INSTITUTO TECNOLÓGICO DE LOS MOCHIS

PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIÓN

MANUAL DE PRÁCTICAS

INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

2011
 Departamento de Ing. Química y Bioquímica

Ing. en Industrias Alimentarias

Manual de Prácticas de

PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIÓN

Elaborado por:

Esaú Bojórquez Velázquez

Estudiante de Ingeniería Bioquímica

M.C. Rafael Jiménez Martínez

Asesor
Índice
PREFACIO ....................................................................................................................... 1
1. DATOS HISTÓRICOS ............................................................................................... 3
2. PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIÓN ................................................ 5
3. NATURALEZA DE LOS MICROORGANIMOS EMPLEADOS
EN PROCESOS INDUSTRIALES .................................................................................. 12
4. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Y OBTENCIÓN DE CULTIVIOS
AXÉNICOS ..................................................................................................................... 14
4.1. Desarrollo de métodos de cultivo puro ................................................................. 14
4.1.1. Primeros cultivos puros .................................................................................. 14
4.1.2. Técnicas de cultivo puro ................................................................................ 16
4.1.3. Consideraciones en el Aislamiento de Microorganismos ............................... 19
4.1.4 Cultivos Bimembres ........................................................................................ 20
5. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS ........................................................... 22
5.1. Morfología ............................................................................................................ 22
5.2. Bioquímica y Fisiología ........................................................................................ 23
6. CRECIMIENTO MICROBIANO .................................................................................. 25
6.1. Naturaleza y Expresión Matemática del Crecimiento ........................................... 25
6.2. Cinética de crecimiento microbiano ..................................................................... 27
6.3. Rendimiento del crecimiento microbiano ............................................................. 31
6.4. Cultivo continuo de microorganismos .................................................................. 32
6.5. Influencia de la Concentración de Nutrientes en la Velocidad de Crecimiento .... 35
6.6. Metabolitos Primarios y Secundarios ................................................................... 37
EXPERIMENTOS ........................................................................................................... 39
I. BACTERIAS ................................................................................................................ 40
I.I Aislamiento y Obtención de Cultivos Axénicos ....................................................... 43
I.II Cinética de Crecimiento Bacteriano ....................................................................... 46
I.III Elaboración de Yogurt ........................................................................................... 48
I.IV Influencia de la Composición del Medio de Cultivo
en el Crecimiento Bacteriano ...................................................................................... 52
II. MOHOS ...................................................................................................................... 55
II.I Aislamiento de Hongos .......................................................................................... 58
 II.II Caracterización Morfológica Macro y Microscópica
y Evaluación de Parámetros Cinéticos........................................................................ 58
II.III Producción de Ácido Cítrico por Aspergillus niger ............................................... 64
Importancia de la Producción de Ácido Cítrico ........................................................ 64
III. LEVADURAS............................................................................................................. 68
III.I Aislamiento y Caracterización Morfológica de
Levaduras Anaerobias Facultativas ............................................................................ 73
III.II Producción de Etanol y Cinética de Crecimiento de Levaduras ........................... 76
ANEXOS ........................................................................................................................ 78
A.I Composición de medios de cultivo ........................................................................ 77
A.II Tinción diferencial por el método de Gram ........................................................... 79
A.III Imágenes siembra por estría en placa ................................................................. 81
A.IV Cinéticas de crecimiento microbiano ................................................................... 84
A.V Mohos y levaduras ante el microscopio ............................................................... 85
A.VI Pruebas bioquímicas ........................................................................................... 87
A.VII Análisis de azúcares reductores mediante el método del ácido dinitrosalicílico
(DNS). ......................................................................................................................... 94
RECOMENDACIONES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO .............................. 97
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 97

ii
 PREFACIO

Todo comenzó con un hombre llamado Leeuwenhoek, un vendedor de telas holandés

quién fue el primer hombre en observar seres microscópicos a los que llamó
“animáculos”, gracias a lentes de aumento que el mismo talló y microscopios que
construyó con sus propias manos.

En la tarea de descubrir el mundo microscópico siguieron hombres como el implacable

Lazzaro Spallanzani, cuyos esfuerzos se enfocaron en contrarrestar y desmentir las
ideas afirmadas por la teoría de la generación espontánea.

Sería imperdonable dejar de mencionar al gran Louis Pasteur, considerado el padre de

la fermentación y quien definió este proceso como el desarrollo de vida en ausencia de
aire, incursionó en la elaboración de las primeras vacunas contra el carbunco y contra
la rabia, y salvó a la industria vinícola francesa, al descubrir que eran diversos tipos de
microbios los responsables de que se estropeara el vino. ¿Quién iba a pensar que
bastaba con calentar el mosto por un tiempo, para en gran medida asegurar una buena
producción?.

Entre los hombres de microbios se encuentra también el metodológico alemán Robert

Koch quien, al aislar el microbio causante del carbunco Bacillus antraxis, determinó los
postulados para asegurar el carácter patógeno de un microorganismo, y en gran parte
fue gracias a él, que tuvo lugar el desarrollo de métodos prácticos y certeros para la
obtención de microorganismos en forma de cultivos puros.

La existencia de los antibióticos que salvan tantas vidas, se debe a la perspicacia que
tuvo Alexander Fleming, al ser capaz de detectar la presencia de una sustancia que
inhibía el desarrollo de colonias bacterianas alrededor de un hogo dentro de una caja
Petri, la penicilina.

1
A lo largo de la historia las investigaciones desarrolladas por estos y muchos otros
hombres, han permitido la aplicación de los sistemas biológicos a niveles industriales,
generando producciones en masa de bienes y servicios muy variados.

En la actualidad gracias a estos procesos es posible obtener un sinfín de productos de

gran importancia, los cuales satisfacen necesidades muy diversificadas de la sociedad
en general.

Por ello debe hacerse énfasis en garantizar que, las nuevas y futuras generaciones
dirigidas al mantenimiento y ejercicio de los bioprocesos, comprendan los principios
científicos y tecnológicos que rigen su comportamiento.

El presente trabajo incluye algunos de los aspectos relacionados con el aprendizaje de

un Ingeniero en Industrias Alimentarias, considerando que parte de su perfil de egreso
implica el entendimiento de los procesos fermentativos para su aplicación a nivel
industrial, o en áreas de investigación que busquen la optimización, nuevas especies
microbianas o fuentes de materias primas más económicas que generen mayor
rentabilidad.

2
 1. DATOS HISTÓRICOS
Las aplicaciones de los microorganismos han estado presentes desde tiempos
inmemorables, ya sea en el campo de la salud, permitiendo la producción de vacunas y
antibióticos o en la producción de alimentos mediante procesos de fermentación. El
hombre hizo uso de ellos sin saber que éstos existían desde que descubrió la manera
de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. El queso fue elaborado en Irak a partir de leche
de vaca o cabra en el 6 000 a.C., el pan se conoce desde 4 000 a.C. aproximadamente,
la cerveza era conocida antes del 6 000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo
Egipto existía ya verdadera producción en 1 700 a.C., el vinagre se producía desde
antes de esa fecha y el vino es también muy antiguo, ya que existe evidencia de su
producción antes del 2 000 a.C. en Egipto, y en China se usaban mohos para fermentar
soya alrededor del año 500 a.C.

En la primera mitad del siglo XX tiene lugar el desarrollo de procesos fermentativos a

nivel industrial para la producción de etanol, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico,
ácido glucónico acetona, butanol y glicerol. En este periodo las fermentaciones
anaeróbicas se realizaban en cultivos sumergidos y las fermentaciones aeróbicas en
cultivos en superficie. La demanda continua exigía incrementar la productividad de
fermentaciones industriales para la obtención de levadura de panificación y ácidos
orgánicos, lo que condujo al uso de tanques profundos con suministro de grandes
cantidades de aire estéril. El desarrollo de procesos para obtención de penicilina
durante la Segunda Guerra Mundial reafirmó e impulsó el avance de la fermentación
industrial. Sin embargo, el periodo de la postguerra provocó un estancamiento temporal
debido al crecimiento de la industria petroquímica, y la disponibilidad de químicos de
bajo costo para la producción de ácidos orgánicos y solventes mediante síntesis
química. Hacia el final de siglo XX, un mejor entendimiento de la biología molecular
propició el desarrollo de sistemas de fermentación eficientes para la obtención de
productos bioquímicos. En el presente las aplicaciones industriales de fermentaciones
implican, entre otros casos, el uso de pectinasas para incrementar la producción de
jugos de frutas, y amilasas para modificaciones enzimáticas de almidones. Estos son
ejemplos que involucran la intervención indirecta de microorganismos en el desarrollo
de alimentos y sus componentes. La producción de goma por la bacteria fitopatógena
Xanthomonas campestris, es un ejemplo de explotación de un organismo originalmente
3
indeseable, para la producción de un aditivo empleado como agente de viscosidad en el
desarrollo de bebidas y productos alimenticios semisólidos. El uso del moho Aspergillus
niger para implementar la obtención de ácido cítrico con altos rendimientos fue
establecido en los años 1920´s, tornándose como un ejemplo clásico de un proceso
realizado inicialmente mediante cultivo en superficie que eventualmente fue convertido
a un proceso sumergido aireado con la aplicación de cepas mutantes. Actualmente, las
tecnologías de fermentación han adquirido prestigio debido al potencial biotecnológico
de los microorganismos, al evidente riesgo que representan los procesos de síntesis
química tanto para las personas como para el medio ambiente, y al posible desarrollo
de una economía sustentable por el uso de materias primas renovables.

Con la aparición de la biología molecular, en los años cincuenta, se descifra la

estructura del material genético, así como los mecanismos celulares que permiten
traducir en proteínas la información genética. En los años setenta surgen las técnicas
de la ingeniería genética y con ello la posibilidad de aislar, editar y manipular el material
genético, lográndose incluso el trasplante de genes entre especies, creándose así los
organismos transgénicos. Este conjunto de conocimientos sobre el material genético y
las proteínas de la célula viva, así como de las metodologías para manipularlos,
constituye una de las plataformas de despegue de la biotecnología moderna. A partir de
1979 la Microbiología Industrial recibe un nuevo y notable impulso cuando se concretan
a nivel de procedimientos prácticos las posibilidades que ofrece la ingeniería genética,
disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biología Molecular. Esto
posibilita la producción industrial, basada en la utilización de microorganismos
recombinantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa vía, como la
insulina, la hormona de crecimiento, el interferón y otras de muy reciente aparición en el
mercado de productos relacionados con el área de la salud.

4
 2. PROCESOS INDUSTRIALES DE FERMENTACIÓN
El término “fermentación” (del latín fervere = hervir) inicialmente fue reservado para la
actividad microbiana anaeróbica donde, en el proceso de producción de energía, el ATP
solo se genera por fosforilación a nivel de sustrato y el receptor final de electrones es
un compuesto orgánico (uno de los ejemplos más representativos de metabolismo
anaerobio es la fermentación del azúcar lactosa para generar ácido láctico). Debe su
nombre a la acción de las levaduras sobre melazas, azúcares o extractos de frutas y
granos ya que hacían “hervir” estos medios gracias a la producción de dióxido de
carbono en la fase acuosa. En la actualidad se denomina fermentación a todo proceso
en el que se vean involucrados microorganismos, sean aerobios o anaerobios, y a
aquellos en los que se utilizan células animales y vegetales. Es por ello que los
procesos de Microbiología Industrial o las Fermentaciones Industriales o los Procesos
Industriales de Fermentación, son o pueden considerarse como sinónimos. Sin
embargo el uso de este término se está haciendo muy general y se corre el peligro de
no poder aplicarlo con precisión a un determinado tipo de proceso biológico.

Los microorganismos pueden ser considerados desde dos puntos de vista antagónicos.
Uno corresponde al aprovechamiento de sus actividades metabólicas (crecimiento y
producción de metabolitos) para obtener bienes y/o servicios, y otro completamente
distinto corresponde a los efectos perjudiciales que ocasionan, generalmente asociados
al desarrollo de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y al deterioro
producido sobre alimentos y materiales diversos. La Microbiología Industrial se ocupa
fundamentalmente de las actividades útiles de los microorganismos.

La Biotecnología es una actividad multidisciplinaria que incorpora la aplicación de los

principios científicos y de la ingeniería al procesamiento de materiales por agentes
biológicos para proveer bienes y servicios. Los agentes biológicos pueden ser células
microbianas, animales, vegetales y enzimas, entendiéndose por bienes a cualquier
producto industrial relacionado con alimentos, bebidas, productos medicinales, etc., y
por servicios a aquellos vinculados a la purificación de aguas y tratamiento de efluentes.
Esta definición que es la más conocida y aceptada por la mayor parte de los países fue
propuesta por la Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OECD).

5
Por lo tanto, la Microbiología Industrial representa una parte, seguramente la más
importante de la Biotecnología.

Así mismo las bases de la Microbiología Industrial están cimentadas en los principios de
disciplinas como Matemáticas, Química, Bioquímica, Termodinámica, Microbiología,
Biología Celular, Tecnologías de Instrumentación y Control e Ingeniería, las cuales
permiten incorporar a los procesos fermentativos conceptos de Estequiometria,
Fenómenos de Transporte y Operaciones Unitarias (transferencia de materia, calor y
cantidad de movimiento), criterios de Escalamiento, Cinética Enzimática y de
Crecimiento Microbiano, conocimiento de las Rutas Metabólicas así como estudios
acerca de la influencia del medio de cultivo sobre la productividad del proceso y la
formación de productos.

Una rama importante en la aplicación de microorganismos a nivel industrial es la

Biotecnología Molecular, la cual se enfoca en la producción de un amplio rango de
proteínas, sin embargo, haciendo uso de una serie de técnicas y metodologías
denominadas en conjunto Tecnología de DNA Recombinante, puede también
desarrollar la obtención de una gran diversidad de compuestos de bajo peso molecular.
Con sistemas de expresión eficientes, es relativamente fácil clonar y expresar genes de
proteínas particulares. EL producto final lo constituye la proteína expresada o la
catálisis de una reacción específica. En ocasiones, mediante manipulación genética, se
incorpora una nueva actividad catalítica a un microorganismo, la cual es usada para
producir metabolitos de bajo peso molecular in vivo.

Actualmente una gran cantidad de productos farmacéuticos y alimentarios son

producidos mediante bioprocesos industriales bien establecidos. Por ejemplo, las
bacterias son capaces de producir aminoácidos que pueden emplearse en alimentos y
medicamentos. A diferencia de la síntesis química que genera mezclas de productos
(como en el caso de los aminoácidos donde se presentan formas isoméricas tanto L-
como D-), los procesos cimentados en sistemas biológicos poseen una gran
especificidad, gracias a lo cual e ha logrado la obtención de cientos de productos de
origen microbiano en forma pura.

