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Charakterisierung

der über den


RLR-MAVS Signalweg
vermittelten
intrazellulären Immunantwort
gegenüber
Puumala Orthohantavirus

Bachelorarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades

Bachelor of Science

Autor – Benjamin Theodor Geiger

Matrikelnummer – 373819

Abgabe – Oktober 2019

Betreuer – Dr. Daniel Bourquain (RKI)

Erstgutachter – Prof. Dr. Roland Lauster (TU Berlin)

Zweitgutachter – Prof. Dr. Lars Schaade (RKI)

Angefertigt im Fachgebiet Hochpathogene Viren am Zentrum für Biologische


Gefahren und Spezielle Pathogene (ZBS) des Robert Koch-Instituts (RKI) in Berlin.

1
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis 7

Zusammenfassung 10

Abstract 11

1 Einleitung 12

1.1 Molekularbiologie der Hantaviren _________________________________ 13

1.2 Pathogenese_________________________________________________ 16

1.3 Therapie und Expositionsprophylaxe ______________________________ 17

1.4 Erkennung einer Hantavirus-Infektion durch das angeborene Immunsystem 18

1.5 Zielstellung der Arbeit __________________________________________ 20

2 Material 21

2.1 Verbrauchsmaterial, Chemikalien und Instrumente ___________________ 21

2.2 Zelllinien und Viren ____________________________________________ 22

2.3 Enzyme, Antikörper und Molekularbiologische Kits ___________________ 23

2.4 Puffer, Medien und Arbeitslösungen _______________________________ 24

2.5 Verwendete Software und Nukleinsäuren ___________________________ 26

3 Methoden 27

3.1 Zytologische Methoden _________________________________________ 27

3.1.1 Kultivierung und Passage von Zelllinien 27

3.1.2 Zellaufschluss 27

3.1.3 Absorptionsmessung mit QUANTI-Blue 28

3.1.4 Lumineszenzmessung mit QUANTI-Luc™ 28

2
3.2 Proteinbiochemische Methoden __________________________________ 28

3.2.1 Denaturierung und SDS-PAGE 28

3.2.2 Western Blotting 29

3.2.3 Detektion der Zielproteine 29

3.3 Molekularbiologische Methoden __________________________________ 29

3.3.1 RNA-Extraktion aus Zellkulturüberstand 29

3.3.2 RNA-Extraktion aus eukaryotischen Zellen 30

3.3.3 cDNA-Synthese 30

3.3.4 Quantitative-Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR (qRT-PCR) 30

3.3.5 Quantitative-Echtzeit-PCR (qPCR) 31

3.3.6 Relativer Vergleich von Genexpressionen mittels ∆cT-Methode 33

3.4 Virologische Methoden _________________________________________ 33

3.4.1 Infektion adhärenter Monolayer-Zellen 33

3.4.2 Focus forming unit Assay 34

4 Ergebnisse 36

4.1 PUUV löst in A549-Dual Zellen eine MAVS-abhängige Immunantwort aus _ 36

4.1.1 Quantifizierung der IRF-Aktivität 36

4.1.2 Quantifizierung der Expression ausgewählter Gene der angeborenen


Immunantwort 38

4.1.2.1 Quantifizierung der IFN-Genexpression 38

4.1.2.1.1 IFNB1 38

4.1.2.1.2 IFNL1 39

4.1.2.2 Quantifizierung der Expression ausgewählter ISGs 40

3
4.1.2.2.1 MX1 40

4.1.2.2.2 EIF2AK2 (PKR) 41

4.1.2.2.3 RNASEL 42

4.1.2.3 Quantifizierung der Expression proinflammatorischer Cytokine 43

4.1.2.3.1 CXCL1 44

4.1.3 Untersuchung der Expression des antiviralen IFN-stimulierten Proteins


MX1 in PUUV und TULV-infizierten Zellen 45

4.1.4 Untersuchung der Aktivierung des antiviralen Proteins PKR und der
Expression des Transkriptionsfaktors IRF7 46

4.2 Ein Knockout von MAVS begünstigt die Replikation von PUUV in A549-Dual
Zellen _________________________________________________________ 47

4.2.1 Analyse der Expression von viralem NP als Marker für die
Virusreplikation 47

4.2.2 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR 48

4.2.3 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS mittels FFU-


Tests 49

4.3 PUUV Kazan, Sotkamo und CG1820 lösen in A549-Dual Zellen eine MAVS-
abhängige Immunantwort aus _______________________________________ 50

4.3.1 Quantifizierung der IRF-Aktivität 50

4.3.2 Analyse der Expression von viralem NP als Marker für virale Replikation
52

4.3.3 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR 54

4.3.4 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS mittels FFU-


Tests 55

4.4 Amlexanox führt nur teilweise zur Hemmung des RLR-MAVS Signalwegs in
Endothelzellen ___________________________________________________ 56

4
4.4.1 Untersuchung der Expression von viralem NP, des antiviralen Proteins
MX1 und des Transkriptionsfaktors IRF7 57

4.4.2 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR 58

4.4.3 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS mittels FFU-


Tests 59

5 Diskussion 61

5.1 PUUV löst in A549-Dual Zellen eine MAVS-abhängige Immunantwort aus _ 62

5.2 Ein Knockout von MAVS begünstigt die Replikation von PUUV in A549-Dual
Zellen _________________________________________________________ 65

5.3 Eine Wiederholung der Versuche mit anderen PUUV-Stämmen erzielte gleiche
Ergebnisse _____________________________________________________ 66

5.4 Amlexanox führt nur teilweise zur Hemmung des RLR-MAVS Signalwegs in
Endothelzellen ___________________________________________________ 67

6 Fazit und Ausblick 70

7 Literaturverzeichnis 72

8 Eidesstattliche Erklärung 79

9 Abbildungsverzeichnis 80

10 Tabellenverzeichnis 81

11 Anhang 82

11.1 Quantifizierung der NF-κB-Aktivität _____________________________ 82

11.2 Quantifizierung der Expression verschiedener Gene der


proinflammatorischen Antwort _______________________________________ 85

11.2.1 TNF 85

11.2.2 IL6 85

5
11.2.3 IL1B 86

11.2.4 GDF15 87

11.3 Vorversuch zu 4.4 __________________________________________ 88

11.3.1 Untersuchung der Expression von viralem NP, des antiviralen Proteins
MX1 und des Transkriptionsfaktors IRF7 88

11.3.2 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR 89

11.3.3 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS mittels


FFU-Tests 90

6
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abkürzung Bedeutung

ANDV Andesvirus

AX Amlexanox

AXB- Zellen ohne Amlexanoxbehandlung

AXB+ Zellen mit Amlexanoxbehandlung

CMC Carboxymethylcellulose

cRNA complementary RNA

CXCL1 C-X-C Motif Chemokine Ligand 1

EGF epidermal growth factor

EIF2AK2 (PKR) eukaryotic translation initiation factor 2


alpha kinase 2 / protein kinase R

FFU focus forming unit

FKS Fetales Kälberserum

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-
Dehydrogenase

GDF15 growth differentiation factor 15

h p.i. hours post infection

HCPS Hantavirus-induziertes
kardiopulmonales Syndrom

HFRS Hämorrhagisches Fieber mit renalem


Syndrom

HMEC-1 Humane dermale mikrovaskuläre


Endothelzellen

HTNV Hantaanvirus

IFN Interferon

IFNB1 Interferon Beta 1

IFNL1 Interferon Lambda 1

IKKε IkappaB Kinase Epsilon

7
IL1B Interleukin 1 Beta

IL6 Interleukin 6

IRF interferon regulatory factor

ISG Interferonstimuliertes Gen

ISRE interferon stimulated response element

KO Knockout

L-Glu L-Glutamin

MAVS mitochondrial antiviral signaling protein

MoI multiplicity of infection

MX1 MX dynamin like GTPase 1

NE Nephropathia epidemica

NP Hantavirusnukleokapsidprotein

PBS phosphate buffer solution

PUUV Puumala Orthohantavirus

qPCR Quantitative Echtzeit-PCR

qRT-PCR Quantitative-Echtzeit-Reverse-
Transkription-PCR

RdRp RNA-abhängige RNA-Polymerase

RLR RIG-I-like Rezeptor

RNAi RNA interference

RNASEL Ribonuklease L

rRNA Ribosomale RNA

SDS-PAGE sodium dodecylsulfate polyacrylamide


electrophoresis

SEOV Seoulvirus

SNV Sin-Nombre-Virus

-ssRNA Negative sense einzelstrang-RNA

TBK1 TANK-binding kinase 1

8
TLR toll-like Rezeptor

TNF tumor necrosis factor

TULV Tulavirus

vRNA Virale RNA

WB Western Blot

WT Wildtyp

9
ZUSAMMENFASSUNG
Die Hantavirus-Erkrankung zählt in Ausbruchsjahren wie zuletzt 2012 und 2017 zu
den häufigsten meldepflichtigen viralen Erkrankungen in Deutschland, vorrangig
verursacht durch das Puumalavirus (PUUV). Hantaviren müssen die Immunantwort
des Wirts modulieren, um erfolgreich replizieren zu können und pathogen zu sein.
Die Erkennung einer Hantavirus-Infektion durch das angeborene Immunsystem
resultiert in einer Aktivierung von interferon regulatory factors (IRF), welche die
Expression von Interferonen (IFN) induzieren. Die Expression von IFNs führt
wiederum zur Induktion von IFN-stimulierten Genen (ISGs), welche antiviral wirken
und die Virusreplikation inhibieren. Die Immunerkennung basiert insbesondere auf
der Detektion viraler dsRNA durch intrazelluläre Rezeptoren. Ziel dieser Arbeit war
es, die Relevanz der cytoplasmatischen dsRNA-Detektion über RIG-I-like
Rezeptoren (RLR) im Rahmen der PUUV Infektion zu untersuchen. Hierfür wurde mit
Reporterzelllinien gearbeitet, bei denen eine Unterbrechung der RLR-vermittelten
Signalgebung durch einen Knockout des zentralen Adapterproteins MAVS vorlag.
Die Stärke der IFN-Antwort in PUUV-infizierten Wildtyp- und MAVS-KO Zellen wurde
mittels eines Lumineszenz-Reporterassays der IRF-Aktivität quantifiziert. Außerdem
wurde die Expression verschiedener ISGs und IFNs sowohl im Western-Blot
Verfahren als auch in qPCR analysiert. PUUV induzierte im Gegensatz zum niedrig-
pathogenen Tula Virus (TULV) in den Wildtypzellen eine starke IFN-Antwort, was in
einer ebenfalls starken Expression antiviraler ISGs wie MX1 resultierte. In den
MAVS-KO Zellen war hingegen keine PUUV-induzierte IFN-Antwort und ISG-
Expression nachweisbar. Dies resultierte in einer stark erhöhten Replikation (ca. 265-
fach) von PUUV in den MAVS-KO Zellen, während TULV in beiden Zelltypen nicht
replizierte. Aus diesen Ergebnissen schlussfolgern wir, dass die frühe angeborene
Immunerkennung und Induktion der IFN-Antwort gegenüber PUUV im untersuchten
Zelltyp stark vom RLR-MAVS Signalweg abhängig ist. Zudem wird die Replikation
von PUUV stark durch die MAVS-abhängig induzierte IFN-Antwort gehemmt. Die
Ergebnisse dieser Arbeit bilden die Grundlage für eine weitere Erforschung der
Interaktionen zwischen Hantaviren und dem Immunsystem sowie möglicher
Auswirkungen auf die (Immun-)Pathogenese. Zukünftige Untersuchungen müssen
zeigen, ob die stark MAVS-abhängige Induktion einer IFN-Antwort PUUV von
hochpathogenen Hantaviren unterscheidet, oder ob die späte IFN-Antwort
gegenüber PUUV zur (Immun-)Pathogenese beitragen könnte.

10
ABSTRACT
During outbreaks like 2012 and 2017, the hantavirus disease is amongst the most
common viral diseases subject to reporting in Germany. The major causative agent is
the Puumalavirus (PUUV). Modulation of the hosts’ the immune response is a
necessity for hantaviruses in order to replicate successfully and be pathogenic. Upon
infection, hantaviruses are recognized by the innate immune system, which leads to
an activation of interferon regulatory factors (IRF). IRF activation results in the
expression of interferons (IFN), which in turn induce IFN-stimulated genes (ISGs).
ISGs exert antiviral effects and inhibit viral replication. The immune recognition of the
virus is based on the sensing of viral dsRNA by intracellular receptors. The aim of
this study was to examine the importance of the cytoplasmic dsRNA-detection via
RIG-I-like receptors (RLR) following PUUV infection. Therefore, we made use of
reporter cell lines in which the RLR signaling is disrupted via a knockout of the central
adaptor protein MAVS. The intensity of the IFN response in both the PUUV-infected
wild type cells and the MAVS-KO cells was quantified using a luminescence reporter
assay of IRF-activity. Moreover, the expression of different ISGs and IFNs was
analyzed through both western blotting and qPCR. In sharp contrast to the low
pathogenic Tula virus (TULV), PUUV induced a strong IFN response in the wild type
cells, which led to strong expression of antiviral ISGs like MX1. In the MAVS-KO
cells, no induction of an IFN response and ISG expression by PUUV was seen. In
addition, the IFN response correlates with a strongly (by a factor of approx. 265)
decreased replication of PUUV in the wild type cells in comparison to MAVS-KO
cells, whereas TULV did not replicate in both cell types. We conclude that the early
innate immune recognition and induction of an IFN response towards PUUV is
strongly dependent upon the RLR-MAVS-signaling pathway in the examined cell
type. Furthermore, PUUV replication was strongly inhibited by the IFN response
induced via MAVS. This study’s results provide a basis for further research on the
interactions between hantaviruses and the immune system as well as possible
effects on (immune) pathogenesis. Further studies need to show whether the strong
MAVS-dependency of the IFN response differs in highly pathogenic hantaviruses
when compared to PUUV, and if the late IFN response towards PUUV may contribute
to the (immune) pathogenesis.

11
1 EINLEITUNG
Hämorrhagisches Fieber mit renalem Syndrom (HFRS) – daran verstarben im
1
Koreakrieg (1950-53) mehr als 3000 US-amerikanische Soldaten. Bekannt waren
die Symptome seit dem Jahr 960 aus chinesischen Schriften 2, eine erste Isolation
des Krankheitserregers, des gelang jedoch erst zwei Jahrzehnte später Lee et al.
3
1976 aus der Brandmaus (Apodemus agrarius). Der Name Hantaan resultiert aus
dem Namen des Flusses Hantan, in dessen Gebiet das Virus zuerst entdeckt wurde.
3,4
Das HTNV war namensgebend für eine ganze Familie innerhalb der Ordnung der
Bunyavirales, die Familie der Hantaviridae. 5 Hantaviren werden seit 1991 in Alt- und
Neuwelt-Hantaviren unterteilt. Bis dato waren nur drei humanpathogene
Hantavirusspezies bekannt, die in ihrer geographischen Verbreitung, ihren Wirten
6
und Letalität gegenüber dem Menschen unterschieden wurden. HTNV infiziert als
Reservoir die Brandmaus (A. agrarius), findet sich vornehmlich in Korea, China und
dem östlichen Russland und ist mit einer Letalität von zehn bis zwölf Prozent das
7
tödlichste Altwelthantavirus. Seoul Virus (SEOV) ist wie sein Wirt, die Wanderratte
(R. norvegicus), wahrscheinlich weltweit verbreitet, die Infektionen konzentrieren sich
in urbanen Gebieten in Korea und China. Die Letalität liegt bei einem bis zwei
8
Prozent. Die dritte Hantavirusspezies, die bekannt war, ist das Puumalavirus
(PUUV). Es infiziert die Rötelmaus (Myodes glareolus) und ist vornehmlich in Europa
9
verbreitet. Die Letalität liegt bei unter einem Prozent. Nichol et al. entdeckten 1993
nach mehreren Ausbrüchen von akutem Lungenversagen (acute pulmonary distress
syndrome) in Nordamerika eine neue Hantavirusspezies, die Sin-Nombre-Virus
7
(SNV) genannt wurde. SNV ist zusammen mit dem Andes-Virus (ANDV) das
hauptverantwortliche Virus für Hantavirusinfektion in Nord- und Südamerika. Die
Infektionen sind hier seltener, verlaufen aber wesentlich schwerer, mit einer Letalität
10
von bis zu 35 Prozent. Altwelthantaviren führen nach Infektion im Menschen zum
HFRS, Neuwelthantaviren zum Hantavirus-assoziiertem kardiopulmonalen Syndrom
(hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS). In Deutschland ist das PUUV
11
hauptverantwortlich für Hantaviruserkrankungen beim Menschen. Natürlicher Wirt
12
ist die Rötelmaus (Myodes glareolus) 2019 ist mit zwischen Jahresbeginn und 9.
September 1.282 dem RKI gemeldeten Erkrankungsfällen wie bereits die Jahre
13
2007, 2010, 2012, 2015 und 2017 ein Ausbruchsjahr. Meist folgt auf ein
Ausbruchsjahr (z.B. 2017 mit 1731 Fällen) ein Jahr ohne erhöhte Fallzahlen (2018
14
mit 235 Fällen). Der annähernde zweijährige Rhythmus korreliert mit der

12
Populationsgröße der Rötelmaus, welche wiederum mit der Buchenmast (starker
Fruchtkörperproduktion bei Buchen) korreliert. Die Buchenmast liefert reichlich
Nahrung für Rötelmäuse und ermöglicht so eine überdurchschnittlich erfolgreiche
Brutsaison, die im darauffolgenden Jahr in einem Ausbruchsjahr resultiert. 15

1.1 Molekularbiologie der Hantaviren

Hantaviren sind behüllte, negative-sense (-) single-stranded (ss) RNA-Viren, deren


Genom sich – charakteristisch für Vertreter der Bunyavirales – in drei
5
Genomsegmente aufteilt: small, medium und large. Die drei Segmente sind jeweils
von Nukleokapsidprotein (NP) umschlossen. Der large-Genomabschnitt (L) codiert
die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp), welche im Virion bereits an jedem
Segment vorliegt und das virale Genom sowohl repliziert als auch transkribiert. Der
medium-Abschnitt (M) codiert die Hüllproteine Gn und Gc, der small-Abschnitt (S)
16
das NP. Die Größe des gesamten Virions variiert zwischen 120-160 nm im
Durchmesser. 17 (s. Abbildung 1)

Abbildung 1: Aufbau eines Hantavirions.


a) Schematischer Aufbau, zu sehen ist die Aufteilung des viralen ssRNA-Genoms in
drei Segmente, die jeweils von Hantavirusnukleokapsidprotein (NP) umschlossen
sind. Jedes Segment ist mit einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase versehen. Auf
der Virushülle befinden sich sogenannte spike complexes, bestehend aus den zwei
verschiedenen Glykoproteinen Gn und Gc.
b) Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme eines Hantaviruspartikels.
(Abbildung entnommen und verändert aus 18)

