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THÈME : Des débuts de la génétique aux enjeux actuels des biotechnologies Niveau : Spécialité terminale S

TP ENZYMES DE RESTRICTION, OUTILS DE LA BIOLOGIE

MOLECULAIRE

EXTRAIT DU BO:
Notions et contenus :
La révolution technologique du début des années 70.
L’utilisation des enzymes de restriction ouvre la voie du clonage des gènes et de leur séquençage. En
contribuant à une évolution importante du concept de gène et de la perception du polymorphisme, elle
fait entrer la génétique dans l’ère des biotechnologies.
Activités envisageables :
Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction et électrophorèse.

CADRE PÉDAGOGIQUE :
Avant d'étudier la transgenèse et la construction d’organismes génétiquement modifiés (OGM) avec
l’insertion d’un gène dans le génome d’une espèce receveuse, on cherche à comprendre la technique
d’isolement d’un gène à l’aide de ciseaux moléculaires (les enzymes de restriction) et l’identification de
ce dernier après coloration et électrophorèse.

Objectifs de méthode:
o Réaliser techniquement en suivant un protocole
o puis adopter une démarche explicative

Objectifs de connaissances :
o Les enzymes de restriction permettent de découper l’ADN et de réaliser des manipulations des gènes.

Plusieurs possibilités d’organisation de la classe:

 Possibilité n°1 :
1- Démonstration
2- Présentation résultats préparés à l’avance
3- Travail sur logiciel

 Possibilité n°2 :
1- Démonstration ou un élève remplit 1 puits soit 6 élèves
2- Pendant le temps de latence due à la migration de 45 min ( maxi) : travail sur logiciel

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Coin laboratoire et matériel:

 Référence : Kit Pierron www.pierron.fr

Composition du kit de produits

chimiques Ref.13914

- 2 doses pour préparer 2 gels

d’agarose

- Tampon Tris acétate EDTA ou

tampon TAE
pour préparer le gel et pour remplir la
cuve à électrophorèse

- Colorant pour gel d’agarose (à

utiliser en fin de manipulation après
l’électrophorèse)
Réf. 13913

- ADN de phage λ digéré par Hind III pour

remplir 6 puits Réf. 00084

- ADN de phage λ digéré par EcoR1 pour remplir

6 puits Réf. 00083

- Bleu de dépô t

- Solution de dépôt

 le matériel de laboratoire indispensable

Une alimentation (elle peut alimenter 2 cuves d’où 2 gels) Réf. 13176
cuve à électrophorèse spécifique pour gel d’ADN Réf. 13340
solution tampon Réf. 13114
gel d’agarose Réf. 13914
colorant d’ADN Réf. 13914
colorant pour le suivi de la migration Réf. 13913
boîte de coloration des gels (un récipient quelconque suffit) Réf. 01626
micropipette 100 microlitres avec cônes Réf. 13061 et Réf. 13065

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PRINCIPE:
- L’ADN est une molécule acide, dans un tampon pH elle sera chargée négativement.
- L’ADN migre dans un gel d’agarose immergé dans un tampon soumis à un courant électrique.
- Les molécules d’ADN se dirigent vers le pôle positif (anode) plus ou moins vite en fonction de la taille
des fragments. Plus les fragments sont petits, plus ils se déplacent rapidement dans le gel.

Comment agissent les enzymes de restriction ?

Elles digèrent la molécule d’ADN en fonction des séquences nucléotidiques reconnues. On peut l’assimiler à
des ciseaux moléculaires.

Comment suivre la migration des fragments d’ADN ?

Grâce au bleu de dépôt qui est un colorant permettant de suivre visuellement l’avancée de la migration.
Il est constitué de deux substances : le bleu de bromophénol et le xylène cyanol :
Il alourdit les séquences d’ADN qui coulent mieux au fond du puits.
Le bleu de bromophénol marque le front de migration tandis que le xylène cyanol suit les dernières
séquences d’ADN qui ont migré.
Ainsi le bleu de dépôt permet de repérer l’évolution des séquences dans le gel et de savoir quand stopper la
migration.

Comment visualiser les fragments d’ADN séparés ?

Après migration, l’ADN est coloré en bleu par la solution de dépôt.