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Hoy en día existen más de 200 tipos de productos alimenticios fermentados en el
mercado. Existe gran número de procesos biológicos ampliamente usados en la
industria para la fabricación de productos de alta calidad (Tablas 21. y 2.2) como
antibióticos y ácidos orgánicos como cítrico, acético, butírico y propiónico. La síntesis de
proteínas y aminoácidos, lípidos y ácidos grasos, azúcares simples y polisacáridos,
glicerol y muchas otras sustancias químicas mediante bioprocesos, presentan
aplicaciones industriales convenientes desde el punto de vista económico. EL principal
enfoque de las fermentaciones industriales es implementar sistemas de cultivo de
microorganismos a gran escala.

La producción de biomasa se considera como la obtención de masa celular a partir de

bacterias, mohos y levaduras. Las principales aplicaciones se observan en la
elaboración de levadura para panificación y de proteína celular (SCP, Single Cell
Protein). En algunos países ha sido empleada un alga llamada Spirulina para
alimentación de ganado. La SCP es usada como fuente de alimento producida a partir
de materias primas renovables como suero de leche, celulosa, almidón, melazas y un
amplio rango de desperdicios vegetales.

En cuanto a los productos celulares, estos se clasifican intracelulares y extracelulares.

Las enzimas son uno de los principales derivados de este tipo empleados en la
industria. Las enzimas pueden ser extraídas de plantas y animales, pero las enzimas
microbianas tienen la característica de poder ser producidas a gran escala mediante
técnicas convencionales. La actividad de producción enzimática es desarrollada por
mutación, selección y manipulación genética. EL uso de enzimas a nivel industrial es
muy amplio, se aplican en producción de cereales, café, confitería, chocolate, jarabe de
maíz, productos lácteos, bebidas y jugos de frutas. Las enzimas más comúnmente
usadas en las industrias de los alimentos son amilasa y proteasa en productos cárnicos,
pectinasa y hemicelulasa es café, catalasa, lactasa y proteasa en productos lácteos y
glucosa oxidasa en jugos de frutas.

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Tabla 2.1 Sectores industriales y bioproductos relacionados
Sector Producto o Servicio
Químico Etanol, Acetona, Butanol
Ácidos Orgánicos
Enzimas
Perfumes
Polímeros
Farmacéutico Antibióticos
Enzimas
Inhibidores Enzimáticos
Anticuerpos Monoclonales
Esteriodes
Vacunas
Energético Etanol
Metano (Biogás)
Alimentario Productos Lácteos
Levadura de Panadería
Bebidas
Aditivos
Aminoácidos
Vitamina B
Proteínas (SCP)
Agrícola Alimento para Ganado (SCP)
Tratamiento de Residuos
Pesticidas Microbianos
Fijación de N2

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 Tabla 2.2 Productos industriales generados mediante
bioprocesos y microorganismos responsables
Producto Microorganismo
Etanol (no para bebidas) Saccharomyces cerevisiae
Ácido 2-cetoglucónico Pseudomonas sp.
Pectinasa, proteasa Aspergillus niger, A. aureus
Amilasa bacteriana Bacillus subtilis
Proteasa bacteriana B. subtilis
Dextran Leuconostoc mesenteroides
Sorbosa Gluconobacter suboxydans
Cobalamina (vitamina B12) Streptomyces olivaceas
Ácido glutámico Brevibacterium sp.
Ácido glucónico Aspergillus niger
Ácido láctico Rhizopus oryzae
Ácido cítrico Aspergillus niger
Acetona-butanol Clostridium acetobutylicum
Insulina, interferón E. coli recombinante
Levadura de panadería
Levaduras y cultivos Lactobacillus bulgaricus
iniciadores Bacterias acidolácticas
Proteína microbiana (SCP) Candida utilis ,
Pseudomonas
methyllotroph
Penicilina Penicillium chrysogenum
Cefalosporina Cephalosparium
acremonium
Eritromicina Streptomyces erythreus
Aplicación
Química
Intermediario para Ácido D-
araboascórbico
Agentes clarificantes en
jugos de frutas
Almidón modificado, papel
prensado
Detergentes, ablandamiento
de fibras
Estabilizador de alimentos
Producción de ácido
ascórbico
Suplemento alimenticio
Aditivo de alimentos
Productos farmacéuticos
Alimentos y medicamentos
Alimentos y medicamentos
Solventes, intermediario
químico
Terapia humana
Producción de queso y
yogurt
Suplemento alimentario
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Antibiótico
Antibiótico
Antibiótico
Es evidente que la ciencia se comprende ahora como un tipo de actividad de índole
multidisciplinaria, en la que el éxito en la solución de problemas científicos y sociales
complejos sólo se podrá vislumbrar con el concurso y la convergencia de múltiples
conocimientos, herramientas y estrategias. Por lo que resulta adecuado recalcar que la
biotecnología moderna se puede definir como una actividad multidisciplinaria, cuyo
sustento es el conocimiento de frontera generado en diversas disciplinas (entre otras, la
biología molecular, la ingeniería bioquímica, la microbiología, la genómica y la
inmunología), que permite el estudio integral y la manipulación de los sistemas
biológicos (microbios, plantas y animales). A partir de lo cual la biotecnología moderna
busca hacer un uso inteligente, respetuoso y sustentable de la biodiversidad, mediante
el desarrollo de tecnología eficaz, limpia y competitiva, para facilitar la solución de
problemas importantes en sectores tales como alimentación, salud, agricultura, industria
y medio ambiente.

El papel que desempeña así la biotecnología moderna en el mundo actual es clave. El

nuestro es un mundo contaminado y con ecosistemas destruidos por los impactos de la
industrialización. Un mundo con una población en demanda creciente de alimentos,
agua, recursos energéticos, servicios de salud y vivienda. Ante esta realidad, si no
mantenemos una conciencia crítica y nos movemos hacia la búsqueda de alternativas
tecnológicas eficaces, limpias, y respetuosas del medio ambiente iremos
irremediablemente hacia escenarios de mayor contaminación y degradación.

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 3. NATURALEZA DE LOS MICROORGANIMOS EMPLEADOS
EN PROCESOS INDUSTRIALES
Por mucho tiempo los alimentos fermentados han sido preparados empleando la
microflora nativa presente en las materias primas necesarias para su elaboración, y a
pesar del inminente riesgo que representa esta práctica debido a la posible presencia
de patógenos, sigue vigente en diversas partes del mundo en la elaboración comidas
típicas tradicionales. Sin embargo, cada vez más, e iniciando con el aislamiento y
purificación de cepas de levaduras para cervecería por Emil Christian Hansen en 1883,
en la fabricación de muchos productos se emplean cultivos iniciadores. Estos
microorganismos se denominan como Generalmente Reconocidos como Seguros
(GRAS, Generally Recognized as Safe). Son seleccionados por las ventajas de sus
propiedades en términos de alto desempeño durante el proceso e impacto en la calidad
del producto final. Muchas compañías y laboratorios académicos se encuentran en
constante búsqueda y desarrollo de nuevos cultivos. En ocasiones pueden ser
encontrados a manera de hallazgos afortunados, al buscar en una gran cantidad de
muestras tomadas de diversos hábitats. Los métodos de búsqueda emplean medios de
cultivo y condiciones de crecimiento favorables que permitan el desarrollo de un
microorganismo determinado en base a las características deseadas. Alternativamente,
pueden obtenerse ciertas ventajas al conocer los lugares en los que se desarrollan
ciertos tipos de microorganismos, por ejemplo, las levaduras se encuentran de manera
abundante en las superficies de los frutos.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por

aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos. A nivel
industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de
los cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería
genética. Sin embargo, estas cepas sólo son empleadas por la industria que las posee,
debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos casos se dispone de
organismos modificados genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de
biosíntesis, degradación o biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto
significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no están
disponibles para uso general en laboratorios.

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Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el
microorganismo utilizado, en la elección del mismo se deben tener en cuenta ciertos
criterios generales que se indican a continuación:

1. El microorganismo debe poder obtenerse en forma de cultivo puro

2. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.
3. Su velocidad de crecimiento deberá ser alta.
4. Sus requerimientos nutricionales deben ser satisfechos a partir de medios de
cultivo de costo reducido y si es posible que no necesite de factores de
crecimiento.
5. Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida de sus
características particulares.
6. Debe llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
7. Si el objetivo del proceso es un producto, éste debe ser de alto rendimiento y de
fácil extracción del medio de cultivo.
8. Debe poder desarrollarse en cultivos a gran escala
9. De preferencia debe producir esporas u otra forma de reproducción para su fácil
inoculación.
10. Ser inocuo, es decir, no representar peligro para el ser humano, plantas y
animales.
11. Ser susceptible a modificación genética.

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 4. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Y OBTENCIÓN DE
CULTIVIOS PUROS

4.1. Desarrollo de métodos de cultivo puro

Cuando se trabaja con poblaciones microbianas mixtas pueden cometerse errores,

pues se torna difícil determinar cuál es el microorganismo responsable de la producción
del metabolito de interés o aquel que determina la obtención de características
deseables en procesos de maduración, además cabe la posibilidad de resultar en un
rendimiento deficiente debido a la competencia por el o los sustratos disponibles, pero
el factor probablemente más importante en la elaboración de alimentos es la
incertidumbre en cuanto a la presencia de patógenos.

En el siglo XIX se mantenía que los microorganismos tenían una gran capacidad de
variación, respecto tanto a su aspecto morfológico como a su función fisiológica, esta
creencia se dio a conocer como doctrina del pleomorfismo, mientras que la creencia
contraria, relativa a que los microorganismos presentan una constancia y especificidad
de forma y función, se dio a conocer como doctrina del monomorfismo.

Hacia 1870 se empezó a pensar que solamente podría tenerse una idea clara acerca
de la forma y función de los microorganismos si las complicaciones inherentes al
estudio de las poblaciones microbianas mixtas pudiesen evitarse mediante el uso de
cultivos puros.

Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene una sola especie microbiana,
proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza.
En los medios naturales solamente existen cultivos mixtos, en los cuales se presenta
diversas especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el
laboratorio.

4.1.1. Primeros cultivos puros

Gran parte del trabajo inicial sobre las técnicas para la obtención de cultivos puros fue
realizado por Brefeld, trabajando con hongos. Introdujo la práctica de aislar células, así
como la del cultivo de los hongos sobre medios sólidos, para lo cual añadía gelatina a
sus medios líquidos. Sus métodos de obtención de cultivos puros funcionaban
admirablemente para los hongos, pero no resultaban adecuados cuando se aplicaban a
14
bacterias. Uno de los primeros en proponerse fue el método de las diluciones. Un fluido
que contenía una mezcla de bacterias se diluía en medio estéril, con la esperanza de
que en último término podría lograrse un crecimiento que tuviera su origen en una sola
célula. En la práctica este método es tedioso, difícil e incierto; tiene además la evidente
desventaja de que, en el mejor de los casos, solo se puede aislar en forma pura el
microorganismo que predomina en la mezcla original.

El método de las diluciones era obviamente demasiado tedioso e inseguro para ser
utilizado de forma rutinaria. Una manera más prometedora de abordar el problema fue
sugerida por J. Schroeter, quien encontró que sobre sustratos sólidos, como patata,
pasta de almidón, pan y albúmina de huevo, se formaban desarrollos aislados de
bacterias, o colonias. Robert Koch se dio cuenta en seguida de que el desarrollo de
medios sencillos para la obtención de cultivos puros de bacterias era esencial para el
desarrollo de la nueva ciencia. Koch realizó experimentos utilizando superficies estériles
de patatas cortadas, las cuales inoculaba con bacterias. Sin embargo, las patatas
tienen claras desventajas; la superficie del corte es húmeda, lo que permite a las
bacterias móviles desplazarse libremente sobre ella; el sustrato es opaco y, por ello a
veces resulta difícil ver las colonias; y lo más importante, la patata no es buen medio
nutritivo para muchas bacterias.

Koch concibió la idea de que sería mucho mejor si se pudiese solidificar un medio
líquido bien conocido, añadiendo alguna sustancia transparente. De esta manera podría
preparase un gel traslúcido sobre el cual serían fácilmente visibles las colonias
bacterianas que se desarrollasen. Al mismo tiempo, modificando la composición del
líquido base, podrían atenderse los diferentes requerimientos de nutrición de las
diferentes bacterias. Con esta idea presente, añadió gelatina como agente
endurecedor. Una vez solidificada, la superficie de la gelatina se sembraba tomando
una minúscula cantidad de células bacterianas con una aguja de platino, previamente
esterilizada pasándola por una llama y deslizándola varias veces, rápida y suavemente
sobre la superficie del gel. Después de cierto tiempo de incubación, se presentaron
diferentes colonias bacterianas, cada una de las cuales podía ser purificada repitiendo
este proceso de siembra, que se dio a conocer como método de siembra por estría.
Poco después, Koch descubrió que en lugar de sembrar las bacterias sobre la

15
superficie de la gelatina ya solidificada, podía mezclarlas con la gelatina fundida.
Cuando la gelatina se solidificaba, las bacterias quedaban inmovilizadas dentro del gel
y ahí se desarrollaban dando colonias aisladas. Esto se dio a conocer como método de
vertido en placa. Los cultivos puros eran luego transferidos a tubos de ensayo, que
contenían gelatina nutritiva estéril, los cuales habían sido taponados con algodón estéril
y se solidificaban en posición inclinada, denominándose cultivos en tubo inclinado.

A pesar del innovador método desarrollado por Koch para la obtención de cultivos
puros, la gelatina presentaba varios inconvenientes. Es una proteína altamente
susceptible a la digestión y fluidificación por las bacterias. Además cambia de sólido a
líquido a temperaturas por encima de los 28°C. Pronto fue introducido un nuevo agente
solidificante, el agar. El agar es un polisacárido que se extrae de las algas rojas. Para
fundir un gel de agar se requiere una temperatura de 100°C, por lo que permanece
sólido a lo largo de toda la escala de temperaturas a la que se cultivan los
microorganismos y, una vez fundido, permanece líquido hasta que la temperatura baja
a 44°C aproximadamente, hecho que hace posible su uso para la preparación de
cultivos por el método de vertido en placa. Finalmente es un carbohidrato complejo que
es atacado por muy pocas bacterias, por lo que el problema de su fluidificación se
presenta muy raras veces.

4.1.2. Técnicas de cultivo puro

La obtención de un cultivo axénico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que
esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en
ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon
de descendientes.