13
Die Aufnahme in die Wirtszelle erfolgt durch Bindung der Hüllproteine an
Integrinrezeptoren auf der Zelloberfläche. Hierauf wird das Virion entweder über
clathrinvermittelte Endocytose oder über andere Wege aufgenommen. Im
entstandenen Endosom dissoziiert das Virion von den Integrinrezeptoren und das
19
Clathrin vom Endosom. Der pH-Wert wird erniedrigt, was eine Membranfusion
hervorruft, die von den Hüllproteinen vermittelt wird und eine Freisetzung des
17
genetischen Materials ins Cytoplasma bewirkt. Im Cytoplasma katalysiert die
RdRp, die mit im Virion vorhanden war, die Transkription der viralen genomischen –
ssRNA-Segmente zu positive-sense mRNAs, welche translatiert werden. Die
Translation von RdRp und NP findet direkt im Cytoplasma statt, die Hüllproteine
werden im ER glykosyliert. Wurden genügend virale Proteine hergestellt, synthetisiert
die RdRp aus der ursprünglichen viralen RNA (vRNA) komplementäre positive-sense
RNA (cRNA), welche wiederum als Vorlage für neue genomische –ssRNA-Segmente
dient. Die replizierten Genomsegmente werden von NP umschlossen. Der
Zusammenbau von Nachkommenviren erfolgt, vermittelt von den translatierten
Glykoproteinen, am ER-Golgi-Intermediat-Komplex durch Knospung. Die fertigen
Virionen werden in Transportvesikeln zur Plasmamembran transportiert und
16
exocytiert. Hantaviren wie ANDV, SEOV oder HTNV umgehen allerdings das
20
sekretorische System und setzen sich direkt an der Plasmamembran zusammen.
(s. Abbildung 2)

14
Abbildung 2: Lebenszyklus der Hantaviren.
Nachdem sich ein Hantavirus an Integrinrezeptoren einer Zelle anheftet (1) wird es
durch clathrinvermittelte Endocytose (2a) oder über andere, von Clathrin
unabhängige Wege aufgenommen. (2b) Im frühen Endosom (E.E.) erfolgt eine
Dissoziation der Integrinrezeptoren und des Clathrins. Durch die Verringerung des
pH-Werts kommt es im späten Endosom (L.E.) zu einer Virus-Zell Membranfusion,
wodurch vRNA ins Cytosol entlassen wird. (4) Nach erfolgter Transkription und
Translation bzw. Replikation (5a und b) akkumulieren die Hüllproteine an Membranen
des ER-Golgi-Intermediat-Komplexes, wo sie einen Zusammenbau der Virus-
nachkommen herbeiführen (6a), welche zur Plasmamembran transportiert und dort
exocytiert werden. (7) Alternativ kann es auch zu einem Zusammenbau direkt an der
Plasmamembran kommen. (6b) (Abb. verändert aus 20)

15
1.2 Pathogenese

Hantaviren infizieren kleine Säugetiere, in denen keine pathologischen Effekte


12,21
auftreten. Die Infektion ist persistierend. Menschen können als Fehlwirt bei
Kontakt zu aerosolisierten Exkrementen infiziert werden und eine Hantavirus-
9,14
Erkrankung entwickeln. Risikogruppen sind vor allem Menschen, die sich in
22
Gebieten aufhalten, in denen die Wirtspezies verbreitet sind. Klinisch manifestiert
sich die humane Infektion mit Altwelthantaviren im HFRS, welches in mehrere
Phasen eingeteilt wird. Nach einer Inkubationszeit von einer bis fünf Wochen kommt
es in der febrilen Phase zu einem abrupten Fieberanstieg, verbunden mit Schmerzen
in Kopf, Thorax und Abdomen, Schüttelfrost, sowie oftmals Übelkeit und Erbrechen.
In der hypotensiven Phase kommt es zusätzlich zur namensgebenden Hypotension
zu Hautpetechien und konjunktivalen Blutungen, die sich oft in Sehstörungen
manifestieren. Auch kann es zu einer ersten lebensbedrohenden Situation durch
Entwicklung eines Schocks kommen. Es folgt die oligurische Phase, welche durch
Niereninsuffizienz bis hin zur Dialysepflichtigkeit, Thrombozytopenie und eventuelle
extrarenale Manifestationen in ZNS oder Lunge gekennzeichnet ist. Nachfolgend
9,12,18
kommt es zu einer polyurischen Phase und zuletzt zur Rekonvaleszenz. In den
Amerikas kommt es nach einer Infektion mit Neuwelthantaviren zum HCPS.
Zunächst findet sich ebenfalls eine febrile Phase, die allerdings schneller als beim
HFRS eintritt. Danach folgt die kardiorespiratorische Phase, die durch Dys- und
Tachypnoe auffällt. Vor der Rekonvaleszenz kommt es zur diuretischen Phase. Es
bilden sich Lungenödeme, die zu einem kardiogenen Schock führen. Die genauen
molekularen Pathomechanismen einer Hantavirus-Infektion sind allerdings bis heute
unklar. Bekannt ist bisher, dass Hantaviren insbesondere das mikrovaskuläre
Endothel infizieren. Ein kritischer Faktor ist die daher sowohl beim HFRS als auch
HCPS auftretende Leckage der Kapillaren, beim HFRS in Niere und Peritoneum,
21
beim HCPS in der Lunge. Die Symptomatik von HFRS und HCPS ist zudem sehr
ähnlich, ein Unterschied findet sich nur in den primären Zielorganen und der Letalität.
Auch kommt es bei Fällen des HFRS zu Symptomen, die dem HCPS zugeordnet
wurden und vice versa. Deswegen schlugen Clement et al. 2012 für Krankheiten, die
durch Hantaviren verursacht werden, die Sammelbezeichnung „Hantavirus-
23
Erkrankung“ vor. Diese Bezeichnung wird durch das RKI schon seit Jahren
verwendet. Seit 2012 gehört die Hantavirus-Erkrankung zu einer der fünf häufigsten
9
namentlich meldepflichtigen Erkrankungen viraler Ätiologie in Deutschland. Die

16
vorliegende Arbeit befasst sich mit dem in Deutschland vorrangig verbreiteten PUUV.
Auch wurde mit dem niedrigpathogenen Tulavirus (TULV) gearbeitet, allerdings ist
die klinische Relevanz hier unklar, da erst wenige durch eine Infektion mit TULV
24–26
bedingte Krankheitsfälle beschrieben sind. PUUV wird sowohl über Clathrin-
vermittelte Endocytose als auch über Makropinocytose in die Zelle aufgenommen
wird. 27 Dies hat – wie bei allen Hantaviren – zwar keinen cytopathischen Effekt, aber
15,28
eine Dysfunktion und eine Leckage der Kapillaren zur Folge. In vivo finden sich
29
erhöhte Plasmawerte für IL-6, TNFα und diverse Interferone. Das klinische Bild
zeigt eine abgeschwächte Form des HFRS, die Nephropathia epidemica (NE)
genannt wird und bei der Patienten seltener dialysepflichtig werden. 30,31 Das aktuelle
Erklärungsmodell geht von einer exzessiven angeborenen Immunantwort
(Hyperinflammation) aus, welche die Barrierefunktionen des Endothels stört. 32

1.3 Therapie und Expositionsprophylaxe

Da bisher keine kausale antivirale Therapieoption besteht, ist die Behandlungsform


bei einer Hantavirus-Erkrankung symptomatisch, allerdings muss gegebenenfalls
31
dialysiert werden. Auch wird eine Unterstüzung des kardioivaskulären Systems
9
durch Oxygenierung angeordnet. Vereinzelte Versuche mit postexpositions-
prophylaktischen Mitteln wurden durchgeführt, bisher aber ohne durchschlagenden
33
Erfolg. Ist eine Hantavirus-Erkrankung durchstanden, besteht jedoch durch
18
Hantavirus-spezifische Antikörper Schutz vor Reinfektion. Versuche, diesen
Schutz durch Impfungen zu erreichen, werden vor allem in China und Korea, wo der
Großteil der Hantavirus-Erkrankungen stattfindet, durchgeführt. Seit 1990 wird der
Impfstoff Hantavax® entwickelt, der allerdings nicht gegen die europäischen
Hantaviren wirksam ist. Auch besteht bisher noch keine FDA-Genehmigung. 33

Präventivmaßnahmen beinhalten zunächst den Kontakt zu Nagetierausscheidungen


zu vermeiden. Empfehlungen, um das Zuhause und dessen Umgebung frei von
möglichen Ausscheidungen zu halten finden sich auf der Website des RKI. (s.
https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/H/Hantavirus/Merkblatt_PDF.html) Bei Verdacht
auf infiziertes Material sollte unbedingt Schutzkleidung getragen werden, die nach
der Arbeit gewaschen werden soll. 34

17
1.4 Erkennung einer Hantavirus-Infektion durch das
angeborene Immunsystem

Eine der wichtigsten Funktionen des angeborenen Immunsystems ist die Erkennung
von mikrobiellen Strukturen, die evolutionär konserviert sind. Diese werden auch als
pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) bezeichnet und können
verschiedene, für das Überleben oder die Infektiosität des Mikroorganismus wichtige,
Strukturen wie Glykoproteine, Lipopolysaccharide oder Nukleinsäuren sein. Ebenfalls
stark konserviert sind die Proteine, die in eukaryotischen Zellen für die Erkennung
der PAMPs verantwortlich sind. Sie werden pattern recognition receptors (PRRs)
genannt. Es existieren mehrere PRR-Familien, die eine RNA-Virusinfektion
erkennen: tol-like Rezeptoren (TLR), die Viren sowohl extrazellulär als auch nach
erfolgter Endocytose im Endosom erkennen, und RIG-I-like Rezeptoren (RLR), die
PAMPs im Cytosol erkennen. Vor allem TLR 3, 7 und 8 erkennen nach erfolgter
Endocytose ssRNA und dsRNA im Endosom, was in einer Interferon (IFN)-Antwort
resultiert. 35,36

Nachdem Breiner et al. 2018 zeigen konnte, dass Hantavirus-dsRNA in humanen


Lungenepithelzellen (A549 Zellen) insbesondere über RLRs und nicht über TLRs
erkannt wird, befasst sich die vorliegende Arbeit mit dem RLR-MAVS Signalweg. 37

RLRs erkennen dsRNA und 5‘-Triphosphat-ssRNA im Cytoplasma. Die Unter-


scheidung zwischen zelleigener mRNA und fremder RNA gelingt dadurch, dass
Zellen in der posttranskriptionalen mRNA-Prozessierung die mRNA mit einer 5‘-7-
Methylguanosin- bzw. „Cap“-Struktur versehen. Die Methylierung spielt hier eine
38–40
maßgebliche Rolle, da vRNA ein exponiertes 5‘-Triphosphat aufweist. Nach der
Erkennung von vRNA dimerisieren die RLRs und binden an das mitochondrial
41,42
associated antiviral signaling Protein (MAVS) am Mitochondrium. Verschiedene
Studien zeigen, dass MAVS der Schlüsselfaktor in der RLR-vermittelten IFN-Antwort
43,44
ist. MAVS formt nach Bindung der RLRs prionähnliche Aggregate, was zur
Aktivierung verschiedenen Faktoren, unter anderem TANK-binding kinase 1 (TBK1)
45
und IkappaB kinase-epsilon (IKKε), führt. TBK1 und IKKε sind wichtige Faktoren
46
der Immunantwort , die die interferon regulatory factors (IRF) 3 oder 7
47
phosphoryllieren. IRFs translozieren in den Nucleus und initiieren dort durch
Bindung an die Promotorregion die Expression von IFN-Genen. Die sezernierten

18
IFNs werden von IFN-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erkannt, was über eine
Signalkaskade zur Bildung von signal transducer and activator of transcription
(STAT)-Heterodimeren führt. Das STAT-Heterodimer bindet IRF9, um einen
Transkriptionsfaktor zu formen, der an den interferon stimulated response elements
(ISRE)-Promoter bindet und dadurch die Expression interferonstimulierter Gene
48
(ISGs) wie MX1 oder EIF2AK2 (PKR) induziert, welche antiviral wirken.
(s. Abbildung 3)

Abbildung 3: Immunerkennung von Hantaviren.


Abgebildet sind die Signalwege, die nach der Erkennung von Hantaviren durch Toll-
like Rezeptor 3 (TLR3) oder RIG-I-like Rezeptoren (RLRs) ablaufen. Links wird das
Signal nach Erkennung von dsRNA im Endosom durch TLR3 über TRIF
weitergeleitet. Auf der rechten Seite ist der RLR-MAVS-Signalweg abgebildet. Nach
Erkennung von cytoplasmatischer dsRNA durch RLRs binden die Rezeptoren an das
zentrale Signalprotein MAVS. Das Signal wird über IKKε und TBK1 weitergeleitet.
Beide Signalwege münden in der Translokation von IRF3, bzw. 7 in den Nucleus,
was eine IFN-Antwort induziert. Die ausgeschütteten IFNs führen zur Expression von
ISGs. Die Erkennung der dsRNA und Ablaufen der RLR-MAVS-Signalkaskade
führen zur Hemmung von HTNV. 49

19
1.5 Zielstellung der Arbeit
Das Ziel der Arbeit war es, die Relevanz des RLR-MAVS Signalwegs für die PUUV-
induzierte IFN-Antwort im Rahmen der frühen angeborenen Immunerkennung zu
untersuchen. Es sollte mit der einem humanen Lungenkarzinom entstammenden
epithelialen Reporterzelllinie (A549-Dual) gearbeitet werden. Zur Einstufung der Rolle
von MAVS für die IFN-Antwort sollte die gleiche Zelllinie mit MAVS-Knockout (A549-
Dual MAVS-KO) verwendet werden.

Dabei stellten sich folgende Fragen:

1. Lösen PUUV und TULV eine IFN-Antwort in A549-Dual Zellen aus?


2. Ist die IFN-Antwort vom RLR-MAVS Signalweg abhängig?

Nach Infektion mit verschiedenen Virusstämmen sollte eine Quantifizierung der IFN-
Antwort durch einen spezifischen Reporterassay erfolgen. Weiterhin sollten die
Expression von IFNs und ISGs auf Transkriptionsebene untersucht und die
exprimierten Proteine im Western Blot (WB)-Verfahren analysiert werden.

3. Führt eine Deletion des RLR-MAVS Signalwegs (MAVS-KO) zu einer


Veränderung des Replikationsverhaltens von PUUV und TULV?
a. Hemmt die IFN-Antwort die Replikation?
4. Repliziert TULV in A549 MAVS-KO Zellen besser als in A549-Dual Wildtyp
Zellen?

Hierzu wurde die Virusreplikation anhand der Detektion der viralen NP-Expression in
infizierten Zellen, sowie der Quantifizierung von vRNA und Nachkommenviren im
Zellkulturüberstand analysiert.

5. Zeigt sich eine vergleichbare Relevanz des RLR-MAVS Signalwegs für die
durch PUUV induzierte IFN-Antwort in humanen dermalen Endothelzellen
(HMEC-1)?

Als Analogon zum MAVS-KO in den A549-Dual Zellen sollte der TBK-1-Inhibitor
Amlexanox (AX) zur Hemmung des RLR-MAVS Signalwegs in HMEC-1-1 Zellen
verwendet werden.

20
2 MATERIAL
Materialien wie Zentrifugen, Handschuhe oder Inkubatoren, die zur
Standardausrüstung eines Labors der Sicherheitsstufe 2 gehören, werden im
Folgenden nicht gesondert aufgelistet.

2.1 Verbrauchsmaterial, Chemikalien und Instrumente


Tabelle 1: Instrumente

Beschreibung Hersteller

EV 231 Power Supply Consent

Mini-PROTEAN® Tetra Vertical BIO-RAD


Electrophoresis Cell

Trans-Blot™Turbo BIO-RAD

Go Blot™ Cytoskeleton, Inc.

ChemiDoc™ MP BIO-RAD

Applied Biosystems® 7500 Applied Biosystems

Bioruptor® Plus Diagenode

PTC-200 Thermal Cycler MJ Research

EVOS FL Fluoreszenzmikroskop Life Technologies

Infinite® M200 Pro Plate Reader TECAN

Tabelle 2: Chemikalien und Reagenzien

Chemikalie Hersteller

Methanol Roth

ROTIPURAN® ≥99,8 %, p.a. Ethanol Roth

EDTA Thermo Fisher Scientific

Fetales Kälberserum (FKS) Biochrom

L-Glutamin (L-Glu) Biochrom

Tween 20, 10% BIO-RAD

Page Ruler™ Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific

21
Epidermal growth factor (EGF) Invitrogen

Protease & Phosphatase Inhibitor Thermo Fisher Scientific

EDTA (0,5 M), pH 8,0 Thermo Fisher Scientific

Hydrocortison Sigma Alderich

Carboxymethylcellulose (CMC) Sigma Alderich

Penicillin/Streptomycin (P/S) Gibco

Random Primer Mix New England Biolabs

Amlexanox Invivogen

Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterialien Hersteller

Zelkulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 175 Thermo Fisher Scientific


cm2)

Mikrotiterplatten (6-, 12-, 24-, 96-Well) Thermo Fisher Scientific

Mini-PROTEAN TGX Gels, any kD, 10- BIO-RAD


15 Well

96-Well qPCR Platten Life Technologies

2.2 Zelllinien und Viren


Tabelle 4: Verwendete Zelllinien

Zellinie Spezies Zelltyp Quelle

A549 Homo sapiens Epithelzelle aus ATCC


humanem
Lungenkarzinom

HMEC-1 Homo sapiens Endothelzelle aus ATCC


humanem
mikrovaskulären
Gewebe

VeroE6 Chlorocebus Nierenepithelzelle ECACC


spp.

