Practicas Medios de Cultivo y Pruebas de Identificación - 2020 - 2021

PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS
MODULO: ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS

2020-2021
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
Nombre: ………………………………………………………………………………………………..
Módulo: Ensayos Microbiológicos
2
Inmaculada Reillo Escudero
INDICE:
INDICE: ................................................................................................................................................. 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN EN PLACAS. ..................... 4
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN EN TUBOS......................... 8
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: IMViC .................................................................................................. 13
PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA: KIA.................................................................... 18
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: UREASA, ONPG, LDC, REDUCCIÓN DE NITRATOS Y
FENIALANINADESAMINASA ........................................................................................................ 22
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: OXIDASA Y CATALASA ...................................................... 28
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: DNAsa ...................................................................................... 32
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: COAGULASA ......................................................................... 34
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: HEMÓLISIS ............................................................................. 36
PRUEBAS DE SESIBILIDAD BACTERIANA: ANTIBIOGRAMA ............................................... 38
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS CON API 20 E (ó API 10S). ................................. 42
PRUEBA DE OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN (HUHG LEIFSON). METABOLISMOS
HIDROCARBNADO. ......................................................................................................................... 44
PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE AZÚCARES. METABOLISMO HIDROCARBONADO. ... 46
3
Fecha:
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN EN PLACAS.
OBJETIVO/S:
- Aprender a preparar medios de cultivo, esterilizarlos y distribuirlo en placas.

- Aprender el fundamento del autoclave.
MATERIAL Y REACTIVOS:
- Mechero bunsen
- Medios completos deshidratados
- Placas petri 90 mm de diametro
- Agua destilada
- Probetas
- Matraz erlenmeyer
- Autoclave
PROCEDIMIENTO:
- Preparar todo el material necesario.

- Leer las instrucciones que figuran en el envase del medio de cultivo deshidratado y
respetarlas. En la etiqueta se exponen las condiciones de reconstitución del medio,
indicando los gramos necesarios para elaborar 1 litro de medio de cultivo, así como todas
las condiciones a que debe ser sometido.
- Decidir si el medio se va a depositar en placas de petri o en tubos.
o Placas de Petri: se suelen usar placas de 90 mm de diámetro para uso general y
placas de 55 mm para técnicas de filtración por membrana. Para lograr un espesor
adecuado del medio en la placa Petri habrá que depositar los siguientes ml de
medio:
 Si se desea obtener una altura de 2 mm en una placa de Petri de 90 mm de
diámetro habrá que echar 12 ml de medio por placa. Si la placa tiene
55mm de diámetro se añaden 6 ml de medio por placa.
 Cuando la altura requerida es de 3 mm por placa (es lo ideal) y esta es de
90 mm de diámetro, se depositan 20 ml de medio por placa y si la placa
tiene 55 mm de diámetro, 9 ml por placa.
o Tubos: se suelen usar tubos de cultivo de 200x20 ó de 180x18. Según los tubos a
utilizar, se calculan los mililitros correspondientes, habitualmente entre 10 y 20
ml.
- Calcular los gramos necesarios de medio de cultivo deshidratado que se deben pesar para
la cantidad de medio que se desea. Para ello se deben seguir las siguientes pautas:
o Establecer cuántos tubos o placas se necesitan.
o Conocer la capacidad de cada tubo o placa.
o Averiguar cuantos ml de medio se deben preparar.
o Calcular los gramos de polvo de medio de cultivo que se deben pesar.
- Escribir sobre el matraz erlenmeyer con un rotulador resistente al agua, indicando el
medio de cultivo de que se trata, la fecha de preparación y quién lo elabora.
- Pesar el medio de cultivo deshidratado en una balanza que tenga al menos una
sensibilidad de 0,01 g. (en vidrio de reloj o papel aluminio).
4
- Añadir en el matraz erlenmeyer la mitad del agua desionizada fría necesaria, según los
cálculos realizados. (nunca se utilizarán matraces erlenmeyer o vasos de precipitados para
medir líquidos). Y añadir el medio de cultivo deshidratado pesado, añadir el resto de agua.
- Dejar en reposo el medio de cultivo en el agua para favorecer la disolución posterior del
medio.
- Disolver completamente. Utilizar placas calefactoras (con agitador magnético) o mechero
Bunsen (varilla para agitación) como medios de calefacción. (en el caso de medios
sólidos).
- Llevar a ebullición si es un medio sólido o semisólido.
- Ajustar el pH (sólo en el caso de trabajar con componentes deshidratados sueltos).
- Esterilizar en autoclave el medio de cultivo ya preparado y contenido en el erlenmeyer,
tapado con algodón graso y cubierto con papel de aluminio. La mayoría de los medios se
esterilizan en autoclave a 121ºC, 1 atmósfera de presión manométrica, durante 15 minutos
(condiciones estándares). Hay que tener en cuenta que hay medios que no se pueden
esterilizar en autoclave.
- Identificar las placas en su cara inferior por el lado externo con un rotulador de escritura
resistente al agua, identificando el medio de cultivo, la fecha de preparación y el técnico
que lo elaboró.
- Distribuir el medio, una vez esterilizado, en placas de Petri estériles cuando se encuentre a
una temperatura aproximada de 45ºC; esto se evidencia cuando se pueda mantener la
palma de la mano sobre el matraz erlenmeyer sin notar excesivo calor. Para hacer la
distribución en las placas se puede utilizar el propio matraz erlenmeyer, frascos
dosificadores o pipetas graduadas estériles. Las manipulaciones de vertido en placa se
harán alrededor de la llama del mechero Bunsen, en la zona de seguridad, evitando la
formación de burbujas. Antes de echar el medio de cultivo a las placas conviene
homogeneizar el contenido del matraz. En el caso que se prevea que se va a tardar en
dispensarlo hay que atemperarlo adecuadamente en un baño termostatizado a 45 ºC. Si se
utiliza frasco dosificador de medios, conviene autoclavar el medio en el interior del frasco
y posteriormente rellenar las placas.
- Dejar reposar las placas en una superficie horizontal estable, donde pueda solidificar
correctamente el medio. Una vez dispensado, las placas no deben moverse hasta la total
solidificación, con el fin de evitar la formación de ondulaciones en la superficie o el
desbordamiento de la placa.
- Cuando el medio haya solidificado completamente, se procede al secado de las placas
dejándolas a temperatura ambiente, cerradas con la superficie del medio hacia abajo sobre
un plano adecuado, durante unas 24 horas.
- Almacenar las placas que contienen el medio de cultivo en el frigorífico en posición
invertida, con la superficie del medio de cultivo mirando hacia abajo, a una temperatura
entre 4 y 7ºC. En estas condiciones el medio puede mantenerse en buenas condiciones
entre 4 y 6 semanas. Hay que evitar que el medio se congele, ya que habría que desechar
las placas.
- Efectuar el control de calidad. Se efectúa incubando una placa con el medio de cultivo en
posición invertida, en las mismas condiciones que vayamos a trabajar con el estudio
microbiológico, pero sin realizar inóculo alguno. No se debe obtener ningún crecimiento
bacteriano para considerar las placas como válidas.
- Atemperar los medios de cultivo almacenados en el frigorífico antes de utilizarlos.
medio.
5

sólidos).
ESQUEMA:
FUNDAMENTO:
Un medio de cultivo cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de
pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso
pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones.
Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya
preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo
es variado: identificación, multiplicación, etc.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
CALCULOS para la PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO A PARTIR DE MEDIOS

COMPLETOS DESHIDRATADOS:
MEDIO DE CULTIVO TSA:

Ingredientes:
6
Modo de preparación:
Nº de placas a preparar:
Nº de tubos a preparar:
Volumen para cada tubo:
Volumen para cada placa:
Volumen total a preparar:
Gramos de medio sólido deshidratado a pesar:
OBSERVACIONES Y COMENTARIOS:
TRATAMIENTO DE RESIDUOS:
7
Fecha:
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN EN TUBOS.
OBJETIVO/S:
- Aprender a preparar medios de cultivo, distribuirlo en tubos y esterilizarlos.

- Aprender el fundamento del autoclave.
- Mechero bunsen
- Medios completos deshidratados
- Tubos y tapones
- Agua destilada
- Probetas
- Matraz erlenmeyer
- Autoclave
PROCEDIMIENTO:
- Preparar todo el material necesario.

- Leer las instrucciones que figuran en el envase del medio de cultivo deshidratado y
respetarlas. En la etiqueta se exponen las condiciones de reconstitución del medio,
indicando los gramos necesarios para elaborar 1 litro de medio de cultivo, así como todas
las condiciones a que debe ser sometido.
- Decidir si el medio se va a depositar en placas de petri o en tubos.
o Placas de Petri: se suelen usar placas de 90 mm de diámetro para uso general y
placas de 55 mm para técnicas de filtración por membrana. Para lograr un espesor
adecuado del medio en la placa Petri habrá que depositar los siguientes ml de
medio:
 Si se desea obtener una altura de 2 mm en una placa de Petri de 90 mm de
diámetro habrá que echar 12 ml de medio por placa. Si la placa tiene
55mm de diámetro se añaden 6 ml de medio por placa.
 Cuando la altura requerida es de 3 mm por placa (es lo ideal) y esta es de
90 mm de diámetro, se depositan 20 ml de medio por placa y si la placa
tiene 55 mm de diámetro, 9 ml por placa.
o Tubos: se suelen usar tubos de cultivo de 200x20 ó de 180x18. Según los tubos a
utilizar, se calculan los mililitros correspondientes, habitualmente entre 10 y 20
ml.
- Calcular los gramos necesarios de medio de cultivo deshidratado que se deben pesar para
la cantidad de medio que se desea. Para ello se deben seguir las siguientes pautas:
o Establecer cuántos tubos o placas se necesitan.
o Conocer la capacidad de cada tubo o placa.
o Averiguar cuántos ml de medio se deben preparar.
o Calcular los gramos de polvo de medio de cultivo que se deben pesar.
- Escribir sobre el matraz erlenmeyer con un rotulador resistente al agua, indicando el
medio de cultivo de que se trata, la fecha de preparación y quién lo elabora.
- Pesar el medio de cultivo deshidratado en una balanza que tenga al menos una
sensibilidad de 0,01 g. (en vidrio de reloj o papel aluminio).
8
- Añadir en el matraz erlenmeyer la mitad del agua desionizada fría necesaria, según los
cálculos realizados. (nunca se utilizarán matraces erlenmeyer o vasos de precipitados para
medir líquidos). Y añadir el medio de cultivo deshidratado pesado, añadir el resto de agua.
medio.
sólidos).
- Identificar los tubos de ensayo, cerca de la abertura, con los mismos datos que se pusieron en
las placas.
- Distribuir el medio en caliente. Añadir los mililitros que correspondan a cada tubo mediante
una pipeta adecuada o un dosificador de medios. Cerrar los tubos con algodón graso, o con un
tapón metálico tipo capucha. Si se cierra con tapón de rosca, no hay que cerrar
herméticamente para favorecer el proceso de la esterilización. Si se cierran los tubos con
algodón graso, el tapón debe quedar firme, de modo que no se suelte el tubo si lo sujetamos
por el algodón.
- Esterilizar los tubos en autoclave teniendo en cuenta las mismas precauciones que para la
distribución en placa.
- Enfriar los tubos a temperatura ambiente, según las siguientes pautas:
a. Tubos con medio líquido: Enfriar los tubos reposando en una gradilla en posición
vertical.
b. Tubos con agaragar: Enfriar en posición vertical de la misma manera que los tubos
con medio líquido.
c. Tubos con agar inclinado. Disponer los tubos en la mesa de trabajo sobre un soporte
que mantenga la posición inclinada, de modo que el fondo del tubo quede cubierto
completamente por el medio y éste no llegue hasta la abertura.
- Almacenar en el frigorífico, a una temperatura entre 4 y 7 ºC, hasta el momento de ser
utilizados. De esta manera se conservan bien varios meses.
- Efectuar el control de calidad. Se incuba un tubo con el medio de cultivo en las mismas
condiciones que se vaya a trabajar con el estudio microbiológico, pero sin realizar inóculo
alguno y posteriormente se comprueba la ausencia de crecimiento de microorganismos.
- Atemperar el tubo de cultivo antes de usarlo.
ESQUEMA: (VER pag 7)
FUNDAMENTO:
Un medio de cultivo cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de
pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso
pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones.
Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya
preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo
es variado: identificación, multiplicación, etc.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
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CALCULOS para la PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO A PARTIR DE MEDIOS

COMPLETOS DESHIDRATADOS:
AGUA DE PEPTONA:
Ingredientes:
CLARK & LUBS (MR-VP). Rojo de metilo – Voges Proskauer