Una vez que se cuenta con material y medios de cultivo estériles, el siguiente paso para
obtener un cultivo axénico es inocular una sola célula de un microorganismo en un
medio sólido o líquido. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se
podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población
de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo
suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido.
Una colonia de bacterias de tamaño medio contiene, aproximadamente, 10 9 células
individuales, casi tantos individuos como personas pueblan la tierra.
16
Para aislar células individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran
número en que normalmente están presentes. La dilución se realiza mediante siembra
por estría cruzada (también llamada siembra por estría en placa), vertido en placa o
extensión en superficie (extensión en placa).

Los microorganismos son ubicuos, por lo que la preparación de un cultivo puro no

implica solamente el aislamiento de un determinado microorganismo a partir de una
población microbiana natural mixta, sino también el mantenimiento del individuo aislado
y de su descendencia, en un ambiente artificial al que se impide el acceso a otros
microorganismos. Los microorganismos no requieren mucho espacio para su desarrollo;
de ahí que pueda crearse un ambiente artificial dentro de los confines de un tubo de
ensayo, de un matraz o de una caja Petri, los tres tipos de recipientes más comúnmente
utilizados para cultivar microbios. El recipiente de cultivo debe estar inicialmente estéril
(libre de toda forma de vida) y después de la introducción del tipo de microorganismo
deseado debe estar protegido de una posible contaminación externa.

4.1.2.1. Aislamiento de cultivos puros por métodos de siembra en placa

La manera más fácil de obtener cultivos puros de los microorganismos que forman
colonias discretas sobre medios sólidos se lleva a cabo utilizando alguna de las
variables del método de siembra en placa. Este método implica la separación e
inmovilización de los organismos particulares dentro o sobre un medio de cultivo
nutritivo solidificado por agar o algún otro agente gelificante adecuado.

Método de siembra por estría en placa: La siembra por estría es, en general, el
método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa
de siembra con aro en la punta, se toma una muestra de una suspensión mixta de
células convenientemente diluida, y a continuación se hacen estrías paralelas no
superpuestas sobre la superficie de un medio sólido previamente preparado en una caja
Petri. Con forme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van
depositando en la superficie del medio de cultivo menos microorganismos, es decir, el
inóculo se va diluyendo progresivamente con cada estría sucesiva, de tal manera que si
las estrías iniciales proporcionaron un crecimiento confluente, a lo largo de las últimas
estrías se van desarrollando colonias bien aisladas. A continuación, se flamea el asa,

17
se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra
con la misma técnica, en la superficie de medio aún sin sembrar. Repitiendo este
proceso varias veces se logra separar células individuales. Es posible también aislar
mediante estría por agotamiento, esto es, después de tomar la muestra, se hacen
estrías a lo largo de toda la superficie de la placa sin despegar el asa. Después de la
incubación es posible apreciar un gradiente de dilución en el crecimiento de las
colonias, de modo tal que, en la zona de la caja Petri donde se realizaron las primeras
estrías se presentará un crecimiento abundante, a diferencia de las últimas estrías que
generarán colonias bien aisladas.

Vertido en Placa y Extensión en Superficie. En estos métodos, las suspensiones de

células microbianas se diluyen antes de ser inoculadas. Se siguen estas técnicas
cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede
realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por
mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de
células por mililitro. Por tanto se realizan diluciones seriadas (en varias etapas),
normalmente de diez en diez, esto se logra añadiendo 1 mL de la suspensión
bacteriana a 9 mL de medio estéril o solución salina estéril. Se agita vigorosamente
para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y
se vierten en cajas Petri. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras
crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más
grandes.

En el método de extensión en placa, las muestras se siembran directamente en la

superficie del agar contenido en la caja Petri, extendiéndose con la ayuda de un asa de
Digralsky de cristal estéril (varillas de vidrio dobladas en ángulo recto). La suspensión
se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie.

Seguido de la siembra, las placas se dejan incubar hasta la aparición de colonias. Las
técnicas por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de
colonias aisladas que el método de siembra por estría.

18
4.1.2.2. Aislamiento de microorganismos anaerobios

El aislamiento de bacterias anaeróbicas por los métodos de siembra en placa plantea

problemas especiales. Siempre que los organismos en cuestión no mueran
rápidamente al ser expuestos al oxígeno, las placas pueden prepararse de manera
usual y luego incubarse en recipientes cerrados, de los cuales se elimina el oxígeno
bien sea por absorción química o por evacuación. Existen microorganismos a los que se
les denomina anaerobios estrictos, ya que mueren al ser expuestos aunque sea
momentáneamente al aire, por lo que su cultivo requiere medidas extraordinarias para
excluir, en todo momento, incluso trazas de oxígeno. Habitualmente se utilizan dos
técnicas principales para el cultivo de bacterias en completa ausencia de oxigeno;
cultivo rodante y cámaras anaeróbicas.

4.1.3. Consideraciones en el Aislamiento de Microorganismos

Si se quiere aislar un microorganismo a partir de una población natural mixta, con
frecuencia resulta posible, siempre que la técnica sea buena, preparar una serie de
placas sembradas por dilución en la que muchas de las colonias desarrolladas estén
bien separadas unas de otras. Sin embargo estas colonias aisladas pueden distar
mucho de representar un cultivo puro. Es probable que se inicie una colonia particular
por dos microorganismos semejantes sembrados juntos en la placa para dar una
colonia mixta. Además, como los microorganismos varían enormemente en cuanto a
sus requerimientos, ningún medio y conjunto único de condiciones de crecimiento
permitirá el desarrollo de todos los microorganismos presentes en una población
natural. Ciertamente, es probable que solo una fracción de los organismos inicialmente
presentes sea capaz de formar colonias en cualquier medio dado. De ahí que pueda
haber miles de microorganismos que se depositaron también en la superficie del agar y
que aunque no lograron un crecimiento macroscópicamente sigan siendo viables. La
probabilidad de que algunos de estos microorganismos sean tomados y transferidos es
muy elevada. Por todo lo anterior, NUNCA SE DEBE TOMAR LA COLONIA DE UNA
PRIMERA PLACA PARA PREPARAR UN CULTIVO PURO. En lugar de esto, se debe
sembrar por estría una segunda placa, utilizando una suspensión preparada a partir de
una colonia bien aislada. Si todas las colonias de esta segunda placa resultan idénticas,

19
una colonia bien aislada de estas puede entonces emplearse para establecer un cultivo
puro.

No todos los microorganismos capaces de crecer sobre medios sólidos dan origen
necesariamente a colonias bien aisladas. Ciertas bacterias flageladas móviles pueden
extenderse rápidamente por la superficie ligeramente húmeda de la paca recién
preparada. Esto puede evitarse mediante el uso de placas con la superficie bien seca,
en las que las células quedan inmovilizadas. Las espiroquetas y los organismos que
muestran movimientos de desplazamiento pueden moverse sobre un gel de agar o a
través de él, incluso cuando su superficie se encuentra seca. En tales casos, el
movimiento de los organismos en cuestión sirve de ayuda para su purificación, ya que
pueden separarse de otras clases de microorganismos inmovilizados en el agar.

4.1.4 Cultivos Bimembres

El fin que se pretende con el aislamiento es, normalmente, la obtención de un cultivo
puro. Sin embargo, existen ciertos casos en los que no se puede lograr esto, o en los
que conseguirlo es tan difícil que no resulta práctico. En tales circunstancias la
alternativa consiste en obtener el mejor grado de purificación en forma de cultivo
bimembre, el cual contiene solamente dos clases de microorganismos. Esta es la única
forma posible para mantener los virus, ya que estos organismos son todos parásitos
intracelulares. Representa también la mejor manera de mantener en el laboratorio
muchos de los protozoos que se alimentan en la naturaleza de microorganismos más
pequeños, en asociación con sus presas microbianas.

El establecimiento de un cultivo bimembre es una operación que se realiza en dos

fases. Primero es necesario establecer un cultivo puro del organismo que sirve de
alimento (el hospedador en el caso de los virus y de los parásitos intracelulares
obligados, la presa en el caso de los protozoos). Una vez logrado esto, el parásito o
depredador puede ser aislado por cualquiera de los diversos métodos existentes
(siembra en placa en presencia del organismo que sirve de alimento, dilución en medio
líquido, aislamiento de una sola célula) e introducirlo en el cultivo puro del organismo
que sirve de alimento.

20
El mantenimiento con éxito de los cultivos bimembres requiere un gran cuidado ya que
es esencial mantener un equilibrio biológico razonablemente estable entre los dos
componentes. El medio debe permitir el suficiente desarrollo del organismo que sirve de
alimento para satisfacer las necesidades del parásito o depredador, pero no tanto que
sobrepase en crecimiento a su asociado y origine productos metabólicos que sean
perjudiciales para éste.

21
 5. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Michael Adanson creía que si se observaban suficientes caracteres de un
microorganismo, independientemente de su importancia, éste podría ser clasificado con
exactitud. Este enfoque se denomina taxonomía numérica, la cual otorga igual valor a
todos los caracteres. Mediante este enfoque se analizan un gran número de caracteres
de muchas cepas y posteriormente se calcula el porcentaje de caracteres que
comparten cada una de las distintas parejas posibles. La relación de una pareja de
cepas queda reducida a un número, el coeficiente de semejanza (Sj).

Los caracteres utilizados para clasificar bacterias son de dos tipos: los tradicionales y
los modernos. Tradicionalmente, los taxónomos han empleado la morfología, la
bioquímica y la fisiología, la serología y la fagopatía para tomar decisiones sobre una
especie bacteriana. Actualmente, se puede utilizar el porcentaje de pares de bases G-
C, secuencias de bases de DNA, hibridación de DNA, secuencias de bases de mRNA,
secuencias de aminoácidos de proteínas y perfiles de proteínas.

5.1. Morfología

Los criterios morfológicos pueden ser, a su vez, a nivel macro- y microscópico.

Los criterios macroscópicos tienen en cuenta el aspecto de las colonias al crecer en

diferentes medios de cultivo. Por ejemplo, en el agar glucosado de sabouraud las
colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de
consistencia mantecosa o cremosa, lisa o rugosa, con olor dulzón agradable,
volviéndose más pastosas a medida que envejecen.

La observación a nivel microscópico revela la forma de las células individuales, la

disposición característica que adoptan (cadenas, grupos o paquetes irregulares) y la
disposición de los flagelos, la formación y tipo de esporas o la forma de reproducción
sea ésta sexual o asexual.

Sin embargo, un aspecto morfológico no indica necesariamente una relación cercana

entre tipos de organismos, por tanto, los caracteres morfológicos ayudan a describir

22
células microbianas, pero no suministran mucha más información acerca de la relación
entre ellas.

Existe una excepción notable a esta afirmación. La tinción de Gram pone de manifiesto
un carácter morfológico significativo, pues revela si una bacteria posee o no una
membrana externa y tiene una pared de peptidoglicano gruesa o fina.

5.2. Bioquímica y Fisiología

Algunos de los caracteres bioquímicos y fisiológicos utilizados para clasificar

microorganismos se basan en las condiciones que permiten su crecimiento.
Requerimientos de oxígeno (aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos…), valores
óptimos de pH para el crecimiento, condiciones osmóticas y productos finales del
metabolismo son ejemplos de parámetros en los cuales se basa la caracterización de
un cepa.

Las fuentes de carbono que permiten el crecimiento constituyen un conjunto de

caracteres particularmente útiles, debido a que la mayoría de las bacterias pueden
utilizar muchas fuentes de carbono diferentes. Si una bacteria puede usar una fuente de
carbono en particular o no, es un carácter que puede emplearse para calcular el
coeficiente de semejanza. Incluso es posible identificar cualquier especie patógena
Gram negativa, determinando cual o cuales de los 96 compuestos orgánicos diferentes
pueden utilizar como fuente carbono.

Otra propiedad de gran utilidad en el análisis diferencial de microorganismos es su

capacidad fermentativa, pues permite detectar la producción ácidos o gases. Cuando se
acumulan los productos ácidos de la fermentación, el pH del medio baja; este cambio
de pH puede detectarse de varias maneras, siendo la más frecuente el adicionar un
indicador en el medio de cultivo, el cual cambiará de color a medida que aumente la
acidez. Por ejemplo, Escherichia coli puede diferenciarse de la especie estrechamente
relacionada Enterobacter aerogenes por la prueba del rojo de metilo. Escherichia coli
produce suficientes ácidos cuando fermenta azúcares como para cambiar el rojo de
metilo desde amarillo a rojo, pero Enterobacter aerogenes no.

23
La producción tanto de ácidos como de gases a partir de una fuente de carbono en
particular puede ser muy informativa. Un microorganismo que produce ácidos y gases a
partir de la fermentación de lactosa posee una gran probabilidad de ser Escherichia coli.
Sin embargo, la formación de ácidos y gases a partir de lactosa es solo una
identificación presuntiva, cuya confirmación requiere de la intervención de pruebas
adicionales.

En términos bioquímico-fisiológicos las levaduras pueden diferenciarse en cuanto a su

crecimiento a distintas temperaturas (4 o 37°C), fermentación de compuestos
carbonados, asimilación de distintas fuentes de carbono o nitrógeno y formación de
compuestos amiloides extracelulares. Las soluciones para determinar características
fermentativas y asimilativas de compuestos carbonados emplean por lo general
azúcares como glucosa, maltosa o sacarosa, mientras que en la asimilación de
compuestos nitrogenados se utilizan sales como nitrato de potasio (KNO3) y sulfato de
amonio (NH4SO3) o aminoácidos como lisina o triptófano como única fuente de
nitrógeno.

24
 6. CRECIMIENTO MICROBIANO
En cualquier sistema bilógico, el crecimiento puede ser definido como el aumento
ordenado de todos los componentes químicos. El aumento de masa, por sí solo, podría
no indicar un crecimiento real, ya que las células podrían estar incrementando
únicamente su contenido en productos de reserva, tales como glucógeno o poli-β-
hidroxibutirato. En un medio adecuado, y al cual se han adaptado perfectamente, las
bacterias se encuentran en un estado de crecimiento equilibrado. Durante un periodo
de crecimiento equilibrado, una duplicación de la biomasa va acompañada de una
duplicación de todas las demás propiedades medibles de la población, por ejemplo,
proteínas, DNA, RNA y agua intracelular. En otras palabras, los cultivos en crecimiento
equilibrado mantienen una composición química constante. La existencia del
crecimiento equilibrado simplifica la tarea de medir la velocidad de crecimiento de un
cultivo bacteriano; como la velocidad de crecimiento de todos los componentes de una
población es la misma, la medida de cualquier componente basta para determinar la
velocidad de crecimiento.

6.1. Naturaleza y Expresión Matemática del Crecimiento

Un cultivo microbiano en crecimiento equilibrado imita una reacción autocatalítica de

primer orden; es decir, la velocidad de aumento de bacterias en un tiempo dado es
proporcional al número o masa de bacterias presentes en ese tiempo.

La constante de proporcionalidad, µ es un índice de la velocidad de crecimiento y, por

ello, se denomina constante de velocidad de crecimiento. Dado que suponemos que el
crecimiento es equilibrado, µ también relaciona la velocidad de crecimiento de cualquier
componente celular determinado con la cantidad de ese componente, lo que en
términos matemáticos es:

donde N es el número de células/mL, X es la masa de células/mL, Z es la cantidad de

cualquier componente celular/mL, t es el tiempo y µ es la constante de velocidad de
crecimiento. Estas ecuaciones describen adecuadamente el crecimiento de la mayoría
25
de los cultivos de bacterias unicelulares. Otras formas de ellas son más útiles en la
práctica, por ejemplo mediante su integración tenemos:

y al convertir los logaritmos naturales a decimales,

donde los valores de Z y Z0 corresponde a la cantidad de cualquier componente

bacteriano del cultivo en los tiempos t y t0, respectivamente. Midiendo Z y Z0, puede
calcularse el valor de µ, la constante de velocidad de crecimiento del cultivo. Así, si el
cultivo contiene 104 células/mL en t0 y 4 horas más tarde 108 células/mL, la velocidad
de crecimiento específica del cultivo es:

El valor de µ es suficiente para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo. No

obstante, también se utilizan a menudo otros parámetros. Uno de ellos es el tiempo de
duplicación promedio o tiempo de generación (g), que se define como el tiempo
requerido para que todos los componentes del cultivo aumenten en un factor de 2. La
relación entre g y µ puede deducirse, dado que si el intervalo de tiempo considerado (t-
t0) es igual a g, entonces Z equivaldrá el doble de Z0, teniéndose que:

En el ejemplo indicado, el tiempo de duplicación promedio es g = 0.693/2.303 = 0.42

horas, es decir, 25 minutos. Ésta es una velocidad de crecimiento relativamente alta
para una bacteria.

Las anteriores ecuaciones matemáticas del crecimiento bacteriano se han deducido a

partir de la premisa de que la velocidad de incremento es proporcional al número (o
masa) presente en cualquier momento dado. A partir de este supuesto, se demostró
que el tiempo de duplicación es constante durante un periodo de crecimiento
equilibrado.
26
6.2. Cinética de crecimiento microbiano

Si se inocula un microorganismo en un volumen fijo de medio de cultivo fresco y estéril,

el cual constituya un sistema cerrado (cultivo “Batch” o por Lotes), y se determina la el
logaritmo del número de células viables con respecto al tiempo, al graficar dichos datos
pueden distinguirse las fases del crecimiento microbiano, tal y como se muestra en la
figura 6.1:

I II III IV V VI VII VIII

Logaritmo del número de células

Tiempo

Figura 6.1. Fases de la cinética de crecimiento microbiano para un cultivo por lotes

I. Fase Lag o Fase de Latencia: Periodo de tiempo donde el cambio en el

número de células es cero.
II. Fase de Aceleración del Crecimiento: El número de células empieza a
incrementarse, la velocidad de división se incrementa hasta alcanzar su
máximo.
III. Fase de Crecimiento Exponencial: El número de células incrementa
exponencialmente cuando la célula comienza a dividirse. La velocidad de
crecimiento incrementa durante esta fase, pero la velocidad de división es
constante a su valor máximo.
IV. Fase de Desaceleración de Crecimiento: Se debe a la escases de
nutrientes, producción de compuestos inhibidores, depredadores, etc.

27
 V. Fase Estacionaria: La población celular alcanza su máximo valor y no
incrementa de nuevo, el número de células generadas es igual al número de
células que mueren.
VI. Fase de Aceleración Negativa de Crecimiento: Los nutrientes empiezan a
agotarse resultando en el inicio del declive de la población celular.
VII. Fase de Muerte: Después de que los nutrientes disponibles para el
crecimiento se han agotado, las células empiezan a morir y el número de
células viables disminuye.
VIII. Crecimiento Críptico: Algunas células sobrevivientes se adaptan a las
nuevas condiciones del medio y utilizan como nutrientes los restos de las
células muertas, iniciando nuevamente el crecimiento.

El estudio y descripción de la cinética de crecimiento microbiano se enfoca

principalmente en tres de las fases señaladas, debido a su aplicación e importancia en
procesos a nivel industrial: Lag, Exponencial y Estacionaria.

La fase Lag inicia después de la inoculación de un medio de cultivo estéril, constituye

un periodo de adaptación. La longitud de este periodo depende de muchos factores
tales como tipo y edad de los microorganismos, tamaño de inóculo y condiciones de
cultivo. La fase de latencia usualmente se presenta cuando las células deben ajustarse
al nuevo medio antes de que el crecimiento pueda iniciar. Cuando un cultivo microbiano
es transferido de un ambiente a otro, necesita reorganizar sus componentes micro- y
macromoleculares. Esto involucra la síntesis o represión de enzimas o componentes
estructurales de la célula. Si un microorganismo inicialmente se encuentra en un medio
de cultivo con bajas concentraciones de nutrientes y es inoculado en un medio con
elevada cantidad de nutrientes, por lo general la fase Lag será prolongada. Esto se
debe a que las células necesitan producir las enzimas necesarias para metabolizar los
nutrientes disponibles. En caso contrario, es decir, al pasar de un medio rico en
nutrientes a uno con escasa concentración, es muy probable que no se presente fase
Lag.

Otro factor importante que afecta la duración de la fase de latencia es el tamaño de

inóculo. Si se inocula una cantidad pequeña de células en un volumen grande, se
presentara una fase Lag larga. Para operaciones de cultivo de células a gran escala,
28
uno de los objetivos es garantizar que la fase Lag sea lo más corta posible. Por lo tanto,
el inóculo de un fermentador industrial, necesita realizarse a partir de una serie de
tanques de tamaño progresivamente grande para minimizar el efecto de la fase Lag.

La fase Exponencial es caracterizada e identificada por una línea recta en una gráfica
semilogarítmica donde se registra el logaritmo del número de células en el eje de las
ordenadas y el tiempo en el eje de las abscisas, matemáticamente se expresa como:

Lo cual predice una relación exponencial entre el número de células en la población (o

cualquier otra propiedad sujeta a medición) y el tiempo. Representa un periodo de
crecimiento durante el cual la velocidad específica de crecimiento (µ) es constante. Esto
significa que durante cada tiempo de duplicación, el número de células de la población
se duplica en un factor de dos. La razón por la cual se registra gráficamente el logaritmo
del número de células en lugar de su valor aritmético original es la siguiente: El número
de microorganismos de una población que aumenta exponencialmente se incrementa
lentamente al principio y luego muy rápidamente, por ejemplo, durante las tres primeras
duplicaciones de una sola célula sólo se producen siete nuevas células, durante la
séptima se originan 64 y durante la duplicación vigésimo primera 1 048 576. Si se
expresa esta curva en una escala aritmética, el incremento inicial apenas se apreciaría,
mientras que las fases de crecimiento posteriores dispararían la gráfica. En cambio, al
graficar el valor logarítmico, la curva se convierte en línea recta, con una pendiente
directamente relacionada con la tasa de crecimiento de la población. Dado el
comportamiento exponencial se tienen que el número total de células es igual a dos
elevado a un exponente, dicho exponente es el número de generaciones que han
transcurrido desde que la población comenzó a aumentar. La fórmula general es N = 2n,
donde N es el número de células en el cultivo después de que pasen n tiempos de
duplicación.

El crecimiento exponencial se encuentra limitado normalmente por el agotamiento de

los nutrientes disponibles o por la acumulación de productos tóxicos del metabolismo,
como consecuencia, la velocidad de crecimiento disminuye y el crecimiento llega a
detenerse. Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento

29
exponencial a altas velocidades durante largo tiempo. La razón es evidente si se
consideran las consecuencias del crecimiento exponencial. Una sola bacteria con una
masa aproximada de 10-12 gramos y un tiempo de generación de 20 minutos, tras 48
horas de crecimiento exponencial produciría una descendencia de 2.2×1031 gramos, es
decir, unas 4 000 veces la masa de la Tierra.

La fase Estacionaria tiene lugar cuando todas las células detienen su división o cuando
las células viables se encuentran en equilibrio con las células que mueren, es decir, la
velocidad de generación de nuevas células es igual a la velocidad de muerte. Durante
el tiempo de incubación posterior pueden ocurrir varias cosas. Después de que el
crecimiento neto ha cesado, tiene lugar la acumulación de productos dentro de la célula
y en el medio de cultivo, seguido de esto el metabolismo se detiene. La masa celular
total puede permanecer constante, pero es muy probable que el número de células
viables disminuya. Alternativamente, al reducirse la viabilidad, puede presentarse lisis
celular. Esto conduce a la formación de un medio complejo compuesto de sustancias
intracelulares, gracias a lo cual puede presentarse un periodo de crecimiento
secundario, denominado crecimiento críptico (VIII) en el que las células sobrevivientes
se adaptan para asimilar las sustancias presentes como nutrientes. Frecuentemente, se
forman metabolitos secundarios no esenciales por sistemas enzimáticos anteriormente
ausentes o fuera de funcionamiento. La composición macromolecular de la célula sufre
diversos cambios debido a las variaciones en cuanto a las demandas metabólicas
durante las distintas fases del crecimiento. Las células de la fase Estacionaria tienen
una composición química diferente a las de las células de la fase Exponencial. La
composición celular en la fase estacionaria depende del factor limitante específico del
crecimiento. A pesar de esto pueden hacerse algunas generalizaciones: las células en
fase Estacionaria son más pequeñas que en la fase Exponencial (dado que la división
celular continúa después que el incremento de masa se ha detenido), y son más
resistentes a agentes físicos (calor, frío, radiaciones) y químicos adversos. Algunos
microorganismos son capaces de formar endosporas (especies de Bacillus o
Clostridium principalmente) en respuesta a un ambiente restrictivo para el crecimiento.

La importancia en la determinación de la cinética de crecimiento de un microorganismo,

estriba en que representa una herramienta de gran utilidad para evaluar factores y

30
establecer parámetros del proceso fermentativo en cuestión, tales como temperatura,
pH, naturaleza y concentración de nutrientes en el medio de cultivo y el tiempo óptimo
de duración en base al tipo de metabolito que se desea obtener.

6.3. Rendimiento del crecimiento microbiano

La cantidad neta de crecimiento de un cultivo de microorganismos es la diferencia entre

la masa celular (o número de células) utilizada como inóculo y la masa celular (o
número de células) presente en el cultivo cuando se llega a la fase estacionaria.
Cuando el crecimiento se encuentra limitado por un nutriente determinado, existe una
relación lineal fija entre la concentración inicial de dicho nutriente y el crecimiento neto
resultante. La masa de células producida por unidad de nutriente limitante es, por
consiguiente, una constante (Y) denominada rendimiento (por la palabra yield en
inglés). El valor de Y puede calcularse a partir de mediciones del crecimiento total
mediante la ecuación:

Donde X es el peso seco/mL de las células cuando el cultivo entra en la fase

estacionaria, X0 el peso seco/mL inmediatamente después de la inoculación y S la
concentración de nutriente limitante.

El rendimiento puede determinarse para cualquier nutriente que se imponga y una vez
determinado puede emplearse para calcular la concentración de dicho nutriente en una
mezcla desconocida, midiendo que crecimiento soporta una muestra de la mezcla
desconocida cuando se añade a un medio completo en todos los aspectos en el
nutriente limitante. Este tipo de determinación se conoce como bioensayo.
Anteriormente se empleaba para determinar la concentración de aminoácidos y
vitaminas en alimentos. Ahora se han hecho más frecuentes los métodos químicos y
físicos, aunque el fundamento del bioensayo sigue siendo una herramienta de
investigación para detectar y cuantificar compuestos con actividades favorecedoras del
crecimiento. Para realizar un bioensayo solamente se requiere una cepa microbiana
para la cual la sustancia a ensayar sea un nutriente esencial.

31
En el caso de los microorganismos quimioheterotróficos, el rendimiento medio en
función de la cantidad de sustrato orgánico utilizado, suministra un índice de la
eficiencia de conversión del sustrato en masa bacteriana.

Cuando ciertos microorganismos fermentadores estrictos se cultivan en medios ricos, y

los experimentos con marcadores radiactivos muestran que poca o ninguna cantidad de
carbono del sustrato fermentable se convierte en material celular, implica que en estas
condiciones, el material celular proviene de los otros componentes del medio
(aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc.), y el sustrato fermentable sirve únicamente
como fuente de energía. El rendimiento en ATP de muchas fermentaciones es bien
conocido, y el rendimiento celular (gramos de peso seco) por mol de ATP producido
(YATP) es de unos 10 gramos de material celular/mol de ATP, lo que sugiere que la
energía requerida para polimerizar elementos estructurales carbonados a
macromoléculas no varía mucho entre diferentes microorganismos. Sin embargo, esta
constancia no se observa si se considera el rendimiento celular por mol de sustrato
fermentado, ya que distintos microorganismos pueden fermentar a un mismo sustrato
por rutas que difieren en el rendimiento de ATP. Zymomonas mobilis fermenta la
glucosa produciendo alcohol etílico a través de la ruta de Entner-Doudoroff,
produciendo 1 mol de ATP por mol de glucosa; las levaduras, por el contrario,
fermentan la glucosa a etanol mediante la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas,
produciendo 2 moles de ATP por mol de glucosa. Las levaduras producen
considerablemente más células por mol de glucosa fermentada que Zymomonas, pero
aproximadamente la misma cantidad por mol de ATP originado en la fermentación. La
constancia aproximada de YATP puede utilizarse para deducir el rendimiento de ATP de
una ruta desconocida.

6.4. Cultivo continuo de microorganismos

Las poblaciones microbianas pueden mantenerse en estado de crecimiento exponencial

durante un largo periodo de tiempo mediante la utilización de un sistema de cultivo
continuo, el cual está conectado a un depósito de medio de cultivo estéril. Una vez que
se ha iniciado el crecimiento, se añade medio fresco del depósito de manera continua.
El volumen en el recipiente de cultivo se mantiene constante eliminando el volumen en
exceso.
32
Si el medio fresco entra a velocidad constante, la concentración celular en el recipiente
de cultivo permanece también constante después de un periodo inicial de ajuste, pues
los microorganismos se reproducen lo suficientemente de prisa como para reemplazar a
los que se pierden por eliminación del volumen excedente. Si se cambia a velocidad de
alimentación de medio fresco, se produce otro periodo de ajuste, seguido por el
establecimiento de una población constante con una nueva concentración celular; la
velocidad de crecimiento varía para compensar la nueva velocidad de pérdida de
células. Un sistema de cultivo continuo responde de esta manera a una amplia
variación de velocidad de entrada del medio fresco. Sin embargo, cualquiera que sea la
velocidad de entrada del medio, los microorganismos no pueden crecer más
rápidamente de lo que lo harían en un cultivo discontinuo.