A549-Dual™ KO- Homo sapiens Lungenkarzinomzellen InvivoGen,


MAVS Cells mit MAVS-Knockout Catalog #a549d-
(KO) komavs

22
A549-Dual™ Cells Homo sapiens Lungenkarzinomzellen InvivoGen,
Catalog #a549d-
nfis

Tabelle 5: Virusstämme

Spezies Quelle Titer [FFU/ml]

PUUV Kazan Prof. Niedrig, RKI 5*106

PUUV Sotkamo Dr. Klempa, Institute of Virology, 1,2*105


Biomedical Research Center,
Slovak Academy of Science

PUUV CG1820 Natasa Knap, PhD, Institute of 3,5*105


Microbiology and Immunology,
University of Ljubljana

TULV Moravia 94 Dr. Günther; Bernhard-Nocht- 5*106


Institute for Tropical Medicine

2.3 Enzyme, Antikörper und Molekularbiologische Kits


Tabelle 6: Molekularbiologische Kits

Kit Hersteller

Trans-Blot® TURBO™ RTA Midi BIO-RAD


Nitrocellulose Transfer Kit

NucleoSpin® RNA Macherey-Nagel

QIAmp Viral RNA Mini Kit Qiagen

Quanti-Blue™ Solution Invivogen

Quanti-Luc™ Solution Invivogen

SuperSignal™ West Dura Extended Thermo Fisher Scientific


Duration Substrate

TaqMan™ Gene Expression Assay Applied Biosystems

SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific

Tabelle 7: Enzyme

Bezeichnung Verwendung Hersteller

Trypsin Ablösen von Nährbodenzentrum (NBZ)


adhärenten Zellen am RKI

23
Tabelle 8: Antikörper

Bezeichnung Ziel Spezies Hersteller

Primäre Antikörper

11904 IRF3 Kaninchen Cell Signaling


Technologies

4920 IRF7 Kaninchen Cell Signaling


Technologies

ab34757 Hantavirus- Maus Abcam


nukleokapsidprotein

37849 MX1 Kaninchen Cell Signaling


Technologies

ab32036 Phospho-PKR Kaninchen Abcam

8242 NF-κB p65 Kaninchen Cell Signaling


Technologies

5174 GAPDH Kaninchen Cell Signaling


Technologies

4499 Histon H3 Kaninchen Cell Signaling


Technologies

Sekundärantikörper

7074 Rabbit IgG (HRP- Ziege Cell Signaling


linked) Technologies

7076 Mouse IgG (HRP- Ziege Cell Signaling


linked) Technologies

4408 Mouse IgG (A488- Ziege Cell Signaling


labeled) Technologies

2.4 Puffer, Medien und Arbeitslösungen


Tabelle 9: Puffer

Puffer Verwendung Hersteller

StartingBlock™ T20(TBS) Blocken der PVDF- Thermo Fisher Scientific


Blocking Buffer Membran

TGS Buffer, 10x SDS-PAGE Laufpuffer BIO-RAD

24
TBS, 10x Waschpuffer für PVDF- NBZ am RKI
Membran

RIPA Buffer Zelllyse Thermo Fisher Scientific

PBS Waschpuffer in der NBZ am RKI


Zellkultur

LaneMarker Reducing Linearisierung der Thermo Fisher Scientific


Sample Buffer (5x) Proteine in der SDS-
PAGE

IFT Puffer (2% BSA, 0,1% Waschpuffer beim FFU- RKI


Natriumazid in PBS) Test

RA1-Puffer Bestandteil des Macherey-Nagel


NucleoSpin® RNA Kits

Tabelle 10: Zellkulturmedien

Medium Verwendung Hersteller

Dulbecco´s Modified Eagle´s Für Zellkultur von VeroE6 und Gibco


Medium (DMEM) A549

Overlay Medium (3,2 % CMC in Für Fixierung von Viren im RKI


DMEM, 2,5% FKS, 1% P/S) FFU-Test

HMEC-Medium (10% FKS in Für Zellkultur von HMEC-1 RKI


MCDB Medium, 10ng/mL
Epidermal Growth Factor,
1µg/ml Hydrocortison, 10mM L-
Glutamin)

A549-Dual Medium (10% FKS Für Zellkultur von A549-Dual InvivoGen


in DMEM, 2 mM L-Glutamin, 4.5
g/l Glucose, Pen-Strep (100
U/ml-100μg/ml), 100 μg/ml
Normocin™)

Infektionsmedium (1% FKS in Zum Anlegen von RKI


DMEM), 2mM L-Glutamin) Virusverdünnungen bei
Infektion von Zellen

25
2.5 Verwendete Software und Nukleinsäuren
Tabelle 11: Nichtkommerzielle Primer und Sonden

Oligonukleotid Sequenz Verwendung Quelle

PUUV forward s.Quelle Nachweis von Kramski et al.,


primer PUUV mRNA 200750

PUUV reverse
primer

PUUV Sonde

TULV forward s.Quelle Nachweis von Kramski et al,


primer TULV mRNA 200750

TULV reverse
primer

TULV Sonde

MYC forward primer gCC AgA ggA ggA Humanes RKI


ACg AgC T Referenzgen

MYC reverse primer ggg CCT TTT CAT


TgT TTT CCA

MYC Sonde Fam-TgC CCT gCg


TgA CCA gAT CC

Tabelle 12: Kommerziell erhältliche Expressions-Assays

Zielgen Bestellnummer Hersteller

IFNB1 Hs01077958_s1 Thermo Fisher Scientific

TNFA Hs00174128_m1 Thermo Fisher Scientific

IL6 Hs00174131_m1 Thermo Fisher Scientific

IL1B Hs01555410_m1 Thermo Fisher Scientific

MX1 Hs00895608_m1 Thermo Fisher Scientific

EIF2AK2 Hs00169345_m1 Thermo Fisher Scientific

IFNL1 Hs00601677_g1 Thermo Fisher Scientific

RNASEL Hs00221692_m1 Thermo Fisher Scientific

26
Tabelle 13: Verwendete Software

Name Hersteller Verwendung

ImageLab 6.0 BIO-RAD Analyse der Daten aus


dem ChemiDoc™

GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc. Erstellen von Graphen

7500 Software v2.3 Applied Biosystems Auswerten der Daten aus


Home dem Applied Biosystems
® 7500

Microsoft Office Word Microsoft Textverarbeitung

3 METHODEN

3.1 Zytologische Methoden

3.1.1 Kultivierung und Passage von Zelllinien

Alle Zelllinien wurden bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 unter sterilen
Bedingungen in 75 cm2 und 175 cm2 Zellkulturflaschen kultiviert. Adhärente Zelllinien
wurden vor den Passagen zweimal mit PBS gewaschen und durch Zugabe von 2 ml
Trypsin 10 min aus der Zellflasche gelöst. Anschließend wurden die Zellen je nach
Wachstumsstand 1:3 bis 1:10 verdünnt und in 20 bzw. 30 ml neuem Medium
aufgenommen. Die Passagen erfolgten je nach Konfluenz der Zellen alle 3-4 Tage.

3.1.2 Zellaufschluss

Um kultivierte und eventuell infizierte Zellen für Analysen aufzuschließen wurde mit
RIPA Puffer gearbeitet. Dieser wurde zum Schutz der Proteine vor Proteasen und
Phosphatasen zusätzlich mit Halt™ Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher
Scientific) und EDTA (0.5 M), pH 8.0 (Thermo Fisher Scientific) versetzt. Es wurden
pro Well einer 24-Well Platte 100 µL RIPA Puffer (Thermo Fisher Scientific)
hinzugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Um die Effektivität der Lyse zu erhöhen,
wurden das Lysat dreimal für 30 Sekunden ultrabeschallt.

27
3.1.3 Absorptionsmessung mit QUANTI-Blue

Die in dieser Arbeit verwendeten A549-Dual WT, bzw. MAVS-KO Zellen exprimieren
zwei Reportergene. Eines davon ist das secreted embryonic alkaline phosphatase,
(SEAP)-Gen, welches unter Kontrolle eines IFN-β Promotors in Verbindung mit fünf
NF-κB Bindestellen steht. Die SEAP wird von den Zellen ins Medium sezerniert wird
und kann mit dem QUANTI-Blue™-Assay-Reagenz (InvivoGen) in einem Infinite®
M200 Pro Plate Reader (TECAN) quantifiziert werden. Das QUANTI-Blue™-Reagenz
verfärbt sich in Gegenwart von SEAP ins lila-bläuliche, es wird die optische Dichte
bei 620-655 nm gemessen. So kann die NF-κB-Aktivität direkt quantifiziert werden.

3.1.4 Lumineszenzmessung mit QUANTI-Luc™

Die in dieser Arbeit verwendeten A549-Dual WT, bzw. MAVS-KO Zellen besitzen
zwei Reportergene. Eines davon ist eine Luciferase, die unter Kontrolle eines ISG54
minimal Promotors in Verbindung mit fünf ISREs steht und die von den Zellen ins
Medium sezerniert wird. Diese kann mit dem QUANTI-Luc™-Assay-Reagenz
(InvivoGen) in einem Infinite® M200 Pro Plate Reader (TECAN) quantifiziert werden.
Das QUANTI-Luc™-Reagenz enthält Coelenterazin, welches als Substrat für die
Luciferase dient. Es kommt zu einer Chemilumineszenz, welche vom TECAN Reader
gemessen wird. Dadurch kann die IRF-Aktivität direkt quantifiziert werden.

3.2 Proteinbiochemische Methoden

3.2.1 Denaturierung und SDS-PAGE

Um die im Zelllysat enthaltenen Proteine aufzutrennen wurden diese zunächst in


LaneMarker Reducing Sample Buffer bei bei 95°C für 5 min denaturiert.
Anschließend erfolgte eine sodium dodecylsulfate polyacrylamide-gel-electrophoresis
(SDS-PAGE), in der die Proteine der Größe nach aufgetrennt wurden. Hier wurden
Mini-PROTEAN TGX Gels, any kD, 10-15 Well (BIO-RAD) in der Mini-PROTEAN®
Tetra Vertical Electrophoresis Cell (BIO-RAD) nach Herstellerangaben verwendet.
Die Stromversorgung lief über den EV231 Power Supply (Consort) bei 200 V, 1 A
und 150 W für 30 min.

28
3.2.2 Western Blotting

Für einen Nachweis mit Antikörpern wurden die in der SDS-PAGE aufgetrennten
Proteine mit einem semi-dry-WB-System auf eine PVDF-Membran übertragen.
Hierbei wurde das Trans-Blot Turbo Transfersystem (BIO-RAD) nach
Herstellerangaben verwendet. Zunächst wurde die PVDF-Membran in Ethanol (99%)
für eine Minute aktiviert und danach zusammen mit zwei Transferpapierstapeln in
Transferpuffer drei bis vier Minuten equilibriert. In einer Blotting-Kassette lief der
Transfer in drei Minuten bei 25 V und 3,0 A ab. Direkt im Anschluss wurde die
Membran in 25 ml Blockpuffer für eine Stunde bei RT inkubiert, um freie
Bindungsstellen unspezifisch mit Proteinen zu blocken. Bei allen in dieser Arbeit
vorliegenden WB-Bildern wurde als Ladekontrolle die Expression des Housekeeping-
Gens GAPDH detektiert.

3.2.3 Detektion der Zielproteine

Die Detektion der vermuteten Proteine erfolgte über spezifische Antikörper. Zunächst
wurde die WB Membran mit einem in Blockpuffer gelösten Primärantikörper, welcher
spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Dies erfolgte über Nacht bei
4° C auf einem Orbitalrührer. Anschließend wurde die Membran mit Hilfe des Go
Blot™-Systems (Cytoskeleton) eine Stunde mit Sekundärantikörper inkubiert. Der
Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper und ist außerdem an eine
Meerettichperoxidase (Horseradish peroxidase, HRP) gekoppelt. Hiernach wurde die
Membran mit 2 ml SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Thermo
Fisher Scientific) entwickelt. Dieses besteht aus zwei Bestandteilen,
Wasserstoffperoxid und Luminol, welche in Gegenwart der an den
Sekundärantikörper gekoppelten HRP umgesetzt werden. Es entsteht eine
Chemilumineszenz, die im ChemiDoc™ MP (BIO-RAD) nachgewiesen wurde. Die
anschließende Auswertung erfolgte mit der Software ImageLab 6.0 (BIO-RAD).

3.3 Molekularbiologische Methoden

3.3.1 RNA-Extraktion aus Zellkulturüberstand

Um mittels qPCR vRNA im ZKÜS nachzuweisen, wurde zu verschiedenen


Zeitpunkten eine Probe genommen. Die ZKÜSs wurden bei 4° C und 2000rpm für 5
min zentrifugiert, um etwaige tote oder nichtadhärente Zellen zu entfernen. Der

29
Überstand wurde abgenommen, in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Tube überführt und
bei -80°C gelagert. Vor der RNA-Extraktion wurden im ZKÜS vorhandene Viren bei
65° C für 30 min in einem Heizblock inaktiviert. Es folgte eine RNA-Extraktion mit
dem QIAmp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) nach Herstellerprotokoll. Die eluierte RNA
wurde bei -80° C gelagert, um in einer Quantitativen-Echtzeit-Reverse-Transkriptase-
PCR (s. 3.3.4 qRT-PCR) analysiert zu werden.

3.3.2 RNA-Extraktion aus eukaryotischen Zellen

Für eine Untersuchung der zellulären Genexpression nach Virusinfektion erfolgte


eine Extraktion zellulärer RNA aus adhärenten Zellen mittels des NucleoSpin® RNA
Kit (Macherey-Nagel) nach Herstellerangaben.

3.3.3 cDNA-Synthese

Um die extrahierten zellulären RNAs mittels einer quantitativen Echtzeit-PCR (s.


6.4.5. qRT-PCR) zu quantifizieren, wurde nach einer erfolgten RNA-Extraktion die
RNA revers in complementary DNA (cDNA) transkribiert (Two-Step-Verfahren). Die
cDNA-Synthese erfolgte mittels des SuperScript IV-Kits (Thermo fisher Scientific)
nach Herstellerprotokoll unter Verwendung eines random primer mix (New England
Biolabs), der sowohl zufällige Hexamerprimer als auch anchored oligo-dT-Primer
enthält. Anschließend wurde die cDNA bei -20° C gelagert.

3.3.4 Quantitative-Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR (qRT-PCR)

Die Quantifizierung viraler RNA erfolgte über eine Quantitative-Echtzeit-Reverse-


Transkriptase-PCR (qRT-PCR). Hier ist im Enzymmix neben der DNA Polymerase
eine reverse Transkriptase enthalten und ermöglicht die direkte Verwendung von
RNA als Vorlage (One-Step-Verfahren). Die Proben wurden in 96-Well qPCR Platten
(Life Technologies) in einem Applied Biosystems® 7500 Thermocycler analysiert. Mit
der zugehörigen 7500 Software v2.3 werden cT-Werte erhalten. Je niedriger der cT-
Wert, desto höher die Konzentration an RNA in der Probe. Die in der qRT-PCR
verwendeten Primer für PUUV und TULV entstammen der 2007 publizierten Arbeit
von Kramski et al. 50 Der verwendete Ansatz und der Programmablauf sind in Tabelle
14 dargestellt.

30
Tabelle 14: Ansatz und Programmablauf für die qRT-PCR. Volumenangaben in µL

Inhalt Volumen [µl]

Wasser 5,15

Puffer RT 12,5

Enhancer 1

TULV/PUUV forward Primer 1

TULV/PUUV reverse Primer 1

TULV/PUUV Sonde 0,45

Enzymmix 0,9

Probe 3

Temperatur [°C] Zeit [s] Zyklen

45 900

95 600

95 15
42
60 30

3.3.5 Quantitative-Echtzeit-PCR (qPCR)

Für eine Quantifikation der Genexpression von spezifischen Immungenen nach einer
Virusinfektion wurden mit den synthetisierten cDNAs (s. cDNA-Synthese) qPCRs im
TaqMan-Format durchgeführt (Two-Step-Verfahren). Auch hier wurden die Proben in
96-Well qPCR Platten (Life Technologies) in einem Applied Biosystems® 7500
Thermocycler analysiert. Mit der zugehörigen 7500 Software v2.3 wurden ebenfalls
cT-Werte erhalten. Je niedriger der cT-Wert, desto höher die Konzentration an RNA
in der Probe. Der verwendete Ansatz und Programmablauf sind in Tabelle 15
dargestellt.
Tabelle 15: Ansatz und Programmablauf für die qPCR der cDNAs. Volumina in µl.
Assay steht hier für den jeweilig eingesetzten Primer-Sonden-Mix zur Analyse von
verschiedenen Immungenen.

Inhalt Volumen [µl]

Wasser 12,7

Puffer (10x) 2

31
MgCl2 0,6

dNTPs 1,6

Assay (20x) 1

Platinum Taq 0,1

Probe 1

Temperatur [°C] Zeit [s] Zyklen

94 120

94 15
42
60 60

Tabelle 16: Ansatz und Programmablauf für die qPCR der cDNA zur Analyse des
Housekeeping-Gens MYC als Vergleichswert für Gene der angeborenen
Immunantwort. Volumen in µl.

Inhalt Volumen [µl]

Wasser 12,3

Puffer (10x) 2

MgCl2 0,6

dNTPs 1,6

Forward Primer 0,6

Reverse Primer 0,6

Sonde 0,2

Platinum Taq 0,1

Probe 1

Temperatur [°C] Zeit [s] Zyklen

94 120

94 15
42
60 60

32
3.3.6 Relativer Vergleich von Genexpressionen mittels ∆cT-Methode

Um die Stärke der Genexpression zwischen verschiedenen Proben vergleichen zu


können, wurden die cT-Werte aus der 7500 Software v2.3 (Applied Biosystems
Home) zunächst auf die Expression des Housekeeping-Gens MYC normalisiert
(ΔcT):
∆cT = cTZiel − cTReferenz

Die Standardabweichung (s) berechnet sich aus den mittleren


Standardabweichungen von cTZiel und cTReferenz .

s = √sZiel 2 + sReferenz 2
Der verwendete Ansatz und der Programmablauf sind in Tabelle 16 dargestellt.

3.4 Virologische Methoden

Virologisches Arbeiten fand getrennt von nicht-infektiösen Arbeiten in einem


separaten S2-Labor unter einer Sicherheitswerkbank statt.

3.4.1 Infektion adhärenter Monolayer-Zellen

Zum Vergleich der Infektion verschiedener Viren und Zelllinien wurde ein
einheitliches Protokoll angewandt. Um eine Virusinfektion in vitro zu erzielen, wurden
zunächst Zellen ausgesät und 24h inkubiert (80 – 90% Konfluenz). Am Folgetag
wurde das Nährmedium abgenommen und durch Infektionsmedium mit gewünschter
multiplicity of infection (MoI) ersetzt. Eine MoI von 1,0 steht für ein eingesetztes
infektiöses Virus pro ausgesäte Zelle. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Infektion
stets in einem Volumen von 200 µL pro Well einer 24-Well Zellkulturplatte. Nach
einer Adhäsionszeit von einer Stunde unter Kulturbedingungen (37°C, 5% CO2)
wurde das Infektionsmedium wieder entfernt und pro Well 500 µL normales
Zellkulturmedium zugegeben. Die weitere Inkubation erfolgte ebenfalls bei 37°C und
5% CO2 unter sterilen Bedingungen. Probennahme erfolgte durch Abnehmen des
gesamten ZKÜS eines Wells. Hiervon wurden 320 µL eingefroren und für FFU-Tests
(s. Focus forming unit Assay) verwendet. Die restlichen 180 µL wurden bei 65°C für
30 min inaktiviert und via qRT-PCR (s. 3.3.4) analysiert. Die adhärenten Zellen am
Boden des Wells wurden für eine Proteinanalyse im WB (s. Western Blotting) wie in
Punkt 3.1.2 beschrieben aufgeschlossen. Alle Proben wurden in biologischen
Duplikaten genommen und erfolgten zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144

33
Stunden nach Infektion (h p.i. = hours post infection). In einigen Experimenten wurde
der beobachtete Zeitraum verkürzt oder verlängert. Analysen des Zelllysats im WB
wurden stets nur mit einem biologischen Replikat durchgeführt, die Quantifizierungen
der vRNA wurden in qPCR und FFU-Test mit beiden biologischen Replikaten jeweils
in technischen Triplikaten. Alle verwendeten Virusstocks wurden durch Anzucht der
Viren auf VeroE6 Zellen und anschließende Aufreinigung und Aufkonzentrierung
über Zentrifugation durch ein Zuckerkissen (30 % Saccharose) gewonnen. (s.
11
Beschreibung in Bourquain et al. 2019 ) Alle Virusstocks wurden negativ auf
Kontamination durch Mycoplasmata getestet.

