. Jahrhunderts zurück. Die Entdeckung, dass raten verbessern (Woods et al. 2004).
Glycerol S permien v or den S chäden des Einf rie- Schwangerschaftsraten nac h assistierter B e-
rens s chützen ka nn, f ührte zur V erwendung v on fruchtung mi t kr yokonserviertem S pendersamen
menschlichen S permien, d ie a uf T rockeneis b ei hängen o ftmals v on der S permienqualität nac h
–79°C aufbewahrt worden waren (Polge et al. 1949; dem Auftauen a b sowie v om Z eitpunkt der I nse-
6 Bunge u. Sherman 1953; Bunge et al . 1954). In der mination und natürlich den Faktoren der Empfän-
Folge wur de da nn flüssiger Stickstoff verwendet, gerin, wie Al ter, f rühere S chwangerschaften nach
und da mit fa nd die S permienkryokonservierung Spenderinsemination sowie von der ovulatorischen
eine rasche Weiterentwicklung in vielen Ländern Funktion oder S törungen der T ubenfunktion (le
mit d er E tablierung k ommerzieller K ryobanken Lannou u. Lansac 1993). Wenn Ejakulat unter ge-
und entsprechend organisierter nationaler Einrich- eigneten B edingungen g elagert w ird, b esteht k ei-
tungen (Perloff et al. 1964; David et al. 1980; Clarke ne V erschlechterung der S permienqualität mi t
et al. 1997; Leibo et al. 2002). der Z eitdauer der L agerung; Kinder wurden nach
Eine V ielzahl v on K ryokonservierungsproto- Fertilisierungsbehandlungen mit über 28 Jahre ge-
kollen findet mittlerweile Verwendung, die un ter- lagerten Sa menproben g eboren (F eldschuh et al .
schiedliche K ryoprotektiva und Einf riertechniken 2005; Clarke et al. 2006).
einsetzen. Das Überleben der Zellen nach der Ein- Spermien können aus einer Vielzahl von Grün-
frier- und A uftauprozedur hä ngt w esentlich v on den aufbewahrt werden ( 7 Kasten 6.1 ).In einigen
der Minimierung der intrazellulären Eiskristallbil- Fällen muss das Verfahren der S permienkryokon-
dung ab. Dies wird durch die Verwendung geeigne- servierung modifiziert werden (7 Abschn. 6.2.2 ).
ter Kryoprotektiva sowie die Anwendung von Küh- Anmerkung
lungs- und A ufwärmraten erreicht, die die M enge Sowohl für die Fertilitätsprävention als auch die I nfertilitäts-
des intrazellulären Wassers als G rundlage der Eis- behandlung sollt en normale Samenpr oben asser viert w er-
kristallbildung reduzieren (Sherman 1990; K eel u. den, die für mindestens 10 oder mehr Inseminationen bzw.
ART-Behandlungen ausreichen, um sicherzustellen, dass eine
Webster 1993; Watson 1995). Wenn Spermien eine
gute Chance für eine Schwangerschaft besteht. Bei abnorma-
zu lange Periode bei Temperaturen oberhalb von len Ejakulatproben hat sich das P oolen mehrerer Proben für
–130 °C v erbringen (die T ransitionstemperatur), die ART als nicht sinnvoll erwiesen.
insbesondere währ end des A uftauprozesses, kann
eine Rekr istallisation ein setzen, die zur Z unahme Anmerkung
der mög lichen S chädigung d urch in trazelluläre Da für eine ICSI-Behandlung ein einz elnes Spermium pro Ei-
zelle benötigt wir d, lohnt sich die K ryokonservierung jedes
Eiskristallbildung führt.
einzelnen vitalen Spermiums.
Menschliche Spermien tolerieren eine g ewisse
Breite an Kühl- und Aufwärmraten. Sie sind gegen- Anmerkung
über dem ras chen Ein frieren (K älteschock) nic ht Die Lagerung einer vor potentiell fertilitätsschädigender Be-
sehr em pfindlich, mög licherweise a ufgrund der handlung gewonnenen Samenprobe hat oftmals einen signi-
Membranflüssigkeit mit einem ho hen An teil un- fikant positiven psychologischen Wert, weil so die Hoffnung
auf eine zukünftige Vaterschaft besteht. Für Männer, die sich
gesättigter F ettsäuren in der L ipiddoppelschicht einer Therapie mit Alk ylanzien oder ein er Strahlentherapie
(Clarke et al. 2003). Sie können auch aufgrund ihres unterziehen müssen, muss die Samenpr obe vor Beginn der
insgesamt g eringen Wasseranteils (r und 50%) wi- Behandlung gewonnen werden. Alle M änner, die eine Che-
derstandsfähiger gegenüber dem Kryokonservie- mo- oder R adiotherapie benötigen, einschließlich der Ju-
6.1 • Einleitung
155 6
Kasten 6.1 Indikationen für die Kryokonservierung von Spermien