La razón por la cual la velocidad de adición de medio fresco determina la velocidad de

crecimiento del cultivo, se debe al hecho de que la velocidad de crecimiento en un
cultivo continuo está siempre delimitada por la concentración de uno de los nutrientes;
el sistema se encuentra autorregulado. Supóngase un cultivo continuo que opera a una
velocidad constante de adición de medio fresco. Tras la inoculación, el cultivo crecerá a
la máxima velocidad (µmax). A medida que aumente la densidad poblacional del cultivo,
la velocidad de utilización de los nutrientes aumentará hasta que el agotamiento de uno
de los nutrientes empiece a limitar la velocidad de crecimiento. Mientas la velocidad de
crecimiento exceda la velocidad de perdida por eliminación de volumen excedente, la
densidad continuará aumentando, la concentración de nutriente limitante continuará
disminuyendo y, en consecuencia, la velocidad de crecimiento se reducirá hasta que la
velocidad de incremento de células por crecimiento iguale exactamente la velocidad de
pérdida por exceso. Si la velocidad de crecimiento se hiciera momentáneamente menor
que la velocidad de pérdida de células, la densidad de población disminuiría,
aumentaría la concentración de nutriente limitante y la velocidad de crecimiento se
incrementaría hasta que se alcance de nuevo el equilibrio entre la velocidad de
crecimiento y la pérdida de células.

Al considerar el hecho de que en un cultivo continuo la concentración celular

permanece constante y es autorregulable, el sistema puede describirse en términos
matemáticos como:

33
 Velocidad de Producción Velocidad de Perdida de
= Células por Exceso de
de Células en Crecimiento
Volumen

Anteriormente se describió la velocidad de producción de masa microbiana (dX/dt)

como:

La velocidad de pérdida de células por eliminación de volumen en exceso (dX/dt) puede

expresarse como:

Donde la velocidad de flujo (f) se mide en volúmenes de cultivo (V) por hora.
Despejando la tasa de dilución (D), se tiene:

Despejando µ de la ecuación de velocidad de producción de masa microbiana, resulta:

Por tanto, µ = D, es decir, la velocidad de crecimiento es igual a la tasa de dilución en

un sistema estabilizado de cultivo continuo.

Existe un claro ejemplo de sistema de cultivo continuo en la naturaleza; el aparato

digestivo de los rumiantes, de los cuales, con los que más estamos familiarizados son
los bovinos. El rumen de una vaca funciona como un quimiostato, pues los nutrientes
llegan de forma continua y los microorganismos crecen sin parar, y parte de su
contenido pasa continuamente al sistema digestivo. Esto no significa que las vacas
estén siempre comiendo, por el contrario, los rumiantes aportan nutrientes al rumen de
manera regular masticando el forraje regurgitado. Cunado mastican, fluyen al rumen
fragmentos de forraje suspendidos en saliva. La vaca no rumia siempre que esté
comiendo, pero el aporte de nutrientes al rumen es esencialmente continuo porque los

34
fragmentos sólidos de celulosa actúan como reservorio de nutrientes para los
microorganismos.

6.5. Influencia de la Concentración de Nutrientes en la Velocidad de

Crecimiento

Durante las fermentaciones, la velocidad de crecimiento puede considerarse análoga a

la velocidad de una reacción química, la cual se encuentra en función de la
concentración de los reactivos que intervienen en ella. En el caso del desarrollo
microbiano, dichos reactivos están representados por los nutrientes esenciales o
sustratos necesarios para el crecimiento. La relación existente entre la velocidad de
crecimiento y la concentración de sustratos fue descrita por Monod (1949), siendo
similar a la cinética de saturación que exhibe la adsorción monomolecular. De esta
manera, puede aplicarse al crecimiento microbiano un modelo similar al de una
isoterma tipo Langmuir. El modelo de Monod está representado mediante:

donde µ es la velocidad específica de crecimiento, µmax es la velocidad específica de

crecimiento máxima, S es la concentración de sustrato, y Ks es una constante que
equivale a la concentración de sustrato cuando µ = 0.5 µmax.

Los valores de Ks tienden a ser pequeños (1-120 mg/L). Se ha observado que µ ~ µmax
cuando S > 10Ks, no siendo así cuando S < 10Ks, lo que indica que la velocidad
específica de crecimiento se encuentra estrechamente relacionada con la concentración
de sustrato. Debido a que los valores de Ks son bajos, la velocidad específica de
crecimiento durante la fase exponencial es constante. El periodo de transición entre la
fase exponencial y la estacionaria es usualmente corto o abrupto, pues la elevada
concentración celular consume rápidamente la poca cantidad disponible de sustrato
residual. Por esta razón se torna muy difícil calcular los valores de K s en cultivos por
lotes. Sin embargo, es posible emplear la velocidad inicial, momento en el que se
consumen cantidades reducidas de sustrato y donde la velocidad de crecimiento inicial
es cuantificada antes de que los cambios en la concentración de sustrato sean
significativos.

35
El modelo de Monod se basa en observaciones empíricas pero frecuentemente es
racionalizado por su analogía con el modelo de cinética enzimática de Michaelis-
Menten, con la hipótesis de que el crecimiento está determinado por la velocidad
limitante de catálisis enzimática. Además, algunos factores con significado físico y
biológico pueden atribuirse a las dos constantes; µmax es la velocidad específica de
crecimiento máxima en un determinado medio de cultivo a una temperatura y pH
específicos, y Ks es inversamente proporcional a la afinidad del microorganismo por el
sustrato. Existen otros modelos que explican la relación entre la velocidad de
crecimiento y la concentración de sustrato, pero el de Monod es el más comúnmente
usado.

El principal aporte de la determinación de Ks se emplea en sistemas de cultivo continuo

donde µ = D, por lo tanto:

y despejando S:

Lo cual establece la relación fundamental entre la concentración de sustrato y la tasa de

dilución.

Durante el funcionamiento de un cultivo continuo en el cual se mantiene de una

densidad de población estabilizada, la concentración del nutriente limitante (S) también
permanece constante. Por lo tanto, la velocidad de adición del nutriente debe igualar la
velocidad a la cual es utilizado por el cultivo junto con la pérdida por eliminación de
volumen excedente:
(Sustrato Añadido) = (Sustrato Usado para Crecimiento) + (Sustrato Perdido por
Exceso)
es decir;

36
donde Sr es la concentración del nutriente limitante en el depósito y dc/dt es la
velocidad de utilización del nutriente limitante en el crecimiento. Sustituyendo dc/dt por
(dX/dt) (dc/dX), y puesto que dX/dt=µX y ds/dx=1/Y, se tiene:

Durante un estado estable, D=µ, por lo que al despejar X se obtiene:

lo que determina la relación fundamental entre la densidad de población (X) y la

concentración del nutriente limitante (S) en el recipiente de cultivo. Cuando la tasa de
dilución se aproxima a µmax, la densidad de población desciende rápidamente a cero, y
la concertación de nutriente limitante se aproxima a su concentración en el depósito
(Sr).

6.6. Metabolitos Primarios y Secundarios

Los metabolitos primarios se forman durante la fase exponencial del crecimiento

microbiano y constituyen productos finales de las rutas metabólicas, de bajo peso
molecular y que son usados como bloques constituyentes de macromoléculas
esenciales. Los de mayor importancia son los aminoácidos, nucleótidos de purinas y
pirimidinas, y las vitaminas. Los intermediarios en las rutas biosintéticas de estos
productos finales también son considerados metabolitos primarios, por ejemplo los
intermediarios de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas, la ruta de las pentosas fosfato y
el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Mediante esta interpretación, los ácidos orgánicos
como el ácido cítrico y fumárico son considerados metabolitos primarios. La
sobreproducción de metabolitos primarios es evitada por muchos microorganismos
pues representa un desgaste innecesario de energía y nutrientes disminuyendo su
habilidad o capacidad de sobrevivir en la naturaleza. Sin embargo, algunos organismos
pueden sobrevivir al controlar defectos en su mecanismo regulatorio, y estos
sobreproductores son los cultivos elegidos en programas designados al aislamiento de
cepas con potencial fermentativo y biotecnológico-industrial, sometiéndose a estudios
intensivos de desarrollo en los cuales se emplean modificaciones genéticas y
ambientales para disminuir su regulación e incrementar la sobreproducción.
37
Los metabolitos secundarios se generan durante la fase estacionaría del crecimiento y
son moléculas sintetizadas por ciertos microorganismos, usualmente lentos en su ciclo
de crecimiento. Aunque no se requieren para el desarrollo, es decir no son
indispensables para el crecimiento, estos metabolitos pueden tener valor para la
supervivencia de los organismos que los producen. Comúnmente son producidos como
mezclas de sustancias químicas estrechamente relacionadas que pertenecen a la
misma familia. Por ejemplo, existen 3 neomicinas, 5 mitomicinas, 10 bacitracinas, 6
tirocidinas, 8 aflatoxinas, 10 polimixinas, más de 20 penicilinas y 20 actinomicinas. Cada
una es producida por un estrecho rango taxonómico de organismos y su habilidad de
producción puede perderse fácilmente por mutación (degeneración de cepas).

Entre los metabolitos secundarios mejor conocidos se encuentran antibióticos,

micotoxinas y pigmentos. Se han identificado alrededor de 2 000 antibióticos, de los
cuales 1500 son producidos por actinomicetos. Algunas especies se identifican y son
reconocidas por su habilidad de producir antibióticos, por ejemplo las cepas de
Streptomyces griseus producen más de 40 antibióticos.

38
EXPERIMENTOS
 I. BACTERIAS
Bacterias del Ácido Láctico

Las bacterias del ácido láctico (BAL) comprenden los géneros Lactococcus,
Lactobacillus, Carnobacterium, Streptococcus, Enterococcus y Pediococcus (tabla I.I),
entre otros, y poseen la habilidad de producir grandes cantidades de éste ácido a partir
del azúcar. El descenso del pH resultante hace que el medio en que han crecido sea
inadecuado para la mayoría de los otros microorganismos, por lo que el desarrollo de
las bacterias acidolácticas constituye una manera de conservación de alimentos,
además, producen componentes del aroma.

Tabla I.I Principales bacterias acidolácticas

Microorganismo Proceso Producto
Involucrado
Lactobacillus bulgaricus Fermentación de ácido Mantequilla
láctico
Lactobacillus bulgaricus Fermentación de ácido Yogur
Streptococcus thermophilus láctico e hidrólisis de
proteínas
Streptococcus lactis, L. Fermentación de ácido Kefir
bulgaricus láctico
S. lactis o S. cremoris Ácido láctico inicial Quesos en general
(35°C)
Lactobacilos acidolácticos
varios (42°C)
Propionibacterium spp. Fermentación del ácido Queso suizo
propiónico

Estas bacterias son débilmente proteolíticas y lipolíticas, con una ligera tendencia a
producir sabores pungentes. Están presentes de manera natural en el intestino, por lo
que actualmente son denominadas como probióticos. Los probióticos son organismos,
principalmente lactobacilos y bifidobacterias, las cuales son agregados a la dieta para
por enriquecer el nivel de la densidad de la microflora intestinal, un ejemplo de ello es
su incorporación al yogurt. 40
Junto con las levaduras empleadas en panificación y cervecería, las baterías del ácido
láctico son catalogadas como microorganismos GRAS, sin embargo, algunas cepas son
patógenas. Joseph Lister fue el primero en aislar una bacteria acidoláctica en 1873.
Este organismo al que actualmente se hace referencia como Lactococcus lactis es una
de las especias de mayor importancia en la fermentación de productos lácteos.

Existen 16 géneros de BAL, de las cuales 12 presentan actividad en contextos

relacionados a alimentos. Son bacterias Gram-positivas, en forma de bacilos. La
mayoría son mesófilos, pero algunos pueden crecer a temperaturas tanto bajas (4°C)
como altas (45°C). Generalmente prefieren el rango de pH de 4.0-4.5, pero
determinadas cepas pueden tolerar y crecer a pH´s mayores a 9.0 o menores a 3.2.
Necesitan factores de crecimiento como purinas, pirimidinas, aminoácido y vitaminas.
Las bacterias del ácido láctico no presentan un ciclo de los ácidos tricarboxílicos
funcional o una cadena respiratoria de transferencia de electrones, emplean la
fosforilación a nivel de sustrato para generar la energía que requieren.

Su metabolismo puede ser clasificado de dos maneras: homofermentativo, donde el

ácido representa el 95% del total de los productos finales; o heterofermentativo, en el
cual se produce ácido acético, etanol y dióxido de carbono junto con el ácido láctico.

Se ha encontrado que muchas BAL secretan pequeños péptidos de síntesis ribosomal

con actividad antimicrobiana, a los cuales se les ha denominado bacteriocinas. En
mayor medida, estos péptidos son catiónicos de carácter anfipático que se insertan en
las membranas de bacterias estrechamente relacionadas, causando la formación de
poros, evitando el mantenimiento del metabolismo, y propiciando finalmente la muerte.
De estos agentes, el mejor conocido es la nisina, la cual ha sido sustancialmente
empleada como un agente antimicrobiano “natural”. Además de secretar bacteriocinas
muchas de las bacterias de este tipo tiene la capacidad de inhibir el desarrollo de
microorganismos patógenos a través de compuestos como ácido láctico, diacetilo y
peróxido de hidrogeno. Una de las ventajas de emplear estas bacterias es que se han
usado por siglos en la elaboración de alimentos fermentados, considerándose como
inocuas por la FDA (Food and Drug Administration), lo cual permite su aplicación en la
41
industria alimentaria.
 I.I Aislamiento y Obtención de Cultivos Axénicos

I.I.I Objetivos

Objetivo General

Obtener de manera aislada y en forma de cultivo puro cepas de bacterias Gram-

positivas y Gram-negativas mediante la técnica de siembra en placa por estría cruzada.

Objetivos específicos

- A partir de heces fecales obtener un cultivo axénico de Escherichia coli.

- Aislar cepas de bacterias acidolácticas a partir de muestras de leche sin
pasteurizar o de productos lácteos como quesos frescos o yogurt.
- Identificarlas las especies microbianas en base a parámetros bioquímicos y
morfológicos macro- y microscópicos.

I.I.II Materiales

Material Biológico

- 10 g de heces fecales de animales domésticos

- 10 g de leche sin pasteurizar o de un producto lácteo

Material y Equipo

- Algodón
- Asa de platino
- Cuchara estéril
- Tubos de ensaye
- Cajas de Petri estériles
- Matraces Erlenmeyer de 250 mL
- Mecheros Fisher
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa

Medios de Cultivo

- Agar EMB
- Caldo nutritivo
- Agar Lactobacillus MRS
- Caldo para bacterias acidolácticas

43
Medios Para Pruebas Bioquímicas

- Agar Hierro Triple Azúcar (TSI)

- Agar Hierro-Lisina (LIA)
- Agar Citrato de Simmons
- Medio Voges Proskauer
- Medio SIM
- Urea

I.I.III Métodos

1.- Empleando una cuchara estéril, colocar 5 g de muestra en 45 mL de caldo nutritivo

(heces fecales) o en 45 mL de caldo para bacterias acidolácticas (producto lácteo)
según sea el caso. Incubar a 37°C por 24 h.

2.- Dependiendo de la muestra, sembrar por estría cruzada 2 cajas de Petri con agar
EMB (heces fecales) o agar Lactobacillus MRS (producto lácteo). Incubar a 37°C por 24
h.

3.- Examinar las colonias presentes. En el caso de la muestra de origen fecal identificar
colonias aisladas de color verde brillante con centro negro características de bacterias
coliformes (Escherichia coli). Respecto a la muestra de origen lácteo, las colonias de
interés se presentan de color blanco-amarillo con aspecto cremoso.

Elegir una colonia con las características mencionadas, y empleando un asa de platino
perfectamente esterilizada a la flama del mechero, inocular con ella 15 mL de caldo
nutritivo o caldo para bacterias acidolácticas según sea el caso. Incubar a 37°C por 24
h.

4.- A partir del nuevo cultivo, sembrar nuevamente por estría cruzada 2 cajas de Petri
con el medio de cultivo correspondiente (EMB o Lactobacillus MRS). Incubar a 37°C por
24 h. Pasado el tiempo de incubación, examinar las colonias presentes confirmando
que tengan la misma morfología, sugiriendo que se trata de un cultivo puro o en su
defecto semipuro.

5.- Al término de los pasos 1 y 4 tomar una gota del cultivo y una colonia aislada
respectivamente, observar en fresco directamente al microscopio y enseguida realizar
tinción de Gram.

44
6.- Aplicar pruebas bioquímicas para identificar el microorganismo en cuestión.

7.- Una vez comprobado que se trata de un cultivo puro, sembrar en tubo inclinado con
agar nutritivo para las especies de origen fecal y agar Lactobacillus MRS para las de
origen lácteo. Incubar a 37°C por 24 h y almacenar a una temperatura de 5-10°C.

45
 I.II Cinética de Crecimiento Bacteriano

I.II.I Objetivos

Objetivo General

Obtener la representación gráfica e identificar las fases del crecimiento bacteriano para
un cultivo por lotes mediante técnicas turbidimétricas.

Objetivos Específicos

- Establecer el tiempo de duración de la fase Lag y Exponencial de dos

microorganismos de distinta naturaleza y comparar ambos comportamientos.
- Determinar la velocidad específica de crecimiento máxima (µmax) y el tiempo
de generación (g) durante la fase exponencial de ambos microorganismos.

I.II.II Materiales

Material Biológico
- Cultivo axénico de Escherichia coli
- Cepa previamente aislada de bacteria acidoláctica
Material y Equipo
- Algodón
- Perillas
- Pipetas estériles de 10 mL
- Matraz Erlenmeyer de 125 mL
- Matraz Erlenmeyer de 300 mL
- Mecheros Fisher
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa
- Espectrofotómetro

Medios de Cultivo
- Caldo nutritivo
- Caldo para bacterias acidolácticas

46
 I.II.III Métodos

1.- Inocular 10 mL de medio de cultivo con el microorganismo correspondiente (caldo

nutritivo para Escherichia coli y caldo para bacterias acidolácticas en el caso de una
cepa de este tipo). Incubar a 37°C durante 24 h.

2.- Transferir 1 mL del cultivo anterior a un matraz Erlenmeyer con 100 mL del mismo
caldo (tiempo cero).

3. Homogenizar el inóculo en el medio y mantenerlo en incubación a 37°C con una

velocidad de agitación de 100 rpm.

4.- Medir la variación de la densidad óptica (absorbancia en función del tiempo) cada 20
minutos en un Espectrofotómetro, a una longitud de onda de 540 nm durante 300
minutos aproximadamente. Como blanco emplee una muestra estéril del medio de
cultivo correspondiente.

5.- Registrar los datos en la tabla siguiente y graficar el logaritmo natural de la

absorbancia (Ln A 540nm) en función del tiempo, colocando el primer valor en el eje de
las ordenadas y el segundo en el eje delas abscisas. Determinar µmax y g en base a la
ecuación de la recta para la fase de crecimiento exponencial.

Tiempo (minutos) Absorbancia 540 nm

0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300

47
 I.III Elaboración de Yogurt

I.III.I Objetivos

Objetivo general

Llevar a cabo la fermentación de leche entera previamente pasteurizada empleando

bacterias productoras de ácido láctico.

Objetivo específico

- Comparar las capacidades fermentativas de las bacterias acidolácticas que se

encuentran de manera natural en leche entera sin pasteurizar con las de un
cultivo comercia para la elaboración de yogurt.

I.III.II Materiales

Material Biológico

- Cultivos de bacterias acidolácticas previamente aisladas e identificadas a partir

de leche entera (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus)
- Cultivo comercial para la elaboración de yogurt.
Nota: En caso de no contar con cultivos liofilizados de alguna casa comercial, es
posible aislar los microorganismos de yogurt natural comercial para realizar el análisis
comparativo.

Material y Equipo

- Perillas
- Algodón
- Pipetas estériles de 10 mL
- Matraz Erlenmeyer de 250 mL
- Matraz Erlenmeyer de 1 000 mL
- Mecheros Fisher
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa
- Potenciómetro
- Bureta o bureta automática

48
Medios de Cultivo

- Leche entera

Reactivos

- NaOH 0.1 N
I.III.III Métodos

1.- Por duplicado, pasteurizar 50 mL de leche entera en matraces Erlenmeyer

esterilizados de 250 mL.

2.- Asegurando que la leche se encuentre a una temperatura entre 42-44°C inocular
uno de los matraces con bacterias acidolácticas provenientes de leche entera (cepas
silvestres), y el matraz restante con el cultivo comercial liofilizado o aislado a partir de
yogurt natural. Incubar durante 24 horas a una temperatura de 43°C. Esto constituirá el
preinóculo.

3.- En matraces Erlenmeyer esterilizados de 1 000 mL, pasteurizar por duplicado 600
mL de leche entera.

4.- Después de la pasteurización mantener los matraces a una temperatura de 43°C.

Verter el contenido de los matraces de 250 mL al interior de los matraces de 1 000 mL,
agitar para asegurar una incorporación homogénea del preinóculo. Colocar en
incubación a una temperatura de 43°C. Considerar este momento como el tiempo cero.

5.- Realizar determinaciones de pH y acidez titulable cada 30 minutos durante 7 horas o

hasta obtener un valor de pH entre 4.0-4.5.

6.- Representar gráficamente los datos obtenidos, colocando en el eje de las ordenadas
los valores de pH o acidez titulable y en el eje de las abscisas el tiempo.

49
 I.IV Influencia de la Composición del Medio de Cultivo
en el Crecimiento Bacteriano

I.IV.I Objetivos

Objetivo general

Comparar el crecimiento de E. coli, en medios de cultivo cuyo sustrato disponible como

fuente de carbono y energía sea distinto.

Objetivos específicos

- Obtener los perfiles de crecimiento de E. coli en medios de cultivo de

composición distinta, al emplear glucosa y sacarosa como única fuente de
carbono y energía.
- Determinar y comparar los perfiles de consumo bacteriano de glucosa y
sacarosa.

I.VI.II Materiales

Material Biológico

- Cultivo previamente aislado de E. coli

Material y Equipo

- Perillas
- Algodón
- Pipetas estériles de 5 y 10 mL
- Matraz Erlenmeyer de 250 mL
- Mecheros Fisher
- Espectrofotómetro
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa

50
Reactivos

- Glucosa
- Sacarosa
- NH4Cl
- K2SO4
- MgCl2
- K2HPO4

I.VI.III Métodos

1.- Prepare un preinóculo de E. coli en caldo nutritivo, como se describe en el punto

número 1 de la metodología del experimento I.II.

2.- En matraces Erlenmeyer de 250 mL prepare por triplicado 100 mL de un medio de

cultivo con glucosa como única fuente de carbono y otro con sacarosa como única
fuente de carbono (al final deberá contarse con seis matraces, tres de cada medio de
cultivo). Considere la siguiente composición celular y una concentración celular final de
1 g/L.

Elemento Porcentaje en la Célula Fuente

Carbono 50 Glucosa o Sacarosa
Nitrógeno 14 NH4Cl
Fósforo 2 K2HPO4
Azufre 1 K2SO4
Magnesio 0.5 MgCl2

Una vez preparados manténgalos a una temperatura de 37°C.

De estos seis matraces, dos serán conservados para emplearse como blancos en las
determinaciones turbidimétricas.

3.- Inocule cuatro matraces con 1 mL del preinóculo preparado anteriormente (tiempo
cero), y colóquelos en incubación a 37°C y agitación de 100 rpm.

51
4.- A dos de los matraces (uno de cada medio de cultivo), determine la variación de la
densidad óptica (absorbancia en función del tiempo) cada 20 minutos en un
Espectrofotómetro, a una longitud de onda de 540 nm durante 300 minutos
aproximadamente. Grafique el logaritmo natural de la absorbancia (Ln A 540nm) en
función del tiempo, colocando el primer valor en el eje de las ordenadas y el segundo
en el eje delas abscisas. Determine µmax y g para cada uno de los medios de cultivo.

5.- A los dos matraces restantes determine, cada 30 minutos y por el mismo periodo de
tiempo, la concentración de azúcares reductores por el método DNS. Grafique los datos
obtenidos de concentración con respecto al tiempo, colocando de igual manera el
tiempo en el eje de las abscisas y la concentración de azúcares reductores en el eje de
las ordenadas. Investigue como determinar el valor aproximado de Ks para un cultivo
por lotes.

52
 II. MOHOS
Los hongos se encuentran ampliamente distribuidos por todo el globo terrestre y viven
en cualquier sitio que presente material orgánico, agua y una temperatura apropiada,
comprendida generalmente entre 4 y 60 °C, desde el nivel del mar hasta altitudes de
más de 4 000 m, en donde se encuentran los últimos vestigios de vegetación, en los
lugares más húmedos hasta los sitios semidesérticos y aún desérticos en las épocas en
que puede haber ligera humedad en los suelos.

A nivel industrial los hongos presentan usos muy diversificados, como son la obtención
de alimentos, bebidas, condimentos, complementos alimenticios, alcohol industrial,
ácidos orgánicos, antibióticos, esteroides, vitaminas, enzimas, alcaloides y pigmentos.

En cuanto a la producción de alimentos relacionados con la intervención de hongos se

tiene la elaboración de quesos, pan, vino, cerveza y gran variedad de productos
fermentados tradicionales de grupos étnicos en muchas partes del mundo.

En la maduración de quesos con hogos intervienen principalmente cepas del género

Penicillium. P. camembertii y P. candidum crecen en el queso brie y en el camembert,
P. roqueforti o P. glaucum en el roquefort, en el belu, en el gorgonzola, en el stilton y en
el danés azul. El crecimiento de los mohos en los quesos genera los compuestos de
aroma y sabor que distinguen a cada tipo, principalmente ácidos grasos y metilcetonas,
que derivan de la acción enzimática sobre las grasas de la leche cuajada.

En la elaboración de algunas bebidas alcohólicas a partir de granos, por ejemplo el

sake o “vino” de arroz (que en realidad se asemeja más a una cerveza por el alto
contenido de almidón del arroz), intervienen mohos capaces de producir enzimas que
hidrolicen el almidón para generar azúcares fermentables, disponibles para que las
levaduras produzcan alcohol, en el caso particular del sake se recurre a Aspergillus
oryzae. Este proceso se conoce como Sacarificación-Fermentación Simultaneas.

Los alimentos fermentados tradicionales se elaboran a partir de diversos productos

vegetales, como cereales, leguminosas, frutas y residuos agrícolas, o de productos
animales como leche, carne y pescado. Tienen mayor valor nutritivo debido al aumento
en el contenido de aminoácidos esenciales y vitaminas originado por los cambios
bioquímicos que suceden durante la fermentación, son de mejor digestibilidad,
53
apariencia, durabilidad y gusto que las materias primas utilizadas como sustratos para
el desarrollo de los microorganismos responsables de la fermentación.

Como se mencionó anteriormente, además de alimentos, los hongos son la base de la

obtención de gran variedad de productos a nivel industrial, dentro de los cuales se
encuentran los ácidos orgánicos. El de mayor importancia es sin duda el ácido cítrico
cuya demanda asciende a varios miles de toneladas por año. La mayor parte se emplea
en la fabricación de drogas y medicamentos (65%), seguido por las industrias de los
alimentos, bebidas y dulces (poco más del 10%) y el resto se destina al área textil. El
ácido cítrico se produce industrialmente por fermentación de soluciones de sacarosa
con carbonato de calcio utilizando el moho Aspergillus niger, aunque existen varias
especies de mohos capaces de producir ácido cítrico solo A. niger se considera de
importancia industrial. También se producen industrialmente otros ácidos orgánicos
como gálico fermentando extractos tánicos con A. niger y que se utiliza en la fabricación
de colorantes. Ácido láctico por acción de Rhizopus oryzae y que en el mismo proceso
rinde también ácido málico, succínico y fumárico. El ácido láctico se emplea para
acidular jamones y dulces, en el curtido de pieles en la industria textil y para bajar el pH
en medios de cultivo para microorganismos. Por otro lado tenemos el ácido Oxálico,
que se obtiene de manera similar al ácido cítrico a partir de A. niger, pero ajustando el
pH del medio a valores más altos e incrementando la concentración de sales, se utiliza
en el blanqueado y teñido de textiles, en la eliminación de manchas de ácido férrico y
en la limpieza de radiadores de automóviles.

En el área de los medicamentos existen seis géneros de hongos filamentosos que

producen casi 1 000 antibióticos diferentes. Entre ellos se encuentra especies de
Penicillium productoras de penicilinas y griseofulvinas, y de Cephalosporium que
sintetiza cefalosporinas. Las cepas de Penicillium empleadas industrialmente en la
producción de penicilina son P. notatum y P. chrysogenum.