Ingredientes:
10

AGAR CITRATO DE SIMMONS

Ingredientes:
11
CUESTIONES:
1. ¿Qué es un medio de cultivo?
2. ¿Por qué deben esterilizarse los medios de cultivo?
3. ¿Por qué el recipiente donde se preparan los medios de cultivo deben de ser de una
capacidad de 2/3 del volumen total a preparar de medio de cultivo?
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Fecha:
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: IMViC.
OBJETIVO/S:
- Aprender a sembrar en tubos con medio líquido y en slant (siembra en estría)
- Realizar pruebas bioquímicas IMViC
- Interpretar el resultado de las pruebas IMViC
- Medios de cultivo
o 1 tubo con 2 ml de agua de peptona
o 2 tubos con 2ml de Clark & Lubs (RM-VP)
o 1 tubos con 9 ml de Agar Citrato de Simons (en slant ó pico de flauta)
- Asa de siembra
- Mechero bunsen
- Gradilla
- Matraz erlenmeyer, rejilla y trípode
- Estufa
- Reactivo Kovacs
- Reactivo rojo de metilo
- Reactivos VP1 y VP2.
PROCEDIMIENTO:
Prueba del indol:
Se pueden seguir dos métodos, método de Kovacs o método Ehrlich. Vamos a realizar el primero
de ellos:
Método de Kovacs:
- En un tubo con 2 ml de agua de peptona se siembra el microorganismo problema. Incubar a

37ºC, durante 24-48 horas.
- Añadir al cultivo 5 gotas de reactivo indol de Kovacs. El reactivo indol de Kovacs debe ser
fresco, pues con el tiempo cambia el color de amarillo a castaño y pierde sensibilidad. Puede
conservarse en nevera a 4-10ºC algunos días, debe conservarse en frasco color topacio con
cierre hermético.
- Agitar suavemente el tubo y dejarlo unos minutos en reposo.
Prueba de Rojo de metilo:
- En un tubo de ensayo que contenga medio de Clark y Lubs se siembra el microorganismo

problema. El aumento de la concentración de glucosa no acelera la reacción.
- Se incuba a 37ºC durante 48-72 horas. Se debe incubar al menos 48 horas, pues tiene que
transcurrir un tiempo hasta que los microorganismos fermenten toda la glucosa y formen los
ácidos estables. En un tiempo de 18-24 horas de incubación los resultados serán falsamente
positivos ya que no habrán tenido tiempo para metabolizar los productos ácidos iniciales
procedentes de la fermentación de la glucosa.
13
- A este cultivo se le añaden unas gotas (5) de indicador rojo de metilo u otro cuyo intervalo de
viraje sea apropiado. El rojo de metilo a pH = 4,5 es de color rojo, a pH 6,3 es amarillo.
Cambiará de color cuando el pH del medio sea inferior a 4,5.
- Leer después de añadir el indicador.
Prueba de Voges Proskauer:
- En un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra el microorganismo

problema.
- Se incuba durante 48 horas a 37ºC.
- Se añade: 1º 0,5 ml de la disolución de alfa naftol; 2º 0,5 ml de la disolución de hidróxido
potásico. El orden de la adición es importante, pues si se altera puede dar resultado falsos.
- Agitar e inclinar casi horizontalmente el tubo para que se favorezca la oxidación de la
acetoína.
- Reposar el tubo 10-15 minutos e interpretar los resultados.
Prueba del citrato:
- Preparar dos tubos con agar Citrato de Simons (tubos con agar inclinado).
- Inocular un tubo con microorganismo y el otro va a servir de control negativo. El inóculo no
debe ser muy grande para evitar falsos resultados positivos.
- Incubar 24-48 horas a 37ºC dejando los tubos destapados para que se desprenda el anhídrido
carbónico.
- Leer los resultados a las 48 horas de incubación.
ESQUEMA:
INDOL
Agua 24 h 5 gotas
peptona Anillo rosa (+)
37ºC Kovac’s
2 ml
ROJO DE METILO
5 gotas
48 h
Rojo (+)
Clark- 37ºC Rojo de metilo
Lubs 2 ml
14
VOGES PROSKAUER
48 h
Clark- VP1 (-naftol) 6 gotas
Lubs 37ºC Rojo (+)
2 ml VP2 (KOH 0,1M) 2 gotas
Esperar 15 min.
CITRATO
24-48 h
Azul (+)
37ºC
FUNDAMENTO:
INDOL: Con esta prueba pretendemos determinar si las enterobacterias pueden tomar el triptófano
que es un aminoácido que lleva en su composición el agua de peptona y transformarlo en indol o por
el contrario no hacerlo. Si lo hacen serán bacterias INDOL POSITIVAS y si no lo hacen INDOL
NEGATIVAS. La forma de determinarlo es sembrando en un tubo con 2 ml de agua de peptona la
bacteria a estudiar incubar durante 24 h a 37 ºC y añadir el reactivo Kovacs; si se forma anillo rojo en
la superficie indicará que se ha producido INDOL y si el anillo es amarillo indicará que no se ha
producido INDOL.
ROJO DE METILO:
Muchas bacterias de la familia Enterobacteriaceae para obtener la energía necesaria para sus
reacciones metabólicas utilizan la fermentación ácido-mixta de los hidratos de carbono
produciéndose ácidos como productos finales tales como: ácido succínico, ácido acético, alcohol
etílico, etc., según el siguiente esquema:
Glucosa  Ácido pirúvico Ácido láctico

Ácido fórmico
Acetil coenzima A  Ácido succínico
Ácido acético
Alcohol etílico
Mediante esta prueba llamada del rojo de metilo se observa el cambio de color del medio con
indicador (rojo de metilo) debido a la acidificación de éste.
Los microorganismos rojo de metilo positivos acidifican el medio por aparición de ácidos estables.
Esta fermentación es característica de las siguientes enterobacterias: Escherichia, Proteus, Yersinia,
Salmonella, Shigella, Vibrio.
15
VOGES PROSKAUER:
Algunas enterobacterias realizan un tipo de fermentación denominada butanodiólica también llamada