3.4.2 Focus forming unit Assay

Da Hantaviren keine lytischen Viren sind, wurde zur Quantifizierung der infektiösen
Nachkommenviren ein focus forming unit (FFU)-Assay durchgeführt. Durch Auftragen
verschiedener Virusverdünnungen und Anfärben mit fluoreszenzmarkierten
Antikörpern wird der Titer der infektiösen Nachkommenviren ermittelt. Zunächst
wurden VeroE6 Zellen in einer Konzentration von 2x104 Zellen/Well in schwarzen 96
Well Platten mit optischem Boden ausgesät und über Nacht bis zu vollständiger
Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde abgenommen und dekadische
Virusverdünnungen in technischen Triplikaten der jeweiligen Proben zugegeben. Es
folgte eine einstündige Inkubationszeit bei 37°C und 5% CO2, nach der die
Virusverdünnungen wieder abgenommen und durch 100 µl pro Well Overlay Medium
ersetzt wurden. Es enthält Carboxymethylcellulose, welche durch ihre hohe
Viskosität verhindert, dass sich die Infektion über das Medium verbreitet. Nach einer
Inkubation von 7 Tagen bei 37°C und 5% CO2 wurde das Overlay Medium
abgenommen, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und der Zellrasen 10 min mit
eiskaltem Methanol fixiert. Anschließend erfolgte der Immunfluoreszenzfärbung.
Hierfür wurden die Platten zweimal mit 150 µl PBS gewaschen, gefolgt von einer
Zugabe von 100 µl IFT-Puffer für 30 min bei RT und einer einstündigen Inkubation
mit 50 µl Primärantikörper (anti-hantavirus nucleocapsid protein ab34757) 1:500 in
IFT-Puffer verdünnt bei 37°C und 5% CO2. Danach wurde mit 150µl PBS dreimal
gewaschen und mit 50 µl Sekundärantikörper (anti-mouse IgG A488-labeled) 1:1000
in IFT-Puffer verdünnt für eine Stunde bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Abschließend
wurde dreimal mit PBS gewaschen und die Foci fluoreszenzmarkierter Zellen am

34
Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Der Titer wird in FFU/ml angegeben und
berechnet sich mittels der folgenden Formel:

ä
= /
ü ×

35
4 ERGEBNISSE

4.1 PUUV löst in A549-Dual Zellen eine MAVS-abhängige


Immunantwort aus

In dieser Arbeit wurde untersucht, in welchem Maße die intrazelluläre dsRNA


Detektion über den RLR-MAVS Signalweg die Immunantwort gegenüber Hantaviren
beeinflusst. Zunächst wurde mit dem QuantiLuc-Assay die IRF-Aktivität in A549-Dual
WT und MAVS-KO Reporterzellen nach Infektion mit PUUV und TULV quantifiziert.
(s. 364.1.1) Die Expression der durch IRFs induzierten IFNs und der in Folge
exprimierten ISGs wurden mittels einer qPCR quantifiziert. (s. 4.1.2) Im Zelllysat
wurde das IFN-induzierte, antivirale MX1 Protein mittels WB-Verfahren detektiert. (s.
4.1.3) Neben der hier vorgestellten Quantifizierung der IFN-Antwort wurde die NF-κB-
Aktivität und damit die proinflammatorische Entzündungsantwort in A549-Dual Zellen
mit dem QUANTI-Blue™-Assay (s. 3.1.3) untersucht. Die Daten finden sich im
Anhang. (s. 11.1)

4.1.1 Quantifizierung der IRF-Aktivität

Gegenstand der Untersuchung war die IRF-Aktivität in A549-Dual Reporterzellen als


Folge einer Infektion mit PUUV und TULV. Hierfür wurde die Aktivität der
sezernierten Luciferase gemessen. Zunächst wurden A549-Dual Wildtyp (WT) und
MAVS-KO Zellen wie in 3.4.1 beschrieben kultiviert und mit PUUV und TULV in
verschiedenen MoI infiziert. Die Proben aus dem ZKÜS wurden mit dem QuantiLuc-
Assay (s. 3.1.4) analysiert, um die IRF-Aktivität zu quantifizieren. In beiden Zelltypen
war eine generelle Zunahme der IRF-Aktivität zu beobachten Bei einer PUUV-
Infektion mit MoI = 1,0 wurde in den WT Zellen ab 48 h p.i. eine IRF-Aktivität
detektiert, die über die Zeit stark zunahm. Auch bei geringerer MoI kam es zu einer
starken IRF-Aktivität ab 72 h p.i. IFN-β wurde als Positivkontrolle 48 h p.i. zugegeben
und rief ab 72 h p.i. eine verstärkte IRF-Aktivität hervor. (Abbildung 4) In den MAVS-
KO Zellen wurde dagegen nahezu keine IRF-Aktivität auf eine Infektion mit PUUV
hervorgerufen. Die Positivkontrolle mit IFN-β ruft jedoch eine ähnlich starke IRF-
Aktivität wie in den WT Zellen hervor. (Abbildung 5) Eine Infektion mit TULV löste in
beiden Zelltypen bis 144 h p.i. keine deutlich höhere IRF-Aktivität als in nicht
infizierten Zellen aus.

36
Abbildung 4: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual WT Zellen nach
Infektion mit PUUV und TULV. A549-Dual WT Zellen wurden mit PUUV oder TULV
mit MoI = 1,0, 0,1 oder 0,01 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72 und 144 h p.i.
wurde die Luciferase-Aktivität im Überstand als Maß für die IRF-Aktivität mittels des
QuantiLuc-Assays quantifiziert. Rlu steht für relative luminescence units. Als
Positivkontrolle wurde IFN-β 48 h p.i. zugegeben und ab 72 h p.i. detektiert.

Abbildung 5: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual MAVS-KO Zellen


nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-Dual MAVS-KO Zellen wurden mit
PUUV oder TULV mit MoI = 1,0, 0,1 oder 0,01 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72
und 144 h p.i. wurde die Luciferase-Aktivität im Überstand als Maß für die IRF-
Aktivität mittels des QuantiLuc-Assays quantifiziert. Rlu steht für relative
luminescence units. Als Positivkontrolle wurde IFN-β 48 h p.i. zugegeben und ab 72
h p.i. detektiert.

37
4.1.2 Quantifizierung der Expression ausgewählter Gene der
angeborenen Immunantwort

Ziel des Versuches war eine Quantifizierung der Expression repräsentativer Gene
der angeborenen Immunantwort. Um zu untersuchen, ob die IRF-Aktivität nach
PUUV-Infektion mit einer verstärkten IFN-Expression korreliert und dies in der
Expression verschiedener ISGs resultiert, wurden erneut A549-Dual WT und MAVS-
KO Zellen kultiviert und mit PUUV und TULV (MoI = = 0,1) infiziert. Zu den
Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurden die Zellen lysiert und die zelluläre RNA
extrahiert. (s. 3.3.2) Es folgte eine cDNA-Synthese (s. 3.3.3) und qPCRs im TaqMan-
Format. (s. 3.3.5) Folgend sind ΔcT-Werte über die Zeit abgebildet, erhalten nach
Normalisierung auf die Expression des zellulären housekeeping-Gens MYC. (s.
3.3.6)

Es wurde die Expression der IFN-Gene IFNB1 und IFNL1, der ISGs MX1, PKR und
RNASEL, sowie der proinflammatorischen Gene CXCL1, TNF, IL6, IL1B, und GDF15
analysiert.

4.1.2.1 Quantifizierung der IFN-Genexpression

Zur Quantifizierung der IFN-Antwort mittels qPCR wurden die Gene IFNB1 und
IFNL1 analysiert.

4.1.2.1.1 IFNB1

Das Interferon Beta 1 (IFNB1) Gen codiert ein Cytokin IFN-β, ein Typ I-IFN, welches
eine wichtige Rolle in der Abwehr viraler Infektionen spielen. Die Expression war in
den WT und MAVS-KO Zellen 24 h p.i. ähnlich, ob infiziert oder nicht. Ab 48 h p.i.
kam es zu einem Anstieg um 6 ΔcT-Werte der IFNB1-Expression in PUUV-infizierten
WT Zellen, der sich 72 h p.i. nochmals um 2 ΔcT-Werte verstärkte. In MAVS-KO
Zellen und nicht infizierten Zellen kam es zu keiner verstärkten Expression nach
Infektion mit PUUV. Die TULV-Infektion hatte keinen Effekt auf die Expression von
IFNB1. (Abbildung 6)

38
0
PUUV, MoI = 0,1, Wildtyp
PUUV, MoI = 0,1, MAVS-KO
TULV, MoI = 0,1, Wildtyp
TULV, MoI = 0,1, MAVS-KO
-5 nicht infiziert, Wildtyp
nicht infiziert, MAVS-KO
cT

-10

-15
24

48

72

96
h p.i.
Abbildung 6: Expression von IFNB1 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels Two-
step-q-RT-PCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der IFNB1 im Vergleich zur MYC q-RT-PCR und somit für eine erhöhte
Expression des Gens.

4.1.2.1.2 IFNL1

Das Interferon Lambda 1 (IFNL1) Gen codiert das Cytokin IFN-λ1, ein Typ III-IFN,
das ebenfalls eine wichtige Rolle in der Abwehr viraler Infektionen spielt Die
Expression war in den WT und MAVS-KO Zellen 24 h p.i. ähnlich, ob infiziert oder
nicht. Ab 48 h p.i. kam es zu einem deutlichen Anstieg der IFNL1-Expression in
PUUV-infizierten WT Zellen, der sich 72 h p.i. nochmals verstärkte. In MAVS-KO
Zellen und nicht infizierten Zellen kam es zu keiner verstärkten Expression nach
Infektion mit PUUV. Die TULV-Infektion hatte keinen Effekt auf die Expression von
IFNL1. (Abbildung 7)

39
Abbildung 7: Expression von IFNL1 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels Two-
step-q-RT-PCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der IFNL1 im Vergleich zur MYC q-RT-PCR und somit für eine erhöhte
Expression des Gens.

Ein starker Anstieg der beiden analysierten IFN-Gene war nur in WT Zellen nach
PUUV-Infektion zu sehen. In MAVS-KO Zellen wurden diese Gene dagegen nicht
erhöht exprimiert. (Abbildung 6, Abbildung 7) TULV rief in keinem Zelltyp eine IFN-
Expression hervor.

4.1.2.2 Quantifizierung der Expression ausgewählter ISGs

Um zu untersuchen, ob die erhöhte IFN-Expression in ebenfalls erhöhter ISG-


Expression, bzw. fehlender ISG-Induktion in MAVS-KO Zellen resultiert, wurden die
Gene MX1, EIF2AK2, und RNASEL ausgewählt.

4.1.2.2.1 MX1

MX Dynamin Like GTPase 1 (MX1) codiert ein Protein, welches die Replikation
verschiedener RNA- und DNA-Viren behindert. Die Expression wird durch Typ I und -

40
III-Interferone induziert. Die Expression war in den WT und MAVS-KO Zellen 24 h p.i.
ähnlich, ob infiziert oder nicht. Ab 48 h p.i. kam es zu einem deutlichen Anstieg der
MX1-Expression in PUUV-infizierten WT Zellen, der 72 h p.i. wieder etwas abnahm.
In den MAVS-KO Zellen kam es 48 und 72 h p.i. zu einem generellen Anstieg der
Expression über die Zeit. Auch bei Infektion mit TULV beobachteten wir eine erhöhte
Expression in WT Zellen gegenüber MAVS-KO Zellen. (Abbildung 8)

Abbildung 8: Expression von MX1 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-Dual
WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert. Zu den
Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels Two-step-q-
RT-PCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der MX1 im Vergleich zur MYC q-RT-PCR und somit für eine erhöhte
Expression des Gens.

4.1.2.2.2 EIF2AK2 (PKR)

Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Alpha Kinase 2 (EIF2AK2), auch Protein


Kinase R (PKR) ist ein IFN-induziertes Gen und codiert eine Ser/Thr-Proteinkinase,
welche durch dsRNA aktiviert wird und letztlich eine Inhibition der zellulären und
viralen Proteinbiosynthese zur Folge hat. Die Expression war in den WT und MAVS-
KO Zellen 24 h p.i. ähnlich, ob infiziert oder nicht. Ab 48 h p.i. kam es zu einem
deutlichen Anstieg der PKR-Expression in PUUV-infizierten WT Zellen, der 72 h p.i.

41
wieder etwas abnahm. In den MAVS-KO Zellen kam es zu keiner Veränderung der
Expression, die hier generell schwächer verlief. Auch bei Infektion mit TULV
beobachteten wir keine Induktion von EIF2AK2. (Abbildung 9)

Abbildung 9: Expression von EIF2AK2 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels Two-
step-q-RT-PCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der EIF2AK2 im Vergleich zur MYC q-RTPCR und somit für eine
erhöhte Expression des Gens.

4.1.2.2.3 RNASEL
Ribonuclease L (RNASEL) codiert eine Endoribonuclease, die eine Rolle in der
antiviralen IFN-Antwort spielt. Wahrscheinlich resultiert der antivirale Effekt aus der
Kombination von einer Zersetzung von viralen ssRNAs, einer Inhibition der
Proteinbiosynthese durch Degradation von rRNA und einer Induktion von anderen
antiviralen Genen. In der beobachteten Zeit konnten wir keine starke Veränderung
der Expression feststellen, zum 48 h p.i. war die Expression von RNASEL in PUUV-
infizierten WT Zellen am höchsten. 72 h p.i. war die Expression jedoch in allen Zell-
und Infektionstypen wieder auf ähnlichem Niveau wie 24 h p.i. (Abbildung 10)

42
Abbildung 10: Expression von RNASEL nach Infektion mit PUUV und TULV.
A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV
infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens
mittels Two-step-q-RT-PCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere
Menge an Amplifikaten der RNASEL im Vergleich zur MYC q-RT-PCR und somit für
eine erhöhte Expression des Gens.

Die Expression der ISGs MX1 und EIF2AK2 (PKR) war in WT Zellen nach einer
PUUV-Infektion leicht erhöht, (Abbildung 8, Abbildung 9) die Expression von
RNASEL war nicht stark erhöht. (Abbildung 10) In den MAVS-KO Zellen rief eine
PUUV-Infektion keine Expression der analysierten Gene hervor. Generell zeigt sich
in den WT Zellen eine höhere Expression der analysierten Gene, TULV rief keine
Veränderungen der Expression hervor.

4.1.2.3 Quantifizierung der Expression proinflammatorischer Cytokine


Da wir eine starke IFN-Antwort auf PUUV-Infektion in A549-Dual WT Zellen
beobachten konnten, wurden zusätzlich noch ausgewählte Gene der
proinflammatorischen Antwort analysiert. Die Expression der Gene TNF, IL6, IL1B,

43
und GDF15 war nicht besonders erhöht und nahm zum Teil nur über die Zeit zu. Die
Daten finden sich im Anhang. (s. 11.2)

24

48

72

96
0

Abbildung 35) Die Expression von CXCL1 ist allerdings deutlich erhöht. (Abbildung
11) Eine Infektion mit TULV rief ein keinem der analysierten Gene eine Veränderung
der Expression proinflammatorischer Gene hervor.

4.1.2.3.1 CXCL1

C-X-C Motif Chemokine Ligand 1 (CXCL1) ist ein antimikrobielles Gen und codiert
ein Chemokin der CXC Familie. Das codierte Protein spielt als chemischer Lockstoff
eine Rolle in Entzündungsreaktionen. Die Expression war in den WT und MAVS-KO
Zellen 24 h p.i. ähnlich, ob infiziert oder nicht. Ab 48 h p.i. kam es zu einem
deutlichen Anstieg der CXCL1-Expression in PUUV-infizierten WT Zellen, der sich 72
h p.i. nochmals verstärkte. In MAVS-KO Zellen und nicht infizierten Zellen kam es zu
keiner verstärkten Expression nach Infektion mit PUUV. Die TULV-Infektion hatte
keinen Effekt auf die Expression von CXCL1 (Abbildung 11)

44
Abbildung 11: Expression von CXCL1 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels Two-
step-q-RT-PCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der MX1 im Vergleich zur MYC q-RT-PCR und somit für eine erhöhte
Expression des Gens.

4.1.3 Untersuchung der Expression des antiviralen IFN-stimulierten


Proteins MX1 in PUUV und TULV-infizierten Zellen

In den Ergebnisse aus 4.1.1und 4.1.2 war eine erhöhte IRF-Aktivität, eine erhöhte
IFN-Expression und eine erhöhte Expression des MX1 Gens in PUUV-infizierten
A549-Dual WT Zellen zu beobachten. Um auch die Proteinexpression zu
untersuchen, wurden A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen mit PUUV und TULV
infiziert (MoI = 0,1). Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurden die
infizierten Zellen lysiert und die Expression der Proteine MX1, P-PKR und IRF7 im
WB-Verfahren (s. 3.2.2) analysiert.

MX Dynamin Like GTPase 1 (MX1) ist ein Protein, welches die Replikation
verschiedener RNA- und DNA-Viren behindert. Die Expression wird durch Typ I und -
II-Interferone induziert. (s. 4.1.2.2.1)

45
Bei einer Infektion mit PUUV wurde in WT Zellen MX1 ab 48 h p.i. detektiert, im
Gegensatz dazu in den MAVS-KO Zellen nahezu kein MX1. Dies korreliert mit den
Ergebnissen der qPCR in 4.1.2.2.1. Auf eine Infektion mit TULV erfolgte weder in WT
noch in MAVS-KO Zellen eine Expression von MX1. (Abbildung 12)

Abbildung 12: Expression des MX1 Proteins in A549-Dual WT und MAVS-KO


Zellen nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen
wurden mit PUUV oder TULV mit MoI = 0,1 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72
und 144 h p.i. wurde das MX1 Protein im Zelllysat im WB-Verfahren analysiert.
GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

4.1.4 Untersuchung der Aktivierung des antiviralen Proteins PKR


und der Expression des Transkriptionsfaktors IRF7

Virale dsRNA induziert in der Zelle nach Erkennung über RLRs oder TLRs eine IFN-
Antwort durch die Akivierung von IRFs, kann aber auch direkt antivirale Proteine wie
PKR aktivieren. PKR wirdauch in nicht infizierten Zellen schwach exprimiert, aber
durch IFN stark induziert. Ihre antivirale Wirkung entfaltet die PKR erst nach Bindung
an virale dsRNA, die Aktivierung geschieht vermutlich durch Autophosphorylierung.
Wir untersuchten die aktive, phosphorylierte Form (P-PKR) im WB-Verfahren.

IRF7 ist ein Transkriptionsfaktor, der über den RLR-MAVS Signalweg aktiviert wird,
in den Nukleus transloziert und so eine IFN-Antwort induziert, welche wiederum stark
die Expression von IRF7 induziert. (s. Abbildung 3)

Die Phosphorylierung von P-PKR und die Expression von IRF7 wurde erst ab 72 h
p.i. detektiert. Zu sehen ist ein deutlicher Unterschied zwischen den WT und MAVS-
KO Zellen, in den WT Zellen waren beide Proteine 72 h p.i. deutlich stärker

46
vorhanden, die Expression nahm aber zu 144 h p.i. ab. In den MAVS-KO Zellen
nahm die Expression von P-PKR dagegen über diesen Zeitraum zu, IRF7 wurde erst
ab 144 h p.i. exprimiert. (Abbildung 13)

Abbildung 13: Expression von IRF7 und Phosphorylierung von PKR


in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit PUUV. A549-Dual
WT und MAVS-KO Zellen mit PUUV infiziert (MoI = 0,1). Zu den
Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurden die Proteine P-PKR und
IRF7 im Zelllysat im WB-Verfahren analysiert. GAPDH wurde als
Ladekontrolle detektiert.