Entre las enzimas producidas por mohos encuentran las siguientes:

Amilasas: Actúan sobre almidones. Se usan en la fabricación de adhesivos, en la

eliminación de aprestos de fibras textiles y del almidón de la crema de manzana en
la obtención de pectinas y en las industrias farmacéutica y alimentaria. Son

54
producidas por Mucor racemosus, M. rouxii, Rhizopus oryzae, Aspergillus flavus, A.
niger y A. oryzae.

Proteasas: Proteinasas y peptidasas que intervienen en el desengomado de

artículos de seda, en el pelado, curtido o preparación de cueros, en la fabricación de
cola líquida, como aditivos de detergentes y en la industria panadera. Son
sintetizadas por Thamnidium elegans, Mortierella renispora y A. flavus.

Pectinasas: Comprenden pectinesterasas y poligalacturonasas ampliamente

aplicadas a la clarificación de jugos de frutas, en la obtención de fibras de lino y
henequén. Generadas por Aspergillus candidus y otras especies del mismo género.

Lipasas: Administradas a pacientes con digestión deficiente. A. niger

Renina: Precipitación de la caseína de leche en la elaboración de quesos. A. niger y

A. oryzae.

55
 II.I Aislamiento de Hongos

II.I.I Objetivos

Objetivo General

Obtener un cultivo axénico de hogos empleando el método de diluciones y la técnica

de siembra por extensión en superficie.

Objetivo Específico
Aislar un moho del género Aspergillus con posible capacidad para producir ácido cítrico.

II.I.II Materiales

Material Biológico
- Muestra de alimento con indicios de crecimiento de mohos o en su defecto
muestras de suelo de diversas fuentes.
Material y Equipo
- Algodón
- Asa de platino
- Cuchara estéril
- Cajas de Petri
- Tubos de ensaye
- Bolsas estériles para toma de muestras
- Pipetas estériles de 1, 5 y 10 mL
- Varillas de vidrio acodadas estériles
- Matraces Erlenmeyer de 250 mL
- Mechero Fisher
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa

Medios de Cultivo

- Peptona
- Agar Dextrosa y Papa (PDA)

56
 II.I.III Métodos

1.- Rotular tubos de ensaye con el número de dilución desde 10-2 hasta 10-5.

2.- Empleando una cuchara estéril, y cerca de la flama del mechero tomar
aproximadamente 10g de muestra (no es necesario pesar pues solo se desea obtener
colonias aisladas, no determinar la densidad microbiana de la muestra) y colocarla
dentro de la bolsa para toma de muestras.

3.- Verter dentro de la bolsa 90 mL de solución peptonada estéril, cerrar

cuidadosamente y agitar.

4.- A continuación realizar diluciones hasta 10-5. Recordar que en el paso anterior se
efectuó la dilución 10-1.

5.- Sembrar por extensión en superficie las diluciones 10-1, 10-3 y 10-5, colocando 0.1 mL
de cada dilución en una caja de Petri con medio PDA y distribuyendo el inóculo
empleando una varilla de vidrio acodad estéril. Asegurarse que la muestra quede
distribuida de forma homogénea.

6.- Rotular las cajas de Petri indicando número de equipo, medio de cultivo y dilución
con la cual se inoculó.

7.- Incubar a 25-30°C por 24-48 horas.

8.- Con un asa de platino doblada en ángulo de 90°, resembrar por picadura en medio
PDA las colonias que se presenten aisladas, preferentemente las que de manera
presuntiva, por su morfología, pertenezcan al género Aspergillus.

9.- Incubar nuevamente a 25-30°C por 24-48 horas.

10.- Una vez desarrolladas las colonias es preciso asegurarse de tener solamente un
tipo de microorganismo, de ser así, para evitar la propagación de esporas coloque cinta
adhesiva por toda la orilla de la caja de Petri y almacene en refrigeración (5-7°C) para
usos posteriores. No olvide rotular como se indicó anteriormente.

11.- En caso de no contar con un cultivo axénico, repita la siembra por picadura hasta
que solo se desarrolle un único microorganismo.

57
 II.II Caracterización Morfológica Macro y Microscópica
y Evaluación de Parámetros Cinéticos

II.II.I Objetivos

Objetivos Generales

Identificar el género (y de ser posible la especie) al que pertenece un hongo

previamente aislado y evaluar su crecimiento radial en dos medios de cultivo sólidos de
distinta composición.

Objetivos Específicos

Mediante la técnica de microcultivo identificar y caracterizar un moho en base a su

estructura microscópica (tipo de hifa, esporulación, etc.) y criterios de morfología
colonial. Así como también comparar su crecimiento radial en Agar Dextrosa y Papa y
Agar Czapeck Dox.

II.II.II Materiales

Material Biológico

- Cepa purificada de un hongo en medio de cultivo sólido.

Material y Equipo

- Algodón
- Bisturí
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Cajas Petri
- Asa de platino
- Pinzas de disección
- Varillas de vidrio en forma de “V”
- Mechero Fisher
- Incubadora
- Estufa
- Autoclave

Reactivos
- Fenol al 10 %
- Glicerol al 10%
- Azul de algodón con lactofenol

58
Medios de Cultivo

- Agar Czapek Dox

- Agar Dextrosa y Papa (PDA)

II.II.III Métodos

Microcultivo

1.- Para realizar un microcultivo se requiere de una caja Petri que contenga una varilla
de vidrio doblada en forma de “V”, un portaobjetos y un cubre objetos. Esto debe ser
previamente esterilizado mediante calor seco. Una vez listo este material, el primer
paso es ordenar el interior de la caja Petri: Empleando unas pinzas para disección
(esterilizadas a la flama del mechero) colocar el portaobjetos sobre la varilla doblada en
forma de “V” y el cubreobjetos en uno de los extremos del portaobjetos, a manera de
hacer el sistema ergonómico y facilitar su manipulación. Es preciso trabajar en el radio
de protección del mechero para conservar condiciones de esterilidad.

2.- A partir de una caja Petri previamente preparada con agar PDA y empleando un
bisturí estéril, cortar el medio de cultivo sólido en cuadros con un tamaño aproximado 1
cm2.

3.- Colocar un trozo de agar en el centro del portaobjetos, dentro de la caja Petri
señalada en el punto número 1.

4.- Enseguida tomar un asa de platino doblada en ángulo de 90°, tomar el inóculo del
hongo que se desea observar y sembrar por picadura a lo largo de las partes laterales
del agar.

5.- Colocar sobre el agar el cubre objetos que se ubicó previamente en uno de los
extremos del portaobjetos.

6.- Agregar en el fondo de la caja Petri de 5 – 10 mL de glicerol estéril (a falta de

glicerol puede emplearse agua destilada estéril).

7.- Incubar a una temperatura de 25 – 30 °C durante 48 h, o hasta observar crecimiento

por la superficie del cubreobjetos.

59
8.- Retirar el glicerol y adicionar 5 – 10 mL de fenol para inactivar las esporas y
sustraerlo después de 15 – 30 minutos.

9.- Incubar a una temperatura de 37 – 40 °C hasta observar que el agar se ha secado.

10.- Observar al microscopio empleando los distintos objetivos en orden ascendente.

11.- Con sumo cuidado, retirar el cubre objetos empleando pinzas de disección y
colocarlo sobre una gota del colorante azul de algodón con lactofenol en un nuevo
portaobjetos, y sobre el portaobjetos original colocar una gota del mismo colorante
cubriéndolo con un nuevo cubreobjetos, dejar secar y observar nuevamente al
microscopio.

Cinética de Crecimiento

1.- A partir de un cultivo axénico de un hongo previamente aislado y empleando un asa

de platino doblada en ángulo de 90°, sembrar por picadura en el centro de una caja
Petri con medio PDA y otra con medio Czapek Dox.

2.- Medir el crecimiento radial cada tres horas a partir de la inoculación hasta que el
hongo cubra completamente la caja Petri o hasta observar una fase estacionaria de
crecimiento bien definida. Si durante mediciones consecutivas no se observa cambio
alguno, es posible prolongar los intervalos de medición cada seis o doce horas,
dependiendo de la capacidad de desarrollo del microorganismo, y del criterio de quien
realiza el experimento.

3.- Graficar el Ln del diámetro (eje de las ordenadas) con respecto al tiempo (eje de las
abscisas) y determinar la velocidad máxima específica de crecimiento (µ max) para un
cultivo por lotes.

60
Recomendaciones:

La siembra por picadura debe realizarse de abajo hacia arriba con la caja Petri
invertida.

Después de la inoculación y durante todo el proceso de evaluación nunca debe

voltearse la caja Petri pues de lo contrario las esporas del hogo se esparcirán por todo
el medio y se propiciará la proliferación de otras colonias, obstruyendo las mediciones,
generándose datos incorrectos.

De preferencia graficar los datos en cuanto sean obtenidos para poder determinar en
qué momento es posible detener las mediciones, por ejemplo en el caso de que se
cuente con una fase de crecimiento estacionaria bien definida.

61
 II.III Producción de Ácido Cítrico por Aspergillus niger

Importancia de la Producción de Ácido Cítrico

El ácido cítrico (ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico), un ácido tricarboxílico, se
encuentra naturalmente en frutas como limón, naranja, piña, ciruela y pera; en las
semillas de diferentes vegetales; y en huesos, músculos y sangre de animales. En los
inicios de su comercialización, el ácido cítrico fue obtenido inicialmente del jugo de
limón, cristalizado en 1784 por el químico sueco Carl Scheele. El ácido cítrico producido
a partir de frutas es conocido como “ácido cítrico natural” en contraste con el que se
produce mediante microorganismos. Aunque actualmente puede ser sintetizado
químicamente, no existe método químico alguno que supere a la fermentación
microbiana. En 1893, Wehmer investigó la producción de ácido cítrico a partir de
sacarosa empleando cepas de Mucor y Penicillium. Estos experimentos no tuvieron
éxito, por lo que fueron abandonados en 1903, debido a dificultades como la selección
de un microorganismo apropiado, degeneración microbiana, contaminación,
prolongados tiempos de fermentación, elevados costos de construcción de plantas y
una relación insuficiente entre el costo de materias primas y el precio del producto
terminado.

Hasta 1920, todo el ácido cítrico producido comercialmente provino de jugo de lima o
limón. En 1917 Currie describió la primera producción de ácido cítrico con Aspergillus
niger, reportó que diferentes cepas de A. niger, crecen en medios de cultivo con valores
bajos de pH suplementados con 15% (p/v) de sacarosa más otros nutrientes,
convirtiendo el 55% del azúcar en ácido cítrico. El ácido cítrico fue aislado del caldo de
fermentación como citrato de calcio insoluble mediante adición de hidróxido de calcio,
seguido por la regeneración del ácido usando ácido sulfúrico. El ácido cítrico cristaliza
en dos formas: anhídrido y monohidratado. La forma anhidra se produce a temperaturas
que excedan los 36.6 °C, mientras que el monohidratado es producido a temperaturas
no mayores a 36.0 °C. Por 1930 un grupo de fabricantes usaron A. niger mediante el
proceso de fermentación sumergida para la producción de ácido cítrico empleando
sacarosa.

En 1952, America Miles Company (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN) usó el proceso
de fermentación sumergida para producir ácido cítrico en una planta piloto a escala.
62
Existe poca información sobre el proceso que emplearon. Sin embargo, en base a los
resultados presentados en sus patentes, es claro que usaron melazas pretratadas con
un intercambiador de cationes como sustrato deficiente en fosfato, hierro y manganeso.
Después de 1952, muchos países usaron glucosa o melaza de caña y remolacha como
sustratos para producir ácido cítrico.

Entre los microorganismos productores de ácido cítrico, se han usado cepas de A.

niger, pero más recientemente también han sido empleadas algunas levaduras (tabla
II.I), pero aunque se ha seleccionado un gran número de bacterias, levaduras y hongos
superiores, Aspergillus niger ha sido el organismo de elección por las siguientes
razones:

 Facilidad de manejo
 Uso de materia prima barata como sustrato
 Rendimientos altos y consistentes
 Económicamente conveniente

Tabla II.I Diversos microorganismos empleados para producción de ácido cítrico

Microorganismos Productores de Ácido Cítrico

Hongos Levaduras

Penicillium
Aspergillus niger Candida lipolytica C. guilliermondii
restrictum

A. awamori P. janthinellum C. tropicalis C. sucrosa

A. fonsecaeus Trichoderma viride C. zeylanoides Saccharomycopsis

A. luchensis Mucor piriformis C. fibrae Hansenula

A. urentii Ustulina vulgaris C. intermedia Pichia

A. saitoi Botrytis sp. C. parapsilosis Debaryomyces

A. usami Ascochyta sp. C. petrophilum Torulopsis

A. fumaricus Absidia sp. C. subtropicalis Kloeckera

A. phoenicus Talaromyces sp. C. oleophila Rhodotorula

63
 A. lanosus Acremonium sp. C. hitachinica Saccharomyces

A. flavus Eupenicillium sp. C. citrica Zygosaccharomyces

Comúnmente se emplean dos métodos para la producción de ácido cítrico con A. niger:
fermentación en superficie y fermentación en cultivo sumergido. Las melazas de
remolacha y caña de azúcar fueron por muchos años los sustratos preferidos para la
producción de ácido cítrico. Se ha desarrollado la producción de ácido cítrico a partí de
n-parafinas mediante diferentes cepas de Candida u otras levaduras, pero debido a la
generación de ácido isocítrico durante la fermentación así como al precio de los
productos derivados del petróleo, este método no ha resultado económicamente
rentable por lo que no se utiliza comercialmente.

La producción mundial anual de ácido cítrico en 35 países es de ~600 000 toneladas.

De estos, las dos grandes áreas productoras son el Oeste de Europa y EUA. Sin
embargo, EUA aún es importador de ácido cítrico, mientras que el Oeste de Europa
solo exporta. El ácido cítrico es usado en las industrias de alimentos y bebidas (70%),
productos farmacéuticos (12%) y en otras industrias y aplicaciones (18%) (Tabla II.II).
También es empleado para limpieza de metales, como acidulante de bebidas no
alcohólicas, en confitería y puede servir como buffer estabilizador de pH, o bien como
antioxidante de grasas en varios productos alimenticios. En la industria de los alimentos
interviene como conservador al evitar el deterioro del color y el sabor, protege al ácido
ascórbico de la oxidación, inhibe las enzimas oxidativas, actúa como antioxidante y es
un emulsificante en productos lácteos. Interviene en la preparación de bebidas
(proporciona sabor agrio), postres, mermeladas, jaleas, dulces, vinos y frutas
congeladas. En la industria farmacéutica, es usado en jarabes, astringentes y en
tabletas y polvos efervescentes. Es también empleado en transfusiones sanguíneas. En
la industria química, sus usos incluyen acondicionamiento de aguas, decapado de
metales y antiespumante en la fabricación de láminas de vinilo y resinas de poliéster,
así como plastificante no tóxico para hacer películas plásticas. El poder implementarlo
para ajustar el pH permite una amplia aplicación en áreas industriales como
galvanoplastia, curtido de cueros y reactivación de pozos petroleros obstruidos por

64
hierro. Finalmente, el ácido cítrico es usado en la industria de los detergentes
sustituyendo a los fosfatos y en la remoción de azufre de los gases de chimenea.