butilenglicólica o acetoínica. En esta fermentación a partir de la glucosa se producen productos
neutros.
Glucosa  ácido pirúvico  acetoína (acetil metil carbinol) 2,3 butanodiol ; diacetilo
Se observará en esta prueba la capacidad de un microorganismo de producir, en presencia de oxígeno
atmosférico y álcali, un compuesto llamado diacetilo que generará un compuesto coloreado al
añadirle los reactivos apropiados.
Esta prueba es característica de los siguientes géneros de bacterias:
Klebsiella, Serratia, Enterobacter, la mayoría de especies de Erwinia, no todas las especies de
Aeromonas.
CITRATO:
Se observará el crecimiento de microorganismos y el viraje de color del indicador incorporado al
medio por la alcalinización de éste. Se utiliza un medio de cultivo que contenga citrato como fuente
de carbono, sales de amonio inorgánicas como fuente de nitrógeno.
Se investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
La alcalinización del medio es debida a la formación de amoníaco a partir de las sales de amonio que
había en el medio. Y la formación de carbonados y bicarbonatos se debe a la degradación del citrato.
RESULTADOS
Microorganismo I M V C
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoniae
Proteus hausseri
Salmonella enteritidis
CUESTIONES:
1. ¿Qué significa que una bacteria es indol positivo?
16
2. ¿Qué significa que una bacteria sea rojo de metilo positivo?
3. ¿Qué significa que una bacteria sea voges proskauer positivo?
4. ¿Qué significa que una bacteria sea citrato positivo?
17
Fecha:
PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA: KIA
OBJETIVO/S:
- Aprender a sembrar en picadura y estría en la superficie en tubo con agar inclinado.
- Aprender a interpretar el resultado obtenido en la prueba
- Tubos con agar de hierro Kligler en slant.
- Hilo de siembra
- Estufa
- Autoclave
- Mechero Bunsen
- Microorganismos
PROCEDIMIENTO:
- De una colonia de microorganismo puro y joven, con un asa se recoge el centro de la
colonia.
- Inocular por picadura y estría un tubo de cultivo con medio KIA en pico de flauta.
- Incubar 18-24 horas a 37 ºC. Leer justamente a las 18-24 horas, si se leyera antes puede
que no se haya producido la suficiente fermentación de la glucosa y la lactosa para
formarse medio ácido capaz de hacer virar el indicador (rojo de fenol) del medio. Si se
leyera más tarde las 24 horas podría dar un resultado falso alcalino pues el
microorganismo habría utilizado la peptona.
ESQUEMA:
Sembrar en superficie 24 h
y picadura Fermentación lactosa (amarillo)
37ºC Fermentación glucosa (amarillo)
Color negro (producción de H2S)
Grietas (producción de gas)
FUNDAMENTO:
Se pueden realizar tres pruebas a la vez:
- Utilización de azúcares, glucosa y lactosa.
- Producción de gas.
- Producción de ácido sulfhídrico.
Estas pruebas se utilizan para la identificación de enterobacterias, según su capacidad de metabolizar
o no la lactosa.
Cuando un microorganismo utiliza como fuente primaria de carbono los azúcares, se acidifica el
medio, porque se forman ácidos orgánicos. Si no utilizan o no tienen en el medio hidratos de
carbono, utilizan proteínas que alcalinizan el medio por la formación de aminas. Las proteínas en
condiciones de aerobiosis se metabolizan mejor por la vía de la descarboxilación oxidativa de los
aminoácidos que en anaerobiosis.
La glucosa se metaboliza mejor que la lactosa porque la estructura molecular de la glucosa es más
sencilla que la de la lactosa. Para que se metabolice la lactosa, el microorganismo debe tener el
enzima -D galactosidasa.
18
Interpretación de los resultados:

Se observarán los tres parámetros siguientes:
- Cambios de pH.
- Producción de gas.
- Producción de ácido sulfhídrico.
Siempre se pondrá un testigo no inoculado.
Cambios de pH:
Se observan por el cambio de color del medio de cultivo. Aparecen dos partes en el tubo, la
superficial y la interior en el fondo (glucosa) y en la zona inclinada (lactosa) pudiendo ocurrir las
siguientes situaciones:
Fermentación de los azúcares: fermentación solamente de la glucosa; glucosa + lactosa -: zona
profunda amarillo (reacción ácida), zona superficial roja (reacción alcalina). Si aparece primeramente
acidificación del medio por la producción de ácidos a partir de la glucosa, el medio de cultivo se
presenta inicialmente de color amarillo entero, pero posteriormente aparece el color naranja en la
superficie del tubo, debido a la alcalinización de la superficie del medio causada por las aminas que
provienen de la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos que forman la peptona. El
microorganismo utiliza primero la glucosa y cuando ésta se ha agotado, utiliza como fuente de
carbono la peptona. Este microorganismo metaboliza la glucosa.
Fermentan glucosa y lactosa +: zona inclinada y zona profunda amarillas. Se acidifica el medio tanto
en la superficie inclinada como en el interior del tubo color amarillo del medio. Estos
microorganismos metabolizan glucosa y lactosa.
No metabolizan ni lactosa ni glucosa: glucosa – y lactosa -: aparece color rojo en el fondo y en la
superficie del tubo inclinado (reacciones alcalinas). En los microorganismos aerobios el tubo aparece
color naranja en la superficie inclinada debido a la alcalinización del medio ocasionada por la
utilización de la peptona, y en la capa profunda no aparece cambio de color por no poderse
desarrollar en ausencia de oxígeno. En los microorganismos anaerobios facultativos se alcaliniza el
medio tanto en la superficie como en la capa profunda. En estos casos no se metaboliza ni la glucosa,
ni la lactosa pero si la peptona.
Si el microorganismo no utiliza ni glucosa, ni lactosa, ni peptona, no se produce cambio de color del
medio en ninguna zona del tubo. No hay cambio de color en todo el tubo. Esto significa que no
metaboliza ni la glucosa ni la lactosa, ni la peptona. pH inicial = 7,4, color naranja del medio.
Producción de gas:
Aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio del fondo del tubo, debido a la
formación de hidrógeno y de anhídrido carbónico.
Producción de ácido sulfhídrico H2S:
- Se manifiesta por el color negro de la capa profunda, o bien por un anillo negro cerca de
la parte superior de la capa profunda, así como por un precipitado negro en la capa
profunda. El color negro puede enmascarar la acidificación del medio.
Para expresar las reacciones producidas en KIA existe un código que es el siguiente.
REACCIONES GÉNERO
A/A Erwinia
A/A,G Escherichia
K/A Shigella
19
K/A Yersinia
K/A, G, H2S Edwarsiella
K/A, G, H2S Salmonella
K/A, G, H2S Citrobacter
K/A, G, H2S Proteus
A/A, H2S Klebsiella
A/A, H2S Enterobacter
A/A, H2S Serratia
A/A, H2S Hafnia
Se expresa primero la reacción producida en la superficie inclinada del medio y luego la reacción
producida en la capa profunda de la siguiente manera:
(K/A) = superficie inclinada alcalina/capa profunda ácida

