TP 2 Biologie cellulaire 1ère année SNV 2018-2019

TP 2 : LES TECHNIQUES D’ETUDES DE LA CELLULE (partie 2)

En biologie cellulaire, les observations et les mesures peuvent être effectuées à différents
niveaux d’organisation structurale : celui de la cellule entière, celui des organites cellulaires,
celui des membranes biologiques et autres édifices multimoléculaires et enfin celui des
molécules elles-mêmes.

1. LES CULTURES CELLULAIRES

Les cellules sont isolées à partir de certains tissus d’animaux ou de végétaux, puis mises
en culture dans un milieu dont les caractéristiques physico-chimiques sont les plus proches
possible du milieu « naturel » initial dont elles sont issues. (composition, température
oxygénation, lumière, pH…)
Selon leur origine, les cellules se développent en suspension ou en adhérence à un
support. Ces cellules ainsi obtenues, ont l’avantage de constituer un modèle expérimental
simplifié, homogène et stable dans le temps par rapport à un organisme entier.

2. MICROSCOPIE :

Préparation des échantillons :

Observation sur le vivant ou traitement des échantillonspréparations fixées.
- Observation sur le vivant :
Cellules dissociées, entre lame et lamelle
(microscope optique, à fluorescence, contraste de phase)
- Préparation de frottis :
Expansion cellulaire étalée sur lame et lamelle
Fixation des cellules
Déshydratation
Coloration au fluorochrome
(microscope optique, à fluorescence )
Préparation de coupes

3) Technique histologique de préparation de coupes pour la microscopie optique (figure

Objectif : obtenir des coupes très fines, que la lumière puisse traverser, la limite de la
définition de la microscopie photonique est de l’ordre de 0,2 microns
Les étapes de cette technique sont les suivantes :
A) Prélèvement :
Anesthésier l’animal
Disséquer l’animal et prélever une partie de l’organe à étudier.
B) Fixation : elle permet de préserver définitivement les structures dans un état proche du
vivant. Le fixateur provoque la précipitation ou la coagulation des macromolécules. La
fixation doit être rapide pour éviter toute lyse cellulaire.
Exemples : fixateur de Bouin, fixateur de Carnoy ….
C) Inclusion dans la paraffine :
Elle donne à la pièce une consistance assez dure pour permettre la coupe.
La paraffine est une substance liquide qui fond à 56 °C pour qu’elle puisse totalement
imprégner les tissus, il faut donc remplacer l’eau de ces derniers par une substance
liposoluble.

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On commence par déshydrater la pièce dans des bains d’alcools de degrés croissant afin de
remplacer l’eau par l’alcool. Dans un second temps, l’alcool est remplacé par un solvant
organique (benzène, toluène, xylène), à la fois soluble dans l’alcool et dans la paraffine.
Enfin, la pièce est immergée dans la paraffine liquide, qui va substituer au solvant.
La paraffine durcira par simple refroidissement. Une fois la pièce prise en masse, elle pourra
être coupée sans distorsion.
D) Réalisation des coupes :
Les blocs de paraffine contenant la pièce sont découpés en fines tranches (2 à 8 microns) à
l’aide d’un microtome, qui comporte un rasoir d’acier.
Les coupes sont déposées sur une lame de verre imprégnée d’eau albumineuse chauffée à 37
°C, qui les colle à la lame.
E) Coloration
Pour que les coupes puissent être colorées, il faut probablement remplacer la paraffine par
l’eau qui occupait initialement sa place. Les lames sont donc immergées dans un solvant
organique, puis dans des alcools de degrés décroissants et enfin dans l’eau.
La coloration des coupes se fait soit :
- Topographiquement pour observer des structures biologiques,
- Ou cytochimiquement pour mettre en évidence la présence de certaines molécules.

Enfin les coupes sont à nouveau déshydratées puis montées sur une fine lamelle en verre et
collées sur la lame, ce qui permet de les conserver très longtemps.