Samenspende Die lokale und nationale Gesetz- (als Backup für eine ICSI-Be-
Ejakulat von gesunden Spendern, gebung im Hinblick auf genetisches handlung) (Bourne et al. 1995);
die nachweislich oder vermutlich und infektiologisches Screening 4 Behandlung
einer nicht dauer-
fertil sind, kann für eine spätere sollte jeweils beachtet werden. haft bestehenden Infertilität,
Verwendung aufbewahrt werden. wie z.B. bei einer Operation des
Fertilitätserhalt
Diese Spender müssen von Klini- Verschlusses der ableitenden
Das Ejakulat sollte gewonnen und
ken oder Samenbanken rekrutiert Samenwege oder einer Gona-
gelagert werden, bevor ein Mann
werden, und ihr Samen wird anony- dotropinbehandlung bei einem
sich einem kontrazeptiven oder fer-
misiert verwendet. Alternativ gibt hypothalamisch-hypophysären
tilitätsschädigenden Verfahren oder
es auch die Möglichkeit, dass die Hypogonadismus;
Exposition unterzieht, wie z.B.:
Empfänger die Spender kennen. 4 eine
Notwendigkeit der Samen-
4 asektomieV (im Fall einer späte-
Spendersamen kann für die assis- kryokonservierung besteht bei
ren Veränderung in der part-
tierte Befruchtung (ART), IUI, IVF einer assistierten Ejakulation
nerschaftlichen Situation oder
oder ICSI verwendet werden: bei Patienten mit einer Quer-
dem erneuten Wunsch nach
4 die
fürPartnerin eines infertilen schnittslähmung, bei Spermien
mehr Kindern);
Mannes ohne vitale Spermien im Urin bei einer retrograden
4 Behandlungmit zytotoxischen
oder elongierte Spermatiden, Ejakulation oder bei der opera-
Medikamenten oder Radiothe-
die für eine ICSI-Behandlung tiven Samenzellgewinnung aus
rapie, die mit einer gewissen
geeignet sind, oder wenn die dem Genitaltrakt;
Wahrscheinlichkeit die Sper-
Behandlung versagt hat oder 4 änner,
M die nicht in der Lage
matogenese dauerhaft beein-
zu teuer ist; sind, am Tage der ART-Durch-
trächtigen (Meseguer et al.
4 die
umWeitergabe angebo- führung eine frische Samenpro-
2006; Schmidt et al. 2004);
rener Erkrankungen zu ver- be zu gewinnen.
4 aktiv
er Dienst im Rahmen einer
meiden;
gefährlichen Tätigkeit, z.B. Mili- Minimierung des Risikos
4 die
umfetale hämolytische
tärdienst, in Ländern, in denen der Übertragung einer
Anämie durch eine Blutgrup-
die posthume Verwendung des Infektionserkrankung
penunverträglichkeit zu ver-
Samens zulässig ist. Für Männer mit HIV, die unter einer
meiden;
antiretroviralen Thera

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1b) who - laborleitlinien zur Ejakula untersuchung

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Planung: Peter L. Bergmann, Dr. Sabine Höschele

Gedruckt auf säurefreiem Papier 2111 – 5 4 3 2 1 0

I Untersuchung des Ejakulates

3 Fakultative Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

3.3.3 Vereinfachter In-vitro-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

4 Forschungsrelevante Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

Bestimmung spontaner ROS-Produktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

5.4.2 Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

6 Kryokonservierung von Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

7 Qualitätssicherung und Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

7.7 Statistische Verfahren zur Analyse und Dokumentation systematischer

8 Referenzwerte und Nomenklatur der Ejakulatanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189

9 Ausstattung und Sicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

10 Mikroskopie im Andrologielabor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

10.5 Fokussieren des Lichtkondensators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204

11 Vorrats- und Arbeitslösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

13 Befundbögen für Ejakulatuntersuchungen und Untersuchungen des

14 Messfehler und Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

14.5.3 Analyse der Videoaufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

15 Nationale externe Qualitätskontrollprogramme für die Ejakulatanalyse . . . 421

Diese Publikation wurde vom UNDP/UNFPA/WHO/World Bank Special Programme of Re-

Chefredakteur Dr. Lars Björndahl

Dr. Hermann M. Behre Dr. Aucky Hinting

Mr. Godwin E. Imade Dr. Christina C.L. Wang

Diefinanzielle Unterstützung der International Society of Andrology wird hiermit dankbar

Diese Ausgabe d es L aborhandbuchs wird dem Andenken an G eoffrey Waites (1928–2005)

zu v erbessern und die Er gebnisse v ergleichbar zu

Kapitel 3 Fakultative Untersuchungen – 107

Kapitel 4 Forschungsrelevante Methoden – 131

2.3 Erste makroskopische Untersuchung – 17

2.4 Erste mikroskopische Untersuchung – 20

2.9 Niedrige Spermienzahl: Kryptozoospermie und vermutete

2.11 Wenn eine genaue Bestimmung auch bei wenigen Spermien

2.12 Zählung von Zellen, die keine Spermien sind – 51

2.15 Beurteilung der gefärbten Präparate – 60

2.16 Abbildungen zur Spermienmorphologie – 62

2.18 Beurteilung der Leukozyten im Ejakulat – 96

2.19 Beurteilung unreifer Keimzellen im Ejakulat – 100

Kommentar Zwischen 30 und 60 Minuten:

Konzentration (106 per ml)

normer Konsistenz einen Faden von mehr als 2 cm

Taille et al. 1998; Daudin et al. 2000; von Eckardstein

Das P räparat sollte dann b ei e iner Vergrößerung H

. Tab. 2.1 AnnehmbareUnterschiede zwischen

Kasten 2.4 Tiefe der nassen Präparation

Grad der Agglutination

Teile des 1. Isoliert 2. Mäßig 3. Viele 4. Ausgeprägt

Kommentar sollten oft gewechselt werden. Es sollte vermie-

mittleren Prozentsatz für jeden Motilitätsgrad

Kasten 2.6 Vergleich der doppelt gemessenen Prozentsätze

der tatsächlich beobachtete Unterschied diese Zahl Kommentar