(A/A) = superficie inclinada ácida/capa profunda ácida
Los símbolos utilizados para expresar las distintas reacciones son:

A: ácido; K: alcalino; G: gas; H2S: ácido sulfhídrico; SC; sin cambio.
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RESULTADOS:
Microorganismo Fermentación Fermentación Producción Producción Resultado

LACTOSA GLUCOSA de H2S de gases
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoniae
Proteus hausseri
Pseudomonas fluorescenes
Salmonella enteritidis
CUESTIONES:
1. Dibuja en un tubo el resultado para un microorganismo que tras la prueba KIA es K/A H2S+
G- .
2. Dibuja en un tubo el resultado para un microorganismo que tras la prueba KIA es A/A H2S- y
Gas+.
21
Fecha:
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: UREASA, ONPG, LDC, REDUCCIÓN DE NITRATOS Y

FENIALANINADESAMINASA
OBJETIVO/S:
- Aprender a sembrar las pruebas en los medios de cultivo apropiados.
- Tubos con medios de cultivo apropiados a las pruebas a realizar.
- Asa de siembra
- Estufa
- Autoclave
- Mechero Bunsen
- Microorganismos
PROCEDIMIENTO:
UREASA: Con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas.
- Sembrar el microorganismo en un tubo con agar urea de Christensen inclinado, (sembrar
la superficie, no la parte profunda).
- Incubar a 37°C hasta detectar cambio de color del indicador, guardarlo durante 6 días, si
no se produce cambio de color se da como prueba negativa.
ONPG:
- Con un asa de siembra a partir de un cultivo puro y joven sembrar el microorganismo a
estudiar en un tubo con 0,5 ml de disolución salina.
- Añadir un disco ONPG.
- Incubar a 37 ºC durante 20-24 horas y observar el color.
22
LDC:
- Se prepara un tubo con caldo Taylor.

- Se inocula el tubo a partir de un cultivo puro y joven del microorganismo problema.
- Se sella con 2-3 ml de parafina estéril.
- Incubar a 37°C durante 18-24 horas.
REDUCCIÓN DE NITRATOS:
- Se toma una muestra con el asa a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas.
- Colocar un tubo de cultivo, con campana Durham, con caldo con nitrato, e inocular con el
microorganismo.
- Incubar a 37°C durante 12-24 horas.
- Si hay gas en la campana indica que los nitratos han sido reducidos a N2 y se termina aquí la
prueba.
- Si no hay gas en la campana, agregar un mililitro de reactivo A y 1 mililitro de reactivo B.
- Si se formara color rojo o rosado antes de 30 segundos será que los nitratos han sido
reducidos y se termina aquí la prueba.
- Si no se formara color se añade al tubo 20 miligramos de polvo de zinc.
23
FENILALANINADESAMINASA:
- A partir de un cultivo joven y puro se inocula por estría el pico de flauta del medio,
utilizando un asa.
- Incubar a 37 º C durante 24 horas.
- Agregar directamente el reactivo tras la incubación, cuatro o cinco gotas, procurando que
se deslice el reactivo sobre la zona inoculada.
FUNDAMENTO:
UREASA:
ONPG:
24
LDC:
REDUCCIÓN DE NITRATOS:
FENILALANINADESAMINASA:
25
RESULTADOS:
Microorganismo UREASA ONPG LDC REDUCCIÓN FENILALANINA

DE NITRATOS DESAMINASA
Escherichia coli
Proteus hausseri
CUESTIONES:
1- ¿Qué significa que un microorganismo sea ureasa positivo?
2- ¿Qué significa que un microorganismos sea ONPG negativo?
3- ¿Qué significa que un microorganismo de postiva la prueba de LDC?
26
4- ¿Qué significa que un microorganismo de positiva la prueba de FDA?
5- ¿Si se realiza la prueba de reducción de nitratos a un microorganismos y tras añadir los

reactivos nit 2 y nit 2 el tubo no cambia de color qué significa?
6- ¿Qué significa qué un microorganismo de la prueba de reducción de nitratos positiva?
27
Fecha:
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: OXIDASA Y CATALASA
OBJETIVO/S:
- Aprender a realizar las pruebas oxidasa y catalasa a cultivos puros de microorganismos
- Aprender a interpretar el resultado obtenido en las pruebas
OXIDASA:
- Hisopos impregnados en reactivo kovacs oxidasa
- Microorganismo a estudio
- Mechero bunsen
CATALASA:
- Portaobjetos.
- Asa de siembra
- Mechero.
- Peróxido de hidrógeno al 30%.
PROCEDIMIENTO:
OXIDASA:
- Se cultiva en una placa de Petri con agar sangre el microorganismo problema. Se puede
emplear otro medio que sea más conveniente para el crecimiento del microorganismo
investigado. Los medios que contengan glucosa pueden inducir a falsos resultados
negativos debido a que la fermentación de la glucosa inhibe la actividad de la oxidasa.
- Sobre una placa Petri vacía y estéril ó portaobjetos, colocar un trozo de papel de filtro
Whatman nº 1 de unos 6 cm2 en el caso de la placa de petri ó de 1 cm2 en el caso de
utilizar portaobjetos. La tira de papel de filtro impregnada con reactivo oxidasa de Kovacs
se puede sustituir por discos comerciales ya preparados, aunque antes de utilizarlos se
deben rehidratar con unas gotas de agua destilada.
- En el centro del papel de filtro dejar caer 2-3 gotas de reactivo oxidasa de Kovacs. No
confundirlo con el reactivo indol de Kovacs.
- Con un asa se toma una colonia de la placa con el cultivo del microorganismo y se
extiende en el papel.
- Se lee el resultado a los 5-10 segundos.
- Se puede realizar esta técnica de otra manera. Añadiendo directamente el reactivo oxidasa
de Kovacs sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre.
Técnica con tiras reactivas oxidasa:
- Tomar una tira oxidasa.