4.2 Ein Knockout von MAVS begünstigt die Replikation von


PUUV in A549-Dual Zellen

Um die Auswirkungen des MAVS-KO und des damit einhergehenden Verlusts der
IFN-Antwort auf die Replikation von PUUV und TULV zu analysieren, wurde die
Virusreplikation anhand der Detektion des NP im WB-Verfahren untersucht (s. 4.2.1),
sowie anhand der Quantifizierung viraler RNAs im ZKÜS und von gebildeten
Nachkommenviren im ZKÜS (mittels FFU-Test) durchgeführt. (s. 4.2.2,4.2.3)

4.2.1 Analyse der Expression von viralem NP als Marker für die
Virusreplikation

Die Replikation von TULV und PUUV wurde vergleichend in A549-Dual WT und
MAVS-KO Zellen untersucht. Die Zellen wurden kultiviert und mit PUUV und TULV
infiziert (MoI = 0,1) und zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. Proteinlysate
für eine Analyse im WB-Verfahren extrahiert (s. 3.2.2). Die Expression des NP wurde
als Indikator für die Virusreplikation verwendet. Eine deutliche Akkumulation von NP

47
war nach einer Infektion mit PUUV ab 48 h p.i. sowohl in WT als auch MAVS-KO
Zellen zu beobachten, wobei die Menge an NP in MAVS-KO deutlich überwog. Nach
einer Infektion mit TULV war NP nur zum Zeitpunkt der Infektion, nicht aber an
späteren Zeitpunkten nachzuweisen. (Abbildung 14)

Abbildung 14: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit


PUUV und TULV. A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit PUUV und TULV
infiziert (MoI = 0,1). Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurde NP im
Zelllysat im WB-Verfahren analysiert. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

4.2.2 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR


Als Maß für die Bildung und Freisetzung von Nachkommenviren wurde die
Konzentration viraler RNA im ZKÜS mittels q-RT-PCR quantifiziert. Um die
Ergebnisse aus dem WB zu verifizieren und zu erweitern, wurden A549-Dual WT und
MAVS-KO Zellen kultiviert und mit PUUV und TULV infiziert (MoI = 0,1). RNA aus
dem ZKÜS wurden zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. extrahiert und die
Konzentration viraler RNA mit einer q-RT-PCR im TaqMan-Format quantifiziert. (s.
3.3.4) Bei einer PUUV-Infektion waren deutliche Unterschiede zwischen WT und
MAVS-KO Zellen zu erkennen. 0 bis 48 h p.i. wurde in beiden Zelltypen annähernd
gleich viel vRNA nachgewiesen, in den MAVS-KO Zellen 144 h p.i. 4 ΔcT-Werte
mehr als in den WT Zellen. TULV dagegen replizierte in WT Zellen etwas besser als
in MAVS-KO Zellen. Bei Infektion mit TULV nahm die vRNA-Konzentration 24 h p.i.
um 4 ΔcT-Werte zu, um dann bis 72 h p.i. wieder auf Anfangsniveau zu sinken. Ein
Unterschied von 2 ΔcT-Werten bei den Zelltypen zeigten sich nur 144 h p.i., hier
wurde mehr vRNA in den WT Zellen detektiert. (Abbildung 15)

48
cT

Abbildung 15: Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von A549-Dual
WT und MAVS-KO Zellen mit PUUV und TULV. A549-Dual WT und MAVS-KO
Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert. Zu den Zeitpunkten 0, 24,
48, 72 und 144 h p.i. wurden virale Genomkopien im ZKÜS mittels q-RT-PCR
nachgewiesen.

4.2.3 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS


mittels FFU-Tests

Eine wie in 4.2.2 durchgeführte q-RT-PCR erfasst auch nicht infektiöse Viren und
Bruchstücke der Hantavirus-RNA. Um eine genaue Aussage über die Produktion von
infektiösen Nachkommenviren treffen zu können, wurde deshalb ein FFU-Test
durchgeführt. (s. 3.4.2) PUUV wurde mit einer MoI = 0,1 eingesetzt. Von 24 auf 48 h
p.i. war ein Anstieg der Nachkommenproduktion um das ca. 26-fache in beiden
Zelltypen zu beobachten. 72 h p.i. bis 144 h p.i. wurden in den WT Zellen keine
neuen Nachkommen mehr produziert, was mit der einsetzenden Immunantwort
korreliert. (s. 4.1) In den MAVS-KO Zellen war die Produktion um das ca. 300-fache
höher (s. Abbildung 16)

49
Abbildung 16: Quantifizierung von infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS nach
Infektion von A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen mit PUUV. A549-Dual WT und
MAVS-KO Zellen wurden mit PUUV (MoI = 0,1) infiziert. Zu den Zeitpunkten 0, 24,
48, 72 und 144 h p.i. wurden infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS mittels FFU-
Test nachgewiesen.

4.3 PUUV Kazan, Sotkamo und CG1820 lösen in A549-Dual


Zellen eine MAVS-abhängige Immunantwort aus

Um auszuschließen, dass die in 4.1 und 4.2 erzielten Ergebnisse speziell nur mit
PUUV Kazan erzielbar sind, wurde zusätzlich mit zwei weiteren PUUV-Stämmen,
CG1820 und Sotkamo, gearbeitet

Es wurden A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen über 216 h (9 d) mit den drei
Stämmen infiziert. Proben wurden wie in 3.4.1 beschrieben genommen. Es wurden
wie schon in 4.1 und 4.2 die IFN-Antwort der Zellen und die Replikation der drei
Virusstämme analysiert. (s. 4.3.1 - 4.3.4)

4.3.1 Quantifizierung der IRF-Aktivität

Wie in 4.1.1 wurde die IRF-Aktivität nach einer Infektion mit PUUV in A549-Dual
Reporterzellen untersucht. Es wurden drei verschiedene Stämme (MoI = 0,1)
verwendet und zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. Proben aus dem ZKÜS
abgenommen.

50
Es zeigte sich ein ähnliches Ergebnis wie in 4.1.1 Bei einer PUUV CG1820-Infektion
wurde bereits 24 h p.i. eine IFN-Antwort detektiert, die über die Zeit stark zunahm.
Die Immunantwort auf PUUV Kazan wurde ab 48 h p.i. detektiert, auf PUUV Sotkamo
ab 72 h p.i. schwach. (Abbildung 17: ) Im Gegensatz hierzu löste in den MAVS-KO
Zellen kein PUUV-Stamm eine starke IFN-Antwort aus. Eine generelle Zunahme der
IRF-Aktivität über die Zeit war sichtbar. (Abbildung 18)

Wie in 4.1.1 wurde ebenfalls die NF-κB-Aktivität und damit die proinflammatorische
Entzündungsantwort quantifiziert, die Daten finden sich ebenfalls im Anhang. (s.
11.1) Auch bei Infektion mit anderen PUUV-Stämmen zeigte sich, dass die
proinflammatorische Immunantwort in MAVS-KO Zellen nicht so stark wie in WT
Zellen erfolgte. (Abbildung 30, Abbildung 31)

Abbildung 17: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual WT Zellen nach


Infektion mit drei PUUV-Stämmen. A549-Dual WT Zellen wurden mit
verschiedenen PUUV-Stämmen, MoI = 0,1 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72
und 144 h p.i. wurde die Luciferase-Aktivität im Überstand als Maß für die IRF-
Aktivität mittels des QuantiLuc-Assays quantifiziert. Rlu steht für relative
luminescence units.

51
Abbildung 18: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual MAVS-KO Zellen
nach Infektion mit drei PUUV-Stämmen. A549-Dual MAVS-KO Zellen wurden mit
verschiedenen PUUV-Stämmen, MoI = 0,1 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72
und 144 h p.i. wurde die Luciferase-Aktivität im Überstand als Maß für die IRF-
Aktivität mittels des QuantiLuc-Assays quantifiziert. Rlu steht für relative
luminescence units.

4.3.2 Analyse der Expression von viralem NP als Marker für virale
Replikation

Zur Untersuchung des Replikationsverhaltens der drei PUUV-Stämme, wurden wie in


4.2.1 A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen kultiviert und mit PUUV Kazan, CG1820
und Sotkamo infiziert (MoI = 0,1). Proteinlysate wurden zu den Zeitpunkten 0, 24, 48,
72, 144 und 216 h p.i. extrahiert und im WB-Verfahren analysiert (s. Western
Blotting). Auch hier wurde NP als ein Indikator für Virusreplikation verwendet und bei
allen drei Stämmen eine deutliche Akkumulation beobachtet, außer bei Sotkamo, hier
wurde NP nur 144 h p.i. in MAVS-KO Zellen detektiert. (s. Abbildung 19 – Abbildung
21) Kazan zeigte das gleiche Replikationsverhalten wie in Abbildung 14; Eine
Akkumulation von NP über die Zeit, in MAVS-KO Zellen deutlich stärker als in WT
Zellen. Auf eine Infektion mit CG1820 erfolgte bereits ab 24 h p.i. eine starke Bildung
von NP, die allerdings in WT Zellen ab 72 h p.i. stagnierte, bzw. regressiv verlief. In
den MAVS-KO Zellen wurde deutlich mehr NP gebildet.

52
Abbildung 19: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit
Kazan. A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit PUUV Kazan infiziert (MoI
= 0,1). Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurde NP im Zelllysat im WB-
Verfahren analysiert. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

Abbildung 20: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit


CG1820. A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit PUUV CG1820 infiziert
(MoI = 0,1). Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurde NP im Zelllysat im
WB-Verfahren analysiert. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

53
Abbildung 21: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit
Sotkamo. A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit PUUV Sotkamo infiziert
(MoI = 0,1). Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurde NP im Zelllysat im
WB-Verfahren analysiert. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

4.3.3 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR

Um das Replikationsverhalten der drei PUUV-Stämme über den WB hinaus zu


analysieren, wurden wie schon in 4.2.2 A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen
kultiviert und mit den drei PUUV-Stämmen infiziert (MoI = 0,1). RNA aus dem ZKÜS
wurde zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72, 144 und 216 h p.i. (bei Sotkamo nur 0, 48
und 144 h p.i.) extrahiert und die Konzentration viraler RNA mit einer q-RT-PCR im
TaqMan-Format analysiert. (s. 3.3.4). Aufgetragen sind cT-Werte, erhalten mit der
PUUV-spezifischen q-RT-PCR. Die Konzentration der vRNA von PUUV Kazan und
CG1820 war zunächst unabhängig vom Zelltyp ähnlich, CG1820 rief zu Beginn in
beiden Zelltypen eine höhere vRNA-Konzentration hervor als Kazan, 72 h p.i. war die
Konzentration aber wieder annähernd dieselbe. Ab 144 h p.i. begann die
Konzentration der vRNA sowohl von Kazan als auch CG1820 in den MAVS-KO
Zellen anzusteigen, den sehr deutlichen Unterschied von 5 cT-Werten (Kazan), bzw.
3 cT-Werten (CG1820) beobachteten wir 216 h p.i. Die vRNA-Konzentration von
PUUV Sotkamo nahm über die beobachtete Zeit ab.

54
Abbildung 22: Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von A549-Dual
WT und MAVS-KO Zellen mit drei PUUV-Stämmen. A549-Dual WT und MAVS-KO
Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit drei PUUV-Stämmen. Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48,
72, 144 und 216 h p.i. wurden virale Genomkopien im ZKÜS mittels q-RT-PCR
nachgewiesen.

4.3.4 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS


mittels FFU-Tests

Um eine genaue Aussage über die Produktion von infektiösen Nachkommenviren


treffen zu können, wurde wie in 4.2.3 ein FFU-Test durchgeführt. (s. 3.4.2) Die
untersuchten PUUV-Stämme wurden mit MoI = 0,1 eingesetzt und es wurden
infektiöse Nachkommenviren im ZKÜS zu den Zeitpunkten 72, 144 und 216 h p.i.
nachgewiesen. PUUV Kazan produzierte nur 72 h p.i. viermal mehr Nachkommen in
den WT Zellen, 144 und 216 h p.i. aber ca. zehnmal mehr in den MAVS-KO Zellen.
In den WT Zellen nahm die Produktion zu 216 h p.i. um das 1,7-fache zu, in den
MAVS-KO Zellen dagegen um das 73-fache. PUUV CG1820 produzierte bereits 72 h
p.i. achtmal mehr Nachkommen in den MAVS-KO Zellen, die Produktion stieg hier zu
216 h p.i. hin auf das 2,5-fache, wohingegen sie in den WT Zellen gleichblieb. Bei
PUUV Sotkamo beobachteten wir 144 h p.i. eine 12-fach höhere Produktion in den
MAVS-KO Zellen. (Abbildung 23)

55
Abbildung 23: Quantifizierung von infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS nach
Infektion von A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen mit drei PUUV-Stämmen.
A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit PUUV Kazan und CG1820 (MoI =
0,1) infiziert. Zu den Zeitpunkten 72, 144 und 216 h p.i. wurden infektiöse
Nachkommenviren im ZKÜS mittels FFU-Test nachgewiesen. Nach Infektion mit
PUUV Sotkamo wurde nur bei 144 h p.i. gemessen.

4.4 Amlexanox führt nur teilweise zur Hemmung des RLR-


MAVS Signalwegs in Endothelzellen

Um auszuschließen, dass die in 4.1, 4.2 und 4.3 erzielten Ergebnisse speziell nur
mit A549-Dual Zellen erzielbar sind, wurde der Versuchsablauf wie in 3.4.1
beschrieben mit einer humanen dermalen Endothelzelllinie (HMEC-1) durchgeführt.
Da bisher nach TULV-Infektion keine Replikation nachweisbar war, wurde nur noch
mit Kazan infiziert. Hierbei konnte nicht mit dem QUANTI-Luc™ Assay gearbeitet
werden, da die verwendeten HMEC-1 Zellen keine Reportergene besitzen.

56
Um einen Vergleich zum MAVS-KO der A549-Dual Zellen zu simulieren, wurde
Amlexanox (AX) (Invivogen) verwendet. AX agiert als Inhibitor von TBK1, ein Protein,
welches im RLR-MAVS Signalweg von MAVS phosphoryliert wird. und zur Akivierung
von IRFs führt. (s. Abbildung 3)

Es wurden in einem Vorversuch zunächst einmalig 10 µM AX direkt nach Infektion


ins Zellkulturmedium gegeben, was zu widersprüchlichen Ergebnissen führte. (s.0)
Aus den Ergebnissen des Vorversuchs folgerten wir, dass wir zu wenig AX
eingesetzt hatten, um TBK1 und IKKε über den gesamten Infektionszeitraum zu
hemmen. Deswegen wurde der Versuch nochmals wiederholt, diesmal aber nicht nur
zum Zeitpunkt der Infektion 10 µM AX ins Medium gegeben, sondern erneut zu den
Zeitpunkten 48 und 72 h p.i. (hier mit „Boost“ bezeichnet)

4.4.1 Untersuchung der Expression von viralem NP, des antiviralen


Proteins MX1 und des Transkriptionsfaktors IRF7

HMEC-1 Zellen wurden wie in 3.4.1 beschrieben kultiviert und mit Kazan (MoI = 0,1)
infiziert. Proteinlysate wurden zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i.
angefertigt und mittels WB auf die Expression der Proteine NP, IRF7 und MX1
analysiert. (s. 3.2.2) Eine Expression von NP wurde ab 24 h p.i. in beiden Zelltypen
beobachtet, in den Zellen mit AX-Behandlung wesentlich stärker. MX1 und IRF7
wurden in den Zellen ohne AX-Behandlung stärker exprimiert. (Abbildung 24) Im
Vorversuch wurde IRF7 nur in den Zellen mit AX-Behandlung exprimiert. (s. 11.3.1)

57
Abbildung 24: Expression von NP, IRF7 und MX1 in HMEC-1 Zellen nach
Infektion mit Kazan und Zugabe von AX. HMEC-1 Zellen wurden mit Kazan
infiziert (MoI = 0,1) und es wurde 0, 48 und 72 h p.i. 10µM AX zugegeben. Zu den
Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurden NP, IRF7 und MX1im Zelllysat im
WB-Verfahren analysiert. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

4.4.2 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR

Um das Replikationsverhalten von PUUV in HMEC-1 Zellen über den WB hinaus zu


analysieren, wurde wie in 4.2.2 eine q-RT-PCR im TaqMan-Format durchgeführt.

Mit fortschreitender Zeit wurde eine Akkumulation von vRNA im ZKÜS detektiert. Die
vRNA-Konzentration war in Zellen ohne AX-Behandlung über den gesamten
Zeitraum höher. (Abbildung 25) Im Vorversuch war die Konzentration in den Zellen
mit AX-Behandlung nur 48 h p.i. höher. (s. 11.3.2)

58
Abbildung 25: Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von HMEC-1
Zellen mit Kazan und Zugabe von AX. HMEC-1 Zellen wurden mit Kazan infiziert
(MoI = 0,1) und es wurde 0, 48 und 72 h p.i. 10µM AX zugegeben. Zu den
Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i. wurden virale Genomkopien im ZKÜS mittels
q-RT-PCR nachgewiesen.

4.4.3 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS


mittels FFU-Tests

Um eine genaue Aussage über die Produktion von infektiösen Nachkommenviren


treffen zu können, wurde wie in 4.3.4 ein FFU-Test durchgeführt. Proben wurden zu
den Zeitpunkten 24, 48, 72 und 144 h p.i. genommen. (s. 3.4.2) In diesem Zeitraum
nahm die Produktion in beiden Zelltypen zunächst zu. Ab 48 h p.i. produzierte Kazan
in den Zellen ohne AX-Behandlung besser. 144 h p.i. sank die Produktion in beiden
Zelltypen wieder auf Anfangsniveau ab. (Abbildung 26) Im Vorversuch wurde in etwa
das gleiche Ergebnis beobachtet. (s.11.3.3)

59
FFU/mL

24

48

72

4
0

14
Abbildung 26: Quantifizierung von infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS nach
Infektion von ZKÜS nach Infektion von HMEC-1 Zellen mit Kazan und Zugabe
von AX. HMEC-1 Zellen wurden mit Kazan infiziert (MoI = 0,1) und es wurde 0, 48
und 72 h p.i. 10µM AX zugegeben. Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72 und 144 h p.i.
wurden infektiöse Nachkommenviren im ZKÜS mittels FFU-Test nachgewiesen.

60
5 DISKUSSION
Das PUUV ist das hauptverantwortliche Virus für die Hantavirus-Erkrankung in
Europa. Die genauen molekularen Pathomechanismen, welche in der Erkrankung
resultieren, sind bis heute nicht abschließend erforscht. Bekannt ist, dass Hantaviren
primär mikrovaskuläre Endothelzellen in Niere, Peritoneum und Lunge infizieren und
21
dort eine Leckage der Kapillaren verursachen. Hantaviren verursachen dabei
keinen cythopathischen Effekt, die Pathogenität wird aktuell dadurch erklärt, dass auf
eine Hantavirus-Infektion eine exzessive angeborene Immunantwort folgt, durch
32
welche möglicherweise die Barrierefunktion des Endothels gestört wird. Die
Erkennung einer RNA-Virusinfektion durch das angeborene Immunsystem erfolgt
hauptsächlich über die Detektion viraler Nukleinsäuren durch zelluläre PRRs.
Insbesondere virale dsRNAs können endosomal über TLR3 oder im Cytoplasma
durch RIG-I oder MDA5 detektiert werden, wobei RIG-I eher kurze triphosphorylierte
38–40
dsRNAs und MDA5 längere dsRNA-Spezies erkennt. Welcher der beiden
Rezeptoren genau für die Erkennung einer PUUV-Infektion verantwortlich ist, ist noch
nicht geklärt. Die Expression von TLRs und RLRs unterscheidet sich zwischen
verschiedenen Geweben und Zelltypen, sowie auch ihre Bedeutung für die
Immunerkennung unterschiedlicher Viren. Im Fall der Hantaviren konnte bereits die
Beteiligung von TLR3 und RIG-I für die Detektion einer HTNV-Infektion in humanen
36,49
Lungenepithelzellen gezeigt werden , im Fall von PUUV ist dies noch unbekannt.
Nach Bindung von dsRNA rekrutiert TLR3 das Adapterprotein TRIF, die RLRs binden
an MAVS, was beides über eine mehrstufige Signalkaskade (s. Abbildung 3 und
Abbildung 27) zur Aktivierung von IRF3/7 und zur Ausschüttung von IFNs führt. IFNs
werden anhand ihrer bindenden Rezeptoren in drei Familien eingeteilt, die in dieser
Arbeit relevanten sind Typ I und III, deren Induktionssignalwege sich größtenteils
44
überlappen und die eine Schlüsselrolle in der Immunantwort spielen.
Die sezernierten IFNs werden von IFN-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erkannt,
was über eine Signalkaskade zur Bildung von STAT-Heterodimeren führt. (STAT
steht für signal transducer and activator of transcription). Das Heterodimer bindet
IRF9, um einen Transkriptionsfaktor zu formen, der an den interferon stimulated
response elements (ISRE)-Promoter bindet und dadurch die Expression von ISGs
44
induziert. Bei diesen handelt es sich insbesondere um antiviral wirkende Proteine
48
wie MX1 oder PKR. Bourquain et al. zeigten 2019, dass in Endothelzellen und
Makrophagen nur IFN-β (Typ I) und IFN-λ (Typ III) nach einer PUUV-Infektion

61
11
induziert werden. Da eine frühe Aktivierung der IFN-Antwort zur Induktion von
ISGs und damit zur Inhibition der viralen Replikation führt, müssen Hantaviren die
51,52
frühe Aktivierung verhindern oder zumindest verzögern, um pathogen zu sein.
Eine deregulierte Immunantwort kann auch die Grundlage der Immunpathogenese
15,28,29
sein, durch die das Endothel seine Barrierefunktion verliert. Diverse Studien
belegen, dass MAVS der Schlüsselfaktor in der RLR-vermittelten IFN-Antwort ist. 43,44
Es konnte bereits gezeigt werden, dass nach Infektion mit ssRNA-Viren ein MAVS-
KO zu einem Ausbleiben der IFN-Antwort und dadurch zu einer erhöhten
41,42,48,53
Virusreplikation führt. Vergleichbare Ergebnisse wurden in dieser Arbeit mit
PUUV erzielt.