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PROTOCOLE EXPERIMENTAL:
PREPARATION à J-1
 Préparation de 1 litre de tampon TAE
Ajouter 900mL d’eau déminéralisée au 100mL de tampon TAE du kit on obtient 1000mL de tampon TAE prêt
à l’emploi.
 Préparation du gel de migration

Mélanger dans un erlenmeyer l’agarose au tampon TAE

selon les indications de la notice

Passer au micro-ondes puissance 1000W pendant 2 à 3

minutes. Surveiller toutes les 30 secondes l’état du gel, il
doit être transparent et sans grumeaux.

La réussite du TP réside pour une bonne part dans la

qualité du gel.

Le couler dans le moule pourvu d’un peigne.

 Préparation de l’ADN de phage

Dans chaque flacon il y a 60 microlitres d’ADN de phage ce qui permet de remplir 3 puits.
Prélever 20 microlitres d’ADN auxquels on ajoute 10 microlitres de bleu de dépôt. On obtient une solution de
30 microlitres qui sera déposée dans un puits.
 Préparation du colorant du gel
Ajouter 100 ml d’eau distillée au flacon contenant le colorant et agiter pour homogénéiser. 50 ml sont
nécessaires pour colorer un gel. On peut donc colorer 2 gels.

QUELQUES REMARQUES PRATIQUES :

Conseils et astuce : la conservation des produits

Au Réfrigérateur Au Congélateur

 Tampon  Les 3 « ADN » digérés de phage λ

 Colorant du gel  Bleu de dépôt

1- Démouler le gel en enlevant le peigne vers le haut, six puits calibrés sont désormais visibles dans le gel.
2- Placer le portoir à gel dans la cuve

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Aligner les puits sur le trait de repère bleu.

Ce côté représente le pôle négatif.

3- Remplir la cuve de tampon

Verser le tampon jusqu’à ce que le gel soit complètement

recouvert.

Les puits doivent se remplir de tampon

4- Déposer 20 microlitres d’ADN digéré, préalablement mélangé au bleu de dépôt, dans chaque puits grâce
à l’utilisation d’une micropipette

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 Effectuer les dépôts en stabilisant le mouvement par calage des coudes sur la paillasse.
 Ne pas percer le fond des puits !
 Déposer 20µL de chaque solution dans les différents puits :
 Puits 1 : ADN du phage λ digéré par EcoR1
 Puits 2 : ADN du phage λ digéré par HindIII
 Puits 3 : ADN du phage λ digéré par EcoR1
 Puits 4 : ADN du phage λ digéré par HindIII
 Puits 5 : ADN du phage λ digéré par EcoR1
 Puits 6 : ADN du phage λ digéré par HindIII

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5- La migration

 Brancher la cuve.
 La migration doit avoir lieu juste après les dépôts.
 Brancher la cuve au générateur.
 Faire migrer 42 minutes à la tension délivrée par
l’alimentation.
 Le bleu de dépôt permet de suivre la
migration et de juger le moment opportun
pour stopper la manipulation. On peut arrêter
la migration lorsque le bleu de bromophénol
est à 1cm de l’extrémité du gel.

6- Sortie du gel et coloration

 Sortir le gel de la cuve délicatement par glissement (attention aux doigts !).
 Placer le gel dans le colorant pendant 5 minutes en agitant légèrement.

Immerger le gel dans le colorant

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7- Rinçage et décoloration

 Vider le colorant qui reste réutilisable

 Eliminer l’excès de colorant de la surface avec quelques ml
d’alcool à 70% pendant quelques secondes
 Eliminer l’alcool puis rincer à l’eau du robinet plusieurs fois pour
éliminer totalement le colorant

8- Révélation

Puits

1 2 3 4 5 6

Sens de
migration
des
fragments
de
restriction 2 fragments de
restrictions obtenus
avec Hind III

migration obtenue en 41 minutes +

coloration 5 minutes + rinçage à l’eau

On voit apparaître les bandes en quelques minutes mais l’intensité maximale de la coloration s’observe
au bout de quelques heures.

 Si le gel a été trop décoloré, procéder à une nouvelle étape de coloration-décoloration.

 Le gel se conserve ensuite au réfrigérateur pendant deux mois dans un récipient en plastique hermétique avec un petit
peu d’eau au fond (pas trop sinon le gel continue à se décolorer).

 Les gels peuvent être observés sur un rétroprojecteur.

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Activité 1 : Suivre un protocole pour réaliser une électrophorèse de l'ADN

digéré par des enzymes de restriction

1- Démouler le gel en enlevant le peigne vers le haut, six puits calibrés sont désormais visibles dans le gel

2- Placer le portoir à gel dans la cuve et aligner les puits sur le trait de repère bleu. Ce côté représente le pôle
négatif.