- Con un asa se toma una colonia de la placa con el cultivo del microorganismo y se
extiende sobre la parte reactiva de la tira. (uno de los extremos)
- Se observa si existe o no cambio de color.
28
aparición de color azul (+)
Técnica con Hisopo:
FUNDAMENTO:
OXIDASA: Esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo C oxidasa que

participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno. La oxidasa se
puede definir como el enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxígeno.
O2  H2O
O2  H2O2
Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de

ATP, el oxígeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la
intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria,
produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie microbiana.
Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios
estrictos carecen de ella.
Se determina a través de esta prueba la presencia o ausencia del enzima “citocromo C oxidasa” en el
microorganismo, el cual cataliza el último paso de transferencia de electrones desde un sustrato
orgánico (azúcares, polipéptidos, etc.) al oxígeno.
Para ello se observará el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando está reducido y
coloreado cuando se oxida.
Entre los indicadores más utilizados se encuentra la tetrametilparafenilendiamina, que por acción del
enzima citocromo C oxidasa da un compuesto químico de color azul.
citocromo
Ce-
forma reducida incolora forma oxidada

tetrametilparafenilendia azul
mina
29
CATALASA:
La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos que contienen citocromo.
La catalasa cataliza la reacción siguiente: 2 H2O2  2 H2O + O2 (gas)
El peróxido de hidrógeno es un producto final de la degradación aeróbica oxidativa de los hidratos de
carbono.
La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno descomponiéndolo en agua y oxígeno gas. Si se
acumulase el peróxido de hidrógeno en los microorganismos estos morirían, por ello es fundamental
la presencia en los microorganismos de la catalasa.
RESULTADOS:
Microorganismo OXIDASA
Pseudomonas fluoresecens
Escherichia coli
Microorganismo CATALASA
Staphylococcus epidermidis
Enterococcus faecalis
30
CUESTIONES:
1- ¿Qué caracteriza a un microorganismo catalasa positivo?
2- ¿Qué caracteriza a un microorganismos oxidasa positivo?
31
Fecha:
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: DNAsa
OBJETIVO/S:
- Aprender a realizar la prueba DNasa
- Mechero bunsen
- Asa de siembra
- Placas con agar DNA
- HCl 1N
- Estufa
PROCEDIMIENTO:
- Sembrar, a partir de un cultivo joven y puro con colonias aisladas, en el centro de una
placa agar DNA, en forma de estría estrecha.
- Incubar a 37ºC durante 24 horas, y añadir sobre el cultivo, de forma que se quede
totalmente cubierto, disolución de HCl 1N. Dejar en reposo durante 3-5 minutos.
HCl 1N
24 h
Agar DNasa Agar transparente (+)
37ºC
FUNDAMENTO:
32
RESULTADOS:
RESULTADOS:
Microorganismo DNAsa
Staphylococcus aureus
CUESTIONES:
1- ¿Qué caracteriza a un microorganismo DNAsa positivo?
33
Fecha:
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: COAGULASA
OBJETIVO/S:
- Aprender a realizar la prueba coagulasa
- Mechero bunsen
- Asa de siembra
- Plasma de conejo
- Tubos con 2ml caldo BHI
- Tubos esterilizados pequeños
- Estufa
PROCEDIMIENTO:
- En un tubo de hemólisis estéril, se ponen 0,3 ml de plasma al que añadimos 0,1 ml de

cultivo joven en medio líquido (BHI) del microorganismo problema. Se pueden añadir 2-
3 colonias con asa de cultivo si se parte de un medio sólido y emulsionarlas con el
plasma.
- Mezclar por rotación suave el tubo.
- En baño termostatado incubar a 37ºC y observar cada 30 minutos si se forma el coágulo
inclinando el tubo suavemente. Si a las seis horas no se forma coágulo se deja en la estufa
de cultivo durante 24 horas.
0,1 ml
37ºC
37ºC 0,3 ml plasma de Formación de
conejo EDTA coágulos (+)
BHI 18 – 24 h reconstituido 6h
2 ml
También podemos realizar esta prueba con kits rápidos, por técnicas de aglutinación.
FUNDAMENTO:
34
RESULTADOS:
Microorganismo Coagulasa
CUESTIONES:
2- ¿Qué caracteriza a un microorganismo Coagulasa positivo?
35
Fecha:
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: HEMÓLISIS
OBJETIVO/S:
- Aprender a realizar la prueba de hemólisis
- Microorganismo
- Asa de siembra
- Estufa
- Placas de petri con Agar sangre
PROCEDIMIENTO:
- Sembrar en agar sangre con asa de siembra en el microorganismo a estudiar a partir de un

cultivo joven y puro. La siembra puede hacerse por agotamiento en tres giros.
- Incubar 24 horas a 37 ºC.
- Estudiar el tipo de hemólisis que presenta el microorganismo (hemólisis alfa, beta o
gamma).
24 h
agar sangre agar transparente (+)
37ºC
FUNDAMENTO:
RESULTADOS:
Microorganismo Hemólisis
Bacillus spp
Escherichia coli
36
CUESTIONES:
1- ¿Qué caracteriza a un microorganismo βeta hemolítico?
2- ¿Qué caracteriza a un microorganismo alfa hemolítico?
3- ¿Qué caracteriza a un microorganismo gamma hemolítico?
37
Fecha:
PRUEBAS DE SESIBILIDAD BACTERIANA: ANTIBIOGRAMA
OBJETIVO/S:
- Determinar si un antibiótico es sensible o resistente a un antibiótico

- Aprender a realizar la siembra en cesped
- Microorganismo
- Asa de siembra
- Estufa
- Tubo con caldo BHI (5 ml)
- Placas con agar Müeller Hinton
- Discos de antibióticos
PROCEDIMIENTO:
- Preparar cultivos de 18 horas de las bacterias que hay que ensayar en agar tripticasa soja
(TSA).
- Mediante tinción de Gram si es Gram + o -.
- Inocular 3 ó 4 colonias de las bacterias en 5 ml de caldo de tripticasa soja (TSB) o caldo de
infusión cerebro corazón (BHI) e incubar a 37 ºC hasta que la turbidez sea visible (2-5 horas).
Ajustar la turbidez con disolución salina o el mismo caldo estéril hasta una turbidez
equivalente al estándar 0,5 McFarland.
- Nota: alternativamente, como método más rápido, se puede preparar directamente a partir del
cultivo en el medio de agar de 18 horas, suspendiendo las colonias en disolución salina o
caldo de cultivo estéril, hasta lograr la turbidez equivalente al estándar 0,5 McFarland.
- Utilizando un hisopo de algodón, sumergirlo en el inóculo y eliminar el exceso presionándolo
sobre la pared interna del tubo que lo contiene y por encima del nivel del caldo de cultivo.
- Inocular la superficie de una placa de agar Müeller-Hinton con el hisopo pasándolo
uniformemente por una mitad de la superficie en tres giros de 90 º (técnica de siembra de
Kirby-Bauer). Por último, pasar el hisopo por el reborde de la placa de agar. Dejar secar la
placa semiabierta e invertida durante 4-5 minutos, antes de colocar los discos.
- En función de la tinción realizada, colocar los discos de antibióticos apropiados, sobre la
superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y apretándolos suavemente sobre la
superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de la placa y
lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan las zonas de inhibición
(aproximadamente 20 mm). Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que
comiencen a difundir los antibióticos.
- Incubar la placa en posición invertida a 37 ºC durante 18-24 horas.
- Medir los diámetros de las zonas de inhibición con una regla o un calibrador utilizando luz
refleja sobre fondo negro.
38
FUNDAMENTO:
El antibiograma es una prueba en la que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de

un medio de agar a una disolución antibiótica absorbida en discos de papel de filtro o en pastillas.
La difusión del mismo a través del medio produce un halo de inhibición del crecimiento, cuyo
diámetro será proporcional a la potencia del antimicrobiano. Varios factores afectan el halo de
inhibición: la carga de antibiótico en los discos, la difusión del antibiótico en el medio de cultivo,
el tamaño del inoculo bacteriano, la composición y grosor del medio de cultivo, la velocidad del
crecimiento bacteriano y el tiempo de incubación.
Bacterias Gram negativas Bacterias Gram positivas
Ampicilina Penicilina G
Amoxicilina+ácido clavulánico Amoxicilina+ácido clavulánico
Cefotaxima Meticilina (para resistentes a penicilina)
Ceftriaxona Oxacilina
Ciprofloxacina Cefalotina
Gentamicina Cefotaxima
Cotrimoxazol Ceftriaxona
Ciprofloxacina
Eritromicina (de elección para niños)
Vancomicina
Cotrimoxazol
39
RESULTADOS:
Interpretación. Los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de resistente (R),
intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S), de acuerdo a los criterios interpretativos
de la tabla de interpretación de los halos de inhibición de antibacterianos
Microorganismo Antibiótico
Escherichia coli
Escherichia coli es
40
CUESTIONES:
1- ¿Cuándo una bacteria es resistente a un antibiótico ?
41
Fecha:
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS CON API 20 E (ó API 10S).
OBJETIVO/S:
Identificar enterobacterias con tiras API
- Microorganismo
- Pipeta Pasteur
- Asa de siembra
- Placa de petri con agar TSA
- Estufa
- Suero salino ó agua destilada estériles
- Aceite de parafina estéril
PROCEDIMIENTO:
Preparación de la galería:
- Repartir unos 5 ml de agua en los alvéolos de una cámara de inoculación para proporcionar
un ambiente húmedo (3 ml en API 10S).
- Sacar la galería de la bolsa hermética y colocarla en la cámara de incubación.
- Con una pipeta Pasteur estéril se toma una colonia aislada y se realiza una suspensión de las
bacterias en un tubo con 5 ml de agua destilada estéril.
- Paralelamente realizar el test de la oxidasa.
- Llenar un tubo y la cúpula de los test CIT, VP, GEL, ( CIT en API 10S), con la suspensión
anterior.
- Llenar los tubos pero no las cúpulas de los demás test.
- Llenar la cúpula de los test ADH, LDC, ODC, H2S y URE (LCD, ODC, H2S, URE en API
10S); con aceite de parafina para obtener anaerobios.
Período de incubación:
- Incubar durante 18-24 horas a 35-37 ºC.
FUNDAMENTO:
Las tiras API se tratan de kits que tienen medios deshidratados se encuentran contenidos en
microtubos, se rehidratan mediante una suspensión bacteriana y luego se cultivan. Más tarde
se incuban y en este proceso el metabolismo del microorganismo genera cambios en el medio
de cultivo que se aprecian por un cambio de color de éste o al añadir reactivos. Los cambios
ocurridos se interpretan mediante tablas de lectura o mediante ordenadores. Se deben seguir
rigurosamente las instrucciones del fabricante
RESULTADOS:
Interpretación de los resultados:

- Se realiza mediante la tabla de lectura. Según la tabla se anota en la hoja de resultados las
reacciones espontáneas, indicando en cada caso si es positiva + o negativa -.
- Si la glucosa y/o 3 pruebas más dan positivas se efectúa el revelado de los tests que requieren
reactivos:
- Anotar los resultados en la hoja de resultados
- Si la glucosa da negativa y/o el número de test positivos es inferior o igual a 2, proceder a:
42
- Reincubar la galería 24 horas más

- Añadir los reactivos
- Anotar las reacciones de la galería y test complementarios en la hoja de resultados.
Identificación:
- Tras la lectura de todas las reacciones, la hoja de resultados se completa de la siguiente

manera:
- Los test están en grupos de tres y cada uno tiene asignado el valor 1, 2, 4. La galería consta de
20 tst (10 en API 10 S), los números en el interior de cada grupo corresponden a las
reacciones positivas.
- El test de la oxidasa es el número 21 (11 en API 10S), si es positivo se le asigna el valor 4 (2
en API 10S).
- Sumando los valores de los test positivos para cada grupo se obtiene un perfil numérico de 7
cifras (4 cifras en API 10S), el cual identifica una especie bacteriana, según la table
codificada, lista de perfiles numéricos (suministrados por la casa comercial en API 10 S) o
mediante un programa de ordenador (no suministrado por la casa comercial).
43
Fecha:
PRUEBA DE OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN (HUHG LEIFSON). METABOLISMOS

HIDROCARBONADO. MOVILIDAD.
OBJETIVO/S:
Determinar si una bacteria oxida ó fermenta un determinado hidrato de carbono (glucosa, lactosa,
etc..)
- Tubos con medio de cultivo O-F basal

