A novel application of ion exchange chromatography in recombinant hepatitis B

vaccine downstream processing: Improving recombinant HBsAg homogeneity by removing

associated aggregates

Conclusões:
Foi estudada IEC Aniónica
Resina: DEAE Sepharose Fast Flow medium
Estudou-se a Influência da Força Iónica
O buffer de eluição com condutividade elétrica entre 27 e 31 mS / cm apresentou os
melhores resultados para remoção de rHBsAg agregado
Cerca de 79% da HBsAg foi recuperada com pureza acima dos 95%
Foi recuperada entre 94% e 97,5% do total de proteína com o nível de qualidade
aceitável.

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Purification of Recombinant Hepatitis B Surface Antigen (rec-HBsAg) from P.

pastoris: A Process Development Study

Conclusões:
Usadas 6 etapas de separação (efeito combinado cromatografia de imunoafinidade,
troca iónica e exclusão molecular)
Feito scale-up 250x e 500x
Rendimento: 40%
Pureza: >=97%

Matéria prima para análise:

Condutividade: 19 mS/cm
pH=7.2

HBsAg: Concentração: 0.214 mg/mL

Ponto Isoelétrico: 5.6

Conc. Proteina: 1.100 mg/mL

Conc. Lipidos: 1.438 mg/mL
Conc. CarboHd: 1.746 mg/mL
Conc. DNA: 0,20 microg/mL

Buffer usado: 20mM Tris-HCI pH 7.2 com 3mM EDTA

Passos:
I: CTI Aniónica No.1
II: C Afinidade
IV: Dessalinização (Desalting)
V: CTI Aniónica No.2
VI: Ultrafiltração
VII: CEM (Exclusão M.)
VIII: Dessalinização Final (Final Desalting)

Step HBsAg Purity HBsAg Yield

mg/mL % partial total
% %
S.M. 0.214 20 - 100
I 0.158 22 98 98
II 0.693 94 64 63
IV 0.465 94 102 64
V 0.692 97 74 47
 VI 9.315 97 90 43
VII 3.570 98 95 41
VIII 1.116 98 97 39

Neste artigo também encontramos dimensões da cromatografia de troca iónica, em

termos de volume utilizado e tempo de processo (Tabela 4).

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ISOLATION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN (HBsAg) BY AFFINITY CHROMATOGRAPHY ON

ANTIBODY-COATED IMMUNOADSORBENTS

Não tem nada de interesse

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Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals

Dá-nos uma boa explicação da tecnologia e do impacto das diversas fases do processo
de IEC. Interessante para aprofundar a tecnologia se necessário. Nada especifico em
relação HBsAg.

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Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen

from a recombinant Chinese hamster ovary cell line

Aqui foi feito o estudo de como melhorar a eficiencia da IEC.

Fala-se de colocar na fase móvel PEG, pois retém-se mais proteínas, todavia das que
têm maior peso molecular.

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Algo que achei importante para conservação das células.
MAS ACHO QUE TEM QUE SE PERGUNTAR AO JORGE O EFEITO QUE ISTO PODE TER.

Os sobrenadantes da cultura de células coletados foram centrifugados (4000 × g, 4C,

30 min) para remover os restos celulares e concentrados por ultrafiltração ou
precipitados por 45% de sulfato de amônio saturado e, em seguida, armazenados na
presença de 0,05% de mertiolato a 4 ◦C até uso posterior.
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O rHBsAg foi purificado, com alguns ajustes. Ao sobrenadante da cultura de células

(3000 ml de amostra contendo 6,0 g de proteína) foi adicionado 8% (p / v) de
sulfato de amónia seguido de carregamento em uma coluna HIC (Cromatografia de
Interação Hidrofóbica) (Butyl-S Sepharose 6 FF, 70 mm x 55 mm ID , CV = 180 ml)

Pré-equilibrado:
- Buffer A [fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0, contendo 8% de sulfato de amônio, p /
v].
Eluição:
- Buffer B 100% (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0) e isopropanol 30% (v / v) em
sequência. A taxa de fluxo foi de 58 cm / h controlada por AKTAexplorer (1st IEC) e
o comprimento de onda de detecção foi estabelecido em 280 e 260 nm.

As frações eluídas contendo o HBsAg, conforme determinado por ensaio de

imunoabsorção enzimática (ELISA), foram reunidas e dessalinizadas por
ultrafiltração usando uma membrana de corte de peso molecular de 100 kDa.

Finalmente, a amostra dessalinizada foi carregada em uma coluna IEC (coluna DEAE
Sepharose FF, 75 mm x 26 mm ID, CV = 40 ml)

Pré-equilibrada:
- Buffer B (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0)

Eluíção:
- Passo a passo com 12 e 100 % do Buffer C (fosfato de sódio 20 mM pH 7,0, NaCl
1,0 M adicionado) em sequência.

A taxa de fluxo foi de 50 cm / h.

No procedimento IEC de adição de PEG, PEG com pesos moleculares 600, 2.000, 6.000 e
10.000, respectivamente, em diferentes concentrações (0, 1, 4, 16%), foram
adicionados aos buffers B e C durante a cromatografia de troca iónica.

A tabela 1 tem uma avaliação de IEC por eluição de NaCl gradiente em etapas.

Tambem se encontra neste artigo que a utilização de PEG de elevado peso molecular
promove a recuperação de HBsAg

Elution gradient HBsAg recovery (assay by ELISA %)

12% buffer B 41.4 ± 4.2
15% buffer B 57.3 ± 3.5
15% buffer B + 1%PEG 10000 74.1 ± 5.5

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