Sie sind auf Seite 1von 2

Treffpunkt Forschung

© Lorelyn Medina –
­FOTOLIA

Die Laborseite den Phagen T3 und SP6 können


ebenfalls genutzt werden. Viele Fir-

Tipps und Tricks zur in vitro-Transkription men bieten verschiedene besonders


aktive Phagen-Polymerasen an. Man
Mit Hilfe der in vitro-Transkription werden RNAs beliebiger Sequenz kann jedoch auch ohne großen Auf-
in größeren Mengen hergestellt und können für unterschiedliche wand selbst ein gutes, aktives re-
Fragestellungen eingesetzt werden. Die „Arbeiter“ im Reagenzglas kombinantes Protein im Labor expri-
sind dabei spezielle RNA-Polymerasen, die DNA in RNA umschreiben mieren [1].
können. Doch was ist dabei zu beachten? Woher „weiß“ die Polyme- Für die in vitro-RNA-Synthese
rase, welche Sequenz sie transkribieren soll? Und vor allen: Wofür ist wird im ersten Schritt die zu tran-
das gut? skribierende Sequenz mit dem Pro-
motor der Wahl verbunden. Dafür
In vitro-Transkripte werden heute RNA-Polymerasen, monomere, rela- gibt es zwei gängige Möglichkeiten:
in verschiedenen Laboren erfolg- tiv kleine Proteine und können des- Bei Variante A wird die gewünschte
reich hergestellt und dienen bei- halb leicht rekombinant hergestellt Sequenz in kommerziell erhältlichen
spielsweise als sequenzspezi­fische werden [1]. Die T7 RNA-Polymerase Vektoren kloniert, die bereits einen
Sonden für Southern oder Northern erkennt einen spezifischen kurzen der genannten Promotoren enthal-
Blots oder der Analyse von RNA- Promotor aus 17 Basenpaaren, und ten. Bei vielen Vektoren kann die
Strukturen. Was braucht man je- synthetisiert entlang der Sequenz zwischen zwei Phagen-
doch, um in-vitro-RNA-Moleküle downstream gelegenen Sequenz Promotoren kloniert werden, sodass
herszustellen? eine zur Matrize komplementäre mit der entsprechenden Polymerase
Neben einer DNA-Matrize, Ribo- RNA in 5‘-3' Richtung. T7-Polymera- der Sense- oder Antisense-Strang
nukleotiden (ATP, GTP, CTP und sen benötigen zur Initiation der transkribiert wird.
UTP) und etwas Puffer verwendet Transkription eine Purinbase auf Leider kennt eine Polymerase
man für eine in vitro-Transkription dem Matrizen-Strang, wobei Guano- das Projekt des Experimentators
die T7 RNA-Polymerase. Sie wurde sine bevorzugt werden. Daher lässt nicht und weiß deshalb auch nicht,
1996 von Srinivas Sastry und Bara­ man die entsprechende Promotorse- wo sie mit der Transkription aufhö-
bara Ross in dem Phagen T7 (einem quenz oft mit GGG enden, um ein ren soll. Dieses Problem ist einfach
RNA-Virus) gefunden. Phagen-Poly- „klares Startsignal“ für die Polymera- zu lösen: Man setzt einen Restrik­
merasen sind, im Gegensatz zu euka- se zu geben. Weitere Promotoren tionsschnitt ans Ende der gewünsch-
ryotischen und prokaryotischen und entsprechende Polymerasen aus ten Sequenz und die Polymerase

Abb. 1    Schema der b ei d en v ers c h i ed enen Va r i a n t e n


zur Vorberei tu ng d er i n v i tro-T ra ns k r i p t i o n

Variante A: Nach der Klonierung der zu transkribierenden Sequenz hinter den T7 Promotor wird das fertige Plas-
mid per Restriktionsverdau linearisiert und anschließend aufgereinigt.
Variante B: Für die Zielsequenz werden Primer erstellt, wobei der forward Primer die T7-Promotor Sequenz trägt.
Während der PCR entsteht so ein Amplifikat, welches aus Promotor und der zu transkribierenden Sequenz besteht.
Die Isolate aus beiden Varianten können so für eine in vitro-Transkription verwendet werden.

© 2017 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.biuz.de 2/2017 (47)    Biol. Unserer Zeit    89
Treffpunkt Forschung

fällt ganz einfach von der Vorlage reszierende oder anders modifizierte [1] B. He et al., Protein expression and
herunter. Dabei sollte jedoch mög- Nukleotide eingebaut werden. purification, 1997, 9, 142–151.

lichst kein Restriktionsenzym ver- Die oben genannte „gute Startse-


wendet werden, das 3‘-Überhänge quenz für die Polymerase“ und Rest-  Alexander Bruch,
erzeugt. Diese Enden werden näm- riktionsstellen für die Klonierung  Universität Kassel und Science
lich oft von der Polymerase als un- führen dazu, dass in vitro-Transkrip- Bridge;
spezifischer Startpunkt benutzt und te ein oder wenige zusätzliche Nuk-  Sara Haag, Universitätsmedizin
man erhält unerwünschte Transkrip- leotide am 5‘-Ende enthalten.  Göttingen und Science Bridge,
te in der falschen Richtung. In den meisten Fällen (zum Bei- sarimue@gmx.de
In Variante B wird die ge- spiel Sonden für Blots) spielt das
wünschte Sequenz mit Hilfe der keine Rolle. Wenn es jedoch auf die
PCR (polymerase chain reaction) exakt richtige Sequenz ankommt
amplifiziert. Man verwendet einen (zum Beispiel für Interaktionsstudi-
5‘-Primer, der zusätzlich die Sequenz en), kann man diese Problem durch
des entsprechenden Phagenpromo- die Verwendung spezifischer Starter- G u t zu w i sse n
tors und eine gute Startsequenz für Oligonukleotide umgehen. Alterna-
die Polymerase enthält. Nach der tiv kann man zusätzlich die Sequenz Detaillierte Protokolle findet man
zum Beispiel unter
gelelektrophoretischen Aufreinigung eines so genannten Hammerhead- www.openwetware.org/wiki/Sauer:
steht das PCR-Produkt für die in Ribozyms einbauen, das einen exak- In_vitro_transcription_with_T7_
vitro-Transkription zur Verfügung. ten Schnitt am gewünschten 5‘-Ende RNA_polymerase.
Dabei können auch radioaktive, fluo- des Transkripts setzt.

90    Biol. Unserer Zeit    2/2017 (47) www.biuz.de © 2017 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim