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Die Agilent ChemStation

für LC 3D-Systeme

Konzepte des
Spektrenmoduls

s1
 Copyright Agilent Gewährleistung
Technologies 2000
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Agilent Technologies Deutschland GmbH


Hewlett-Packard-Strasse 8
76337 Waldbronn
Deutschland
Die Agilent ChemStation für LC 3D-Systeme

Konzepte des Spektrenmoduls


In diesem Buch

In diesem Handbuch werden die Methoden beschrieben, die hinter dem


Spektrenmodul der HP ChemStation stehen. Es ergänzt die Informationen
aus dem Handbuch HP ChemStation Konzepte mit besonderen Methoden für
die Spektrenanalyse, welche für die HP ChemStation für LC 3D-Systeme und
die HP ChemStation für CE-Systeme verwendet werden können.

Weitere Informationen zur Installation und Konfiguration des


Spektrenmoduls mit einer HP ChemStation für LC-2D-Systeme finden Sie im
Handbuch Installation der HP ChemStation für LC-Systeme.

4
Inhalt

1 Grundlagen der Spektralanalyse


Was ist eine Spektralanalyse? 9
Bestimmung der optimalen Detektionswellenlänge 11
Formate der spektralen Reports 13

2 Automatische Bibliothekssuche mit Spektren


Suchmodi 18
Beschreibung des Reports 21

3 Beurteilung der Peakreinheit


Überprüfen der Peakreinheit 27
Methode 1 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrennormalisie-
rung 31
Methode 2 zur Ermittlung der Peakreinheit: Erstellung von Ver-
hältniskurven (Ratiogram Generation) 34
Methode 3 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrale Ähnlich-
keitskurven (Spectral Similarity Curves) 37
Berechnung der Reinheit 41
Grenzwertkurven 47
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit 50
Empfohlene Einstellungen 59
Überprüfen der Peakreinheit 69
Anzeige der Peakreinheit 74
Analyse der Peakreinheit 86
Massenspektrale Peakreinheit 89

5
Inhalt

6
1

1 Grundlagen der
Spektralanalyse
Grundlagen der
Spektralanalyse

In diesem Kapitel werden folgende Punkte behandelt:


• Was ist eine Spektralanalyse?
• Die Bestimmung der optimalen Wellenlänge.
• Formate der spektralen Reports.

8
Grundlagen der Spektralanalyse
Was ist eine Spektralanalyse?

Was ist eine Spektralanalyse?

Die Spektralanalyse erlaubt Ihnen die Auswertung von Spektraldaten, die mit
einem UV-VIS Dioden-Array- oder einem Fluoreszenz-Detektor erfaßt
wurden.
Die Auswertung von Spektraldaten fügt Ihren analytischen,
chromatographischen Daten eine dritte Dimension hinzu.

Abbildung 1 Spektrale Information

Absorptionsachse

Zeitachse

Wellenlängenachse

Chromatogramm

Spektrum

UV-VIS Dioden-Array-Detektor
Der Dioden-Array-Detektor ermöglicht Ihnen die kontinuierliche Spektren-
aufnahme im UV-VIS-Bereich des Spektrums. Da der Dioden-Array-Detektor
alle Wellenlängen gleichzeitig aufnimmt, kommt es bei der
Spektrenaufnahme zu keinem Empfindlichkeitsverlust.

9
Grundlagen der Spektralanalyse
Was ist eine Spektralanalyse?

Fluoreszenz-Detektor
Der Fluoreszenz-Detektor ermöglicht es Ihnen, Spektrendaten auf drei
verschiedene Arten zu sammeln:
• Sie können die Anregungswellenlänge festsetzen und Emissionsspektren
aufnehmen,
• Sie können die Emissionswellenlänge festsetzen und Anregungsspektren
aufnehmen
• Sie können einen Fluoreszenz-Scan aufnehmen, bei dem sowohl die
Anregungswellenlänge, als auch die Emissionswellenlänge verändert
werden. Dabei werden die Proben dreidimensional charakterisiert.
Anregungs- und Emissionsspektren können während des
Chromatographielaufes aufgenommen werden. Allerdings sinkt mit
steigender Zahl aufgenommener Wellenlängen die Empfindlichkeit der
Analyse, da der Fluoreszenz-Detektor die Daten als Scan aufnimmt. Der
dreidimensionale Fluoreszenz-Scan muß entweder bei abgeschaltetem Fluß
(stopped flow Modus) oder offline aufgenommen werden, da in der Meßzelle
während der Analyse eine konstante Probenkonzentration vorliegen soll.

Spektrenbearbeitung
Sie können Ihre Spektrendaten auf verschiedene Arten bearbeiten. Sie
können zum Beispiel:
• Aus den Spektraldaten ein Chromatogramm extrahieren und die optimale
Detektionswellenlänge für jeden einzelnen Peak bestimmen,
• Eine Bibliothekssuche zur qualitativen Bestimmung durchführen,
• Aus verschiedenen chromatographischen Daten Verhältniswerte bilden
und damit die Peakreinheit bestimmen und
• dadurch (versteckte) Verunreinigungen auffinden.

10
Grundlagen der Spektralanalyse
Bestimmung der optimalen Detektionswellenlänge

Bestimmung der optimalen


Detektionswellenlänge

In der Methodenentwicklung werden zunächst geeignete Bedingungen zur


Peaktrennung und dann die optimale Detektionswellenlänge für jeden Peak
ermittelt.
Eine Möglichkeit besteht darin, die Peakintensität (Absorption oder
Lumineszenz), die Wellenlänge und die Zeit als Umrißzeichnung, dem
sogenannten Isoabsorptionsplot, darzustellen. In dieser Methode werden die
spektralen Informationen als Serie konzentrischer Linien in einer Ebene aus
Wellenlänge und Zeit gezeichnet, wobei jede Linie einen Wert gleicher
Absorption darstellt. Dadurch kann die gesamte spektrale Information
gleichzeitig dargestellt und begutachtet werden. Siehe die mittlere
Darstellung in Abbildung 2.

Abbildung 2 Isoabsorptionsplot

Absorption

Wellenlänge [nm]

Absorption

Zeit

Diese Technik dient in der Methodenentwicklung zum Auffinden der


optimalen Wellenlänge für jeden Peak. Die horizontale Cursorposition
entspricht der Wellenlänge im Isoabsorptionsplot. Wenn der Cursor entlang

11
Grundlagen der Spektralanalyse
Bestimmung der optimalen Detektionswellenlänge

der Wellenlängenachse bewegt wird, wird im unteren Fenster das


entsprechende Chromatogramm rekonstruiert (vgl. Abbildung 2).
Die optimale Detektionswellenlänge wird auf folgende Weise ermittelt:
• Verschieben Sie im Modus “Quick View” in der mittleren Darstellung den
horizontalen Cursor, so daß die Absorption des gewünschten Peaks einen
Maximalwert erreicht und in der unteren Darstellung eine gute
chromatographische Trennung angezeigt wird.
• Wählen Sie den Modus “Signal View” und optimieren Sie die Bandbreite
(Bandwidth), so daß das Signal/Rausch-Verhältnis verbessert und eine
optimale Detektionswellenlänge gefunden wird. Das ermittelte Signal und
die Bandbreite können zum Fenster “Signal” im Modus “Data Analysis”
übertragen werden, indem die Schaltfläche Copy (Kopieren) aktiviert
wird. Die Einstellungen von Signal und Bandbreite können zur Integration,
Identifikation und Quantifizierung herangezogen werden.
Zur Wellenlängenoptimierung für den Fluoreszenz-Detektor benötigen Sie
gewöhnlich zwei Läufe:
• Stellen Sie eine Anregungswellenlänge im unteren UV-Bereich (230 bis 250
nm) ein und nehmen Sie Emissionsspektren auf. Bestimmen Sie mit Hilfe
des Isoabsorptionsplots für jeden Peak im Chromatogramm die optimale
Emissionswellenlänge.
• Erstellen Sie eine Zeittabelle, um die optimale Emissionswellenlänge für
jeden eluierenden Peak einzustellen und nehmen Sie die
Anregungsspektren auf.

Das Fluoreszenz-Spektrum
Der dreidimensionale Iso-Plot wird nur für die Spektrendarstellung von
Fluoreszenz-Scans verwendet. In diesem Fall wird die spektrale Information
in die Ebene aus Anrgeungswellenlänge/Emissionswellenlänge
eingezeichnet. Es gibt keine Zeitachse, da der Fluoreszenz-Scan entweder bei
abgeschaltetem Fluß (stopped-flow Modus) oder offline aufgenommen wird.
Aus dem Iso-Plot können Sie zu jeder beliebigen Wellenlänge das Anregungs-
oder Emissionsspektrum ablesen; die Anregungsspektren werden auf der
y-Achse, die Emissionsspektren auf der x-Achse dargestellt.

12
Grundlagen der Spektralanalyse
Formate der spektralen Reports

Formate der spektralen Reports

Im Spektrenmodul sind folgende Formatvorlagen verfügbar:


• Library Search (Bibliothekssuche) erstellt einen Kalibrierungsreport
einschließlich der Ergebnisse der Bibliothekssuche. Peaknummern,
Retentionszeiten, Übereinstimmungsfaktoren der Bibliothekssuche,
gefundene Mengen und Namen der Komponenten werden gemäß der im
Dialogfeld "Automated Library Search" gewählten Parameter ausgedruckt.
Weitere Informationen finden Sie in “Beschreibung des Reports” auf Seite
21.
• Short + Spectrum (Kurz mit Spektrum) erzeugt einen Report mit den
Gerätebedingungen, dem Chromatogramm, den quantitativen Ergebnissen
und den Plots zur Peakreinheit.
• Detail + Spectrum (Details mit Spektrum) besteht aus dem Header, den
Gerätebedingungen, dem Chromatogramm, quantitativen Ergebnissen,
Kalibrierkurven und Plots zur Peakreinheit. Der Header wird in einer Datei
mit dem Namen RPTHEAD.TXT im Verzeichnis METHOD gespeichert. Sie
können den Kopfteil mit einem Texteditor bearbeiten, um einen für die
Methode spezifischen Text hinzuzufügen.
• Performance + Lib. Search (Leistungsfähigkeit mit Bibliothekssuche)
kombiniert die Formatvorlage Performance und Library Search.

Informationen zur Peakreinheit


Die Information zur Peakreinheit bezieht sich auf die Beurteilung von
Spektren über alle Peaks, wobei Reinheitsplots für jede Substanz erstellt
werden. Diese Plots beinhalten überlagerte und normalisierte Spektren,
sowie einzelne und überlagerte Signale. Die Reinheitsplots können ebenfalls
den Schwellenwert und Übereinstimmungskurven enthalten, abhängig von
den Purity Preferences Einstellungen für die Methode.
Die numerischen Berechnungen ergeben den Reinheitsfaktor, ein Maß für die
Übereinstimmung in der Spektrenform. Weitere Informationen zur
Peakreinheit finden Sie in Kapitel 3 “Beurteilung der Peakreinheit”.

13
Grundlagen der Spektralanalyse
Formate der spektralen Reports

14
2

2 Automatische
Bibliothekssuche mit
Spektren
Automatische
Bibliothekssuche mit
Spektren

Herkömmliche Datenanalysesysteme identifizieren gefundene Substanzen


durch Vergleich der Retentionszeiten. Dies kann in folgenden Fällen zu
fehlerhaften Ergebnissen führen:
• Neben den kalibrierten Substanzen erscheinen andere Substanzen im
angegebenen Retentionszeitfenster.
• Im angegebenen Retentionszeitfenster erscheinen mehrere Substanzen.
• Aufgrund veränderter Säuleneigenschaften oder Flußraten wird die
Substanz auf der Säule länger retardiert und damit im vorgegebenen
Zeitfenster nicht mehr erfaßt.
Eine Möglichkeit zur Vermeidung solcher Fehler ist die Verwendung von
Qualifier-Peaks, wie im Handbuch Agilent ChemStation Konzepte
beschrieben.
Bei Verwendung eines Dioden-Array-Detektors können solche Fehler
vermieden werden, weil UV-Spektren zur Identifizierung eines Peaks zur
Verfügung stehen. Standardspektren werden mit einer Referenzprobe unter
definierten chromatographischen Bedingungen gewonnen und in einer
Datenbank abgelegt (Spektrenbibliothek). Sie können das Spektrum jeder
unbekannten Substanz mit Spektren aus einer oder mehreren
Spektrenbibliotheken vergleichen. Spektren können zum visuellen Vergleich
übereinander gelegt werden und die Ähnlichkeit zwischen Standardspektrum
und Probenspektrum kann berechnet werden.
Die ChemStation kann diesen Prozeß für alle Peaks in einem
Chromatogramm und für alle Chromatogramme einer Sequenz
automatisieren. Zusätzlich zur Identifikation einer Substanz kann die
Software eine Reinheitskontrolle des Peaks durchführen, wobei die
Einstellungen des Dialogfeldes Purity Preferences benutzt werden.
Diese qualitativen Ergebnisse können zusammen mit den quantitativen
Ergebnissen in einem Report dargestellt werden. Dieser Report enthält alle
Information, die über einen Peak benötigt wird:
• Substanzname,
• Menge,
• Retentionszeit,
• Übereinstimmungsfaktor (Identity Match Factor) der Identifikation und

16
Automatische Bibliothekssuche mit Spektren

• Reinheitsfaktor (Purity Match Factor).


In diesem Kapitel werden die verschiedenen Konzepte für eine
Bibliothekssuche beschrieben. Informationen über die Durchführung einer
Bibliothekssuche erhalten Sie in der Online-Hilfe und dem integrierten
Lernprogramm.

17
Automatische Bibliothekssuche mit Spektren
Suchmodi

Suchmodi

Es kann unter drei Suchmodi gewählt werden. Eine Spektrenbibliothek und


eine Kalibriertabelle sind Voraussetzung für alle drei Modi. Die
Peakreinheitskontrolle kann optional genutzt werden.
1 Identifikation durch Bibliothekssuche.
Dieser Modus ist der allgemeinste Suchmodus. Die ChemStation
verwendet das Chromatogramm als Basis für die Bibliothekssuche. Sie
vergleicht die Spektren aller Peaks, die integriert wurden und durch ihre
Retentionszeiten charakterisiert werden, mit den Spektren aus zu bis vier
Bibliotheken. Um den Prozeß zu beschleunigen und die Zuverlässigkeit zu
erhöhen, können Sie die Suche auf Peaks einengen, die in einem
bestimmten Retentionszeitfenster liegen. Dies geschieht mit der Vorlage
zur Bibliothekssuche (Library Search Template), wie in |Abbildung 3
gezeigt.

Abbildung 3 Retentionszeitfenster

Linkes Fenster
Erwartete Retentionszeit
Rechtes Fenster

Zeit [min]

Der Name der Substanz, deren Spektrum am bestem mit dem des Peaks
übereinstimmt, wird dem Peak zugeordnet. Sie können einen eigenen
Wert zur Festlegung der minimalen Übereinstimmung festlegen. Falls die
gefundene Übereinstimmung besser als der angegebene Wert ist, wird der
Peak als identifiziert gemeldet. Die ChemStation verwendet dann die
Kalibriertabelle und sucht nach einem Eintrag mit demselben Namen.
Falls ein Eintrag gefunden werden kann, wird mit den vorhandenen Daten
die gefundene Menge berechnet.

18
Automatische Bibliothekssuche mit Spektren
Suchmodi

Falls in der Kalibriertabelle kein passender Name gefunden werden kann,


wird die Peakidentität angegeben, die Menge kann aufgrund der
fehlenden Kalibrierdaten nicht berechnet werden.
Dieser Modus wird zur Suche nach unbekannten Substanzen eingesetzt.
Er ist besonders effizient, wenn die Zahl der Substanzen im
Chromatogramm klein im Vergleich zur Zahl der Einträge in der
Bibliothek ist.
2 Zielsubstanzsuche mit einer Kalibriertabelle.
Dieser Suchmodus ist nur für durch die Methode kalibrierte Substanzen
gedacht. Die ChemStation vergleicht nur die Spektren von kalibrierten
Substanzen mit Spektren von bis zu vier Bibliotheken. Peaks werden nur
bei positivem Spektrenvergleich als identifiziert gemeldet. Die
Substanznamen in der Kalibriertabelle müssen mit den Substanznamen in
der Bibliothek übereinstimmen.
Ein Zielfenster für die Retentionszeiten kann als Teil der Suchmethode
angegeben werden. Nur die Peaks, deren Retentionszeit im Zielfenster
liegt, werden identifiziert. Die beste Übereinstimmung wird nur dann als
Identifikation gewertet, wenn ein eingegebener Mindestwert für die
Übereinstimmung erreicht wird.
Dieser Modus eignet sich zur Suche nach bestimmten kalibrierten
Substanzen in einem Chromatogramm. Dies ist die bevorzugte
Suchmethode für Chromatogramme mit sehr vielen Substanzen, von
denen aber nur wenige Peaks, die von Interesse sind, kalibriert sind.
3 Zielsubstanzsuche mit Spektrenbibliothek.
In diesem Falle wird die gesamte Spektrenbibliothek zur Suche
herangezogen und nicht nur die Einträge, die auch in der Kalibriertabelle
stehen. Die ChemStation verwendet die Spektrenbibliothek als Basis. Sie
vergleicht alle Bibliotheksspektren mit den Spektren des
Chromatogramms und versucht, alle vom Integrator gefundenen Peaks zu
identifizieren, die in das Retentionszeitenfenster fallen, das für die
Bibliothekseinträge und in der Bibliotheksvorlage spezifiziert ist. Nur die
Peaks, deren Retentionszeit mit dem definierten Retentionszeitfenster
übereinstimmen, werden zu einer Identifizierung herangezogen. Falls eine
Übereinstimmung gefunden wird, die einen vorgegebenen Grenzwert
überschreitet, wird der Peak als identifiziert gemeldet. Es erfolgt dann die
Quantifizierung auf der Grundlage des Namenseintrages in der
Kalibriertabelle. Wenn die Substanz sowohl in der Bibliothek als auch in
der Kalibriertabelle existiert, wird sie als identifiziert mit vorhandener

19
Automatische Bibliothekssuche mit Spektren
Suchmodi

Kalibration gemeldet. Wenn die Substanz nicht in der Kalibriertabelle


vorliegt, wird sie als unkalibriert gemeldet.
Dieser Modus ist empfehlenswert, wenn Sie Bibliotheken mit speziellen
Gruppen von Substanzen erstellt haben. Sie verfügen zum Beispiel über
eine Bibliothek mit wasserlöslichen und eine mit fettlöslichen Vitaminen.
Dann können Sie das Chromatogramm nach diesen bestimmten
Substanzen gezielt absuchen. Wenn ein Chromatogramm über viele Peaks
verfügt, ist dieser Modus zur ersten Identifizierung von Substanzen
empfehlenswert.
4 Peakreinheitskontrolle
Die Peakreinheitskontrolle kann optional durchgeführt werden. Wir
empfehlen die Peakreinheitskontrolle vor einer Bibliothekssuche, da
eventuelle Übereinstimmungen nur so gut sein können wie die Qualität
der Trennung. Die ChemStation vergleicht die Übereinstimmung von
Spektren in verschiedenen Teilen des Peaks. Sie berechnet einen
Reinheitsfaktor. Für die Reinheit kann ein Grenzwert definiert werden,
unterhalb dessen Ergebnisse im Report mit einem x markiert werden.
Weitere Informationen zur Peakreinheit finden Sie in Kapitel 3
“Beurteilung der Peakreinheit”.