3- Remplir la cuve de tampon

Verser le tampon dans la cuve à électrophorèse, le gel doit être complètement recouvert ainsi que les puits.

4- Placer les solutions d’ADN digéré dans chacun des 6 puits grâce à une micropipette
Entraînement à l’utilisation de la micropipette par prélèvement d’eau : 20 microlitres.
Déposer 20µL de chaque solution dans les 6 puits :
Puits 1 : ADN du phage λ digéré par EcoR1
Puits 2 : ADN du phage λ digéré par HindIII
Puits 3 : ADN du phage λ digéré par EcoR1
Puits 4 : ADN du phage λ digéré par HindIII
Puits 5 : ADN du phage λ digéré par EcoR1
Puits 6 : ADN du phage λ digéré par HindIII
Précautions :
Effectuer les dépôts en stabilisant le mouvement par calage des coudes sur la paillasse.
Ne pas percer le fond des puits !

5- La migration
Brancher la cuve
La migration doit avoir lieu juste après les dépôts.
Brancher la cuve au générateur
Faire migrer 30 à 45 minutes en fonction de l’avancée du front de migration. Le bleu de dépôt permet de
suivre la migration et de juger le moment opportun pour stopper la manipulation. On peut arrêter la migration
lorsque le bleu de bromophénol est à 1cm de l’extrémité du gel.

6- Sortie du gel et coloration

Sortir le gel de la cuve délicatement par glissement (attention : mettre éventuellement des gants).
Immerger le gel dans le colorant bleu pendant 5 minutes en agitant légèrement.

7- Rinçage et décoloration
Vider le colorant qui reste réutilisable
Eliminer l’excès de colorant de la surface avec quelques ml d’alcool à 70% pendant quelques secondes
Eliminer l’alcool puis rincer à l’eau du robinet plusieurs fois pour éliminer totalement le colorant.

8- Révélation
On voit apparaître les bandes en quelques minutes mais l’intensité maximale de la coloration s’observe
au bout de quelques heures.

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Activité 2 : Rechercher à l'aide du logiciel ANAGENE comment les enzymes

de restriction ECOR1 et HINDIII coupent l'ADN du phage lambda

Précaution avant le TP : Avoir chargé au préalable au niveau de chaque poste le fichier « Adnphage.edi »
dans Anagène extrait du CD capacités expérimentales.

1- Donner la séquence de bases reconnue par chacune des 2 enzymes, elle apparaît en rouge à l’écran.
2- Quelle est la taille de l’ADN du phage en nombre de nucléotides ?
3- Schématiser une carte de restriction qui intègre un site de coupure. Ce dernier apparaît sous la forme
d’une barre verticale rouge.
4- Consigner dans un tableau à construire :
a. le nombre de sites de coupures,
b. les n°s de site de coupure (compter à partir du nucléotide coupé),
c. le nombre de fragments obtenus,
d. Calculer la taille des fragments.
5- Connaissant le principe de l’électrophorèse qui consiste à séparer des molécules d’un mélange d’après
leur taille grâce à une migration dans un champ électrique du pôle négatif vers le pôle positif, anticiper la
séparation des fragments issus de la digestion par ECOR1 en schématisant les résultats.
6- Confronter au terme de la migration (manipulation de l’activité 1) les résultats réels à ceux traduits par
votre schéma.

Extrait de la fiche technique d’Anagène

Lancer Anagène

 Fichier  ouvrir  cliquer sur « Adnphage.edi »  ok

 Sélectionner les 5 séquences du phage en cliquant sur leur gauche
l’ADN du phage est donné par séquences de 10 000 nucléotides inscrites comme : « lam 1-10 », puis les 10 000
suivants : « lam10-20 », « lam20-30 », etc…
 Traiter (dans le bandeau supérieur)  action enzymatique
 Représentation : cocher « graphique » et « tableau »
 Choisir : sites à 6 bases  sélectionner parmi toutes les enzymes disponibles : « EcoR 1 » et « Hind III » 
Ajouter  Ok
 Choisir : Fenêtre « en mosaïque »
 Sélectionner ensuite (grâce à l’ascenseur) chacune une séquence de l’ADN du phage comme par exemple la 1ère
séquoence «lam 1-10 ».

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