5.1 PUUV löst in A549-Dual Zellen eine MAVS-abhängige


Immunantwort aus

Es wurde mit humanen Lungenkarzinomzellen (A549) gearbeitet, die schon in


36,37,52,54,55
diversen anderen Studien als gutes Modellsystem für Infektionskinetiken
mit Hantaviren dienten. Die in dieser Arbeit verwendeten A549-Dual Zellen besitzen
darüber hinaus Reportergene, die eine Quantifizierung der IFN-Antwort über den
QuantiLuc-Assay ermöglichten. Für eine umfassende Analyse der IFN-Antwort auf
eine Infektion mit PUUV oder TULV wurde in der vorliegenden Arbeit mit
verschiedenen Methoden gearbeitet. Zunächst wurde die IRF-Aktivität mit dem
QuantiLuc-Assay quantifiziert. Anschließend wurde die Expression verschiedener
IFNs und ISGs mittels qPCR analysiert. Die exprimierten Proteine wurden im WB-
Verfahren detektiert.

In der Arbeit von Bodenstein konnte 2018 bereits gezeigt werden, dass TULV in
55
A549 Zellen keine detektierbare Immunantwort auslöst. Dies konnte in der
vorliegenden Arbeit bestätigt werden. TULV löst weder in WT noch in MAVS-KO
Zellen eine detektierbare IFN-Antwort aus. Dies kann daran liegen, dass TULV in
A549 Zellen nicht repliziert, was in 4.2 gezeigt wurde oder die Infektion von der Zelle
sofort bemerkt und eingedämmt wird. Bisher sind nur wenige durch eine Infektion mit
24–26
TULV bedingte Krankheitsfälle beschrieben. Auch scheinen bei TULV-Infektion
durch die fehlende Replikation keine RLR-dsRNA Liganden zu entstehen und
zumindest in A549 Zellen dsRNA-bindende TLR3, bzw. ssRNA-bindende TLR7/8-

62
Rezeptoren keine große Rolle für die Erkennung einer TULV-Infektion zu spielen,
obwohl diese Zellen TLR3 exprimieren. 56

Nach Infektion von A549-Dual WT Zellen mit PUUV kam es zu einer starken IFN-
Antwort. Zunächst kam es zu einer starken IRF-Aktivität ab 48 h p.i. (s. 4.1.1) PUUV
benötigt also einige Zeit, um so viel dsRNA zu akkumulieren, dass diese von RLRs
erkannt wird. Eine andere Erklärung ist die mögliche Hemmung der Immunantwort
durch PUUV, bis der Stimulus doch zu stark wird, ein Phänomen, was schon in
57 51,52
ANDV und anderen Hantaviren beobachtet wurde. Die IRF-Aktivität korrelierte
mit einer starken Expression von IFNB1 und IFNL1, was in der qPCR sichtbar
gemacht werden konnte (s. 4.1.2.1.1 und 4.1.2.1.2) Die ausgeschütteten IFNs
induzierten wiederum die ISGs MX1 und EIF2AK2, wie in der qPCR zu sehen war.
(s. 4.1.2.2.1, und 4.1.2.2.2) Wie bereits Kanerva et al. 1996 zeigen konnten, wird
58
MX1 von Typ I-IFNs induziert und inhibiert PUUV und TULV in VeroE6 Zellen. Im
Western Blot wurde die Expression des Proteins MX1 nur in PUUV WT ab 48 h p.i.
nachgewiesen, in MAVS-KO Zellen und nach TULV-Infektion wurde MX1 aufgrund
der fehlenden IFN-Antwort nicht exprimiert. (s. 4.1.3)

Weiterhin wurde in 4.1.4 die Expression des Transkriptionsfaktors IRF7 und die
Aktivierung des antiviralen Proteins PKR untersucht. PKR wird sowohl basal als auch
durch Typ-I-IFN-Stimulation exprimiert und liegt in geringer Konzentration immer im
Cytoplasma vor, wo sie nach Bindung von dsRNA eine Autophosphorylierung
untergeht. Die aktivierte Form, Phospho(P)-PKR führt letztendlich zur Inhibition der
59
zellulären und viralen Proteinbiosynthese. Wir beobachteten in A549-Dual WT
Zellen 72 h p.i. eine deutlich stärkere Aktivierung von PKR im Vergleich zu den
MAVS-KO Zellen. Da die IFN-Antwort in den MAVS-KO Zellen ausbleibt, liegt auch
weniger PKR vor, kann also auch weniger stark aktiviert werden. IRF7 wurde in den
WT Zellen früher und stärker als in den MAVS-KO Zellen exprimiert, in denen die
Expression erst 144 h p.i. detektiert wurde. Eventuell kommt es in den MAVS-KO
Zellen über andere Signalwege zu einer sehr schwachen oder späten IFN-Antwort,
worauf auch das stärkere Vorhandensein von P-PKR 144 h p.i. in MAVS-KO Zellen
hinweist. Hierzu müssten weitere Versuche erfolgen.

Ein Knockout von MAVS unterdrückte nahezu gänzlich die IFN-Antwort auf PUUV in
A549-Dual Zellen. Diese Ergebnisse gleichen denen aus vorangegangenen Studien.
Seth et al. infizierten 2005 humane embryonale Nierenzellen mit Sendai Virus,

63
ebenfalls ein –ssRNA-Virus. Sie identifizierten durch RNAi (Silencing) MAVS als
zentrales Signalprotein zur Aktivierung von IFNs nach Viruserkennung durch den
53
RIG-I-Rezeptor. In der Arbeit von Sun et al. 2006 wurde in Fibroblasten,
Makrophagen und dendritischen Zellen bestätigt, dass das von Seth et al. 2005
entdeckte MAVS Protein essentiel für die virale Induktion von IFN ist. Um die Rolle
von MAVS in vivo zu untersuchen, wurden MAVS-KO Mäuse verwendet und mit
vesicular stomatitis virus, ebenfalls ein –ssRNA-Virus infiziert. Sie kommen zum
42
Schluss, das MAVS essentiell für die antivirale Immunabwehr ist. Wu et al. kamen
2018 durch Infektionen von MAVS-KO Mäusen mit Influenza A Virus (ebenfalls ein –
ssRNA-Virus) zu dem Ergebnis, dass die IFN-β-Expression bei MAVS-KO reduziert
48
wird. Lee et al. gingen 2011 nicht mit einem MAVS-KO sondern einem RIG-I
Knockdown vor. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass die angeborene antivirale
Immunantwort in Abwesenheit von RIG-I stark beeinträchtigt wird. 49

Die proinflammatorische Antwort auf PUUV-Infektion (s. 11.1, 11.2) war in A549-Dual
WT gegenüber den MAVS-KO Zellen nur schwach erhöht. Erklärbar ist das
Ausbleiben der proinflammatorischen Anwort dadurch, dass durch den RLR-MAVS
Signalweg vor allem IRF3 aktiviert wird. NF-κB wird vornehmlich über den TLR-
48
vermittelten Signalweg aktiviert , weswegen wir nach PUUV-Infektion keine
deutliche NF-κB-Aktivität detektierten. (s. 11.1) Für HTNV ist zudem eine Hemmung
60
der Aktivierung von NF-κB in Nierenzellen durch virales NP beschrieben. Um
abzugrenzen, ob dieses Verhalten Stimulus- bzw Zelltyp-spezifisch ist, oder ob
PUUV die Aktivierung von NF-κB gezielt hemmt, müsste die proinflammatorische
Antwort nach PUUV-Infektion im Vergleich zu beispielsweise einer poly:IC
Transfektion (artifizielle dsRNA-Stimulation) in verschiedenen Zelltypen betrachtet
werden.

Ausnahme ist das Gen CXCL1, dem einzigen untersuchten Gen der
proinflammatorischen Antwort, welches in A549-Dual Zellen sehr ähnlich wie IFNB1
und IFNL1 exprimiert wird. (s. 4.1.2.3.1) Ob CXCL1 über den RLR-MAVS Signalweg
induziert wird, ist bisher unbekannt. Hier müssten weitere Versuche erfolgen,
beispielsweise mit einem IRF3/7-Knockout. Suthar et al. 2010 und Lazear et al. 2013
erzielten erhöhte CXCL1-Expressionen in MAVS-KO Mäusen durch Infektion mit
West-Nil-Virus (WNV). WNV ist ebenfalls ein sRNA-Virus und wird durch den RIG-I
Rezeptor erkannt, was Suthar et al. 2010 durch RIG-I Knockout zeigen konnten. 61,62

64
5.2 Ein Knockout von MAVS begünstigt die Replikation von
PUUV in A549-Dual Zellen

TULV repliziert in A549-Dual schlechter als PUUV, was von Bourquain et al. 2019
11,55
und Bodenstein et al. 2018 bereits gezeigt wurde. In der vorliegenden Arbeit
konnte gezeigt werden, dass eine Deletion des RLR-MAVS Signalwegs und das
darauffolgende Ausbleiben einer IFN-Antwort das Replikationsverhalten von TULV
nicht verbessert. Die ineffiziente Replikation von TULV in A549 Zellen beruht also
nicht auf einer RLR-MAVS bedingten IFN-Antwort. Und die fehlende IFN-Antwort
resultiert wahrscheinlich aus der fehlenden Akkumulation viraler PAMPs.

Um pathogen zu sein, müssen Hantaviren die IFN-Antwort hemmen oder zumindest


verzögern. 51,52 Beispielsweise kann das nicht pathogene Prospect Hill Virus (PHV) in
Endothelzellen nicht replizieren, weil bereits eine frühe IFN-Antwort induziert wird,
63,64
welche die Replikation hemmt. Es stellte sich hier also die Frage, ob eine späte
IFN-Antwort ab ca. 48 h p.i. in A549-Dual WT Zellen noch einen Einfluss auf die
Replikation von PUUV hat. Wie in Punkt 4.2 gezeigt, führt ein Knockout von MAVS
ab 48 h nach PUUV-Infektion zu einer starken Erhöhung der Virusreplikation und
Produktion von infektiösen Nachkommenviren im Vergleich zu den WT Zellen. Somit
hat die späte IFN-Antwort große Effekte auf die Replikation von PUUV in A549-Dual
Zellen. Dieses Ergebnis deckt sich mit einigen Studien, die allerdings in anderen
Zelllinien mit WNV und in vivo durchgeführt wurden. Suthar et al. zeigten 2010, dass
die durch den RLR-MAVS Signalweg aktivierte IFN-Antwort essentiell für die
Immunität gegenüber WNV ist. Ein Knockout von MAVS führte sowohl in vivo als
61
auch in Makrophagen zu stark erhöhter Virusreplikation. Eine erhöhte Replikation
bei MAVS-KO konnten auch Zhao et al. 2016 in hämatopoetischen Zellen und Roe et
43,44
al. 2019 in dendritischen Zellen nachweisen. Die scheinbar erhöhte Replikation
lässt sich dadurch erklären, dass in MAVS-KO Zellen nahezu keine IFN-Antwort
mehr stattfindet und somit keine antiviralen Proteine wie MX1 oder PKR exprimiert
werden. So kann PUUV ungestört replizieren, die Replikation und Produktion
infektiöser Nachkommen ist im Vergleich zu WT Zellen erhöht. Lee et al. zeigten
2011 mittels RIG-I Knockdown in HTNV-infizierten A549 Zellen, dass die durch den
Knockdown beeinträchtigte angeborene antivirale Immunantwort dazu führt, dass die
Replikation begünstigt wird. 49 MAVS wird von RLRs aktiviert, insofern hat ein MAVS-
KO den etwa gleichen Effekt wie ein RIG-I Knockdown. (s. Abbildung 3 und

65
Abbildung 27) Allerdings werden dadurch sowohl RIG-I-Rezeptoren ausgeschaltet,
die eher kurze triphosphorylierte dsRNAs erkennen, als auch MDA5-Rezeptoren, die
38–40
längere dsRNA-Spezies erkennen. Somit konnten wir nicht ausschließen, dass
PUUV auch über MDA5-Rezeptoren erkannt wird und es müssten weitere Versuche
erfolgen.

5.3 Eine Wiederholung der Versuche mit anderen PUUV-


Stämmen erzielte gleiche Ergebnisse

Da die phänotypische Differenzen, die in vitro bei verschiedenen Substämmen von


65
PUUV beobachtet werden , berücksichtigt werden müssen, wurde für eine
Diversifikation der mit PUUV Kazan in 4.1 und 4.1.4 erzielten Ergebnisse die
gleichen Untersuchungen mit zwei weiteren Virusstämmen, PUUV Sotkamo und
CG1820, durchgeführt. Der Stamm PUUV Kazan wurde aus der Region um die Stadt
Kazan im heutigen Russland 1983 von Gavrilovskaya et al. isoliert. 66 PUUV CG1820
wurde 1984 von Tkachenko et al. in der Region um Bashkiria in der ehemaligen
U.S.S.R. isoliert.67Der finnische Sotkamo Stamm wurde 1985 von Schmaljohn et al.
5
isoliert. Wir erzielten ähnliche Ergebnisse wie mit PUUV Kazan. (s. 4.3) Auch die
beiden anderen PUUV-Stämme riefen im Gegensatz zu den WT Zellen in MAVS-KO
Zellen keine IFN-Antwort hervor. (s. 4.3.1) Die virale Replikation und
Nachkommenproduktion wurden ebenfalls durch MAVS-KO begünstigt. (s. 4.3.2 –
4.3.4) Gegenüber PUUV CG1820 kam es in WT Zellen zu einer stärkeren und früher
einsetzenden IFN-Antwort. Ob dies mit dem schnelleren Einsetzen der
Virusreplikation und einer daraus resultierenden schnelleren Akkumulation von
PAMPs korreliert oder auf Unterschiede in der Hemmung der angeborenen
Immunantwort hinweist, bleibt zu untersuchen.

Auffällig war das Verhalten von PUUV Sotkamo. Es wurde nur eine schwache IRF-
Aktivität nach Infektion mit Sotkamo detektiert. (s. 4.3.1) Allerdings konnte die
Expression von MX1 im WB-Verfahren detektiert werden (Daten nicht gezeigt) Die
ΔcT-Werte für Sotkamo in der q-RT-PCR nehmen über die beobachtete Zeit ab (s.
4.3.3). Das Verhalten ist dadurch zu erklären, dass Sotkamo bei der Virusanzucht in
VeroE6 Zellen deutlich schlechter wächst als PUUV Kazan oder CG1820. Iheozor-
Ejiofor et al. hatten 2016 in ihrer Arbeit ebenfalls Schwierigkeiten, höhere Titer von
68
Sotkamo anzuziehen. Die vom RKI erstellten Virusstocks von Sotkamo haben

66
ebenfalls niedrigere Titer. (s. Tabelle 5) Im Rahmen des Möglichen wurde versucht,
Sotkamo so anzuziehen, dass sich ein ähnliches Verhalten wie bei Kazan oder
CG1820 zeigt, es gelingt aber nicht optimal. Der MAVS-KO begünstigt aber die
Nachkommenproduktion von Sotkamo. (s. 4.3.4)

Auch hier wurde die proinflammatorische Antwort mit dem QUANTI-Blue™-Assay


untersucht. Es zeigte sich nach Infektion mit PUUV CG1820 eine sehr geringe
Aktivierung von NF-κB, die in WT Zellen deutlich früher als in MAVS-KO erfolgt. Es
kommt durch den RLR-MAVS Signalweg auch zu einer gewissen NF-κB-Aktivierung
und damit zur Expression proinflammatorischer Gene. 42

5.4 Amlexanox führt nur teilweise zur Hemmung des RLR-


MAVS Signalwegs in Endothelzellen

Hantaviren infizieren in vivo vornehmlich das mikrovaskuläre Endothel. Die


Erforschung in Endothelzellen ist daher unabdingbar, weswegen wir unser Modell auf
Endothelzellen übertragen wollten. Um einen MAVS-KO in HMEC-1 zu simulieren,
wurden die Zellen in der vorliegenden Arbeit mit AX behandelt. AX ist ein kleines
Molekül, welches eigentlich als Therapeutikum verwendet wird, um Aphten und
47
Asthma zu behandeln. Außerdem sind Auswirkungen auf Gewicht und
Glukosespiegel in vivo bekannt. 46 AX agiert als spezifischer Inhibitor zweier Kinasen,
(IKKε und TBK1) die beide von MAVS aktiviert werden, was zur Translokation von
IRFs in den Nucleus führt (s. Abbildung 27) und inhibiert durch Kompetition um die
47
ATP-Bindung. TBK1 und IKKε werden außerdem über den TLR3-Signalweg
aktiviert. 42

In einem Vorversuch (s.) wurde direkt nach Infektion 10µM AX ins Zellkulturmedium
gegeben. Es kam zu ähnlichen Ergebnissen wie in den A549-Dual Zellen. Die
Expression von NP in den Zellen ohne Amlexanoxbehandlung (AXB-) war niedriger
als in den Zellen mit AXB (AXB+). Die Expression von IRF7 fiel hier auf, da sie in
AXB+ stärker war als in AXB-. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass durch die in
AXB+ erhöhte Expression von NP IRF7 auf anderen Wegen aktiviert wird. Wie in
Abbildung 3 zu sehen, wird IRF7 nicht nur über den RLR-MAVS Signalweg sondern
auch über den TLR3-vermittelten Weg aktiviert. Wir stellten nach dem Vorversuch die
Hypothese auf, dass AX von den Zellen mit der Zeit verstoffwechselt wird und eine
Konzentration von einmalig 10 µM nicht ausreicht, um TBK1 und IKKε dauerhaft zu

67
hemmen. So kam es 72 h p.i. zur Expression von IRF7. In der q-RT-PCR replizierte
PUUV ähnlich wie in A549 Zellen, in AXB+ zunächst besser als in AXB-. 144 h p.i.
glich sich jedoch die Konzentration der vRNA im ZKÜS. Dies ließ uns wieder
vermuten, dass wir eine zu niedrige AX-Konzentration eingesetzt hatten. Auch der
FFU-Test untermauerte diese Hypothese. Die Produktion der infektiösen
Nachkommenviren nahm über die Zeit ab, 72 h p.i. wurden sogar mehr
Nachkommenviren in AXB- produziert.

Wie in Punkt 4.4 beschrieben, wurde der Versuch deshalb wiederholt. Diesmal
wurden nicht nur zum Infektionszeitpunkt 10 µM AX ins Medium gegeben, sondern
auch 48 und 72 h p.i. Im WB (s. 4.4.1) führte dies zunächst zu Ergebnissen, die sich
wesentlich besser mit den Ergebnissen aus den A549-Dual Zellen deckten. NP
wurde in AXB+ später, dafür wesentlich stärker als in AXB- exprimiert. IRF7 wurde in
AXB- stärker exprimiert und nicht wie im Vorversuch in den AXB+ Zellen. Dies
entsprach unseren Erwartungen, da durch die AX-Behandlung TBK1 und IKKε
gehemmt werden, was zu einer verminderten Aktivierung von IRF7 führt. MX1 wurde
in AXB- marginal stärker exprimiert. Auch dies entsprach unseren Erwartungen, da
durch eine verminderte Aktivierung von IRF7 auch weniger IFNs ausgeschüttet und
somit auch weniger ISGs (wie MX1) exprimiert werden. Der Effekt von AX auf die
Expression von MX1 war allerdings sehr schwach. Aus den Ergebnissen des WB
folgerten wir, dass die IFN-Antwort in HMEC-1 nach AX-Behandlung zumindest
abgeschwächt ist. Auffällig waren allerdings die Effekte von AX auf das
Replikationsverhalten von PUUV. Wie in der q-RT-PCR (s. 4.4.2) zu sehen ist,
replizierte PUUV in AXB- besser, was nicht unseren Erwartungen nach der Analyse
im WB entsprach. Der FFU-Test (s. 4.4.3) konnte die Ergebnisse des Western Blots
nicht validieren. Auch hier replizierte PUUV zunächst in AXB- besser. Die
Nachkommenproduktion nahm aber nach 72 h p.i. ab und war 144 h p.i. wieder auf
dem Stand von 24 h p.i. Dies ist zum einen dadurch erklärbar, dass AX auch in der
stärkeren Konzentration keinen sehr starken inhibierenden Effekt hat. Hier müssten
weitere Versuche erfolgen, um die optimale Hemmkonzentration von AX
herauszufinden. Der kritische Faktor, der dabei berücksichtigt werden muss, ist die
schon in diversen Studien berichtete Cytotoxizität von AX, welche zu einer
69–71
verminderten Virusreplikation führt. Auch könnte der RLR-MAVS Signalweg von
mehr Faktoren beeinflusst werden als in den A549 Zellen. Hier müssten weitere
Versuche mit MAVS-KO oder RNAi in HMEC-1 erfolgen.

68
Abbildung 27: Die über den RLR-MAVS-Signalweg vermittelte intrazelluläre
Immunantwort gegenüber Puumala Orthohantavirus.
PUUV wird in A549 Zellen wird hauptsächlich über den RLR-MAVS Signalweg
erkannt, worauf verschiedene andere Studien unserer Arbeitsgruppe hinweisen.
11,37,55
und in dieser Arbeit bestätigt werden konnte, da ein MAVS-KO zum völligen
Ausbleiben einer Immunantwort führte. Die Erkennung von cytoplasmatischer dsRNA
durch RIG-I oder MDA5 führte in WT Zellen final zu einer ISG-Expression, was die
Replikation von PUUV inhibierte. Lag ein MAVS-KO vor, kam es nicht zu einer IRF-
Aktivierung, einer IFN-Induktion und auch keiner ISG-Expression, wodurch PUUV
enthemmt replizieren konnte. Dieses Verhalten scheint nicht vom Virusstamm
abhängig zu sein. In HMEC-1 führte die Verwendung von AX zur Hemmung von IKKε
und TBK1 nur teilweise zu einer Inhibition des RLR-MAVS Signalwegs.

69
6 FAZIT UND AUSBLICK
Diese Arbeit zielte darauf ab, die Relevanz des RLR-MAVS Signalwegs für die für
die PUUV-induzierte IFN-Antwort im Rahmen der frühen angeborenen
Immunerkennung einzuschätzen. Es wurde vornehmlich mit den beiden einem
humanen Lungenkarzinom stammenden Reporterzelllinien A549-Dual und A549-
Dual MAVS-KO gearbeitet, um die Rolle von MAVS für die IFN-Antwort im Rahmen
der frühen angeborenen Immunerkennung einzuschätzen.

Folgende Erkenntnisse konnten wir gewinnen:

1. Die ineffiziente Replikation von TULV in A549 Zellen lässt sich nicht durch
eine RLR-MAVS induzierte IFN-Antwort erklären.
2. PUUV löst eine nicht vom Virusstamm abhängige Immunantwort über den
RLR-MAVS Signalweg aus, die in einer Expression von verschiedenen IFNs
mündet. Die IFNs induzieren wiederum verschiedene ISGs. MAVS agiert hier
als zentrales Signalprotein, bei einem Knockout kommt es zu einem nahezu
kompletten Ausbleiben einer PUUV-induzierten IFN-Antwort.
3. Durch die exprimierten ISGs kommt es zu einer Hemmung der Replikation von
PUUV in A549-Dual WT Zellen. In den MAVS-KO Zellen repliziert PUUV
ungehemmt.
4. TULV repliziert unabhängig vom MAVS-KO in A549 Zellen nicht.
5. Die Übertragung des Modells auf HMEC-1 funktioniert nicht reibungslos,
ähnliche Ergebnisse konnten jedoch erzielt werden.

Die Ergebnisse stimmen mit denen anderer Forschungsgruppen überein, die mit
diversen –ssRNA-Viren verschiedene Zelllinien infizierten. Hieraus folgern wir, dass
die frühe angeborene Immunantwort und Induktion einer IFN-Antwort gegenüber
PUUV stark von der Erkennung über RLRs und Weiterleitung über MAVS abhängig
ist. Außerdem wird die Replikation von PUUV durch die Immunantwort gehemmt.
TULV repliziert allerdings in A549-Dual unabhängig vom RLR-MAVS Signalweg
nicht.

In weiteren Versuchen sollte verstärkt mit Endothelzellen gearbeitet werden, nicht nur
HMEC-1. Die Effekte von AX könnten durch einen Knockout oder RNAi spezifiziert
und verbessert werden. Hier stellt sich die Frage, ob die Disruption der Permeabilität,

70
die sich nach Hantavirus-Infektion in vivo zeigt, von der Immunantwort abhängig ist.
Außerdem könnte mit weiteren Zelltypen wie Podozyten gearbeitet werden, um die
renalen Aspekte der Hantavirus-Erkrankung zu erforschen. Auch könnte mit anderen
Zelltypen wie Immunzellen gearbeitet werden und andere, auch hochpathogene
Hantaviren eingesetzt werden. Abschließend stellt sich die Frage, über welchen RLR
Hantaviren erkannt werden. Hierbei könnte mit RIG-I und MDA5 Knockouts
gearbeitet werden.

71
7 LITERATURVERZEICHNIS
1. Smadel, J. E. Epidemic hemorrhagic fever. Am. J. Med. Sci. 225, 660–668
(1953).

2. Avšič Županc, T. & Korva, M. Hantavirus Infections. Emerg. Infect. Dis. Clin.
Case Stud. 21, 25–36 (2014).

3. Lee, H. W., Lee, P. W. & Johnson, K. M. Isolation of the etiologic agent of


Korean hemorrhagic fever. J. Infect. Dis. 137, 298–308 (1978).

4. Lee, H. W., Baek, L. J. & Johnson, K. M. Isolation of Hantaan Virus, the


Etiologic Agent of Korean Hemorrhagic Fever, from Wild Urban Rats. J. Infect.
Dis. 146, 638–644 (1982).

5. Schmaljohn, C. S. et al. Antigenic and genetic properties of viruses linked to


hemorrhagic fever with renal syndrome. Science (80-. ). 227, 1041–1044
(1985).

6. McKee, K. T. J., LeDuc, J. W. & Peters, C. J. Textbook of Human Virology.


(Mosby-Year Book, 1991).

7. Nichol, S. T. et al. Genetic identification of a hantavirus associated with an


outbreak of acute respiratory illness. Science (80-. ). 262, 914–917 (1993).

8. Plyusnin, A. et al. Tula virus: A newly detected hantavirus carried by European


common voles. J. Virol. 68, 7833–7839 (1994).

9. Krüger, D. H., Ulrich, R. G. & Hofmann, J. Hantaviren als zoonotische


Krankheitserreger in Deutschland. Dtsch. Arztebl. Int. 110, 461–467 (2013).

10. Mertz, G. J. et al. Diagnosis and treatment of new world hantavirus infections.
Curr. Opin. Infect. Dis. 19, 437–442 (2006).

11. Bourquain, D., Bodenstein, C., Schürer, S. & Schaade, L. Puumala and Tula
Virus Differ in Replication Kinetics and Innate Immune Stimulation in Human
Endothelial Cells and Macrophages. Viruses 11, 855 (2019).

12. Vaheri, A. et al. Hantavirus infections in Europe and their impact on public

72
health. Reviews in Medical Virology 23, 35–49 (2013).

13. Robert Koch Institut. Epidemiologisches Bulletin. Epidemiol. Bull. 25, 416–422
(2019).

14. Faber, M. Hantaviruserkrankungen in Deutschland: Hohe Fallzahlen im


Frühsommer 2019. Epidemiol. Bull. 25, 221 (2019).

15. Hofmann, J., Krüger, D. & Loyen, M. Hantavirus-Infektionen in Deutschland –


ein Rückblick auf das Ausbruchsjahr 2017. Epidemiol. Bull. 15, 143–146
(2018).

16. Muyangwa, M., Martynova, E. V., Khaiboullina, S. F., Morzunov, S. P. &


Rizvanov, A. A. Hantaviral proteins: Structure, functions, and role in hantavirus
infection. Frontiers in Microbiology 6, 1326 (2015).

17. Hepojoki, J., Strandin, T., Lankinen, H. & Vaheri, A. Hantavirus structure -
Molecular interactions behind the scene. J. Gen. Virol. 93, 1631–1644 (2012).

18. Vaheri, A. et al. Uncovering the mysteries of hantavirus infections. Nat. Rev.
Microbiol. 11, 539–550 (2013).

19. Lozach, P. Y. et al. Entry of bunyaviruses into mammalian cells. Cell Host
Microbe 7, 488–499 (2010).

20. Cifuentes-Muñoz, N., Salazar-Quiroz, N. & Tischler, N. D. Hantavirus Gn and


Gc envelope glycoproteins: Key structural units for virus cell entry and virus
assembly. Viruses 6, 1801–1822 (2014).

21. Hjelle, B. & Torres-Pérez, F. Hantaviruses in the Americas and their role as
emerging pathogens. Viruses 2, 2559–2586 (2010).

22. Vapalahti, K., Virtala, A. M., Vaheri, A. & Vapalahti, O. Case-control study on
Puumala virus infection: smoking is a risk factor. Epidemiol. Infect. 138, 576–
584 (2010).

23. Clement, J., Maes, P., Lagrou, K., Van Ranst, M. & Lameire, N. A unifying
hypothesis and a single name for a complex globally emerging infection:
Hantavirus disease. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31, 1–5 (2012).

73
24. Klempa, B. et al. Occurrence of renal and pulmonary syndrome in a region of
northeast Germany where Tula Hantavirus circulates. J. Clin. Microbiol. 41,
4894–4897 (2003).

25. Zelená, H., Mrázek, J. & Kuhn, T. Tula Hantavirus Infection in


Immunocompromised Host, Czech Republic. Emerg. Infect. Dis. 19, 1873–5
(2013).

26. Reynes, J. M., Carli, D., Boukezia, N., Debruyne, M. & Herti, S. Tula hantavirus
infection in a hospitalised patient, France, June 2015. Eurosurveillance 20,
30095 (2015).

27. Bauherr, S. et al. Macropinocytosis and Clathrin-Dependent Endocytosis Play


Pivotal Roles for the Infectious Entry of Puumala Virus. bioRxiv (2019).
doi:10.1101/694208

28. Niskanen, S., Jääskeläinen, A., Vapalahti, O. & Sironen, T. Evaluation of Real-
Time RT-PCR for Diagnostic Use in Detection of Puumala Virus. Viruses 11,
661 (2019).

29. Klingström, J. et al. Innate and adaptive immune responses against human
Puumala virus infection: immunopathogenesis and suggestions for novel
treatment strategies for severe hantavirus-associated syndromes. J. Intern.
Med. 285, 510–523 (2019).

30. Terajima, M., Vapalahti, O., Van Epps, H. L., Vaheri, A. & Ennis, F. A. Immune
responses to Puumala virus infection and the pathogenesis of nephropathia
epidemica. Microbes and Infection 6, 238–245 (2004).

31. Wagner, B. & Forslund, T. Nephropathia Epidemica - Ein tückisches Souvenir


aus Nordeuropa. Dtsch. Arztebl. Int. 96, 898–901 (1999).

32. Garanina, E. et al. Cytokine Storm Combined with Humoral Immune Response
Defect in Fatal Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Case, Tatarstan,
Russia. Viruses 11, 601 (2019).

33. Brocato, R. L. & Hooper, J. W. Progress on the Prevention and Treatment of


Hantavirus Disease. Viruses 11, 610–624 (2019).

74
34. Jacob, J., Koch, J., Krüger, D. H., Schmidt-Chanasit, J. & Ulrich, R. G.
Informationen zur Vermeidung von Hantavirus-Infektionen. RKI
Informationsblatt 1–2 (2008).

35. Jensen, S. & Thomsen, A. R. Sensing of RNA Viruses: a Review of Innate


Immune Receptors Involved in Recognizing RNA Virus Invasion. J. Virol. 86,
2900–2910 (2012).

36. Handke, W., Oelschlegel, R., Franke, R., Krüger, D. H. & Rang, A. Hantaan
Virus Triggers TLR3-Dependent Innate Immune Responses. J. Immunol. 182,
2849–2858 (2009).

37. Breiner, J., Bourquain, D. & Schaade, L. The immunomodulatory functions of


hantavirus nucleocapsid and non-structural proteins. (SUP Biotech, 2018).

38. Kell, A. M. & Gale, M. RIG-I in RNA virus recognition. Virology 0, 110–121
(2015).

39. Goubau, D., Deddouche, S. & Reis e Sousa, C. Cytosolic Sensing of Viruses.
Immunity 38, 855–869 (2013).

40. Yoneyama, M. et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in
double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat. Immunol. 5,
730–737 (2004).

41. Belgnaoui, S. M., Paz, S. & Hiscott, J. Orchestrating the interferon antiviral
response through the mitochondrial antiviral signaling (MAVS) adapter. Curr.
Opin. Immunol. 23, 564–572 (2011).

42. Sun, Q. et al. The Specific and Essential Role of MAVS in Antiviral Innate
Immune Responses. Immunity 24, 633–642 (2006).

43. Zhao, J. et al. MAVS Expressed by Hematopoietic Cells Is Critical for Control of
West Nile Virus Infection and Pathogenesis. J. Virol. 90, 7098–7108 (2016).

44. Roe, K. et al. Dendritic cell-associated MAVS is required to control West Nile
virus replication and ensuing humoral immune responses. PLoS One 14,
e0218928 (2019).

75
45. Li, S.-Z. et al. Phosphorylation of MAVS/VISA by Nemo-like kinase (NLK) for
degradation regulates the antiviral innate immune response. Nat. Commun. 10,
3233 (2019).

46. Oral, E. A. et al. Inhibition of IKKɛ and TBK1 Improves Glucose Control in a
Subset of Patients with Type 2 Diabetes. Cell Metab. 26, 157–170 (2017).

47. Reilly, S. M. et al. An inhibitor of the protein kinases TBK1 and IKK-ε improves
obesity-related metabolic dysfunctions in mice. Nat. Med. 19, 313–321 (2013).

48. Wu, W. et al. RIG-I Signaling via MAVS Is Dispensable for Survival in Lethal
Influenza Infection in Vivo. Mediators Inflamm. 2018, (2018).

49. Lee, M.-H. et al. RNA helicase retinoic acid-inducible gene I as a sensor of
Hantaan virus replication. J. Gen. Virol. 92, 2191–2200 (2011).

50. Kramski, M. et al. Detection and typing of human pathogenic hantaviruses by


real-time reverse transcription-PCR and pyrosequencing. Clin. Chem. 53,
1899–905 (2007).

51. Matthys, V. & Mackow, E. R. Hantavirus Regulation of Type I Interferon


Responses. Adv. Virol. 2012, 1–9 (2012).

52. Rang, A. Modulation of Innate Immune Responses by Hantaviruses. Crit. Rev.


Immunol. 30, 515–527 (2012).

53. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K. & Chen, Z. J. Identification and characterization
of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-κB and
IRF3. Cell 122, 669–682 (2005).

54. Shim, S. H. et al. Comparison of innate immune responses to pathogenic and


putative non-pathogenic hantaviruses in vitro. Virus Res. 160, 367–373 (2011).

55. Bodenstein, C., Bourquain, D. & Schaade, L. Charakterisierung der Replikation


pathogener und nicht - pathogener Hantaviren in humanen Endothelzellen und
Makrophagen. (2018).

56. Tissari, J., Sirén, J., Meri, S., Julkunen, I. & Matikainen, S. IFN-alpha enhances
TLR3-mediated antiviral cytokine expression in human endothelial and

76
epithelial cells by up-regulating TLR3 expression. J. Immunol. 174, 4289–94
(2005).

57. Cimica, V., Dalrymple, N. A., Roth, E., Nasonov, A. & Mackow, E. R. An innate
immunity-regulating virulence determinant is uniquely encoded within the
Andes virus nucleocapsid protein. MBio 5, e01088-13 (2014).

58. Kanerva, M., Melén, K., Vaheri, A. & Julkunen, I. Inhibition of Puumala and
Tula Hantaviruses in Vero Cells by MxA Protein. Virology 224, 55–62 (1996).

59. Lemaire, P. A., Anderson, E., Lary, J. & Cole, J. L. Mechanism of PKR
Activation by dsRNA. J. Mol. Biol. 381, 351–60 (2008).

60. Taylor, S. L., Frias-Staheli, N., García-Sastre, A. & Schmaljohn, C. S. Hantaan


virus nucleocapsid protein binds to importin alpha proteins and inhibits tumor
necrosis factor alpha-induced activation of nuclear factor kappa B. J. Virol. 83,
1271–1279 (2009).

61. Suthar, M. S. et al. IPS-1 is essential for the control of west nile virus infection
and immunity. PLoS Pathog. 6, e1000757 (2010).

62. Lazear, H. M. et al. IRF-3, IRF-5, and IRF-7 Coordinately Regulate the Type I
IFN Response in Myeloid Dendritic Cells Downstream of MAVS Signaling.
PLoS Pathog. 9, e1003118 (2013).

63. Geimonen, E. et al. Pathogenic and nonpathogenic hantaviruses differentially


regulate endothelial cell responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 13837–
42 (2002).