20
Automatische Bibliothekssuche mit Spektren
Beschreibung des Reports

Beschreibung des Reports

Nach einer Bibliothekssuche enthält ein typischer Report folgende Daten:


• Das Chromatogramm/Elektropherogramm mit Beschriftung der
Retentions-/Migrationszeiten,
• Kopfteil mit Informationen zu Dateinamen und Suchparametern,
• Beschreibung des Detektorsignals und zwei Analysentabellen,
• Retentionszeiten aller gefundenen Peaks des Analysenlaufes,
• Retentionszeiten von passenden Standards aus der Bibliothek,
• Retentionszeiten der Kalibriertabelle und
• Gefundene Mengen der Substanzen und deren Reinheitsfaktor (falls
gewünscht), zusammen mit:
Nummer des Bibliothekseintrages,
Übereinstimmungsfaktor mit der Bibliothek und
Substanzname.
In den Spalten des Reports zur Bibliothekssuche werden verschiedene
Markierungen eingesetzt, um die Reinheit der Substanz, den
Übereinstimmungsfaktor und den Namen der Substanz zu markieren.
Diese Markierungen haben folgende Bedeutung:

Markierungen zur Reinheit


Bei unreinen Substanzen unterscheiden sich die Spektren im vorderen und
hinteren Teil eines Peaks voneinander, beide werden für eine
Bibliothekssuche herangezogen.
u: Substanz ist unrein. Spektrum im Peakanstieg (Upslope)
wurde zur Identifikation benutzt.
d: Substanz ist unrein. Spektrum im Peakabfall (Downslope)
wurde zur Identifikation benutzt.

Markierungen zum Übereinstimmungsfaktor:


x: Übereinstimmungsfaktor liegt unterhalb des
vorgegebenen Grenzwerts.

21
Automatische Bibliothekssuche mit Spektren
Beschreibung des Reports

Markierungen zum Substanznamen:


?: Die Substanz wurde mit einem Übereinstimmungsfaktor
unterhalb des vorgegebenen Grenzwertes identifiziert.
??: Die Substanz wurde mit einem Namen identifiziert, der
bereits an eine andere Substanz bei besserer
Übereinstimmung vergeben wurde. Es konnte für diese
Substanz keine bessere Zuordnung mit einem eindeutigen
Namen gefunden werden.

Markierungen der Mengenangabe:


+: Menge dieses Stoffes zu hoch — Grenzwerteinstellung aus
„Compound Details“ wird überschritten.
-: Menge dieses Stoffes zu niedrig — Grenzwerteinstellung
aus „Compound Details“ wird unterschritten.
Peaks, die mit keinem Eintrag in der Kalibriertabelle übereinstimmen,
werden in einer getrennten Tabelle zusammengefaßt, die den Titel
„Uncalibrated Compounds“ (Unkalibrierte Substanzen) trägt.

22
3

3 Beurteilung der
Peakreinheit
Beurteilung der
Peakreinheit

Dieses Kapitel beschreibt die Überprüfung der Peakreinheit für die


Software-Versionen A.05.0x und älter sowie für die Version A.06.0x.

24
Beurteilung der Peakreinheit

25
Überprüfung der Peakreinheit
(A.05.0x und älter)

Dieser Abschnitt beschreibt die verschiedenen Methoden zur Überprüfung


der Peakreinheit:
• Überprüfen der Peakreinheit.
• Methode 1 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrennormalisierung.
• Methode 2 zur Ermittlung der Peakreinheit: Erstellung von
Verhältniskurven (Ratiogram Generation).
• Methode 3 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrale Ähnlichkeitskurven
(Spectral Similarity Curves).
• Berechnung der Reinheit.
• Grenzwertkurven.
• Analyse der Peakreinheit.
• Empfohlene Einstellungen.

26
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Überprüfen der Peakreinheit

In jeder chromatographischen Analyse ist es wichtig zu wissen, ob ein Peak


aus einer oder aus mehreren Komponenten besteht. In der
Qualitätssicherung kann eine überlagerte Verunreinigung des
interessierenden Peaks die quantitative Auswertung verfälschen. Bei
Forschungsaufgaben kann eine überlagernde und unentdeckte Komponente
den Verlust wertvoller Information bedeuten.

Was versteht man unter “Überprüfung der Peakreinheit”?


Mit einer Überprüfung der Peakreinheit wird festgestellt, ob ein Peak zu
einer reinen Substanz gehört oder Verunreinigungen enthält. Diese
Bewertung basiert auf dem Vergleich von Spektren, die während der Elution
des Peaks aufgenommen werden. Normalerweise werden hierfür drei
Spektren benutzt. Zwei Spektren werden in den Wendepunkten des Peakan-
bzw. abstieges genommen (Up und Down Slope) und ein drittes im
Peakmaximum (Top- oder Apexspektrum). Sie können bei Bedarf auch 5, 7, 9
oder alle Spektren eines Peaks zur Reinheitskontrolle heranziehen.
Wenn diese Spektren nicht identisch sind, enthält der Peak theoretisch eine
spektrale Verunreinigung. Die spektrale Verunreinigung kann von einer oder
von mehreren Komponenten stammen, von Peaks, die nicht
basisliniengetrennt sind oder von der Hintergrundabsorption.

VO RS IC HT Auch wenn identische Spektren gefunden werden, kann der Peak


Verunreinigungen enthalten. Dies ist der Fall, wenn die spektrale Absorption
im Vergleich zu der Hauptkomponente klein ist oder wenn die Verunreinigung
und die Hauptkomponente gleiche oder sehr ähnliche Spektren bei ähnlicher
Elutionszeit aufweisen.

Der Peakreinheitsplot besteht aus den Peakspektren in einer normalisierten


und einer überlagerten Darstellung. Der Reinheitsfaktor ist ein Maß für die
Ähnlichkeit dieser Spektren untereinander.
Eine Verunreinigung in einem Peak kann auch dann entdeckt werden, wenn
eine korrigierbare Hintergrundabsorption vorliegt. Normalerweise stört eine
Hintergrundabsorption die Quantifizierung nicht, weil diese durch Korrektur
entfernt werden kann. Die Hintergrundabsorption kann sich in einem
Analysenlauf jedoch durch Variation des Lösungsmittels oder der
Lösungsmittelzusammensetzung verändern.

27
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Der Übereinstimmungsfaktor (Match Factor)


Eine Aufdeckung von Verunreinigungen in einem Peak durch visuellen
Spektrenvergleich ist zeitraubend und eignet sich nicht zur Automatisierung.
Daher stehen verschiedene statistische Verfahren für den automatischen
Spektrenvergleich zur Verfügung. Mit einem mathematischen Verfahren wird
die Ähnlichkeit zwischen den Spektren numerisch verglichen. Es berechnet
einen Übereinstimmungsfaktor, der den Ähnlichkeitsgrad zwischen den
Spektren berechnet.
Aus der Ähnlichkeit folgt der Übereinstimmungsfaktor mit folgender
Definition:

 ∑ x × ∑ y 
2

10 ×  ∑ x × y –  -------------------------- 
3

  n 
Match Factor = --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
2 ∑
 x × ∑ x   2 ∑
y × ∑ y 
 ∑ x –  --------------------------   ×  ∑ y –  -------------------------- 
  n    n 

x und y sind die gemessenen Absorptionswerte bei derselben Wellenlänge in


beiden Spektren; n ist die Anzahl der Datenpunkte und Σ die Summe der
Datenpunkte. Der Wertebereich beginnt mit 0 bei keiner Übereinstimmung
und reicht bis 1000 bei identischen Spektren. Allgemein bedeuten Werte von
größer 990, daß die Spektren ähnlich sind. Werte zwischen 900 und 990
deuten auf Ähnlichkeiten in den Spektren hin, wobei die Ergebnisse mit
Vorsicht zu interpretieren sind. Alle Werte kleiner als 900 bedeuten, daß die
Spektren unterschiedlich sind.
Der ermittelte Übereinstimmungsfaktor hängt von einigen Parametern ab.
Diese Parameter werden durch Probe und Trennmethode vorgegeben. Sie
umfassen Eigenschaften der Komponente, Absorptionsbeiträge der Matrix,
die spektrale Rauschhöhe (Noise Level), Hintergrundabsorptionen und
Verschiebungen (Shifts) der Spektren durch Einflüsse der Lösungsmittel
oder Analysengeräte (unterschiedliche Wellenlängenkalibrierung).

Glättung von Spektren


Die Reinheitskontrolle ist unzuverlässig, wenn die Rauschhöhe des
Spektrums genauso groß ist, wie die Absorption selbst. Die Spektrenglättung
funktioniert folgendermaßen:
1 Für eine definierte Anzahl von Datenpunkten, die man auch als Filter
bezeichnet, beispielsweise 5, wird eine kubische Regression durchgeführt,

28
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

um daraus einen neuen Datenpunkt zu ermitteln.


2 Der Filter wird dann einen Datenpunkt weiter gerückt. Vier der bei der
letzten Regression verwendeten Datenpunkte und ein zusätzlicher werden
demnach für die Ermittlung des nächsten Punktes verwendet.
Durch die Verwendung des Glättungsalgorithmus kann
Untergrundrauschen statistisch verringert werden, was die Identifikation
der Peaks im Spektrum zuverlässiger macht.

HINWEIS Der Glättungsalgorithmus kann jedoch, abhängig von der Länge des Filters,
also der Anzahl der Datenpunkte, die im Glättungsalgorithmus Verwendung
finden, das Profil des Spektrums verändern. Empfehlenswert ist die Glättung
aller Spektren mit dem gleichen Filter, bevor Vergleiche der Spektren
durchgeführt werden.

Interpolation von Spektren


Wenn Sie Spektren mit niedriger Auflösung aufgenommen haben, können Sie
die Funktion Interpolation (Splining) verwenden, um Ihrem Spektrum mehr
das Aussehen eines Kurvenverlaufs, als das eines Polygons zu geben. Hierbei
werden mittels trigonometrischer Funktionen zusätzliche Datenpunkte
zwischen den tatsächlichen Datenpunkten des Spektrums berechnet. Die
Originaldatenpunkte des Spektrums bleiben bei der Verwendung dieser
Funktion erhalten.

Bildung der Ableitung von Spektren


In abgeleiteten Spektren sind bestimmte Details deutlicher sichtbar, als in
den Originalspektren. Kleine Unterschiede treten deutlicher hervor und sind
visuell leichter zu beurteilen. Allerdings nimmt der Rauschanteil zu, wodurch
der Einsatzbereich abgeleiteter Spektren begrenzt ist.

Möglichkeiten zur Bestimmung der Peakreinheit


Die Peakreinheit kann nur bei Peaks mit Basislinientrennung ermittelt
werden. Bei Nachbarpeaks ohne Basislinientrennung enthält jeder Peak
einen Anteil des Nachbarn als Verunreinigung, die Beurteilung der
Peakreinheit ist schwieriger.
Die Peakreinheit kann interaktiv, Peak für Peak, ermittelt werden und zwar
für alle Peaks eines Datensatzes oder im Anschluß an einen Analysenlauf
automatisch als Teil einer Methode, bei der beispielsweise das
Spektrenreport-Format Detail+Spectrum gewählt wurde.

29
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Sie können die Ermittlung der Peakreinheit hinsichtlich Genauigkeit oder


Durchsatz durch Anpassung folgender Vorgaben optimieren:
• Anzahl der in einem Peak verwendeten Spektren,
• Wellenlängenbereich, der zur Berechnung verwendet wird,
• Referenzspektren,
• Grenzwert für die Reinheit (Purity Threshold),
• Bearbeitung der Spektren einschließlich Logarithmierung, Glättung,
Interpolation und Bildung von Ableitungen verschiedener Ordnung,
• Normalisierung der Spektren und
• Berechnung und Anzeige der Reinheitskomponenten (dies umfaßt die
Spektren, die Unterschiede der Spektren, die Signale, die Darstellung der
Absorptionsverhältnisse der Signale, die Ähnlichkeit und
Grenzwertkurven).
Es gibt verschiedene Möglichkeiten zur Beurteilung der Peakreinheit. Diese
werden in den folgenden Abschnitten besprochen und umfassen:
• Normalisierung der Spektren (Spectral Normalization): Vergleich
von normalisierten Spektren aus verschiedenen Bereichen des Peaks,
• Verhältnisauftragung (Ratiogram): Das Verhältnis der
Absorptionswerte bei zwei oder mehr Wellenlängen wird als Funktion der
Zeit aufgetragen und
• Ähnlichkeitskurve (Similarity Curve): Vergleich eines ausgewählten
oder eines gemittelten Spektrums mit allen anderen Spektren, die während
der Elution des Peaks aufgenommen wurden.

30
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 1 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrennormalisierung

Methode 1 zur Ermittlung der


Peakreinheit: Spektrennormalisierung

Eine bekannte Methode zur Beurteilung der Peakreinheit bedient sich der
Normalisierung mit anschließendem Vergleich der Peakspektren. Die
Normalisierung kompensiert Konzentrationsänderungen in der Detektorzelle
während der Elution des Peaks.
Die Spektren werden zum Beispiel im Peakanstieg, dem Peakabfall und dem
Maximum aufgenommen. Die Spektren werden normalisiert und zur
graphischen Darstellung übereinander gelegt. Diese Methode eignet sich gut
für eine interaktive Datenauswertung und kann für die automatische
Routineanalyse angepaßt werden.
Falls die Angabe eines numerischen Faktors gewünscht wird, können die
Spektren aus den verschiedenen Teilen des Peaks miteinander mathematisch
verglichen werden und die Reinheitsfaktoren werden zusammen mit der
Retentionszeit ausgedruckt.
Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für Spektren aus Peakanstieg, Maximum und
Peakabfall mit Normalisierung. Sowohl die visuelle Beurteilung, als auch der
mathematisch gefundene Reinheitsfaktor zeigen deutlich den Unterschied
zwischen reinen und verunreinigten Peaks.

Abbildung 4 Peakreinheitskontrolle durch Übereinanderlegen von Spektren

31
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 1 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrennormalisierung

Zur Erhöhung der Präzision kann die Agilent ChemStation die


Peakreinheitsfaktoren auch mit 3, 5, 7, 9, oder allen Spektren eines Peaks
berechnen.

Hintergrundkorrektur mit Referenzspektren (Background


Correction)
Zur Korrektur von Hintergrundeffekten und der Extraktion von Spektren aus
einem Datensatz stehen verschiedene Korrekturmöglichkeiten zur
Verfügung:

Korrektur mit einem Spektrum (Single Spectrum Correction)


Ein definiertes Spektrum, zu einer festen Zeit aus dem Datensatz genommen,
wird von den Spektren des Peaks subtrahiert. Diese Korrektur eignet sich
nicht bei variierender Hintergrundabsorption.

Basislinienkorrektur (Baseline Correction)


Ein Spektrum der Basislinie des Datensatzes oder ein interpoliertes
Spektrum aus zwei Basislinienspektren wird von den Peakspektren
subtrahiert. Diese Korrektur eignet sich zur Kompensation einer sich
langsam ändernden Hintergrundabsorption.

Peakmaximumkorrektur (Peak Apex Correction)


Referenzspektrum aus dem Peakmaximum wird von allen anderen Spektren
des Peaks subtrahiert. Diese Korrektur kann angewandt werden, wenn
Spektren der Basislinie nicht zur Verfügung stehen.

Basislinie des Peaks (Peak Baseline): Im Modus Peak Baseline


hängen die gewählten Referenzspektren vom Speichermodus der Spektren
im Datensatz ab.
All spectra stored (alle Spektren gespeichert): Start und Ende der
Peakintegration werden als Zeitpunkt für linkes und rechtes
Referenzspektrum gewählt.
Peak-controlled spectra (Peak-kontrollierte Spektren): Das erste Spektrum
vom Typ Basislinie, jeweils links und rechts des gewählten Peaks, wird als
linkes und rechtes Referenzspektrum gewählt. Falls kein linkes oder rechtes
Basislinienspektrum gefunden wird, wird das erste oder letzte Spektrum des
Datensatzes als Referenz verwendet.
Verwenden Sie diesen Modus, wenn alle Spektren im Datensatz gespeichert
sind.

32
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 1 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrennormalisierung

Nächste Basislinie (Nearest Baseline): Ein Referenzspektrum wird


an einem dem Peak nächstgelegenen Punkt der Basislinie gewählt und vom
gewählten Spektrum subtrahiert.

33
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 2 zur Ermittlung der Peakreinheit: Erstellung von Verhältniskurven
(Ratiogram Generation)

Methode 2 zur Ermittlung der


Peakreinheit: Erstellung von
Verhältniskurven (Ratiogram Generation)

Verwendung der Verhältnisauftragung der Signale zur


Peakreinheitsbestimmung
Diese Betrachtung basiert auf der Auftragung der Absorptionsverhältnissee
zweier oder mehr Wellenlängen während der Peakelution.
Für eine reine Komponente gilt, daß die molare Absorption A bei einer
Wellenlänge λ1 direkt proportional zu der bei einer beliebigen anderen
Wellenlänge λ2 ist:
A(λ1) = K x A(λ2)
wobei die Konstante K charakteristisch für die Substanz und die gewählte
Wellenlängen ist. Das Verhältnis der Absorption bei zwei Wellenlängen ist für
eine reine Komponente eine Konstante. Die Auftragung der Absorption über
die Retentionszeit ergibt eine Rechteckfunktion mit der Amplitude K. Die
Gegenwart einer koeluierenden Verunreinigung mit einem unterschiedlichen
K-Wert erzeugt eine Abweichung im sonst flach verlaufenden Graphen.
Abweichungen von einer flachen Verhältnisauftragung können von
veränderter Hintergrundabsorption (scharfe Gradienten) oder vom
Basislinienrauschen stammen.
Abbildung 5 zeigt die Signale und eine Verhältnisauftragung von
Absorptionswerten für einen reinen und einen verunreinigten Peak. Ein
Grenzwert dient der Vermeidung von zu starkem Rauschen. Wenn eines der
beiden Signale den Grenzwert unterschreitet, wird das Verhältnis auf Null
gesetzt.

34
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 2 zur Ermittlung der Peakreinheit: Erstellung von Verhältniskurven
(Ratiogram Generation)

Abbildung 5 Verhältnisauftragung für reine und verunreinigte Peaks

Absorption
[mAU] Signal A
Signal B

Zeit [min]

Grenzwertkurve
unrein rein

Zeit [min]

Verhältnisauftragung (Ratiogram)
Eine andere Methode zur Überprüfung der Peakreinheit verwendet mehrere
Absorptionsverhältnisse zur Erzeugung einer Verhältnisauftragung. Anstelle
einiger ausgewählter Wellenlängen, werden die Verhältnisse der
Absorptionswerte bei allen Wellenlängen relativ zur Wellenlänge mit der
stärksten Absorption aufgetragen. Die maximale Absorption wird in jedem
Spektrum gesucht und das Verhältnis zu den Absorptionswerten bei anderen
Wellenlängen für das gesamte Chromatogramm aufgetragen. Die
Verhältnisauftragung erfolgt in einem Fenster mit einer horizontalen
Zeitachse und einer vertikalen Wellenlängenachse.
Die Farbwerte entsprechen Verhältniswerten. Niedrige und hohe
Verhältniswerte werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt. Dieses
Verfahren bietet einen sehr schnellen Überblick über die Reinheit aller Peaks
in einem Chromatogramm.

35
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 2 zur Ermittlung der Peakreinheit: Erstellung von Verhältniskurven
(Ratiogram Generation)

Abbildung 6 Verhältnisauftragung (Ratiogram)

rein unrein
mAU

Wellenlängenv
erhältnis

Zeit

Bei einem reinen Peak ergibt diese Auftragung eine Folge paralleler Banden,
wobei sich die Farbe der Banden während der Peakelution nicht ändert. Ein
reiner Peak hat ein konstantes Verhältnis über die gesamte Peakbreite.
Wenn ein Peak verunreinigt ist, ändert sich die Farbe der Banden mit der
Elutionszeit. Das Verhältnis ist nicht konstant.

36
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 3 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrale Ähnlichkeitskurven (Spectral
Similarity Curves)

Methode 3 zur Ermittlung der


Peakreinheit: Spektrale
Ähnlichkeitskurven (Spectral Similarity
Curves)

Spektrale Ähnlichkeitskurven können im Fenster „Peak Signals“ auf dem


Bildschirm „Peak Purity“ eingesehen werden.
Wenn Einzelheiten der Darstellung nicht klar zu erkennen sind, dann können
Sie das Fenster vergrößern, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten
und diese ziehen. Auf dem Bildschirm wird beim Ziehen der Maus ein
Rechteck angezeigt, das den zu vergrößernden Ausschnitt markiert.
Doppelklicken mit der linken Maustaste stellt den Originalbildschirm wieder
her.
Spektrale Ähnlichkeitskurven geben die genauesten Informationen zur
Reinheit eines Peaks. Alle Spektren eines Peaks werden wahlweise mit einem
oder mehreren Spektren verglichen, zum Beispiel mit dem Spektrum im
Peakmaximum. Der Grad der Übereinstimmung, bzw. die spektrale
Ähnlichkeit wird gegen die Elutionszeit aufgetragen. Das ideale Profil ist eine
flache Linie bei 1000, wie in Abbildung 7 (a) gezeigt.
Zu Beginn und Ende eines Peaks nimmt die Rauschhöhe relativ zur
Signalhöhe zu, der Beitrag des spektralen Hintergrundrauschens zum
Peakspektrum wird stärker. Der Beitrag der Rauschhöhe zur
Ähnlichkeitskurve ist in Abbildung 7 (b) gezeigt.

37
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 3 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrale Ähnlichkeitskurven (Spectral
Similarity Curves)

Abbildung 7 Ähnlichkeitskurven eines reinen Peaks mit und ohne Rauschen in Relation zum
idealen Ähnlichkeitsfaktor (1000) und anwenderdefiniertem Grenzwert (980)

a) Peak ohne Verunreinigung und Rauschen b) Peak ohne Verunreinigung mit Rauschen

980 980

Ähnlichkeitskurve Ähnlichkeitskurve
.

1000 1000

Peakspektrum, 20 mAU Rauschen, 0.1 mAU

Die zweite horizontale Linie dieser Darstellung ist der anwenderdefinierbare


Grenzwert der Reinheit, der in Abbildung 7 auf 7 eingestellt ist. Wo die
Ähnlichkeitskurve über diesem Limit liegt, ist der Peak außerhalb der
vorgegebenen Definition der Reinheit.

Ähnlichkeitskurven in der Darstellung


Ähnlichkeit/Grenzwert
Im Dialogfeld „Advanced Purity Preferences“ können Sie eine Anzeige der
Ähnlichkeitskurve als Verhältnis von Ähnlichkeit und Grenzwert wählen.
Lesen Sie dazu den Abschnitt “Grenzwertkurven” auf Seite 47.
Punkte, die eine Verunreinigung aufweisen, zeigen einen Verhältniswert von
größer als 1, reine Punkte von unter 1.

Verwendung vorgegebener Zielspektren


Die Agilent ChemStation erlaubt die Berechnung eines Reinheitsfaktors und
von Ähnlichkeitskurven relativ zu verschiedenen Zielspektren, wie in Figure
8 gezeigt. Im allgemeinen bietet die Option „Compare the Average Spectrum“
die beste Information bei unbekannten Verunreinigungen. Die Flexibilität der
Wahl eines definierten Zielspektrums ist in solchen Fällen wertvoll, wo in der
Auswertung eine Annahme über die Lage der Verunreinigung gemacht
werden muß oder wo die Empfindlichkeit in der Beurteilung der Reinheit
erhöht werden muß. Ein Beispiel soll die Anwendungsmöglichkeiten

38
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 3 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrale Ähnlichkeitskurven (Spectral
Similarity Curves)

verdeutlichen: falls eine Verunreinigung am Peakende vermutet wird, kann


die Wahl des Spektrums aus Maximum oder Peakabfall zum Vergleich mit
allen anderen Spektren die besten Informationen liefern.

Figure 8 Verhältniskurven mit verschiedenen Zielspektren aus einem Peak

Peak mit 2% Verunreinigung

1
0
Verhältnis des Front- Verhältnis des Verhältnis des Verhältnis des
spektrums zu allen Maximum- hinteren gemittelten
anderen Spektren spektrums zu allen spektrums zu allen spektrums zu allen
anderen Spektren anderen Spektren anderen Spektren

Figure 8 zeigt die Verhältniskurven mit Spektren aus Peakanstieg, Maximum,


Peakabfall und Durchschnittspektrum eines Peaks mit Verunreinigung hinter
dem Peakmaximum (Apex).
Das Front Spectrum (Spektrum des Peakanstieges) zeigt eine geringe
Verunreinigung am Peakende. Die Abweichung in dieser ersten
Verhältniskurve ist klein, weil das Anstiegsspektrum eine geringe Absorption
aufweist (mit der Folge einer hoch liegenden Verhältniskurve).
Das Apex Spectrum (Spektrum im Maximum) zeigt eine geringe
Verunreinigung am Peakanfang (das Spektrum des Maximums enthält nur
eine kleine Menge der Verunreinigung) und eine starke Verunreinigung am
Peakende.
Das Tail Spectrum (Spektrum des Peakendes) mit einer deutlichen
Verunreinigung zeigt eine Verunreinigung am Peakanfang.
Das Average Spectrum (Mittelwertspektrum, ein Mittelwert aller Spektren
des Peaks, hier aus Anstieg, Maximum und Abfall) zeigt eine Verunreinigung
im gesamten Peak wegen der spektralen Beiträge der Verunreinigung. Das
Mittelwertspektrum enthält mehr Beiträge der Verunreinigung, als das
Spektrum des Maximums. Es zeigt stärkere Verunreinigung am Peakbeginn
(Elutionsfront) und geringere Verunreinigung am Peakende, als die
Verhältnisauftragung mit dem Spektrum des Maximums.

39
Beurteilung der Peakreinheit
Methode 3 zur Ermittlung der Peakreinheit: Spektrale Ähnlichkeitskurven (Spectral
Similarity Curves)

Die Form der Ähnlichkeits-, Grenzwert und Verhältniskurven hängt von Lage,
Stärke und spektralen Besonderheiten der Verunreinigung ab, so daß keine
allgemeine Beschreibung erfolgen kann. Die Form kann sich von Fall zu Fall
ändern.

40
Beurteilung der Peakreinheit
Berechnung der Reinheit

Berechnung der Reinheit

Der Wert einer berechneten Reinheit hängt davon ab, welche Vorgaben Sie
wählen:
• Mit oder ohne Ähnlichkeitskurve
• Grenzwertkurve beifügen
• Grad der Reinheit berechnet mit...

HINWEIS Der Reinheitsfaktor ist kein absolutes Maß für die Peakreinheit. Er ist
vielmehr eine Funktion der Parameter, die während der Berechnung benutzt
wurden, besonders abhängig dabei vom Grenzwert für die Reinheit. Aus
diesem Grund müssen die Ergebnisse zusammen mit den Grenzwerten
interpretiert werden. Für reine Peaks werden vergleichbare Ergebnisse für
verschiedene Parametereinstellungen erstellt. Für unreine Peaks wird der
schlechteste Fall ermittelt. Nur Datenpunkte, die zu einer Verunreinigung
gehören, beispielsweise Spektren, die unter dem Grenzwert liegen, werden
bei der Berechnung berücksichtigt. Aus diesem Grund kann eine Änderung
des Grenzwertes einen drastischen Einfluß auf den Reinheitsfaktor eines
unreinen Peaks haben. Im folgenden Abschnitt finden Sie detailiertere
Informationen zu diesen Berechnungen. Eine genaue Beschreibung der
Ähnlichkeitskurven der ChemStation finden Sie unter “Das Fenster "Purity"”
auf Seite 75.

Keine Ähnlichkeitskurve gewählt (No Similarity Curve


Selected)
Wählen Sie diese Einstellung für Daten, die mit der Option Peak Controlled
Spectra aufgenommen wurden
1 Die Übereinstimmungsfaktoren werden zwischen jedem Spektrum, das im
Fenster „Peak Spectra“ des „Purity Display“ gewählt wurde und dem oder
den Spektren angezeigt, die in „Purity Calculated with…“ definiert wurden
(z. B. Average, Front & Tail). Falls nur zwei Spektren verfügbar sind,
werden nur diese verglichen und die Vorgaben für die Berechnung des
Übereinstimmungsfaktors (z. B. Average, Front & Tail Spectra etc.) haben
keine Gültigkeit.
2 Wenn ein Wert unter dem vorgegebenen Grenzwert (von z. B. 990) liegt,

41
Beurteilung der Peakreinheit
Berechnung der Reinheit

wird der Reinheitsfaktor als Mittelwert aller berechneten


Übereinstimmungsfaktoren unter dem Grenzwert angegeben. In diesem
Fall wurde der Peak bereits als unrein identifiziert und nur Spektren, die
unter dem Grenzwert liegen werden benutzt, um den Grad der
Verunreinigung zu ermitteln. Liegt kein Wert unterhalb des Grenzwertes,
ist der Reinheitsgrad der Mittelwert aller berechneter
Übereinstimmungsfaktoren.

A - Reinheitsfaktor = 995.6 (100% der Spektren)


B - Reinheitsfaktor = 986.5 (50% der Spektren)
X = Übereinstimmungsfaktoren, die zur Berechnung des Reinheitsfaktors dienten
O = Übereinstimmungsfaktoren, die nicht zur Berechnung des Reinheitsfaktors dienten

In Beispiel B liegen zwei von vier Übereinstimmungsfaktoren (50%) unter


dem Grenzwert. Der Reinheitsfaktor wird nun als Mittelwert dieser
Übereinstimmungsfaktoren errechnet.

Wahl einer Ähnlichkeitskurve (Similarity Curve Selected)


Verwenden Sie diese Einstellung für Datensätze, die mit der Einstellung „All
Spectra“ aufgenommen wurden.
Der Übereinstimmungsfaktor aller Spektren des Peaks und dem Spektrum
oder den Spektren, die in „Purity Level Calculated With...“ angegeben wurden
(z. B. Average, Front & Tail Spectra etc.) werden berechnet und als
Ähnlichkeitskurve im Fenster „Peak Signals“ im „Peak Purity Display“
angezeigt.
Falls mehr als zwei benachbarte Übereinstimmungsfaktoren unterhalb des
Grenzwertes liegen, wird der Reinheitsfaktor als Mittelwert aller Punkte der
Ähnlichkeitskurve berechnet, die mehr als zwei benachbarte
Übereinstimmungsfaktoren unter dem Grenzwert aufweisen.
Falls zwei oder weniger benachbarte Übereinstimmungsfaktoren unterhalb
des Grenzwertes liegen, wird der Reinheitsfaktor als Mittelwert aller
Übereinstimmungsfaktoren berechnet, die über dem Grenzwert liegen.
Alle Spektren, die zur Berechnung der Ähnlichkeitskurve verwendet wurden,
erhalten an der Unterkante des Fensters "Peak Signals" farbige
Strichmarkierungen ( ' ). Die Farbkodierungen der Markierungen haben
folgende Bedeutung:

42
Beurteilung der Peakreinheit
Berechnung der Reinheit

Schwarz: Übereinstimmungsfaktor liegt über dem Grenzwert.


Rot: Übereinstimmungsfaktor liegt unter dem Grenzwert und
wird zur Reinheitsberechnung verwendet.
Blau: Übereinstimmungsfaktor liegt unter dem Grenzwert und
wird nicht zur Reinheitsberechnung verwendet.

A - Reinheitsfaktor = 995.6 (90% der Spektren)


B - Reinheitsfaktor = 986.5 (60% der Spektren)
C - Reinheitsfaktor = 988.6 (30% der Spektren)
D - Reinheitsfaktor = 986.5 (60% der Spektren)
X = Übereinstimmungsfaktoren, die zur Berechnung des Reinheitsfaktors dienten
O = Übereinstimmungsfaktoren, die nicht zur Berechnung des Reinheitsfaktors dienten

Die oben gezeigten Beispiele verdeutlichen verschiedene Methoden zur


Beurteilung der Reinheit:
• Beispiel A zeigt nur einen Punkt in der Ähnlichkeitskurve unter dem
Grenzwert von 990. In diesem Fall wird der Reinheitsfaktor mit den neun
Punkten der Kurve berechnet (90%), die oberhalb des Grenzwertes liegen.
• Beispiel B zeigt sechs benachbarte Punkte unter dem Grenzwert. Der
Reinheitsfaktor wird als Mittelwert dieser sechs
Übereinstimmungsfaktoren berechnet.
• Beispiel C zeigt vier Datenpunkte unter dem Grenzwert, wovon nur drei
miteinander benachbart sind. Der Reinheitsfaktor wird als Mittelwert der
drei Übereinstimmungsfaktoren der benachbarten Punkte berechnet.
• Beispiel D zeigt zwei Gruppen jeweils drei benachbarter Punkte unter dem
Grenzwert. Der Reinheitsfaktor wird als Mittelwert dieser sechs
Datenpunkte errechnet.

43
Beurteilung der Peakreinheit
Berechnung der Reinheit

Verwenden der Grenzwertkurve (Include Threshold


Curve)
Eine Grenzwertkurve zeigt den Einfluß des Rauschens auf eine gegebene
Ähnlichkeitskurve. Der Effekt ist bei Peakstart und Peakende größer. Eine
Grenzwertkurve ist eine Ähnlichkeitskurve eines reinen Peaks mit einem
Rauschanteil.
Zusätzlich wird ein Mittelwert der einzelnen Grenzwerte im Informationsfeld
"Purity Information" angezeigt.

A - Reinheitsfaktor = 988.6 (30 % der Spektren)


B - Reinheitsfaktor = 986.5 (60 % der Spektren)
C - Grenzwertkurven
X = Übereinstimmungsfaktoren, die zur Berechnung des Reinheitsfaktors dienten
O = Übereinstimmungsfaktoren, die nicht zur Berechnung des Reinheitsfaktors dienten

Das Beispiel oben zeigt die unterschiedlichen Methoden zur Berechnung des
Reinheitsfaktors:
• In Beispiel A werden drei benachbarte Übereinstimmungsfaktoren
unterhalb der Grenzwertkurve (X) zur Berechnung des Reinheitsfaktors
benutzt. Die Grenzwerte dieser drei Punkte werden auch zur Berechnung
des Grenzwertes benutzt, der im Informationsfeld „Purity Information“
angezeigt wird.
• In Beispiel B werden beide Gruppen mit drei benachbarten
Übereinstimmungsfaktoren unterhalb der Grenzwertkurve (X) zur
Berechnung des Reinheitsfaktors verwendet. Diese sechs
Übereinstimmungsfaktoren werden auch zur Berechnung des
Grenzwertes benutzt, der im Informationsfeld „Purity Information“
angezeigt wird.

Klassifizierung von Peaks als rein oder verunreinigt


Der berechnete Reinheitsfaktor wird zur Reinheitsinformation auf dem
Bildschirm unterhalb des Peakspektrums verwendet. Wenn der
Reinheitsfaktor innerhalb der Grenzwertkurve liegt (die manuell gewählt
oder aus der Grenzwertkurve berechnet werden kann), wird der Peak als rein

44
Beurteilung der Peakreinheit
Berechnung der Reinheit

(pure) klassifiziert. Wenn der Reinheitsfaktor den Grenzwert überschreitet,


wird der Peak als verunreinigt klassifiziert.

HINWEIS Die entdeckte Verunreinigung ist eine Verunreinigung im Spektrum des


Peaks, was nicht unbedingt bedeutet, daß die eluierte Komponente unrein ist.
Verunreinigungen im Spektrum können durch Veränderung des
Lösungsmittels (Gradienten) verursacht werden oder treten in Peaks auf, die
nicht Basislinien-getrennt sind.

Layout des Fensters Peak Signals


Abbildung 9 zeigt einen reinen Peak. Die nach unten weisenden
Strichmarkierungen zeigen die Lage der Spektren, die zur Berechnung der
Peakreinheit genommen wurden. Die kleinen, nach unten weisenden
Strichmarkierungen zeigen die Lage der Referenzspektren, die zur
Berechnung der Peakreinheit genommen wurden. Die längeren, nach oben
gerichteten Strichmarkierungen zeigen Start und Ende des Peaks gemäß
Integrationsergebnis. Sie können die Optionen zur Darstellung der
Ähnlichkeitskurve im Dialogfeld „Advanced Purity Options“ wählen.

45
Beurteilung der Peakreinheit
Berechnung der Reinheit

Abbildung 9 Das Fenster “Peak Signals” mit Ähnlichkeits- und Grenzwertkurve

Nnorm
6

1
5
5
2
4
6
| |
3 | |
’ ’ ’ 990

2
7
3
8
1
4
9
0 ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ 1000
8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 min

1 Peakprofil
2 Peakstart
3 Start des Referenzspektrums
4 Ähnlichkeitskurve
5 Lage der gewählten Spektren
6 Peakende
7 Ende des Referenzspektrums
8 Grenzwertkurve
9 Markierungen zur Auswertung

46
Beurteilung der Peakreinheit
Grenzwertkurven

Grenzwertkurven

Der Einfluß des Rauschens ist in Abbildung 10 verdeutlicht. Der


Ähnlichkeitsfaktor nimmt mit zunehmendem Rauschen ab, oder bei
konstantem Rauschen, bei abnehmender Signalintensität (bei schlechterem
Signal-Rausch-Verhältnis).

Abbildung 10 Ähnlichkeitsfaktor als Funktion der Rauschintensität


Absorption [mAU]
25 mAU
25

20
Spektrale Verunreinigung
gößer als Rauschen
5 mAU

10

5 Spektrale Verunreinigung 1 mAU


innerhalb des Rauschens
1

1000 990 980 970 960 950 940

Abnehmende Änlichkeit

Die Grenzwertkurve zeigt den Einfluß des Rauschens auf eine gegebene
Ähnlichkeitskurve. Der Effekt ist bei Peakstart und Peakende größer. Eine
Grenzwertkurve kann für einen reinen Peak als Ähnlichkeitskurve mit einem
Rauschanteil beschrieben werden. Abbildung 11 (a) zeigt sowohl die
Ähnlichkeitskurve als auch die Grenzwertkurve für einen reinen Peak mit
Rauschen, Abbildung 11 (b) für einen unreinen Peak.

47
Beurteilung der Peakreinheit
Grenzwertkurven

Abbildung 11 Einfluß von Verunreinigung und Rauschen auf Ähnlichkeits- und Grenzwertkurven
(a) Peak ohne Verunreinigung aber mit Rauschen (b) Peak mit Verunreinigung und Rauschen

5 % Verunreinigung

980 980
Grenzwertkurve Ähnlichkeitskurve

Ähnlichkeitskurve Grenzwertkurve

1000 1000

Rauschen, 0.1 mAU Reinheitsspektrum 1 mAU

Der Grenzwert für das Rauschen wird automatisch ermittelt. Hierzu wird die
Standardabweichung aus Spektren mit reinem Rauschen zu einer definierten
Zeit und mit wählbarer Anzahl ermittelt. Die Standardwerte der Agilent
ChemStation liegen bei 14 Spektren zur Minute 0. In den nachfolgenden
Analysen können Sie den Grenzwert für das Rauschen als festen Wert gemäß
Ihrer Erfahrung oder gemäß den vorherigen Messungen festlegen.
Die Grenzwertkurve, durch die gestrichelte Linie dargestellt, bezeichnet den
Bereich, in dem die spektrale Verunreinigung unterhalb des Grenzwertes des
Rauschens liegt. Über diesem Grenzwert ist die spektrale Verunreinigung
größer als das Hintergrundrauschen und die Ähnlichkeitskurve schneidet die
Grenzwertkurve, was auf eine spektrale Verunreinigung hindeutet
(vorausgesetzt, die Parameter „Reference“ und „Noise“ wurden geeignet
gewählt).
Die Agilent ChemStation kann die Ähnlichkeits- und Grenzwertkurve in drei
Modi darstellen:
1 Ohne jegliche Veränderung, siehe Abbildung 12 (a);
2 Als natürlicher Logarithmus ln, siehe Abbildung 12 (b). Durch diese
Darstellung werden im Peakmaximum mehr Details sichtbar (unterer Teil
der Graphik);
1000 – similarity
3 Als Verhältnis: ratio = ----------------------------------------- , siehe Abbildung 12 (c).
1000 – threshold

48
Beurteilung der Peakreinheit
Grenzwertkurven

Bei einem spektral reinen Peak sind die Verhältniswerte kleiner als 1, bei
spektral verunreinigten Peaks größer als 1. Der Vorteil dieser
Verhältnisbildung liegt in der Darstellung nur einer Linie mit leichterer
Interpretationsmöglichkeit.

Abbildung 12 Grenzwert- und Ähnlichkeitskurven,


(a) wie berechnet,
(b) ln (des Grenzwertes) und ln (der Ähnlichkeit) und
(c) als Verhältniswert

(a) Wie berechnet (b) Als natürlicher Logarithmus (c) als Verhältnis

Grenzwertkurve ln (Grenzwert)

ln (Ähnlichkeit)

1
995
Ähnlichkeitskurve

995
1000 1000 0

49
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Dieser Abschnitt beinhaltet praktische Ratschläge zur Datenaufnahme, die


sich für die Analyse der Peakreinheit und zur Einstellung der
Peak-Reinheits-Optionen eignet.

Spektrenaufnahme
Das Überprüfen der Peakreinheit basiert auf dem Vergleich mehrerer
Spektren über einem Peak. Stellen Sie sicher, daß genügend Spektren hoher
Qualität für den Vergleich zur Verfügung stehen. Stellen Sie sicher, daß der
Detektor gut funktioniert, die Intensität der Detektorlampe in Ordnung ist,
und daß die geeignete Flußzelle und Schlitz gewählt sind. Grundsätzlich ist
die Optimierung in Hinsicht auf die Empfindlichkeit wichtiger als auf
Auflösung. Kleine Spektrenverschiebungen erstrecken sich über breite
Wellenlängenbereiche, so daß die Auflösung nicht so ausschlaggebend ist.
Verwenden Sie den Modus “Store All Spectra”, um kontinuierlich Spektren
aufzunehmen. Neuere Detektoren unterstützen den Modus “All in Peak”,
wobei kontinuierlich Spektren aufgenommen werden, wenn ein Peak
detektiert wurde. Zusätzlich werden 20 Spektren am Anfang des Laufes
gespeichert, um Basislinienrauschen für die Reinheitsanalyse zu bestimmen.
Setzen Sie die Peakbreite auf dem Dioden-Array-Detektor Bildschirm auf die
Breite des schmalsten interessierenden Peaks im Lauf.
Stellen Sie sicher, daß sich die Probenkonzentration im linearen Meßbereich
des Detektors befindet. Ist eine Substanz zu hoch konzentriert, mißt der
Detektor im Wellenlängenbereich höchster Absorption außerhalb seines
linearen Bereiches, wohingegen er bei den anderen Wellenlängen immernoch
im linearen Bereich bleibt. Daraus relultieren bei unterschiedlichen
Konzentrationen Spektren mit veränderter Form, so daß sie Substanz unter
Umständen als unrein erkannt wird. Ist die Konzentration der Substanz zu
gering, sind die Signal/Rausch-Verhältnisse für die Spektren niedrig. Somit
nimmt die Empfindlichkeit der Reinheitsanalyse ab. Die genaueste und
empfindlichste Reinheitsanalyse erhalten Sie für Peaks mit einer Höhe von
250 bis 800 mAU.
Im folgenden Abschnitt finden Sie empfohlene Einstellungen zur
Überprüfung der Peakreinheit. Wird eine mögliche Unreinheit detektiert,
können Sie sich die Ergebnisse kritisch betrachten, um die Unreinheit zu
bestätigen und weiter zu charakterisieren.

50
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Einstellung der “Purity Options”


Wählen Sie die folgenden Einstellungen in den entsprechenden Feldern des
Dialogfeldes “Purity Options”.

Referenzspektrum
Referenzspektren sind Basislinienspektren, die zur Korrektur der
Hintergrundabsorption verwendet werden. Wir empfehlen, immer ein
Referenzspektrum zu verwenden. Stellen Sie am besten "Automatic Peak
Baseline" ein. In diesem Modus wird je ein Spektrum der Basislinie in der
Nähe des Start- und Endpunktes der Integration genommen. Eine lineare
Extrapolation dieser beiden Spektren wird verwendet, um alle Spektren über
dem Peak zu korrigieren. Durch diese 2-Punkt Referenz können
Detektorabdrift und Veränderungen der mobilen Phase bei Verwendung von
Gradienten kompensiert werden. Die anderen Referenzmodi sind
abwärtskompatibel zu vorhergehenden Softwareversionen, so daß manche
Informationen zur Peakreinheit auch erhalten werden können, wenn nur
wenige Spektren aufgenommen wurden.
Sind zwei Peaks nicht komplett Basislinien-getrennt, kann die automatische
Auswahl eines Referenzspektrums (Verwendung von “Peak Baseline”) dazu
führen, daß das Referenzspektrum im Tal zwischen den beiden Peaks
gewählt wird. Ein nicht aufgelöster Peak kann nicht rein sein. In diesem Fall
kann der Reinheitstest dazu verwendet werden, nach anderen versteckten
Substanzen zu suchen. Verwenden Sie die Option “Manual Reference”, um
ein Referenzspektrum vor oder hinter der Gruppe von Peaks auszuwählen.

Wavelength Range
Verwenden Sie diese Einstellungen, um den Wellenlängenbereich, der für die
Reinheitsüberprüfung verwendet werden soll, festzulegen. Sie können z. B.
eine untere Grenze setzen für den Bereich, in dem die mobile Phase ein
hohes Rauschen verursacht. Sie können eine obere Grenze setzen, um
größere Wellenlängen, bei denen die interessierende Substanz nicht
absorbiert, auszugrenzen.

Purity Display
Sie können festlegen, wie die Reinheit berechnet wird und welche
Informationen in der Anzeige der Reinheit enthalten sind. Wir empfehlen, alle
Optionen auszuwählen, ausgenommen der Funktion “Signal Ratios”
(Signalverhältnisse). Die beiden wichtigsten Optionen sind “Draw & Use
Similarity Curve” (Ähnlichkeitskurve zeigen und verwenden) und “Include
Threshold Curve” (mit Grenzwertkurve). Wenn “Similarity Curve”

51
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

ausgewählt ist, wird das aktuelle Spektrum jeweils mit allen Spektren über
dem Peak verglichen und die Ergebnisse werden zur Bestimmung der
Reinheit verwendet.
Ein Grenzwert muß ausgewählt werden, um zu entscheiden, ob die Angabe
der Reinheit für ein Spektrum gut ist oder nicht. In der Vergangenheit mußte
dieser Grenzwert von Referenzmaterial ausgehend empirisch ermittelt
werden. Grundsätzlich beinhaltet diese Annäherung das Problem, daß sich
der passende Grenzwert mit Änderungen des Signal/Rausch-Verhältnisses
verändert. Dies hieß, daß sich mit veränderter Peakgröße auch der passende
Grenzwert änderte. Ist “Include Threshold Curve” ausgewählt, berechnet die
Software nun automatisch den passenden Grenzwert für jedes Spektrum des
Peaks, basierend auf dem individuellen Signal/Rausch-Verhältnis.

Spectra per Peak


Verwenden Sie “Spectra per Peak”, um festzulegen, wie viele Spektren
übereinandergelegt werden und wie sie ausgewählt werden. Wenn jedes
Spektrum mit einem Mittelwertspektrum verglichen wird, wird die Auswahl
der Spektren für die Mittelwertbildung gesteuert. “Set By User” (vom
Benutzer gewählt) beginnt mit dem ersten Spektrum auf jeder Seite des
Peaks, das den Grenzwert für die Absorption überschreitet und verteilt den
Rest der gewählten Peakanzahl gleichmäßig über den Peak. Verwenden Sie
“Automatic Spectra Selection” (automatische Auswahl der Spektren), wird
eine ungerade Anzahl an Spektren, beginnend mit dem Spektrum im
Peakmaximum, ausgewählt. Die verbleibenden Spektren werden dann je
nach Peakbreite und Symmetrie über dem Peak verteilt. Durch die Auswahl
von “Set By User”, wird sichergestellt, daß Spektren im gesamten Bereich bis
hin zu den Peakrändern verwendet werden. In der Regel repräsentieren 15
Spektren einen Peak ausreichend.
Der Grenzwert bestimmt, wie klein ein Spektrum sein darf, um noch in der
Überprüfung der Reinheit berücksichtigt zu werden. Normalerweise wird der
Wert auf 1 – 2 mAU gesetzt, um sicherzustellen, daß die Ränder der Peaks mit
überprüft werden.

Reinheit
Wenn “Include Threshold Curve” nicht angewählt ist, muß der Grenzwert für
die Reinheit verwendet werden, um die Grenze für die Überprüfung der
Reinheit manuell festzulegen. Ist “Threshold Curve” (Grenzwertkurve)
angewählt, wird dieser Wert in der Überprüfung der Reinheit nicht
verwendet.

52
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Einstellen weiterführender Optionen für die Überprüfung


der Reinheit (Advanced Purity Options)
Signalverarbeitung (Signal Processing)
Diese Einstellungen betreffen nur die Anzeige des Peaks und der Signale auf
dem Bildschirm “Purity Results”. Wir empfehlen die Verwendung der
voreingestellten Werte.

Spektrenverarbeitung (Spectra Processing)


Erlaubt Ihnen, mathematische Berechnungen, wie Glättung und Interpolation
der Spektren. In der Praxis vergrößert alles, das kleine Unterschiede in
Spektren vergrößert (Ableitungen) auch das Rauschen, während alles, das
das Rauschen vermindert (Glättung) die Empfindlichkeit für kleine
Veränderungen in den Spektren vermindert.

Spectra Normalization
Wählen Sie “Match” aus, wenn die Spektren sehr ähnlich sind, die
Konzentrationen jedoch stark variieren. Wählen Sie den gleichen Bereich für
die Normalisierung aus, den Sie im Dialogfeld “Purity Options” angegeben
haben.

Reinheit (Purity)
Das Feld “Purity Level Calculated With” legt das Spektrum oder die Spektra
fest, die für den Vergleich mit jedem einzelnen Spektrum über dem Peak
verwendet werden. Bei kleinen Peaks kann es von Vorteil sein, ein
Mittelwertspektrum zu verwenden. Im Peakmaximum befindet sich das
größte Spektrum des Peaks. Die Verwendung des Maximumspektrums
vereinfacht die Interpretation der Ergebnisse.
Durch die Auswahl von “Display as Similarity/Threshold” wird ein Vergleich
zwischen den Ergebnissen für jedes Spektrum und dem erwarteten Ergebnis
basierend auf der Grenzwertberechnung durchgeführt. Ist das Verhältnis
kleiner als 1, ist der Test für dieses Spektrum positiv, ist es größer als 1,
scheitert er. Dies beseitigt die Skalierungsprobleme, die auftreten, wenn Sie
sich von großen Spektren hin zu kleineren bewegen.

Grenzwertkurve (Threshold Curve)


Um Grenzwertkurven zu berechnen, verwendet die Software
Basislinienspektren, um das Rauschen zu berechnen. Voreingestellt ist die
Verwendung der ersten 14 Spektren eines Laufes. In dieser Region darf nie
ein Peak auftreten. Wenn der Peak sehr weit vom Beginn des Laufes entfernt

53
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

liegt oder Sie einen Gradienten verwenden, kann es genauer sein, das
Basislinienspektrum näher am Peak zu nehmen. Hierzu stellen Sie die
Startzeit auf einen anderen Wert ein. Abbildung 13 zeigt die Ergebnisse für
einen reinen Peak

Abbildung 13 Ergebnisse für einen reinen Peak

Ähnlichkeits-
verhältnis

Für einen reinen Peak liegt das Ähnlichkeitsverhältnis für jeden Punkt unter
1, die Spektren liegen gut übereinander und die Unterschiede zwischen den
Spektren zeigen keine Systematik. Das Feld ist dann grün und es wird
angezeigt ”The purity factor is within the calculated threshold limit” (der
Faktor für die Reinheit liegt innerhalb des berechneten Grenzwertes).
Abbildung 14 zeigt die Ergebnisse für einen Peak mit einer Unreinheit von
0.5 % .

54
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Abbildung 14 Ergebnisse für einen Peak mit einer Unreinheit von 0,5 %

Ähnlichkeits-
verhältnis

Bei einer Unreinheit des Spektrums von 0.5 % steigt das


Ähnlichkeitsverhältnis auf einen Wert über 1 an. Liegt das Verhältnis für 3
oder mehr aufeinanderfolgende Punkte über 1, schlägt die Überprüfung der
Reinheit fehl, das Feld wird erscheint rot und es wird folgendes angezeigt
"The purity factor exceeds the calculated threshold limit" (der
Reinheitsfaktor übersteigt den berechneten Grenzwert). Die Veränderungen
im Spektrum und die verschiedenen Spektren zeigen ein deutliches Muster.

Weitere Charakterisierung unreiner Peaks


Um unreine Peaks weiter zu charakterisieren, können 2 einfache Änderungen
in den Parametern vorgenommen werden und der Peak nochmals überprüft
werden. Setzen Sie im “Purity Options”-Bildschirm "Spectra per Peak'" auf
"automatic 3". Setzen Sie in den “Advanced Purity Options” den “Purity Level
Calculated with” auf “Front and Tail”. Hierduch vergleicht die Software ein
Spektrum vom Beginn des Peaks und ein Spektrum vom Ende des Peaks mit
jedem einzelnen Spektrum und erzeugt dabei 2 Ähnlichkeitsverhältnisse.
Abbildung 15 zeigt die Ergebnisse mit diesen veränderten Einstellungen.

55
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Abbildung 15 Peak mit einer Verunreinigung von 0,5 % und veränderten Einstellungen für die
Reinheit

Dies zeigt die ungefähre Position der Hauptkomponente und der


Verunreinigung. Beachten Sie, daß die relativen Größen der
Ähnlichkeitsverhältnisse nicht die relativen Größen der Hauptkomponente
und der Unreinheit widerspiegeln.

Fehlerhafte Ergebnisse beim Überprüfen der Reinheit


Zwei allgemeine Probleme der Daten stören die Überprüfung der Reinheit.
Zum einen sind nichtlineare Daten durch zu hohe Probenkonzentrationen zu
nennen. Dies ist leicht herauszufinden, da das Spektrum im Peakmaximum
nicht zu allen anderen Spektren paßt und Sie das charakteristische M Muster
für die Ähnlichkeit finden, wie in Abbildung 16 gezeigt.

56
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Abbildung 16 Beurteilung der Reinheit bei nichtlinearen Daten

M-symbol
pattern

Das zweite Problem tritt auf, wenn Regionen des Spektrums mit hoher
Hintergrundabsorption in die Überprüfung der Reinheit mit einbezogen
werden. Das Ähnlichkeitsverhältnis wird dann sehr verrauscht und die
Überlagerung der Spektren ist schlecht, wie in Abbildung 17 gezeigt.

Abbildung 17 Beurteilung der Reinheit bei hoher Hintergrundabsorption

Dies kann sehr leicht vermieden werden, indem der Wellenlängenbereich


verkleinert wird, um die verdächtigte Region auszugrenzen (in diesem Fall

57
Beurteilung der Peakreinheit
Verwendung der Analyse zur Peakreinheit

Einstellung der unteren Grenze auf 220 nm) und der Test erneut durchgeführt
wird. Die Ergebnisse sind in Abbildung 18 dargestellt.

Abbildung 18 Beurteilung der Reinheit mit verkleinertem Wellenlängenbereich

58
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Empfohlene Einstellungen

Im Folgenden finden Sie Beispieleinstellungen für die Dialogfelder “Purity


Options” und “Advanced Purity Options”, basierend auf dem jeweils
verwendeten Modus.

Beispiel 1: “All Spectra” oder “All in Peak with Similarity


Curves” — Automatischer Modus
Diese Einstellungen ermöglichen die genauesten Ergebnisse, aber erfordern
viel Platz auf der Festplatte und lange Rechenzeiten.

Empfohlene Einstellungen in Purity Preferences


Option Einstellung:
Reference
Spectrum Automatic; Peak Baseline
Wavelength
Range Wie erforderlich
Purity Display Draw Spectra (Spektrendarstellung); On
Draw Spectral Difference (Spektrale Abweichung zeigen);
On
Draw & Use Similarity Curve (Ähnlichkeitskurve zeigen &
verwenden); On
Include Threshold Curve (mit Grenzwertkurve); On
Draw Signals (Signal zeigen); On; Extracted from Spectra
(Aus den Spektren)
Draw Signal Ratios (Signalverhältnis zeigen); Off
Spectra per
Peak Automatic; 7

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Purity Display Die Peakreinheit wird mit einer Ähnlichkeitskurve
berechnet. Der Rauschbeitrag wird mit einer
Grenzwertkurve berechnet.
Spectra per

59
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Peak Diese Spektren dienen der Konstruktion der


Ähnlichkeitskurven über alle Spektren des Peaks. Unter
|“Berechnung der Reinheit” auf Seite 41 finden Sie weitere
Informationen zu den Grenzwerten der Spektren, die zur
Berechnung der Peakreinheit verwendet werden. Sie
sollten entweder 7 oder 9 Spektren pro Peak verwenden.
Grenzwert [mAU]; hängt von Ihrem System ab (0 bis 5
mAU). Grenzwert gilt für Spektren zur Berechnung der
Peakreinheit.
Spektren mit einem Absorptionsbereich unterhalb des
Grenzwertes werden nicht zur Berechnung der Reinheit
verwendet.
Reinheitsgrenz
wert Keine Verwendung mit Grenzwertkurven.

Empfohlene Einstellungen in Advanced Purity Options


Option Einstellung:
Signal
Processing Absorptionswert für die Signale [mAU]; 2
Normalize (Normalisierung); Maximum
Spectra
Processing All Off (Keine)
Spectra
Normalization Normalize (Normalisierung); Match (Übereinstimmung)
Reinheit Purity level calculated with (Reinheitsfaktor berechnet
mit); Average Spectrum (Gemitteltes Spektrum)
Similarity curve displayed as (Darstellung der
Ähnlichkeitskurve); Ln(Similarity & Threshold)
Grenzwertkurve Calculate standard deviation of noise at (min)
(Berechnung der Standardabweichung des Rauschens bei
min); 0 with; 14 spectra

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Purity: Verwenden Sie das Mittelwertspektrum zur
nicht-interaktiven Berechnung der Reinheit. Die
Reinheitskurve wird mit dem Mittelwertspektrum

60
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

berechnet aus der Einstellung „Spectra per Peak“


(Spektren pro Peak), wenn alle Spektren des Peaks
gespeichert werden.
Threshold
Curve: Berechnen Sie die Rauschhöhe mit Spektren, die in einem
flachen Abschnitt der Basislinie aufgezeichnet wurden
(etwa 12 bis 25 Spektren).

Beispiel 2: „All Spectra“ oder „All in Peak“; mit


Ähnlichkeitskurven; Manuelle Interpretation
Diese Einstellungen ermöglichen die genauesten Ergebnisse, aber erfordern
viel Platz auf der Festplatte und lange Rechenzeiten. Die manuelle
Auswertung wird hauptsächlich in der Methodenentwicklung eingesetzt.

Empfohlene Einstellungen in Purity Preferences


Option Einstellung:
Reference
Spectrum Automatic; Peak Baseline
Wavelength
Range Wie erforderlich
Purity Display Draw Spectra (Spektrendarstellung); On
Draw Spectral Difference (Spektrale Abweichung zeigen);
On
Draw & Use Similarity Curve (Ähnlichkeitskurve zeigen &
verwenden); On
Include Threshold Curve (mit Grenzwertkurve); On
Draw Signals (Signal zeigen); On; Extracted from Spectra
(Aus den Spektren)
Draw Signal Ratios (Signalverhältnis zeigen); Off
Spectra per
Peak Automatic; 7

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Reference
Spectra Es können zur interaktiven Bestimmung der Peakreinheit
auch manuell gewählte Referenzspektren benutzt werden.

61
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Purity Display Die Peakreinheit wird mit einer Ähnlichkeitskurve


berechnet. Der Rauschbeitrag wird mit einer
Grenzwertkurve berechnet.
Spectra per
Peak. Diese Spektren dienen, zusammen mit allen anderen
Spektren des Peaks, der Ermittlung der
Ähnlichkeitskurven. Die Zahl der Spektren wird im
Dialogfeld „Advanced: Purity“ eingestellt. Für ein
Mittelwertspektrum sollten 7oder 9, für Front/Tail
Spectrum 3 oder 5 und für All Peak Spectra 3 oder 5
Spektren gewählt werden.
Threshold [mAU]; Hängt von Ihrem System ab (0 to 5
mAU). Grenzwert gilt für Spektren zur Berechnung der
Peakreinheit.
Spektren mit einem Absorptionsbereich unterhalb des
Grenzwertes werden nicht zur Berechnung der Reinheit
verwendet.
Reinheit. Keine Verwendung mit Grenzwertkurven.

Empfohlene Einstellungen in Advanced Purity Options


Option Einstellung:
Signal
Processing Signal time range to display (Zeitbereich der
Signalanzeige)) (*peak width); 4
Absorbance threshold for signals (Absorptionsgrenzwert)
[mAU]; 2
Normalize (Normalisierung); Maximum
Spectra
Processing All Off (Keine)
Spectra
Normalization Normalize (Normalisierung); Match (Übereinstimmung)
Reinheit Purity level calculated with (Reinheitsfaktor berechnet
mit); All peak spectra (Alle Spektren des Peaks)
Similarity curve displayed as (Darstellung der
Ähnlichkeitskurve); Ln(Similarity & Threshold)
Grenzwertkurve Calculate standard deviation of noise at (min)
(Berechnung der Standardabweichung des Rauschens bei
min); 0 with; 14 spectra

62
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Reinheit Die interaktive Berechnung der Peakreinheit kann in
jedem Modus erfolgen. Die Ähnlichkeitskurve wird mit
dem gewählten Spektrum und allen gespeicherten
Spektren des Peaks berechnet.
Grenzwertkurve Für die gleiche Datei können Sie einen zuvor berechneten
Wert verwenden, um die Berechnungszeit zu verkürzen.
Berechnen Sie die Rauschhöhe mit Spektren, die in einem
flachen Abschnitt der Basislinie aufgezeichnet wurden
(etwa 12 bis 25 Spektren).

63
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Beispiel 3: „All Spectra“ oder „All in Peak“; keine


Ähnlichkeitskurven
Mit diesen Einstellungen werden Ergebnisse schneller aber mit reduzierter
Genauigkeit berechnet.

Empfohlene Einstellungen in Purity Preferences


Option Einstellung:
Reference
Spectrum Automatic; Peak Baseline
Wavelength
Range Wie erforderlich
Purity Display Draw Spectra (Spektrendarstellung); On
Draw Spectral Difference (Spektrale Abweichung zeigen);
Off
Draw & Use Similarity Curve (Ähnlichkeitskurve zeigen &
verwenden); Off
Include Threshold Curve (mit Grenzwertkurve); Off
Draw Signals (Signal zeigen); On; Extracted from Spectra
(Aus den Spektren)
Draw Signal Ratios (Signalverhältnis zeigen); Off
Spectra per
Peak Automatic; 5
Reinheit Purity Threshold (Grenzwert der Reinheit); 990

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Reference
Spectra Es können zur interaktiven Bestimmung der Peakreinheit
auch manuell gewählte Referenzspektren benutzt werden.
Spectra per
Peak Diese Spektren werden zur Berechnung der Peakreinheit
verwendet. Sie können entweder 5 oder 7 Spektren pro
Peak angeben.
Grenzwert gilt für Spektren zur Berechnung der
Peakreinheit.
Threshold [mAU]; Hängt von Ihrem System ab (0 bis 5

64
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

mAU);
Grenzwert der Spektren wird in der Berechnung der
Peakreinheit verwendet.
Spektren mit einem Absorptionsbereich unterhalb des
Grenzwertes werden nicht zur Berechnung der Reinheit
verwendet.
Reinheit Wird zur Bestimmung reiner/verunreinigter Peaks
verwendet.

Empfohlene Einstellungen im Dialogfeld „Advanced Purity“


Option Einstellung:
Signal
Processing Signal time range to display (Zeitbereich der
Signalanzeige)) (*peak width); 4
Absorbance threshold for signals (Absorptionsgrenzwert)
[mAU]; 2
Normalize (Normalisierung); Maximum
Spectra
Processing All Off (Keine)
Spectra
Normalization Normalize (Normalisierung); Match (Übereinstimmung)
Reinheit Purity level calculated with (Reinheitsfaktor berechnet
mit); Apex spectrum (Spektrum des Peakmaximums)
Grenzwertkurve Nicht verwendet

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Reinheit Sie können in Spectra auch die Einstellungen „Average“
oder „All“ wählen.

65
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Beispiel 4: Peak Controlled Spectra


Diese Einstellung erfordert den geringsten Platz auf der Festplatte und liefert
die schnellsten aber am wenigsten genauen Ergebnisse.

Empfohlene Einstellungen in Purity Preferences


Option Einstellung:
Reference
Spectrum Automatic; Apex (Spektrum des Peakmaximums)
Wavelength
Range Wie erforderlich
Purity Display Draw Spectra (Spektrendarstellung); On
Draw Spectral Difference (Spektrale Abweichung zeigen);
On
Draw & Use Similarity Curve (Ähnlichkeitskurve zeigen &
verwenden); Off
Include Threshold Curve (mit Grenzwertkurve); Off
Draw Signals (Signal zeigen); On; Stored in Data File
(Speicherung im Datensatz)
Draw Signal Ratios (Signalverhältnis zeigen): Off
Spectra per
Peak Automatic; All
Reinheit Purity Threshold (Grenzwert der Reinheit); 990

Weitere Informationen

Option Beschreibung
Reference
Spectra Es können zur interaktiven Bestimmung der Peakreinheit
auch manuell gewählte Referenzspektren benutzt werden.
Sie können auch die „Nearest Baseline“ (nächstgelegene
Basislinie) benutzen, wenn der Datensatz genügend
Basislinienspektren enthält.
Spectra per
Peak Diese Spektren werden zur Berechnung der Peakreinheit
verwendet.
Grenzwert gilt für Spektren zur Berechnung der
Peakreinheit.

66
Beurteilung der Peakreinheit
Empfohlene Einstellungen

Threshold [mAU]; Hängt von Ihrem System ab (0 to 5


mAU). Grenzwert gilt für Spektren zur Berechnung der
Peakreinheit.
Spektren mit einem Absorptionsbereich unterhalb des
Grenzwertes werden nicht zur Berechnung der Reinheit
verwendet.
Reinheit Wird zur Bestimmung reiner/verunreinigter Peaks
verwendet.

Empfohlene Einstellungen im Dialogfeld „Advanced Purity“


Option Einstellung:
Signal
Processing Signal time range to display (Zeitbereich der
Signalanzeige)) (*peak width); 4
Absorbance threshold for signals (Absorptionsgrenzwert)
[mAU]; 2
Normalize (Normalisierung); Maximum
Spectra
Processing All Off (Keine)
Spectra
Normalization Normalize (Normalisierung); Match (Übereinstimmung)
Reinheit Purity level calculated with (Reinheitsfaktor berechnet
mit); All peak spectra
Grenzwertkurve Nicht verwendet

Weitere Informationen
Option Beschreibung
Reinheit Sie können für Spektren auch die Einstellung „Average“
wählen.