- Hidratos de carbono (glucosa, lactosa, sacarosa)
- Hilo de siembra
- Estufa
- Microorganismos
PROCEDIMIENTO:
- Sembrar un tubo (O) y otro (F) por picadura a partir de un cultivo puro de la cepa que se
desea estudiar.
- Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
- Los microorganismos fermentadores dan reacción en los dos tubos. Los oxidativos sólo en el
tubo sin vaselina. La degradación oxidativa (color amarillo) sólo se observa en la parte más
cercana a la superficie del tubo mientras que en la fermentativa, se observa el color amarillo,
en toda la columna del medio. Los inactivos no provocan cambio en ningún tubo.
- También puede observarse si la cepa en estudio es inmóvil (crecimiento sólo en el canal de
picadura) o móvil, (turbidez en toda la columna con medio).
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
CON CON CON
MICROORGANISMO GLUCOSA LACTOSA SACAROSA
O F O F O F
Escherichia coli AG AG AG AG K K Especie
fermentativa
Pseudomonas aeruginosa A K K K K K Especie
oxidativa
Salmonella enteritidis AG AG K K K K Especie
fermentativa
K = alcalino, verde (sin cambio)
44
G = gas, observable a veces

A = ácido, amarillo
FUNDAMENTO:
Prueba para la diferenciación de bacilos Gram negativos, basada en la determinación del

metabolismo oxidativo y/o fermentativo de los carbohidratos. El azul de bromotimol del medio
permite identificar las variaciones del pH. Los ensayos se hacen por duplicado en dos tubos, uno
cubierto con aceite de vaselina (F) y otro sin (O). Además del cambio de color del indicador (de
verde a amarillo) es necesario observar la producción de gas y el tipo de crecimiento obtenido. Al
medio se le añade el carbohidrato a estudiar en una concentración del 1%.
RESULTADOS:
Microorganismo Agar basal O-F + 1% Agar basal O-F + movilidad

glucosa 1% lactosa
Tubo O Tubo F Tubo O Tubo F
45
Fecha:
PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE AZÚCARES. METABOLISMO HIDROCARBONADO.
OBJETIVO/S:
Determinar si una bacteria fermenta un determinado hidrato de carbono.
- Tubos con caldo rojo fenol y campana Durham

- Asa de siembra
- Hidrato de carbono a estudio (glucosa, lactosa, etc..)
- Estufa
- Microorganismos
PROCEDIMIENTO:
- Sembrar un tubo con caldo rojo fenol (con hidrato de carbono a estudio incorporado al 1%) y
campana Durham, a partir de un cultivo puro de la cepa que se desea estudiar.
- Sellar con parafina estéril.
- Incubar a 37ºC durante 18-24 horas.
- Los microorganismos fermentadores virarán el medio a color amarillo. La producción de gas
se observa en la campana Durham.
FUNDAMENTO:
Prueba para la determinación del metabolismo fermentativo de los carbohidratos. El rojo de fenol del
medio permite identificar las variaciones del pH. Además del cambio de color del indicador (de rojo
a amarillo) se puede observar la producción de gas. Al medio se le añade el carbohidrato a estudiar
en una concentración del 1%.
RESULTADOS:
Microorganismo Caldo rojo fenol + 1% glucosa Caldo rojo fenol + 1% lactosa
46
47

Practicas Medios de Cultivo y Pruebas de Identificación - 2020 - 2021

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Practicas Medios de Cultivo y Pruebas de Identificación - 2020 - 2021

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PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS

MODULO: ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN EN PLACAS.

- Aprender a preparar medios de cultivo, esterilizarlos y distribuirlo en placas.

- Preparar todo el material necesario.

- Disolver completamente. Utilizar placas calefactoras (con agitador magnético) o mechero

CALCULOS para la PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO A PARTIR DE MEDIOS

MEDIO DE CULTIVO TSA:

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN EN TUBOS.

- Aprender a preparar medios de cultivo, distribuirlo en tubos y esterilizarlos.

- Preparar todo el material necesario.

ESQUEMA: (VER pag 7)

CALCULOS para la PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO A PARTIR DE MEDIOS

CLARK & LUBS (MR-VP). Rojo de metilo – Voges Proskauer

Volumen total a preparar:

AGAR CITRATO DE SIMMONS

1. ¿Qué es un medio de cultivo?

2. ¿Por qué deben esterilizarse los medios de cultivo?

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: IMViC.

Prueba del indol:

- En un tubo con 2 ml de agua de peptona se siembra el microorganismo problema. Incubar a

Prueba de Rojo de metilo:

- En un tubo de ensayo que contenga medio de Clark y Lubs se siembra el microorganismo

Prueba de Voges Proskauer:

- En un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra el microorganismo

Prueba del citrato:

Glucosa  Ácido pirúvico Ácido láctico

Algunas enterobacterias realizan un tipo de fermentación denominada butanodiólica también llamada

2. ¿Qué significa que una bacteria sea rojo de metilo positivo?

3. ¿Qué significa que una bacteria sea voges proskauer positivo?

4. ¿Qué significa que una bacteria sea citrato positivo?

PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA: KIA

Interpretación de los resultados:

Producción de ácido sulfhídrico H2S:

(K/A) = superficie inclinada alcalina/capa profunda ácida

Los símbolos utilizados para expresar las distintas reacciones son:

Microorganismo Fermentación Fermentación Producción Producción Resultado

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: UREASA, ONPG, LDC, REDUCCIÓN DE NITRATOS Y

- Se prepara un tubo con caldo Taylor.

Microorganismo UREASA ONPG LDC REDUCCIÓN FENILALANINA

2- ¿Qué significa que un microorganismos sea ONPG negativo?

3- ¿Qué significa que un microorganismo de postiva la prueba de LDC?

4- ¿Qué significa que un microorganismo de positiva la prueba de FDA?

5- ¿Si se realiza la prueba de reducción de nitratos a un microorganismos y tras añadir los

6- ¿Qué significa qué un microorganismo de la prueba de reducción de nitratos positiva?

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: OXIDASA Y CATALASA

Técnica con tiras reactivas oxidasa:

- Tomar una tira oxidasa.

aparición de color azul (+)

Técnica con Hisopo:

OXIDASA: Esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo C oxidasa que

Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de

forma reducida incolora forma oxidada

1- ¿Qué caracteriza a un microorganismo catalasa positivo?

2- ¿Qué caracteriza a un microorganismos oxidasa positivo?

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: DNAsa

1- ¿Qué caracteriza a un microorganismo DNAsa positivo?

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: COAGULASA

- En un tubo de hemólisis estéril, se ponen 0,3 ml de plasma al que añadimos 0,1 ml de

2- ¿Qué caracteriza a un microorganismo Coagulasa positivo?

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN: HEMÓLISIS

- Sembrar en agar sangre con asa de siembra en el microorganismo a estudiar a partir de un