64. Alff, P. J. et al. The pathogenic NY-1 hantavirus G1 cytoplasmic tail inhibits
RIG-I- and TBK-1-directed interferon responses. J. Virol. 80, 9676–86 (2006).

65. Sundström, K. B. et al. Characterization of two substrains of Puumala virus that


show phenotypes that are different from each other and from the original strain.
J. Virol. 85, 1747–56 (2011).

66. Gavrilovskaya, I. N. et al. Adaptation to laboratory and wild animals of the


haemorrhagic fever with renal syndrome virus present in the foci of European
U.S.S.R. Arch. Virol. 77, 87–90 (1983).

77
67. Tkachenko, E. A. et al. Isolation in Vero-E6 cells of Hanta virus from
Clethrionomys glareolus captured in the Bashkiria area of the U.S.S.R. Ann.
Soc. Belg. Med. Trop. (1920). 64, 425–6 (1984).

68. Iheozor-Ejiofor, R. P. et al. Vaccinia virus-free rescue of fluorescent replication-


defective vesicular stomatitis virus and pseudotyping with Puumala virus
glycoproteins for use in neutralization tests. J. Gen. Virol. 97, 1052–1059
(2016).

69. Liu, Y. et al. Amlexanox, a selective inhibitor of IKBKE, generates anti-tumoral


effects by disrupting the Hippo pathway in human glioblastoma cell lines. Cell
Death Dis. 8, e3022 (2017).

70. Landriscina, M. et al. Amlexanox Reversibly Inhibits Cell Migration and


Proliferation and Induces the Src-dependent Disassembly of Actin Stress
Fibers in Vitro. J. Biol. Chem. 275, 32753–32762 (2000).

71. Gonzalez-Hilarion, S. et al. Rescue of nonsense mutations by amlexanox in


human cells. Orphanet J. Rare Dis. 7, 58 (2012).

78
8 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

Ich versichere hiermit an Eides statt, dass ich die von mir eingereichte Bachelorarbeit
selbstständig verfasst und ausschließlich die angegebenen Hilfsmittel und Quellen
verwendet habe.

Benjamin Theodor Geiger

79
9 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Aufbau eines Hantavirions. _____________________________________________ 13
Abbildung 2: Lebenszyklus der Hantaviren.___________________________________________ 15
Abbildung 3: Immunerkennung von Hantaviren. _______________________________________ 19
Abbildung 4: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual WT Zellen nach Infektion mit PUUV
und TULV. ______________________________________________________________________ 37
Abbildung 5: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual MAVS-KO Zellen nach Infektion mit
PUUV und TULV.. ________________________________________________________________ 37
Abbildung 6: Expression von IFNB1 nach Infektion mit PUUV und TULV. __________________ 39
Abbildung 7: Expression von IFNL1 nach Infektion mit PUUV und TULV. __________________ 40
Abbildung 8: Expression von MX1 nach Infektion mit PUUV und TULV. ___________________ 41
Abbildung 9: Expression von EIF2AK2 nach Infektion mit PUUV und TULV. ________________ 42
Abbildung 10: Expression von RNASEL nach Infektion mit PUUV und TULV. _______________ 43
Abbildung 11: Expression von CXCL1 nach Infektion mit PUUV und TULV. ________________ 45
Abbildung 12: Expression des MX1 Proteins in A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen nach
Infektion mit PUUV und TULV. _____________________________________________________ 46
Abbildung 13: Expression von IRF7 und Phosphorylierung von PKR in A549-Dual WT und KO
Zellen nach Infektion mit PUUV. ___________________________________________________ 47
Abbildung 14: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit PUUV und
TULV. _________________________________________________________________________ 48
Abbildung 15: Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von A549-Dual WT und MAVS-
KO Zellen mit PUUV und TULV. ____________________________________________________ 49
Abbildung 16: Quantifizierung von infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS nach Infektion von
A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen mit PUUV. _______________________________________ 50
Abbildung 17: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual WT Zellen nach Infektion mit drei
PUUV-Stämmen. ________________________________________________________________ 51
Abbildung 18: Quantifizierung der IRF-Aktivität in A549-Dual MAVS-KO Zellen nach Infektion mit
drei PUUV-Stämmen. _____________________________________________________________ 52
Abbildung 19: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit Kazan. ____ 53
Abbildung 20: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit CG1820. ___ 53
Abbildung 21: NP-Expression in A549-Dual WT und KO Zellen nach Infektion mit Sotkamo.. _ 54
Abbildung 22: Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von A549-Dual WT und MAVS-
KO Zellen mit drei PUUV-Stämmen. ________________________________________________ 55
Abbildung 23: Quantifizierung von infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS nach Infektion von
A549-Dual WT und MAVS-KO Zellen mit drei PUUV-Stämmen. __________________________ 56
Abbildung 24: Expression von NP, IRF7 und MX1 in HMEC-1 Zellen nach Infektion mit Kazan und
Zugabe von AX. _________________________________________________________________ 58
Abbildung 25: Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von HMEC-1 Zellen mit Kazan
und Zugabe von AX. _____________________________________________________________ 59
Abbildung 26: Quantifizierung von infektiösen Nachkommenviren im ZKÜS nach Infektion von
ZKÜS nach Infektion von HMEC-1 Zellen mit Kazan und Zugabe von AX. ________________ 60

80
Abbildung 27: Die über den RLR-MAVS-Signalweg vermittelte intrazelluläre Immunantwort
gegenüber Puumala Orthohantavirus _______________________________________________ 69
Abbildung 28: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual WT nach Infektion mit PUUV und
TULV über 144 h. ________________________________________________________________ 82
Abbildung 29: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual MAVS-KO nach Infektion mit
PUUV und TULV über 144 h._______________________________________________________ 83
Abbildung 30: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual WT nach Infektion mit
verschiedenen PUUV-Stämmen über 144 h. __________________________________________ 84
Abbildung 31: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual MAVS-KO nach Infektion mit
verschiedenen PUUV-Stämmen über 144 h. __________________________________________ 84
Abbildung 32: Expression von TNF nach Infektion mit PUUV und TULV. __________________ 85
Abbildung 33: Expression von IL6 nach Infektion mit PUUV und TULV. ___________________ 86
Abbildung 34: Expression von IL1B nach Infektion mit PUUV und TULV. __________________ 87
Abbildung 35: Expression von GDF15 nach Infektion mit PUUV und TULV. ________________ 87
Abbildung 36: Expression von NP, IRF7 und MX1 in HMEC-1 Zellen nach Infektion mit Kazan und
Zugabe von AX. _________________________________________________________________ 88
Abbildung 37 Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von HMEC-1 Zellen mit Kazan
und einmaliger Zugabe von AX. ____________________________________________________ 89
Abbildung 38: Analyse der Replikation von PUUV in HMEC-1 Zellen über 144 h durch
Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren. ___________________________________ 90

10 TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1: Instrumente ........................................................................................................................... 21
Tabelle 2: Chemikalien .......................................................................................................................... 21
Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien .......................................................................................................... 22
Tabelle 4: Verwendete Zelllinien ........................................................................................................... 22
Tabelle 5: Virusstämme ......................................................................................................................... 23
Tabelle 6: Molekularbiologische Kits ..................................................................................................... 23
Tabelle 7: Antikörper ............................................................................................................................. 23
Tabelle 8: Enzyme ................................................................................................................................. 23
Tabelle 9: Puffer .................................................................................................................................... 24
Tabelle 10: Zellkulturmedien ................................................................................................................. 25
Tabelle 11: Nichtkommerzielle Primer und Sonden .............................................................................. 26
Tabelle 12: Kommerziell erhältliche Expressions-Assays ..................................................................... 26
Tabelle 13: Verwendete Software ......................................................................................................... 27
Tabelle 14: Ansatz und Programmablauf für die qRT-PCR von TULV oder PUUV. ............................. 31
Tabelle 15: Ansatz und Programmablauf für die qPCR der cDNAs zur Analyse von Gene der
angeborenen Immunantwort.................................................................................................................. 31
Tabelle 16: Ansatz und Programmablauf für die qPCR der cDNA zur Analyse des Housekeeping-Gens
MYC als Vergleichswert für Immungene. .............................................................................................. 32

81
11 ANHANG

11.1 Quantifizierung der NF-κB-Aktivität

Zunächst wurden wie in 4.1 A549-Dual Zellen infiziert, um dann mittels des Quanti-
Blue Assays (s.3.1.3) die NF-κB Aktivität zu quantifizieren. Es stellte sich heraus,
dass die NF-κB Aktivität, wie auch dir IRF-Aktivität, in MAVS-KO Zellen geringer war
als in WT Zellen. In den WT Zellen konnte eine leicht erhöhte NF-κB Aktivität 144 h
post PUUV-Infektion festgestellt werden. (Abbildung 28, Abbildung 29) Erklärbar ist
dieser Umstand dadurch, dass MAVS auch zu einer gewissen NF-κB-Aktivierung und
damit zur Expression proinflammatorischer Gene führt. 42

Abbildung 28: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual WT nach


Infektion mit PUUV und TULV über 144 h. A549-Dual WT Zellen wurden mit PUUV
oder TULV mit MoI = 1,0, 0,1 oder 0,01 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72 und
144 h p.i. wurde die SEAP-Aktivität im Überstand als Maß für die NF-κB Aktivität
mittels des QuantiBlue-Assays quantifiziert. Es wurde eine Absorptioinsmessung bei
620 nm durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde IFN-β 48 h p.i. zugegeben und ab 72
h p.i. detektiert.

82
Abbildung 29: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual MAVS-KO nach
Infektion mit PUUV und TULV über 144 h. A549-Dual WT Zellen wurden mit PUUV
oder TULV mit MoI = 1,0, 0,1 oder 0,01 infiziert. Zu den Zeitpunkten 24, 48, 72 und
144 h p.i. wurde die SEAP-Aktivität im Überstand als Maß für die NF-κB Aktivität
mittels des QuantiBlue-Assays quantifiziert. Es wurde eine Absorptioinsmessung bei
620 nm durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde IFN-β 48 h p.i. zugegeben und ab 72
h p.i. detektiert.

Eine Wiederholung des Experiments mit drei verschiedenen PUUV-Stämmen (s.


4.3.1) führte zu einem ähnlichen Ergebnis. PUUV CG1820 löste in WT Zellen bereits
ab 48 h p.i. eine detektierbare proinflammatorische Antwort aus, bei 144 h p.i. lösten
auch die beiden anderen Stämme eine Antwort aus. Die proinflammatorische Antwort
war in MAVS-KO Zellen nicht so stark wie in WT Zellen. (s. Abbildung 30 und
Abbildung 31)

83
Abbildung 30: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual WT nach
Infektion mit verschiedenen PUUV-Stämmen über 144 h. A549-Dual WT Zellen
wurden mit verschiedenen PUUV-Stämmen, MoI = 0,1 infiziert. Zu den Zeitpunkten
24, 48, 72 und 144 h p.i. wurde die SEAP-Aktivität im Überstand als Maß für die NF-
κB Aktivität mittels des QuantiBlue-Assays quantifiziert. Es wurde eine
Absorptioinsmessung bei 620 nm durchgeführt.

Abbildung 31: Quantifizierung der NF-κB Aktivität in A549-Dual MAVS-KO nach


Infektion mit verschiedenen PUUV-Stämmen über 144 h. A549-Dual WT Zellen
wurden mit verschiedenen PUUV-Stämmen, MoI = 0,1 infiziert. Zu den Zeitpunkten
24, 48, 72 und 144 h p.i. wurde die SEAP-Aktivität im Überstand als Maß für die NF-
κB Aktivität mittels des QuantiBlue-Assays quantifiziert. Es wurde eine
Absorptioinsmessung bei 620 nm durchgeführt.

84
11.2 Quantifizierung der Expression verschiedener Gene
der proinflammatorischen Antwort

11.2.1 TNF

Tumor necrosis factor (TNF) codiert ein multifunktionales proinflammatorisches


Cytokin. In der beobachteten Zeit nahm die Expression nach Infektion mit PUUV in
A549 WT Zellen im Vergleich zu nicht infizierten oder MAVS-KO Zellen leicht zu. (
Abbildung 32)

Abbildung 32: Expression von TNF nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels
qPCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der qPCR und somit für eine erhöhte Expression des Gens.

11.2.2 IL6
Interleukin 6 (IL6) codiert ein Cytokin, welches bei Entzündungen ins Serum
sezerniert wird und durch den IL6-Rezeptor eine transkriptionelle
Entzündungsantwort induziert. In der beobachteten Zeit nahm die Expression nach
Infektion mit PUUV oder TULV in beiden Zelltypen gleichermaßen zu.

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Abbildung 33: Expression von IL6 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-Dual
WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert. Zu den
Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels qPCR
quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an Amplifikaten der
qPCR und somit für eine erhöhte Expression des Gens.

11.2.3 IL1B

Interleukin 1 Beta (IL1B) codiert ein Mitglied der Interleukin-1-Cytokinfamilie. Das


Protein ist ein wichtiger Mediator in Entzündungsantworten. In der beobachteten Zeit
nahm die Expression nach Infektion mit PUUV oder TULV in beiden Zelltypen
gleichermaßen zu. (Abbildung 34)

86
Abbildung 34: Expression von IL1B nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels
qPCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der qPCR und somit für eine erhöhte Expression des Gens.

11.2.4 GDF15

Growth Differentiation Factor 15 (GDF15) codiert ein Mitglied der Transforming


Growth Factor (TGF)-Familie. Das codierte Protein agiert als Cytokin und wird in
entzündeten Zellen exprimiert. In der beobachteten Zeit konnten wir keine
Veränderung der Expression feststellen. (Abbildung 35)

Abbildung 35: Expression von GDF15 nach Infektion mit PUUV und TULV. A549-
Dual WT und MAVS-KO Zellen wurden mit MoI = 0,1 mit PUUV und TULV infiziert.
Zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h p.i. wurde die Expression des Gens mittels
qPCR quantifiziert. Ein höherer ΔcT-Wert steht für eine größere Menge an
Amplifikaten der qPCR und somit für eine erhöhte Expression des Gens.

87
11.3 Vorversuch zu 4.4

Um einen Vergleich zum MAVS-KO der A549-Dual Zellen zu simulieren, wurde


Amlexanox (AX) (Invivogen) verwendet. AX agiert als Inhibitor von TBK1, ein Protein,
welches im RLR-MAVS Signalweg von MAVS phosphoryliert wird. und zur
Aktivierung von IRFs führt. (s. Abbildung 3)

Es wurden einmalig 10 µM AX direkt nach Infektion ins Zellkulturmedium gegeben.

11.3.1 Untersuchung der Expression von viralem NP, des


antiviralen Proteins MX1 und des Transkriptionsfaktors IRF7

HMEC-1 Zellen wurden wie in 4.4 beschrieben kultiviert und mit Kazan (MoI = 0,1)
infiziert. Proteinlysate wurden mittels WB auf die Expression der Proteine NP und
IRF7 analysiert, um die Replikation von PUUV Kazan und die Immunantwort der
HMEC-1 Zellen zu ermitteln. In den mit AX behandelten Zellen wurde eine stärkere
Expression von sowohl NP als auch IRF7 ab 72 h p.i. beobachtet. (Abbildung 36)

Abbildung 36: Expression von NP, IRF7 und MX1 in HMEC-1 Zellen nach
Infektion mit Kazan und Zugabe von AX. HMEC-1 Zellen wurden mit Kazan
infiziert (MoI = 0,1) und es wurde AX zugegeben. Zu den Zeitpunkten 0, 24, 48, 72
und 144 h p.i. wurden NP, IRF7 und MX1 im Zelllysat im WB-Verfahren analysiert.
GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.

88
11.3.2 Quantifizierung viraler RNA im ZKÜS via qRT-PCR

Um das Replikationsverhalten von PUUV in HMEC-1 Zellen zu analysieren, wurde


die Konzentration viraler RNA im ZKÜS mittels q-RT-PCR quantifiziert. (s. 3.3.4).
Wurde TBK1 durch AX inhibiert, war die vRNA-Konzentration von Kazan in HMEC-1
ab 48 h p.i. höher. In HMEC-1 Zellen, die nicht mit AX behandelt wurden, war die
Konzentration zunächst niedriger, zum Zeitpunkt 144 h p.i. wurden vergleichbare
vRNA-Konzentrationen im ZKÜS detektiert. (Abbildung 37)

Abbildung 37 Quantifizierung von vRNA im ZKÜS nach Infektion von HMEC-1


Zellen mit Kazan und einmaliger Zugabe von AX. HMEC-1 Zellen wurden mit
Kazan infiziert (MoI = 0,1) und es wurde AX zugegeben. Zu den Zeitpunkten 0, 24,
48, 72 und 144 h p.i. wurden virale Genomkopien im ZKÜS mittels q-RT-PCR
nachgewiesen.

89
11.3.3 Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren im
ZKÜS mittels FFU-Tests

Um eine genaue Aussage über die Produktion von infektiösen Nachkommenviren


treffen zu können, wurde wie in 4.3.4 ein FFU-Test durchgeführt. Proben wurden zu
den Zeitpunkten 72 und 144 h p.i. genommen. (s. 3.4.2). In diesem Zeitraum verlief
die Replikation in beiden Zelltypen regressiv. 72 h p.i. replizierte PUUV in den Zellen
ohne AX-Behandlung besser. (Abbildung 38)

Abbildung 38: Analyse der Replikation von PUUV in HMEC-1 Zellen über 144 h
durch Quantifizierung der infektiösen Nachkommenviren. Im beobachteten
Zeitraum nahm die Replikation sowohl mit als auch ohne die Zugabe von AX ab. Bei
72 h p.i. replizierte PUUV besser in Zellen, die mit AX behandelt wurden.

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DANKSAGUNG

Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. Lars Schaade für die Möglichkeit bedanken,
meine Bachelorarbeit in der Arbeitsgruppe Bunyaviren zu schreiben.

Weiterhin geht mein Dank an Prof. Dr. Andreas Nitsche für die Bereitstellung der
Laboratorien und Arbeitsplätze sowie die Aufnahme in das Fachgebiet ZBS1. An
dieser Stelle möchte ich auch allen Mitarbeiter*innen von ZBS1 danken, die mich in
viele Geräte eingewiesen haben und die stets für ein angenehmes Arbeitsklima
sorgten.

Mein größter Dank geht an meine Arbeitsgruppe, mit der ich den Laboralltag
verbringen durfte, namentlich an Herrn Dr. Daniel Bourquain, Frau Stefanie Schürer
und Herrn Clemens Bodenstein. Daniel möchte ich für die exzellente
wissenschaftliche Supervision und Betreuung meiner gesamten Bachelorarbeit sowie
für sein für Fragen stets bemerkenswert geduldiges offenes Ohr danken. Steffi danke
ich für die vielen Stunden zusammen an Werkbänken, in denen ich von ihr viele
wertvolle Strategien für die Laborarbeit erlernen durfte, sowie für ihre tatkräftige Hilfe
bei vielen Versuchen. Clemens danke ich ebenfalls für zahlreiche Einführungen und
seine Hilfe bei Versuchen.

Mein Dank geht weiterhin an die anderen Studierenden, die im Studierendenraum


stets für eine durchweg positive und entspannte Arbeitsatmosphäre sorgten und mich
oft bei Fragen unterstützten.

Zum Schluss möchte ich ebenfalls besonders meiner Familie danken, die mich
jederzeit voll und ganz in all meinen Vorhaben unterstützen, sowie Frau Charlotte
Mencke für ihren seelischen und moralischen Beistand während des Verfassens
meiner Bachelorarbeit.

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