67
Überprüfung der Peakreinheit (A.06.0x)

Dieser Abschnitt beschreibt die verschiedenen Methoden zur Überprüfung


der Peakreinheit:
• Überprüfen der Peakreinheit
• Anzeige der Peakreinheit
• Analyse der Peakreinheit
• Massenspektrale Peakreinheit

68
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Überprüfen der Peakreinheit

In jeder chromatographischen Analyse ist es wichtig zu wissen, ob ein Peak


aus einer oder aus mehreren Komponenten besteht. In der
Qualitätssicherung kann eine überlagerte Verunreinigung des
interessierenden Peaks die quantitative Auswertung verfälschen. Bei
Forschungsaufgaben kann eine überlagernde und unentdeckte Komponente
den Verlust wertvoller Information bedeuten.

Was versteht man unter “Überprüfung der Peakreinheit”?


Mit einer Überprüfung der Peakreinheit wird festgestellt, ob ein Peak zu
einer reinen Substanz gehört oder Verunreinigungen enthält. Diese
Bewertung basiert auf dem Vergleich von Spektren, die während der Elution
des Peaks aufgenommen werden. Pro Peak werden dafür 5 Spektren
verwendet: jeweils zwei Spektren auf der Anstiegs- und der Abstiegsflanke
des Peaks und ein Spektrum im Peakmaximum (das Top- oder
Apexspektrum). Die fünf Spektren werden gemittelt und mit allen Spektren
verglichen, die für diesen Peak aufgenommen worden sind.
Wenn diese Spektren nicht identisch mit dem gemittelten Spektrum sind,
enthält der Peak theoretisch eine spektrale Verunreinigung. Die spektrale
Verunreinigung kann von einer oder von mehreren Komponenten stammen,
von Peaks, die nicht basisliniengetrennt sind oder von der
Hintergrundabsorption.

VO RS IC HT Auch wenn identische Spektren gefunden werden, kann der Peak


Verunreinigungen enthalten. Dies ist der Fall, wenn die spektrale Absorption
im Vergleich zu der Hauptkomponente klein ist oder wenn die Verunreinigung
und die Hauptkomponente gleiche oder sehr ähnliche Spektren bei ähnlicher
Elutionszeit aufweisen.

Das Fenster "Spectra" zeigt die Spektren mit dem Vergleichsspektrum


(gemitteltes Spektrum), in einer normalisierten und einer überlagerten
Darstellung. Das Fenster "Purity" enthält die Signale mit der überlagerten
Information über den Reinheitsgrad. Der Reinheitsfaktor ist ein Maß für die
Ähnlichkeit dieser Spektren untereinander.
Eine Verunreinigung in einem Peak kann auch dann entdeckt werden, wenn
eine korrigierbare Hintergrundabsorption vorliegt. Normalerweise stört eine

69
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Hintergrundabsorption die Quantifizierung nicht, weil diese durch Korrektur


entfernt werden kann. Die Hintergrundabsorption kann sich in einem
Analysenlauf jedoch durch Variation des Lösungsmittels oder der
Lösungsmittelzusammensetzung verändern.

Der Übereinstimmungsfaktor (Match Factor)


Eine Aufdeckung von Verunreinigungen in einem Peak durch visuellen
Spektrenvergleich ist zeitraubend und eignet sich nicht zur Automatisierung.
Daher stehen verschiedene statistische Verfahren für den automatischen
Spektrenvergleich zur Verfügung. Mit einem mathematischen Verfahren wird
die Ähnlichkeit zwischen den Spektren numerisch verglichen. Es berechnet
einen Übereinstimmungsfaktor, der den Ähnlichkeitsgrad zwischen den
Spektren berechnet.
Aus der Ähnlichkeit folgt der Übereinstimmungsfaktor mit folgender
Definition:

 ∑ x × ∑ y 
2

10 ×  ∑ x × y –  -------------------------- 
3

  n 
Match Factor = --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
2 ∑
 x × ∑ x   2 ∑
y × ∑ y 
 ∑ x –  --------------------------   ×  ∑ y –  -------------------------- 
  n    n 

x und y sind die gemessenen Absorptionswerte bei derselben Wellenlänge in


beiden Spektren; n ist die Anzahl der Datenpunkte und Σ die Summe der
Datenpunkte. Der Wertebereich beginnt mit 0 bei keiner Übereinstimmung
und reicht bis 1000 bei identischen Spektren. Allgemein bedeuten Werte von
größer 990, daß die Spektren ähnlich sind. Werte zwischen 900 und 990
deuten auf Ähnlichkeiten in den Spektren hin, wobei die Ergebnisse mit
Vorsicht zu interpretieren sind. Alle Werte kleiner als 900 bedeuten, daß die
Spektren unterschiedlich sind.
Der Übereinstimmungsfaktor hängt von verschiedenen Parametern ab, die
durch die Probe und die Trennmethode vorgegeben werden. Dazu gehören:
Substanzspezifität, Absorptionsbeiträge der Matrix und die spektrale
Rauschhöhe sowie Hintergrundabsorptionen und Verschiebungen der
Spektren, die durch Einflüsse der Lösungsmittel oder Analysengeräte
hervorgerufen werden (unterschiedliche Wellenlängenkalibrierungen).

70
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Glättung von Spektren


Die Reinheitskontrolle ist unzuverlässig, wenn die Rauschhöhe des
Spektrums genauso groß ist, wie die Absorption selbst. Die Spektrenglättung
funktioniert folgendermaßen:
1 Für eine definierte Anzahl von Datenpunkten, zum Beispiel 5, auch als
Filter bezeichnet, wird eine kubische Regression durchgeführt, um daraus
einen neuen Datenpunkt zu ermitteln.
2 Der Filter wird dann einen Datenpunkt weiter gerückt. Vier der bei der
letzten Regression verwendeten Datenpunkte und ein zusätzlicher werden
demnach für die Ermittlung des nächsten Punktes verwendet.
Durch die Verwendung des Glättungsalgorithmus, kann Untergrundrauschen
statistisch verringert werden, wodurch die Identifizierung von Peaks im
Spektrum zuverlässiger wird.

HINWEIS Der Glättungsalgorithmus kann jedoch, abhängig von der Länge des Filters,
also der Anzahl der Datenpunkte, die im Glättungsalgorithmus Verwendung
finden, das Profil des Spektrums verändern. Empfehlenswert ist die Glättung
aller Spektren mit dem gleichen Filter, bevor Vergleiche der Spektren
durchgeführt werden.

Interpolation von Spektren


Wenn Sie Spektren mit niedriger Auflösung aufgenommen haben, können Sie
die Funktion Splining (Interpolation) verwenden, um Ihrem Spektrum mehr
das Aussehen eines Kurvenlaufs, als das eines Polygons zu geben. Hierbei
werden mittels trigonometrischer Funktionen zusätzliche Datenpunkte
zwischen den tatsächlichen Datenpunkten des Spektrums berechnet. Bei der
Verwendung dieser Funktion bleiben die Orginaldatenpunkte des Spektrums
erhalten.

Logarithmieren von Spektren


Logarithmierte Spektren komprimieren die Absorptionsskala. Sie können
sehr nützlich sein, wenn die Absorption über einen großen Bereich geht.

Bildung der Ableitung von Spektren


In abgeleiteten Spektren sind bestimmte Details deutlicher sichtbar, als in
den Originalspektren. Kleine Unterschiede treten deutlicher hervor und sind
visuell leichter zu beurteilen. Allerdings nimmt das Rauschen zu, was den
Einsatzbereich abgeleiteter Spektren begrenzt.

71
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

Hintergrundkorrektur mit Referenzspektren (Background


Correction)
Zur Korrektur von Hintergrundeffekten und der Extraktion von Spektren aus
einem Datensatz stehen verschiedene Korrekturmöglichkeiten zur
Verfügung:

Manuelles Auswählen der Referenz (Manual Reference Selection)


Wenn ein Referenzspektrum ausgewählt worden ist, wird das gewählte
Spektrum zur festgelegten Zeit aus dem Datensatz genommen und von jedem
Spektrum des Peaks abgezogen. Diese Korrektur eignet sich nicht bei
variierender Hintergrundabsorption.
Wenn zwei Basislinienspektren ausgewählt worden sind, wird zwischen den
zwei Spektren linear interpoliert. Das aus den zwei Spektren interpolierte
Spektrum wird von den Peakspektren abgezogen. Diese Korrektur eignet sich
zur Kompensation einer sich langsam ändernden Hintergrundabsorption.

Automatisches Auswählen des Referenzspektrums (Automatic


Reference Selection)
Bei der automatischen Auswahl des Referenzspektrums hängen die
gewählten Referenzspektren vom Speichermodus der Spektrens im
Datensatz ab.
All Spectra (Alle Spektren): Die integrierten Spektren am Anfang und
Ende des ausgewählten Peaks werden als Referenzspektren genommen und
linear interpoliert, wie bei der manuellen Auswahl von zwei
Referenzspektren.
Peak-controlled Spectra (peakkontrollierte Spektren): Ein
Referenzspektrum wird an einem dem Peak nächstgelegenen Punkt der
Basislinie gewählt und subtrahiert, wie bei der manuellen Auswahl von
einem Spektrum.

Möglichkeiten zur Bestimmung der Peakreinheit


Methoden zur Bestimmung der Peakreinheit können nur für Peaks mit
Basislinientrennung verwendet werden. Bei Peaks ohne Basislinientrennung
ist die Bestimmung der Peakreinheit komplizierter, da jeder Peak einen
Anteil des benachbarten Peaks als Verunreinigung enthält.
Peakreinheit kann interaktiv, Peak für Peak, ermittelt werden und zwar für
alle Peaks eines Datensatzes, oder im Anschluß an einen Analysenlauf

72
Beurteilung der Peakreinheit
Überprüfen der Peakreinheit

automatisch als Teil einer Methode, bei der beispielsweise das


Spektrenreport-Format "Detail+Spectrum" gewählt wurde.
Sie können die Ermittlung der Peakreinheit hinsichtlich Genauigkeit oder
Durchsatz durch Anpassung folgender Vorgaben optimieren:
• Wellenlängenbereich, der zur Berechnung verwendet wird,
• Referenzspektren,
• Grenzwert für die Reinheit (Purity Threshold),
• Bearbeitung der Spektren einschließlich Logarithmierung, Glättung,
Interpolation und Bildung von Ableitungen verschiedener Ordnung,
• Berechnung und Anzeige der Reinheitskomponenten (dies umfaßt die
Spektren, die Unterschiede der Spektren, die Signale, die Ähnlichkeit- und
Grenzwertkurven).
Die Möglichkeiten zur Beurteilung der Peakreinheit werden in den folgenden
Abschnitten besprochen. Sie umfassen:
• Normalisierung der Spektren (Spectral Normalization): Vergleich
von normalisierten Spektren aus verschiedenen Bereichen des Peaks,
• Ähnlichkeitskurve (Similarity Curve): Vergleich eines gemittelten
oder eines ausgewählten Spektrums mit allen anderen Spektren, die
während der Elution des Peaks aufgenommen wurden.

73
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Anzeige der Peakreinheit

Fenster "Spectra"
Das Fenster "Spectra" zeigt die fünf Spektren, mit denen das gemittelte
Spektrum berechnet wird, das in der Reinheitsberechnung verwendet wird.
Um die Peakspektren detaillierter zu untersuchen, können Sie die
graphischen Funktionen der Agilent ChemStation verwenden.

Spektrennormalisierung
Eine bekannte Methode zur Beurteilung der Peakreinheit bedient sich der
Normalisierung mit anschließendem Vergleich der Peakspektren. Die
Normalisierung kompensiert Konzentrationsänderungen in der Detektorzelle
während der Elution des Peaks. Diese Funktion ist als Teil der Agilent
ChemStation verfügbar.
Die Spektren werden zum Beispiel im Peakanstieg, dem Peakabfall und dem
Maximum aufgenommen. Die Spektren werden normalisiert und zur
graphischen Darstellung übereinander gelegt. Diese Methode eignet sich gut
für eine interaktive Datenauswertung und kann für die automatische
Routineanalyse angepaßt werden.
Alternativ können, wenn die Angabe eines numerischen Faktors gewünscht
wird, können die Spektren aus dem Peakanstieg und -abfall miteinander
mathematisch verglichen werden und die Reinheitsfaktoren werden
zusammen mit der Retentionszeit ausgedruckt.
Abbildung 19 zeigt ein Beispiel für Spektren aus Peakanstieg, Maximum und
Peakabfall mit Normalisierung. Sowohl die visuelle Beurteilung, als auch der
mathematisch gefundene Reinheitsfaktor zeigen deutlich den Unterschied
zwischen reinen und verunreinigten Peaks.

74
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Abbildung 19 Peakreinheitskontrolle durch Übereinanderlegen von Spektren

Das Fenster "Purity"


Der Inhalt Fensters "Purity" hängt von den ausgewählten "Purity"
(Reinheits)-Parametern ab. Standardmäßig wird das Reinheitsverhältnis
(Purity Ratio) angezeigt, das die Signale mit überlagerten Ähnlichkeits- sowie
Grenzwertkurven zeigt, siehe Abbildung 20). Die grünen und roten Banden
am unteren Rand zeigen den vom Anwender definierten Grenzwert. Der
berechnete Reinheitswert für jedes Spektrum im Peak wird als schwarzer
Punkt angegeben; wenn der Punkt innerhalb der grünen Bande liegt, liegt die
Reinheit des Spektrums innerhalb der akzeptierten Definition der Reinheit.

75
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Abbildung 20 Das Fenster "Purity"

Spektrale Ähnlichkeitskurven
Die spektralen Ähnlichkeitskurven werden in dem Fenster "Purity" der
Bildschirmdarstellung Spectra gezeigt, (siehe Abbildung 20)
Wenn Einzelheiten der Darstellung nicht klar zu erkennen sind, dann können
Sie das Fenster vergrößern, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten
und diese ziehen. Auf dem Bildschirm wird beim Ziehen der Maus ein
Rechteck angezeigt, das den zu vergrößernden Ausschnitt markiert.
Doppelklicken mit der linken Maustaste stellt den Originalbildschirm wieder
her.
Spektrale Ähnlichkeitskurven geben die genauesten Informationen zur
Reinheit eines Peaks. Alle Spektren eines Peaks werden wahlweise mit einem
oder mehreren Spektren verglichen, standardmäßig mit einem gemittelten
Spektrum. Der Grad der Übereinstimmung, bzw. die spektrale Ähnlichkeit
wird gegen die Elutionszeit aufgetragen. Das ideale Profil ist eine flache Linie
bei 1000, wie in Abbildung 21 (a) gezeigt.
Zu Beginn und Ende eines Peaks nimmt die Rauschhöhe relativ zur
Signalhöhe zu, der Beitrag des spektralen Hintergrundrauschens zum

76
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Peakspektrum wird stärker. Der Beitrag der Rauschhöhe zur


Ähnlichkeitskurve ist in Abbildung 21 (b) gezeigt.

Abbildung 21 Ähnlichkeitskurven eines reinen Peaks mit und ohne Rauschen in Relation zum
idealen Ähnlichkeitsfaktor (1000) und anwenderdefiniertem Grenzwert (980)
a) Peak ohne Verunreinigung und Rauschen b) Peak ohne Verunreinigung mit Rauschen

980 980

Ähnlichkeitskurve Ähnlichkeitskurve
.

1000 1000

Peakspektrum, 20 mAU Rauschen, 0.1 mAU

Grenzwertkurve
Die Grenzwertkurve zeigt den Einfluß des Rauschens auf eine gegebene
Ähnlichkeitskurve. Der Effekt ist bei Peakstart und Peakende größer. Eine
Grenzwertkurve ist eine Ähnlichkeitskurve eines reinen Peaks mit einem
Rauschanteil.
Der Einfluß des Rauschens ist in Figure 22 verdeutlicht. Der
Ähnlichkeitsfaktor nimmt mit abnehmendem Signal-Rausch-Verhältnis ab
oder, bei konstantem Rauschen, bei abnehmendem Absorptionsbereich.

77
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Figure 22 Ähnlichkeitsfaktor als Funktion der Rauschintensität


Absorption [mAU]
25 mAU
25

20
Spektrale Verunreinigung
gößer als Rauschen

5 mAU

10

5 1 mAU
Spektrale Verunreinigung
innerhalb des Rauschens
1

1000 990 980 970 960 950 940

Abnehmende Änlichkeit

Abbildung 23 (a) zeigt sowohl die Ähnlichkeitskurve als auch die


Grenzwertkurve für einen reinen Peak mit Rauschen, Abbildung 23 (b) für
einen unreinen Peak.

Abbildung 23 Einfluß von Verunreinigung und Rauschen auf Ähnlichkeits- und Grenzwertkurven
(a) Peak ohne Verunreinigung aber mit Rauschen (b) Peak mit Verunreinigung und Rauschen

5% Verunreinigung

980 980
Ähnlichkeitskurve
Grenzwertkurve
Ähnlichkeitskurve Grenzwertkurve

1000 1000

Rauschen, 0.1 mAU Reinheitsspektrum 1 mAU

78
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Der Grenzwert für das Rauschen wird automatisch bestimmt, basierend auf
der Standardabweichung aus Spektren mit reinem Rauschen zu einer
definierten Zeit. Standardmäßig werden 14 Spektren zu Beginn des
Analysenlaufs gewählt (z.B. bei 0 Minuten).
Die Grenzwertkurve, durch die gestrichelte Linie dargestellt, bezeichnet den
Bereich, in dem die spektrale Verunreinigung unterhalb des Grenzwertes des
Rauschens liegt. Über diesem Grenzwert ist die spektrale Verunreinigung
größer als das Hintergrundrauschen und die Ähnlichkeitskurve schneidet die
Grenzwertkurve, was auf eine spektrale Verunreinigung hindeutet
(vorausgesetzt, die Parameter „Reference“ und „Noise“ wurden geeignet
gewählt).

Verwendung vorgegebener Zielspektren


Die Agilent ChemStation erlaubt die Berechnung eines Reinheitsfaktors und
von Ähnlichkeitskurven relativ zu verschiedenen Zielspektren, wie in
Abbildung 24 gezeigt. Im allgemeinen bietet der standardmäßige Vergleich
mit dem gemittelten Spektrum die beste Information bei unbekannten
Verunreinigungen. Die Flexibilität der Wahl eines definierten Zielspektrums
ist in solchen Fällen wertvoll, wo in der Auswertung eine Annahme über die
Lage der Verunreinigung gemacht werden muß oder wo die Empfindlichkeit
in der Beurteilung der Reinheit erhöht werden muß. Ein Beispiel soll die
Anwendungsmöglichkeiten verdeutlichen: Falls eine Verunreinigung am
Peakende vermutet wird, kann die Wahl des Spektrums aus Maximum oder
Peakabfall zum Vergleich mit allen anderen Spektren die besten
Informationen liefern.

Abbildung 24 Verhältniskurven mit verschiedenen Zielspektren aus einem Peak

Peak mit 2% Verunreinigung

1
0
Verhältnis des Front- Verhältnis des Verhältnis des Verhältnis des
spektrums zu allen Maximum- hinteren gemittelten
anderen Spektren spektrums zu allen spektrums zu allen spektrums zu allen
anderen Spektren anderen Spektren anderen Spektren

79
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Abbildung 24 zeigt die Verhältniskurven mit Spektren aus Peakanstieg,


Maximum, Peakabfall und Durchschnittspektrum eines Peaks mit
Verunreinigung hinter dem Peakmaximum (Apex).
Das Front Spectrum (Spektrum des Peakanstieges) zeigt eine geringe
Verunreinigung am Peakende. Die Abweichung in dieser ersten
Verhältniskurve ist klein, weil das Anstiegsspektrum eine geringe Absorption
aufweist (mit der Folge einer hoch liegenden Verhältniskurve).
Das Apex Spectrum (Spektrum im Maximum) zeigt eine geringe
Verunreinigung am Peakanfang (das Spektrum des Maximums enthält nur
eine kleine Menge der Verunreinigung) und eine starke Verunreinigung am
Peakende.
Das Tail Spectrum (Spektrum des Peakendes) mit einer deutlichen
Verunreinigung zeigt eine Verunreinigung am Peakanfang.
Das Average Spectrum (ein Mittelwert der fünf ausgewählten Spektren
eines Peaks) zeigt die spektrale Verunreinigung im gesamten Peak an. Das
Mittelwertspektrum enthält mehr Beiträge der Verunreinigung, als das
Spektrum des Maximums. Es zeigt stärkere Verunreinigung am Peakbeginn
(Elutionsfront) und geringere Verunreinigung am Peakende, als die
Verhältnisauftragung mit dem Spektrum des Maximums.
Die Form der Ähnlichkeits-, Grenzwert und Verhältniskurven hängt von Lage,
Stärke und spektralen Besonderheiten der Verunreinigung ab, so daß keine
allgemeine Beschreibung erfolgen kann. Die Form kann sich von Fall zu Fall
ändern.

Anzeige und Berechnung der Peakreinheit


Der Reinheitsfaktor ist kein absolutes Maß für die Peakreinheit. Er ist eine
Funktion der Parameter, die in den Berechnungen verwendet wurden und
dabei besonders abhängig vom Grenzwert für die Reinheit ("Purity
Threshold" ). Aus diesem Grund müssen die Ergebnisse zusammen mit den
Grenzwerten interpretiert werden. Für reine Peaks werden auch bei
verschiedenen Parametervorgaben vergleichbare Ergebnisse erzielt. Dies gilt
nicht für unreine Peaks, für die eine Worst-Case-Analyse durchgeführt wird.
Nur Datenpunkte, die zu einer Verunreinigung gehören, zum Beispiel
Spektren, die unterhalb des Grenzwertes liegen, werden in der Berechnung
berücksichtigt. Daher kann eine Änderung des Grenzwertes den
Reinheitsfaktor für einen verunreinigten Peak drastisch beeinflussen. Im
folgenden Abschnitt finden Sie detailiertere Informationen zu diesen
Berechnungen. Eine genaue Beschreibung der Ähnlichkeitskurven der

80
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Agilent ChemStation finden Sie unter “Spektrale Ähnlichkeitskurven” auf


Seite 76.

All Spectra (Alle Spektren)


1 Alle referenzkorrigierten Spektren eines Peaks, die über dem
anwenderdefinierten Grenzwert liegen, werden für die Berechnung der
Reinheit und der Grenzwertkurven verwendet; fünf dieser Spektren
werden in dem Fenster "Spectra" dargestellt.
2 Die Übereinstimmungsfaktoren werden zwischen jedem Spektrum und
dem Mittel der fünf im Fenster "Spectra" angezeigten Spektren berechnet.
Sie werden als einzelne Punkte in der Darstellung "Purity" eingezeichnet.
Beim anwenderdefinierten Grenzwert (User-defined Threshold) wird die
Ähnlichkeitskurve dem Purity-Plot überlagert.
Beim berechneten Grenzwert (Calculated Threshold) wird der Grenzwert
für jedes Spektrum berechnet: Die Reinheitswerte der Spektren werden
als das Verhältnis zwischen dem Grenzwert und dem Ähnlichkeitswert
definiert, was eine gerade Linie ergibt. Dies zeigt die reinen und
verunreinigten Datenpunkte deutlicher. Die Ähnlichkeits- und
Grenzwertkurven werden dem Purity-Plot überlagert.

Peak-kontrollierte Spektren
1 Alle referenzkorrigierten Spektren eines Peaks, die über dem
anwenderdefinierten Grenzwert liegen, werden für die Berechnung
verwendet und in dem Fenster "Spectra" dargestellt.
2 Die Übereinstimmungsfaktoren werden zwischen jedem Spektrum, das in
dem Fenster "Spectra" dargestellt ist und dem Mittel dieser Spektren
berechnet; sie werden als einzelne Punkte in der Bildschirmdarstellung
"Purity" eingezeichnet.
3 Der Reinheitswert ist der Mittelwert aller berechneter
Übereinstimmungsfaktoren.

Klassifizierung von Peaks als rein oder verunreinigt


Der berechnete Reinheitsfaktor wird zur Reinheitsinformationauf dem
Bildschirm unterhalb des Peakspektrums verwendet. Wenn der
Reinheitsfaktor innerhalb der Grenzwertkurve liegt (die manuell gewählt
oder aus der Grenzwertkurve berechnet werden kann), wird der Peak als rein
(pure) klassifiziert. Wenn der Reinheitsfaktor den Grenzwert überschreitet,
wird der Peak als verunreinigt klassifiziert.

81
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

HINWEIS Die entdeckte Verunreinigung ist eine Verunreinigung im Spektrum des


Peaks, was nicht unbedingt bedeutet, daß die eluierte Komponente unrein ist.
Verunreinigungen im Spektrum können durch Veränderungen des
Lösungsmittels (Gradienten) verursacht werden oder bei Peaks auftreten, die
nicht basisliniengetrennt sind.

Informationen zur Peakreinheit


Reinheitsfaktor (Purity Factor)
Der Reinheitsfaktor ist ein numerischer Wert für die Reinheit des Peaks.
• Wenn der Peak als rein klassifiziert worden ist, ist der Reinheitsfaktor der
Mittelwert aller Spektren, die innerhalb der Grenzen liegen.
• Wenn der Peak als verunreinigt klassifiziert worden ist, ist der
Reinheitsfaktor der Mittelwert aller Spektren, die außerhalb der Grenzen
liegen.
In jedem Fall sind die Anzahl der Spektren, die für die Berechnung des
Reinheitsfaktors verwendet werden, und die Basis für die Berechnung
festgelegt.

Grenzwert (Threshold)
Für einen berechneten Grenzwert ist dies der Mittelwert all der Spektren, die
für die Berechnung des Reinheitsfaktors verwendet worden sind. Für einen
anwenderdefinierten Grenzwert ist dies der Wert, den Sie in der Option
"Purity" eingeben.

Peakspektren (Peak Spectra)


"Peak Spectra" zeigt Einzelheiten der fünf Spektren, die für die Berechnung
der Reinheit ausgewählt worden sind. Sie können sich außerdem folgendes
anzeigen lassen:
• Difference spectra (Differenzspektren): Spektren, die als die
Differenz zwischen dem gemittelten Spektrum und dem individuell
ausgewählten Spektrum berechnet worden sind. Reine Peaks zeigen in
dem Differenzspektrum nur Rauschen.
• Compared spectrum (Vergleichsspektren): das gemittelte Spektrum,
das für die Reinheitsberechnung verwendet wird.
• All recorded spectra (Alle aufgenommenen Spektren): Alle
Spektren, die über einen Peak hinweg aufgenommen wurden.

82
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

• Reference spectra (Referenzspektren): Das Spektrum oder die


Spektren, die für die Hintergrundkorrektur verwendet wurden.

Berechnung der Reinheit und des Rauschens


Die Information über die Berechnung der Reinheit (Purity Calculation) gibt
die Anzahl der aufgenommenen Spektren und die Anzahl der Spektren an, die
innerhalb des Grenzwertes liegen bzw. den Grenzwert überschreiten, und die
für die Berechnung des Reinheitsfaktors verwendet worden sind.
Die Information über die Berechnung des Rauschens (Noise Calculation) gibt
die Anzahl der Spektren an, die für die Berechnung des Grenzwerts für das
Rauschen verwendet worden sind sowie die Ergebnisse der Berechnung. Sie
können das Rauschspektrum sowie die Rauschstatistik graphisch darstellen
lassen. Weiterhin können Sie die Parameter für die Berechnung des
Rauschens verändern.

HINWEIS Das Verändern der Parameter für die Berechnung des Untergrundrauschens
kann einen großen Einfluß auf die Ergebnisse der Reinheitsberechnung
haben. Stellen Sie sicher, daß Sie die Informationen sorgfältig lesen, die im
Abschnitt “Optionen für "Advanced Peak Purity" (erweiterte Peakreinheit)”
auf Seite 84 gegeben werden, bevor Sie irgendwelche Änderungen
vornehmen.

Purity Curve (Reinheitskurve)


Die Reinheitskurve zeigt die Ergebnisse des Vergleichs von jedem Spektrums
eines Peaks mit dem gemittelten Spektrum. Die Werte in der Spalte
"Difference" stellen die arithmetische Differenz zwischen den Werten in der
Spalte "Purity" und der Spalte "Threshold" dar. Mit dem Wert "Differenz" wird
festgelegt, welche Spektren in der Berechnung der Reinheitsfaktors (Purity
Factor) und des Grenzwertes (Threshold Value) für den Peak verwendet
werden.

More Purity Curves (Weitere Reinheitskurven)


Die Information in "More Purity Curves" zeigt die Ergebnisse der
Berechnungen der Reinheit mit den Peakanstiegs-, Maximum- und
Peakabfallsspektren zusätzlich zm gemittelten Spektrum (siehe “Verwendung
vorgegebener Zielspektren” auf Seite 79). Sie können sich wahlweise die
Ähnlichkeitskurven jeder einzelnen oder aller Berechnungen anzeigen lassen.
Sie können ebenfalls die Parameter der Reinheitsberechnung verändern
sowie die Art und Weise der Darstellung.

83
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

HINWEIS Das Verändern der Parameter für die Berechnung der Reinheit kann einen
großen Einfluß auf die Ergebnisse der Berechnung der Reinheit haben. Stellen
Sie sicher, daß Sie die Information aus Abschnitt “Optionen für "Advanced
Peak Purity" (erweiterte Peakreinheit)” auf Seite 84 sorgfältig lesen, bevor Sie
irgendwelche Änderungen durchführen.

Optionen für "Advanced Peak Purity" (erweiterte


Peakreinheit)
Änderungen, die in den Optionen "Advanced Peak Purity" (erweiterte
Peakreinheit) vorgenommen werden, können einen großen Einfluß auf die
Ergebnisse der Berechnung der Peakreinheit haben. Wir empfehlen, daß Sie
keine Änderungen durchführen, wenn Ihnen nicht vollständig klar ist,
welchen Effekt Ihre Änderungen auf die Ergebnisse haben werden.

Purity Calculation (Berechnung der Reinheit)


"Purity Calculations" verwendet standardmäßig den Mittelwert der fünf
Spektren, die über den Peak hinweg genommen worden sind (siehe “Was
versteht man unter “Überprüfung der Peakreinheit”?” auf Seite 69), aber Sie
können der Berechnung auch andere Spektren zugrundelegen:
All peak spectra (alle Peakspektren) verwendet jedes der fünf
ausgewählten Spektren, um fünf Ergebnisse zu erstellen, die in dem gleichem
Fenster dargestellt werden.
Die Optionen Apex spectrum (Maximumspektrum), Front spectrum
(Peakanstiegsspektrum) und Tail spectrum (Peakabfallsspektrum)
verwenden spezifische Spektren, mit denen Sie die Empfindlichkeit der
Reinheitsanalyse verbessern können (siehe “Verwendung vorgegebener
Zielspektren” auf Seite 79).
Front & Tail spectrum liefert zwei Ergebnissätze, die mit den Front-
(Peakanstiegs-) und Tail (Peakabfalls-)spektren als Basis bei der Berechnung
der Reinheit ermittelt worden sind.
Standardmäßig wird die Peakreinheit als das Reinheitsverhältnis "Purity
Ratio" angegeben (siehe Abbildung 20), aber Sie können sich die Ergebnisse
auch als Ähnlichkeits- und Grenzwertkurven anzeigen lassen.
Die Agilent ChemStation kann die Ähnlichkeits- und Grenzwertkurve in drei
Modi darstellen:
1 Ohne jegliche Veränderung, siehe Abbildung 25 (a);
2 Als natürlicher Logarithmus ln, siehe Abbildung 25 (b). Durch diese

84
Beurteilung der Peakreinheit
Anzeige der Peakreinheit

Darstellung werden im Peakmaximum mehr Details sichtbar (unterer Teil


der Graphik);
1000 – similarity
3 Als Verhältnis: ratio = ----------------------------------------- , siehe Abbildung 25 (c).
1000 – threshold

Bei einem spektral reinem Peak sind die Verhältniswerte kleiner 1, bei
spektral verunreinigten Peaks größer als 1. Der Vorteil dieser
Verhältnisbildung liegt in der Darstellung nur einer Linie mit leichter
Interpretationsmöglichkeit.

Abbildung 25 Grenzwert- und Ähnlichkeitskurven,


(a) wie berechnet,
(b) ln (des Grenzwertes) und ln (der Ähnlichkeit) und
(c) als Verhältniswert

(a) Wie berechnet (b) Als natürlicher Logarithmus (c) als Verhältnis

Grenzwertkurve ln (Grenzwert)

ln (Ähnlichkeit)

1
995
Ähnlichkeitskurve

995
1000 1000 0

Grenzwert für das Rauschen


Standardmäßig wird der Grenzwert für das Rauschen automatisch bestimmt
über die Standardabweichung von 14 reinen Rauschspektren zu Beginn eines
Analysenlaufs (0 Minuten). Sie können die Zeit und die Anzahl der Spektren
verändern, von denen die Standardabweichung des Rauschens berechnet
wird, oder Sie können einen festgelegten Wert für die Standardabweichung
eingeben (Standardwert 0,1). Die beste Genauigkeit wird erreicht, wenn die
Standardabweichung von einer bestimmten Anzahl von Scans berechnet
wird.

85
Beurteilung der Peakreinheit
Analyse der Peakreinheit

Analyse der Peakreinheit

Dieser Abschnitt beinhaltet praktische Ratschläge zur Datenaufnahme, die


sich für die Analyse der Peakreinheit und zur Einstellung der
Peak-Reinheits-Optionen eignet.