4) Technique cytologique ou technique de coupes minces (pour la microscopie

électronique) :
But : obtenir à partir d’un échantillon parfaitement conservé des coupes suffisamment minces
(500 à 700 A°) pour être transparentes aux électrons, et suffisamment contrastées pour donner
une image nette à l’écran.
Les différentes étapes :
A) Prélèvement :
B) Fixation
Afin de conserver (après la mort) des ultrastructures cellulaires sans altération (c'est-à-dire
proches du vivant), on fixe les cellules in vivo à l’aide de :
- Produits fixateurs : tetroxyde d’osmium, glutaraldéhyde
- Agents physiques : propane liquide (- 196 °C)
Il s’agit d’une étape critique qui conditionne le succès de l’étude cytologique.
C) Rinçage :
Dans le but d’éliminer le fixateur en lui substituant une solution de même pH, plusieurs
rinçages successifs sont à réaliser.
D) Déshydratation
Il s’agit de débarrasser les pièces de leurs eaux en les plongeant dans des bains d’alcool à
concentrations croissantes ou dans de l’acétone.
Dernier solvant : oxyde de propylène : solvant de résine.
E) Inclusion :
C’est le durcissement des échantillons après le remplacement du milieu intracellulaire aqueux
par un milieu solide (résine).
F) Durcissement des coupes ultra minces
- Fragmenter l’échantillon en coupes de 500 à 700 °A d’épaisseurs
- Taille des blocs,
- Ultramicrotomie,

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- Confection des coupes automatiques,

- Recueil des coupes sur une grille métallique.
G) Coloration
Augmenter le contraste des objets biologiques en leur associant des sels de métaux lourds
(acétate d’uranyle, citrate de plomb, nitrate d’argent…)

5) La technique de cryodécapage :
Cette technique de préparation du matériel par la microscopie électronique est de plus en plus
utilisée en biologie cellulaire, en particulier pour l'étude des membranes.
On congèle d'abord la cellule dans de l'azote liquide (-196°C). Le processus est si rapide que
les structures les plus fines du cytoplasme ne sont pratiquement pas altérées. Une cellule ainsi
surgelée est très cassante; quand on la fracture à l'aide d'une lame de métal, la ligne de cassure
tend à suivre les zones de moindre résistance qui sont précisément la surface interne des
membranes. On laisse un peu d'eau s'évaporer de la surface pour en accentuer le relief
(décapage). Après on l'examine au microscope électronique par la méthode de la réplique.
La fabrication d'une réplique en microcopie : la surface de l’objet est recouverte d'une
mince couche de métal lourd, opaque aux électrons. Ce métal est ensuite recouvert d'un film
de carbone transparent aux électrons puis la réplique ainsi formée est libérée pour l'examen au
microscope.

6- Fractionnement cellulaire (figure 4)

- Principe :
L'ultracentrifugation permet de séparer les organites et les enclaves cellulaires en fonction de
leurs coefficients de sédimentation. Ces derniers dépendent de la taille de la particule, sa
forme, sa densité et de la viscosité du milieu où elle se trouve
- Réalisation :
A) Homogénéisation

L'ultracentrifugation est précédée par une étape indispensable qu’est l'homogénéisation. Elle
pour effet la libération les organites et les enclaves cellulaires a partir de fragments de tissus
broyés en suspension dans une solution de saccharose. Après sédimentation des éléments du
tissu conjonctif, des débris cellulaires et des cellules intactes, le surnageant est recueilli et
centrifugé.
B) Fractionnement :

On soumet le tube à une force centrifuge pouvant aller jusqu'à 300 000 fois la force de la
gravité. La vitesse de sédimentation maximale est presque, immédiatement atteinte

Ultracentrifugation différentielle : c’est une série de centrifugations à des vitesses

croissantes qui permet de séparer différentes structures (organites) selon leurs vitesses de
sédimentation propres. Les structures qui sédimentent plus vite se trouvent dans le fond du
tube et forment le culot. Les autres, restées en suspension, forment le surnageant.
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- Centrifugation sur gradient de sédimentation : un gradient de viscosité (ou de densité) est
artificiellement réalisé dans le tube (exemple : la solution de saccharose). La centrifugation
aboutit à la formation de bandes correspondant à l’accumulation des structures de densités
voisines. Cette technique est plus fine car elle met en jeu à la fois la vitesse de sédimentation
et la densité de la structure à isoler.

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7- L’autoradiographie

Les isotopes sont employés en biochimie pour marquer des molécules, suivre des réactions ...
On cherche souvent à localiser la présence de ces molécules marquées à un endroit précis : sur
un gel d'électrophorèse, dans un tissu ou une cellule ... L'autoradiographie est une méthode
permettant la détection qualitative de matériel radioactif fixé sur un substrat solide : gel de
polyacrylamide, nitrocellulose, plaque de chromatographie sur couche mince ... Cette matrice
peut alors être mise en contact avec un film (généralement à rayons X). Les radiations émises
(particules ou rayons ) impressionneront alors le film vis-à-vis leur lieu d'émission. Le
développement du film permet de localiser les endroits où est situé le traceur radioactif. En
microscopie, les films traditionnels sont moins facilement utilisables : on emploie alors des
émulsions photographiques qu'on dépose directement sur des coupes histologiques.

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