Spektrenaufnahme
Das Überprüfen der Peakreinheit basiert auf dem Vergleich mehrerer
Spektren über einem Peak. Stellen Sie sicher, daß genügend Spektren für den
Vergleich zur Verfügung stehen und daß die Qualität der Spektren hoch ist.
Stellen Sie sicher, daß der Detektor gut funktioniert, die Intensität der
Detektorlampe in Ordnung ist, und die geeignete Flußzelle und Schlitz
gewählt sind. Grundsätzlich ist die Optimierung in Hinsicht auf die
Empfindlichkeit wichtiger als auf Auflösung. Kleine Spektrenverschiebungen
erstrecken sich über breite Wellenlängenbereiche, so daß die Auflösung nicht
so ausschlaggebend ist.
Verwenden Sie den Modus “Store All Spectra”, um kontinuierlich Spektren
aufzunehmen. Neuere Detektoren unterstützen den Modus “All in Peak”,
wobei kontinuierlich Spektren aufgenommen werden, wenn ein Peak
detektiert wurde. Zusätzlich werden 20 Spektren am Anfang des Laufes
gespeichert, um Basislinienrauschen für die Reinheitsanalyse zu bestimmen.
Setzen Sie die Peakbreite auf dem Dioden-Array-Detektor Bildschirm auf die
Breite des schmalsten interessierenden Peaks im Lauf.
Stellen sie sicher, daß sich die Probenkonzentration im linearen Meßbereich
des Detektors befindet. Ist eine Substanz zu hoch konzentriert, mißt der
Detektor im Wellenlängenbereich höchster Absorption außerhalb seines
linearen Bereiches, wohingegen er bei den anderen Wellenlängen immer
noch im linearen Bereich bleibt. Daraus resultieren bei unterschiedlichen
Konzentrationen Spektren mit veränderter Form, so daß die Substanz unter
Umständen als unrein erkannt wird. Ist die Konzentration der Substanz zu
gering, sind die Signal/Rausch-Verhältnisse für die Spektren niedrig. Somit
nimmt die Empfindlichkeit der Reinheitsanalyse ab. Somit nimmt die
Empfindlichkeit der Reinheitsanalyse ab. Die genaueste und empfindlichste
Reinheitsanalyse erhalten Sie für Peaks mit einer Höhe von 250 bis 800 mAU.
Verwenden Sie die empfohlenen Einstellungen zur Überprüfung der
Peakreinheit. Wird eine mögliche Unreinheit detektiert, können Sie sich die

86
Beurteilung der Peakreinheit
Analyse der Peakreinheit

Ergebnisse kritisch betrachten, um die Unreinheit zu bestätigen und weiter


zu charakterisieren.

Einstellung der Optionen "Peak Purity"


Wählen Sie die folgenden Einstellungen in den entsprechenden Feldern des
Dialogfeldes "Spectral Options".

Wellenlängenbereich
Verwenden Sie diese Einstellungen, um den Wellenlängenbereich, der für die
Reinheitsüberprüfung verwendet werden soll, festzulegen. Sie können z. B.
eine untere Grenze setzen für den Bereich, in dem die mobile Phase ein
hohes Rauschen verursacht. Sie können eine obere Grenze setzen, um
größere Wellenlängen, bei denen die interessierende Substanz nicht
absorbiert, auszugrenzen.

Spectra Processing
Verwenden Sie "Spectral processing" für mathematische Berechnungen wie
Transformation, Glättung und Interpolation von Spektren. In der Praxis
vergrößert alles, das kleine Unterschiede in Spektren vergrößert
(Ableitungen) auch das Rauschen, während alles, das das Rauschen
vermindert (Glättung) die Empfindlichkeit für kleine Veränderungen in den
Spektren vermindert.

Absorbance Threshold (Absorptionsgrenzwert)


Der Absorptionsgrenzwert legt die niedrigste Intensität für ein Spektrum fest,
das in die Analyse mit einbezogen werden kann. Normalerweise wird der
Grenzwert auf 1 – 2 mAU festgelegt, um sicherzustellen, daß die Spektren am
Rand eines Peak in die Überprüfung der Reinheit mit einbezogen werden.

Reference Spectrum
Referenzspektren sind Basislinienspektren, die zur Korrektur der
Hintergrundabsorption verwendet werden. Wir empfehlen, daß Sie immer ein
Referenzspektrum verwenden. Die empfohlene Einstellung ist "Automatic".
In diesem Modus wird je ein Spektrum der Basislinie in der Nähe des Start-
und Endpunktes der Integration genommen. Eine lineare Extrapolation
dieser beiden Spektren wird verwendet, um alle Spektren über dem Peak zu
korrigieren. Durch diese 2-Punkt-Referenz können Detektorabdrift und
Veränderungen der mobilen Phase bei Verwendung von Gradienten
kompensiert werden. Die anderen Referenzmodi sind abwärtskompatibel zu
vorhergehenden Softwareversionen, so daß manche Informationen zur

87
Beurteilung der Peakreinheit
Analyse der Peakreinheit

Peakreinheit auch erhalten werden können, wenn nur wenige Spektren


aufgenommen wurden.
Sind zwei Peaks nicht komplett basisliniengetrennt, kann die automatische
Auswahl eines Referenzspektrums (Verwendung von "Automatic reference
selection") dazu führen, daß das Referenzspektrum im Tal zwischen den
beiden Peaks gewählt wird. Ein nicht aufgelöster Peak kann nicht rein sein.
In diesem Fall kann der Reinheitstest dazu verwendet werden, nach anderen
versteckten Substanzen zu suchen. Verwenden Sie die Option "Manual
reference selection", um ein Referenzspektrum vor oder hinter der Gruppe
von Peaks auszuwählen.

Reinheitsgrenzwert
Wenn Ihre Daten von der Aufnahme peakkontrollierter Spektren stammen,
müssen Sie einen Wert für den Reinheitsgrenzwert (purity threshold)
eingeben. Typischerweise wird der Standardwert 990 sinnvolle Ergebnisse
liefern.
Wenn Ihre Daten aus der Aufnahme von "All Spectra" oder "All in peak"
stammen, erhalten Sie die besten Ergebnisse, wenn die Agilent ChemStation
einen Grenzwert für jedes Spektrum berechnet, basierend auf dem jeweiligen
Signal/Rausch-Verhältnis. Alternativ können Sie einen festen Grenzwert für
alle Scans im Peak definieren, was allerdings nicht empfohlen wird. Wenn Sie
einen festen Grenzwert verwenden, wählen Sie einen Wert, der deutlich
höher ist als bei peakkontrollierten Spektren, z.B. zwischen 995 und 998.

88
Beurteilung der Peakreinheit
Massenspektrale Peakreinheit

Massenspektrale Peakreinheit

In der LC/MS erreicht die Intensität der Ionen, die eine Substanz
charakterisieren, zu einer bestimmten Retentionszeit ein Maximum, wenn die
Konzentration dieser Substanz im MSD maximal ist. Abhängig von den
chromatographischen Bedingungen und der Scan-Zyklus-Zeit, können die
Retentionszeiten von dicht hintereinender eluierenden Verbindungen sehr
eng beieinander liegen, so daß mehrere Komponenten im
Gesamtionenchromatogramm (TIC) als ein Peak erscheinen können oder als
Peak mit Verzerrung (z.B. Schultern). Beim Untersuchen der
Retentionszeiten, bei denen einzelne Ionen ihre maximale Intensität
erreichen, kann es möglich sein, Cluster von Ionen zu bilden, die zu den
gleichen Zeiten maximale Intensität erreichen; es wird angenommen, daß alle
diese Ionen zur selben Komponente gehören. Wenn mehrere Ionencluster zu
verschiedenen Retentionszeiten unter demselben chromatographischen Peak
maximale Intensität erreichen, kann der Peak als unrein angesehen werden
und die individuellen Ionencluster können bestimmt werden.
Bei dieser Analyse werden mehrere Annahmen gemacht:
• Die Komponenten einer Mehrkomponentenmischung können entweder
über ihre Massenspektren oder ihre Retentionszeiten getrennt werden.
Entweder hat jede Komponente der Mischung ein scharfes
Massenspektrum mit eigenen m/z -Werten, oder die Komponenten werden
ausreichend gut getrennt, damit mehrfache Maxima bestimmt werden
können.
• Das Signal-Rausch-Verhältnis ist hoch genug, um wahre Maxima eindeutig
zu identifizieren.
• Die Retentionszeiten der Ionen, die als Basis für die Berechnung der
Retentionszeiten der Komponenten genommen werden, sind präzise und
repräsentativ.
Meistens erzeugt die Electrospray-Ionisation (ESI) nur Molekularionen, es
sei denn, es wird die Collision-Induced Dissociation (CID) verwendet, um
Fragmente zu produzieren. Dies bedeutet, daß es möglich ist, zwei scharf
getrennte, einfach geladenen Ionen in einer Spektrenserie zu identifizieren
und zu quantifizieren, (selbst wenn diese koeluieren). Dabei sollte man
vorsichtig sein, da Kationen- und Anionen -Addukte neben den erwarteten
[M+H]+ oder [M-H]- Ionen noch weitere Ionen erzeugen können. Atmospheric
pressure chemical ionization (APCI) (Chemische Ionisation bei

89
Beurteilung der Peakreinheit
Massenspektrale Peakreinheit

Atmosphärendurck) produziert ebenso Molekularionen, aber thermische


Fragmentierung ist bei APCI häufiger als bei Electrospray.
Außerdem enthält ein Massenspektrum Information über Isotope, die bei der
Identifizierung und bei der Bestimmung der Reinheit helfen kann.
Der Algorithmus zur Peakreinheit wird einen unreinen Peak nur dann
identifizieren, wenn spektrale und zeitliche Unterschiede bestehen. Manuelle
Interpretation kann Ihnen weiter helfen. Im Gegensatz zu UV-Daten können
MS-Daten verwendet werden, um unreine Peaks zu quantifizieren, solange
die "Komponenten" unterschiedliche Ionen haben. Die Peakreinheit (Peak
Purity) erfordert im allgemeinen Scan-Daten, nicht SIM-Daten, um sinnvoll zu
sein.

Massenspektrometrische Reinheitsberechnungen
Ein Bereich des TICs, der die integrierte Fläche des Peaks abdeckt, wird mit
einem bestimmten Satz von m/z-Werten abgesucht und die maximale
Intensität für jeden m/z-Wert bestimmt. Für jedes gefundene Maximum wird
eine interpolierte Retentionszeit über eine parabolische Anpassung
berechnet (Scanzahl). Die Retentionszeiten der größten Maxima werden in
Cluster zusammengefaßt, die dann mit den Substanzen identifiziert werden,
die in diesem Bereich enthalten sind. Information über die Anzahl der
Komponenten, die Retentionszeiten (Scanzahl) jeder Komponente und die
größten m/z-Werte im Cluster werden im Report angegeben.
Den ausgewählten Satz von m/z-Werten erhält man durch die Untersuchung
der Scans bei 25%, 50% und 75% der Zeit der integrierten Peaks. Dabei werden
alle m/z-Werte verwendet, deren Intensität größer ist als 1% der maximalen
Intensität im Scan (Basispeak). Für jeden ausgewählten m/z-Wert, wird die
mittlere Intensität des ersten und letzten Scans im Zeitbereich für die
Hintergrundkorrektur verwendet, bevor die Cluster bestimmt werden.
Jeder m/z-Wert eines Satzes wird in jedem Scan des zeitlichen Bereichs
überprüft und die maximale Intensität wird, zusammen mit den Intensitäten
der beiden Seiten des Maximums, gespeichert. Es wird nur ein Maximum pro
m/z-Wert gespeichert. Jedes gespeicherte Maximum wird daraufhin
überprüft, daß es in dem ersten oder letzten Scan nicht erscheint und auf
keiner Seite eine Intensität von Null hat.
Nachdem eine interpolierte Scanzahl für den m/z -Wert berechnet und die
Hintergrundkorrektur durchgeführt worden ist, wird eine Tabelle erstellt, die
folgendes enthält: die m/z-Werte, die Intensität und die interpolierten
Scanzahlen, geordnet nach interpolieren Scanzahl.

90
Beurteilung der Peakreinheit
Massenspektrale Peakreinheit

Cluster werden bestimmt, indem die größten Intensitäten in der Liste


untersucht werden und zwar in der Reihenfolge zunehmender Scananzahl.
Sobald ein Cluster registriert worden ist, wird die mittlere interpolierte
Scanzahl der m/z-Werte im Cluster berechnet; wenn der nächste Punkt, der
in Erwägung gezogen wird, mehr als einen halben Scan vom Mittelwert
entfernt ist, wird ein neuer Cluster begonnen.
Die Anzahl der gefundenen Cluster wird im Bericht als die Zahl der
Komponenten angegeben; die mittlere interpolierte Scananzahl ist die
angegebene Scanzahl; und die m/z-Werte mit den zwei größten Häufigkeiten
im Cluster entsprechen den Ionen.
Ein integrierter Peak, der mehr als einen Cluster enthält, gilt als verunreinigt.

Massenspektrometrische Reinheit
Ions for Peak Window
Das Fenster "Ions for Peak" zeigt die zwei m/z-Werte mit den größten
Intensitäten in jedem Cluster an. "Single Component Peaks" zeigt zwei Ionen,
die ihre maximale Intensität zur gleichen Retentionszeit erreichen:
"Multi-Component Peaks" zeigt Ionenpaare, die zur gleichen Zeit die
maximalen Intensitäten erreichen. Jedes Ionenpaar zeigt eine Komponente in
dem verunreinigten Peak an. Um die Ionen detaillierter zu untersuchen,
können Sie die graphischen Funktionen der Agilent ChemStation verwenden.

Das Fenster "MS Peak Purity Results"


Das Fenster "MS Peak Purity Results" enthält die tabellarischen Ergebnisse
der Peakreinheitsanalyse. Jede Zeile in der Tabelle enthält die Information
für eine Komponente: die mittlere interpolierte Scanzahl und die zwei Ionen
mit der größten Intensität.

91
Beurteilung der Peakreinheit
Massenspektrale Peakreinheit

92
Index

A H Was ist?, 27, 69


Ableitung von Spektren, 29, 71 Hintergrund Peaksignal-Fenster, 37
Absorption Absorption, 27, 69
Ratio (Verhältnis), 34 Hintergrundabsorption, 57 R
Ähnlichkeitskurve, 51 Hintergrundkorrektur, 32, 72 Ratio (Verhältnis)
Reinheitsgrad berechnen, 42 Hinweise, 50 Signalauftragung, 34
Apex Spectrum (Spektrum im Maxi- Ratiogram (Verhältnisauftragung), 35
mum), 39, 80 I Berechnung des Absorptionsverhält-
Automatische Bibliothekssuche mit Isoabsorptionsplot, 11 nisses, 35
Spektren Referenzspektrum, 51, 87
allgemeiner Suchmodus, 18 K Hintergrundkorrektur, 32, 72
Peakreinheit, 20 Kontur Reinheit
Suchmodi, 18 Höhenkarte, 11 massenspektrometrischl, 91
Zielsubstanz Analyse, 19 Linie, 11 Peak, 27, 69
Automatische Spektrenbibliothek- Reinheitsberechnung
ssuche L Grenzwertkurve, 77, 81
Überblick, 16 linearer Bereich, 50, 86 massenspektrometrische, 90
Average Spectrum (Mittelwertspek- logarithmische Spektren, 71 Reinheitsgrad, 53
trum), 39 Reinheitsgrad berechnen, 41
M Ähnlichkeitskurve in der Darstellung
B Markierung zur Reinheit, 21 Ähnlichkeit/Grenzwert, 38
Basislinie Markierungen zum Substanznamen, 22 keine Ähnlichkeitskurve gewählt, 41
Korrektur, 32, 72 Markierungen zum Übereinstimmungs- Verwenden der Grenzwertkurve, 44
Bearbeiten von Spektren faktor, 21 Wahl einer Ähnlichkeitskurve, 42
Normalisieren, 31, 74 Massenspektrale Peakreinheit, 89 Report
Vergleichen, 31, 74 Match Factor (Übereinstimmungsfak- Bibliothekssuche, 13
Bestimmung tor), 28, 70 Peakreinheit, 13
optimale Detektionswellenlänge, 11 spektraler, 13
N
C nichtlineare Daten, 56 S
COMPARE-Befehl, 28, 70 Normalisieren Signal
Spektren, 31, 74 Ratio Plot (Verhältnisauftragung), 34
D Signalverarbeitung, 53
dritte Dimension, 9 O Spektralanalyse
optimale Wellenlänge, 11 was ist?, 9
F Spektrale Ähnlichkeitskurven, 37, 76
Fenster "Peak Signals", 76 P Spektren
Fluoreszenz-Spektrum, 12 Peak Ableitung, 29, 71
Front Spectrum (Spektrum des Pea- Reinheit, 27, 69 glätten, 28, 71
kanstieges), 39, 80 Verunreinigung, 27, 69 logarithmisch, 71
Peakreinheit Normalisieren, 31, 74
G Ähnlichkeitskurve, 47 Spektrenaufnahme, 50, 86
gemitteltes Spektrum, 80 Grenzwertkurve, 44, 47, 77, 84 Spektrenverarbeitung, 53
Glättung von Spektren, 28, 71 massenspektrometrisch, 89 Spektrum
Grenzwertkurve, 44, 47, 53, 77, 81, 84 Rauschen, 47 Korrektur, 32, 72
Anzeigemodus, 48, 79 Spektrale Ähnlichkeitskurven, 37, 76 Referenz, 51, 87
Verwendung vorgegebener Zielspek- Spektrum, Fluoreszenz-, 12
tren, 38, 79

93
Index

T
Tail Spectrum (Spektrum des Peak-
endes), 39, 80
Tips, 86

U
unreine Peaks, 55

V
Vergleichen
Spektren, 31, 74
Verunreinigung, 27, 69
vielfache
Absorptionsverhältnis, 35

W
Wellenlänge
Optimierung, 11

Z
Zielspektrum, 38, 79

94
s1
In diesem Handbuch

In diesem Handbuch werden die


Methoden beschrieben, die hinter dem
Spektrenmodul der HP ChemStation
stehen. Es ergänzt die Informationen
aus dem Handbuch HP ChemStation
Konzepte mit besonderen Methoden
für die Spektrenanalyse, welche für die
HP ChemStation für LC 3D-Systeme
und die HP ChemStation für CE-
Systeme verwendet werden können.

Weitere Informationen zur Installation


und Konfiguration des
Spektrenmoduls mit einer
HP ChemStation für LC-2D-Systeme
finden Sie im Handbuch Installation
der HP ChemStation für LC-Systeme.