Tabla II.II Usos del ácido cítrico a nivel industrial

Industria Área Usos
Bebidas General Saborizante
Conservador
Clarificante
Prevención de deterioro
Vino Prevención de turbidez
Inhibición de oxidación
Bebidas Saborizante
carbonatadas Ayuda a la carbonatación
Alimentos Confección Saborizante
Alimentos Antioxidante
congelados
Productos lácteos Emulsificante
Regulador de pH
Mejoramiento de color
Inactivación de metales
traza
Farmacéutica Disolvente y saborizante
Efervescente con H2CO3
Cosméticos Antioxidante y sinergístico
Otras Recubrimiento electrolítico
de metales
Tratamiento de agua de
caldera
Detergentes
Curtido
Textiles

65
 II.III.I Objetivos

Objetivo General

Producir ácido cítrico mediante fermentación en medio sumergido a partir de un cultivo

de Aspergillus niger previamente aislado y caracterizado.

Objetivo Específico

Detectar la producción de ácido cítrico durante el periodo de fermentación

determinando las variaciones de pH y grados Brix en función de tiempo.

II.III.II Materiales

Material Biológico

- Cepa aislada del hongo Aspergillus niger previamente identificada por criterios de
caracterización morfológica macro- y microscópica mediante la técnica de microcultivo.
Material y Equipo

- Algodón
- Cajas de Petri
- Agitadores de vidrio
- Papel Filtro Watman No. 1
- Pipetas estériles de 1, 5 y 10 mL
- Matraces Erlenmeyer de 1 000 mL
- Mechero Fisher
- Potenciómetro
- Refractómetro
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa

Reactivos

- Tween 80

66
Medios de Cultivo

- Agar Dextrosa y Papa (PDA)

- Medio para Obtención de Ácido Cítrico Mediante Fermentación en Cultivo
Sumergido.

II.III.III Métodos

1.- Cultivar una cepa aislada de A. niger en una caja Petri con medio de cultivo PDA de
3 a 5 días a una temperatura de 28-30 °C.

2.- Una vez desarrollado el hongo, agregar a la caja Petri 10 mL de una solución estéril
de Tween 80 al 0.5%. Suspender las esporas realizando movimientos oscilatorios en
forma circular o en forma de “∞”. También es posible realizar la suspensión de las
esporas mediante agitación magnética empleando un agitador estéril en el centro de la
caja Petri.

3.- Tomar 5 mL de la suspensión de esporas e inocular 600 mL de medio de cultivo

contenido en un matraz Erlenmeyer de 1 000 mL.

4.- Incubar durante 8 días a una temperatura de 27.5 °C con agitación constante de 200
rpm.

5.- Cada 24 horas y en el momento de inoculación, determinar pH y °Brix de una

muestra de 50 mL del cultivo previamente filtrada con papel filtro Watman No. 1.

6.- Registrar los datos obtenidos graficando las variaciones de pH y °Brix (ordenadas)
respecto al tiempo (abscisas).

67
 III. LEVADURAS
El uso de levaduras en contextos relacionados con alimentos a nivel mundial es
sinónimo de Saccharomyces cerevisiae, levadura empleada en cervecería y panadería.
Sin embargo, existen otras levaduras involucradas en procesos de fermentación.

Las levaduras son organismos heterotróficos cuyos hábitats naturales son las
superficies de tejidos vegetales, incluyendo flores y frutas. Sus requerimientos
nutricionales son simples, requieren una fuente de carbono, algunos minerales,
suplementos de nitrógeno y vitaminas. Se emplean sales de amonio y rangos
equivalentes de compuestos orgánicos nitrogenados como aminoácidos y urea. Las
vitaminas requeridas son biotina, ácido pantoténico y tiamina.

En base a su metabolismo, las levaduras pueden dividirse en dos grupos: anaerobios

facultativos y aerobios obligados. Además de la conversión aeróbica de azúcares a
CO2, H2O y un rendimiento mucho mayor de masa celular, los anaerobios facultativos
son capaces de desarrollar crecimiento anaerobio y la conversión fermentativa de
azúcares en alcohol etílico, CO2, y biomasa. Levaduras fermentativas como
Saccharomyces cerevisiae, al ser desarrolladas en un medio de cultivo el cual contenga
3 ppm de secuencias específicas de DNA, pueden presentar mutaciones selectivas en
su DNA mitocondrial, de modo tal que su mitocondria es eliminada, resultando cepas
incapaces de utilizar oxígeno, es decir, fermentativas obligadas. Dichas cepas producen
cantidades menores de células que las cepas silvestres, por lo que sus colonias poseen
un tamaño notablemente más pequeño.

Saccharomyces es esférica o elipsoidal. Mientas que las cepas de laboratorio son

haploides (poseen una copia de cada uno de los 16 cromosomas lineales), las cepas
industriales son poliploides (poseen múltiples copias de cada cromosoma) o
aneuploides (cantidades variables de cada cromosoma). Se han identificado alrededor
de 6 000 genes en levaduras y en efecto se ha secuenciado el genoma completo.

Las levaduras empleadas en panificación fueron obtenidas originalmente de la industria

cervecera; tomándolas de la espuma formada en la superficie de los tanques de
fermentación. A mediados del siglo XIX la industria cervecera encontró cepas de la
levadura Saccharomyces carlesburgensis, lo cual aceleró el establecimiento de la

68
industria productora de levadura dirigida a panificación. La producción de levadura para
panificación empleando sacarosa derivada de melazas, requiere aireación vigorosa del
medio de cultivo, para que la cantidad máxima posible del carbono disponible sea
dirigida a la producción de masa celular, en lugar de contribuir a la formación de etanol.

El mecanismo de control que determina el metabolismo en levaduras (respiración

aeróbica o fermentación) se basa en la concentración de azúcar a la que el
microorganismo es expuesto. En concentraciones elevadas de azúcar, las células
activan el modo fermentativo y el piruvato es metabolizado vía acetaldehído a etanol. A
bajas concentraciones de azúcar el piruvato es conducido a acetil-CoA y a la cadena
respiratoria. Esto es denominado efecto Crabtree.

La lógica indica que cuando las concentraciones de azúcar son elevadas, la célula no
necesita generar gran cantidad de moléculas de ATP por molécula de azúcar, por otro
lado, si el suministro de azúcar es limitado, las levaduras maximizan la eficiencia con la
cual la utilizan (el rendimiento de ATP vía fermentación y respiración es de 2 y 32
moléculas, respectivamente). Lo que esto significa en procesos comerciales de
fermentación es claro, en cervecería, donde el requerimiento primario es un elevado
rendimiento de alcohol, el contenido de azúcar en el medio de cultivo es alto, mientras
que en la producción de levadura para panadería, donde se requiere elevado
rendimiento celular, la concentración de azúcar siempre debe mantenerse baja, pero es
suministrada continuamente al proceso (“fed batch”).

La aireación vigorosa de cepas de Saccharomyces cerevisiae en presencia de un nivel

abundante de carbohidrato (alrededor del 3%) produce el dominio metabólico de la ruta
fermentativa. Esto resulta en la producción de un nivel significante de alcohol etílico y
una notable reducción del nivel de masa celular. La industria productora de levadura
para panificación contrarresta el efecto Crabtree empleando alimentaciones
incrementadas, las cuales involucran adiciones puntuales de melazas al cultivo aireado
en tanques, generando un nivel residual de sacarosa no mayor al 0.0001%. De esta
manera no se presenta una represión tipo “feedback” causada por niveles elevados de
sacarosa. La levadura Candida utilis es facultativamente anaeróbica; sin embargo, bajo
condiciones de aireación vigorosa y concentraciones elevadas de azúcar el efecto
Crabtree no se presenta. Así, éste microorganismo puede usarse convenientemente
69
para convertir lactosa de suero y azúcares en masa celular empleada en alimentación y
forrajes.

Todas las levaduras son capaces de utilizar glucosa. La utilización de otros azúcares
dependerá de la especie; el tipo de azúcares empleados constituye el criterio principal
para la identificación de levaduras. Todas las levaduras pueden emplear sulfato de
amonio como única fuente de nitrógeno. Muy pocas levaduras tienen la capacidad de
usar nitratos como única fuente de nitrógeno. Entre las levaduras productoras de
ascosporas, el número (1,4 u 8) y la forma de las ascosporas (esféricas, ovaladas,
riñón, sombrero, aguja) constituye un criterio adicional para la identificación del género
y la especie.

Las levaduras pueden reproducirse sexualmente, pero en condiciones adecuadas lo

hacen principalmente por gemación. Una célula puede reproducirse por gemación más
de 20 veces, cada división deja una marca o cicatriz, de modo que al contarlas es
posible saber si se trata de una célula joven o vieja.

La superficie de la pared celular de las levaduras se encuentra rodeada por una carga
relativamente negativa debido a la presencia de grupos fosfato unidos a los
polisacáridos de la pared celular. Esto produce que células adyacentes puedan
interactuar hasta cierto punto, y la presencia de iones calcio sirve como puentes
mediante enlaces iónicos. Acopladas con otras interacciones como lectinas en la
superficie, varía el grado de asociación entre distintas cepas, resultando en diferentes
niveles de floculación, lo cual tiene como ventaja la separación de las células del medio
líquido al final de la fermentación. Al igual que en la membrana de los organelos, la
membrana plasmática está compuesta de esteroles (ergosterol), ácidos grasos
insaturados y proteínas (permeasas). Como se requiere de oxígeno para las reacciones
de desaturación involucradas en la síntesis de lípidos, pueden suministrarse cantidades
relativamente pequeñas, siempre y cuando se trate de una fermentación anaeróbica.

70
 III.I Aislamiento y Caracterización Morfológica de
Levaduras Anaerobias Facultativas

III.I.I Objetivos

Objetivo General

Obtener de forma pura un cultivo de levadura anaerobia facultativa presente en las

superficies de las frutas.

Objetivos específicos

- Identificar cepas de levaduras anaerobias facultativas mediante la técnica de

siembra con doble capa.
- Observar las características morfológicas macroscópicas de las colonias y
microscópicas de las células mediante preparaciones en fresco y tinción
simple con azul de metileno.

III.I.II Materiales

Material Biológico

- Frutos como uva, piña, mango, durazno, guayaba o manzana

Material y Equipo

- Cuchillo
- Algodón
- Asa de platino
- Cuchara estéril
- Tabla para picar
- Tubos de ensaye
- Cajas de Petri estériles
- Matraces Erlenmeyer de 500 mL
- Matraces Erlenmeyer de 125 mL
- Pipetas estériles de 5 ml
- Tapón de hule horadado
- Mangueras de hule
- Mecheros Fisher
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa

71
Medios de Cultivo

- Peptona
- Agar Bacteriológico
- Medio típico para levaduras
- Agar Dextrosa y Papa (PDA)

III.I.III Métodos

1.- Separar la cáscara del resto del fruto, sobre una tabla para picar y empleando un
cuchillo limpio que ha de ser pasado por la flama del mechero, cual si fuere un asa de
platino, esperar a que el cuchillo se enfríe antes de empezar a cortar (de preferencia
usar guantes).

2.- Pesar 100g de la cascara y colocarlos en un matraz Erlenmeyer de 500 mL con 250
mL de medio típico para levaduras. Tapar el matraz con un tapón de hule horadado, el
cual esté conectado a una manguera de hule y esta se colocará dentro de un matraz
Erlenmeyer de 125 mL lleno de agua, a manera de candado de fermentación, tal y
como se muestra en la siguiente figura.

Figura III.I Sistema de cultivo para levaduras en

condiciones de anaerobiosis

72
3.- Incubar a 30 °C hasta detectar la presencia de burbujas en la superficie del medio
de cultivo o la emanación de CO2 a través de la manguera dentro del matraz de 125
mL. Esto puede durar de 24-72 horas.

4.- Realizar diluciones del medio de cultivo hasta 10-5 y sembrar cada una de ellas por
vertido en placa empleando medio PDA. Una vez solidificado el medio PDA, verter una
capa de agar bacteriológico en la superficie para asegurar condiciones de anaerobiosis.
Incubar a 30°C de 24-48 horas.

5.- Después del periodo de incubación las cajas Petri pueden despedir aroma a alcohol.
Identificar las colonias embebidas en el agar productoras de CO2, es fácil apreciarlas
debido a que junto a ellas quedan atrapadas burbujas del gas. En ocasiones, en la
parte inferior del agar se desarrollan burbujas de gran tamaño.

6.- Repetir el procedimiento de fermentación señalado en el paso 2, en 70 mL de medio

típico para levaduras contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, solo que en esta
ocasión el inóculo estará constituido por una de las colonias productoras de CO2
señaladas en el punto anterior, la cual deberá tomarse con un asa de platino
previamente esterilizada a la flama del mechero, y ser colocada en el nuevo medio de
cultivo fresco. Es importante no olvidar colocar el candado de fermentación para
asegurar condiciones de anaerobiosis.

7.- Transcurrido el tiempo de la fermentación, sembrar mediante estría cruzada dos

cajas Petri con medio PDA e incubar de 24-48 horas a 30°C.

8.- Observar la morfología de las colonias, si son iguales probablemente se trate de un

cultivo puro, lo cual se comprobará realizando tinción con azul de metileno y
preparación en fresco para analizar al microscopio.

73
 III.II Producción de Etanol y Cinética de Crecimiento de Levaduras

III.II.I Objetivos

Objetivo general

Cultivar una cepa silvestre de levadura previamente aislada y monitorear su crecimiento

y capacidad de producción de etanol.

Objetivos específicos

- Determinar el comportamiento gráfico del crecimiento de una cepa de

levadura previamente aislada mediante técnicas turbidimétricas.
- Establecer el tiempo de duración de la fase exponencial, con el fin de
determinar el momento correcto para detener el proceso de fermentación.
- Cuantificar el rendimiento de producción de etanol respecto a la cantidad de
la fuente de carbono suministrada.

III.II.II Materiales

Material Biológico

- Cultivo axénico de levadura silvestre previamente aislada

Material y Equipo

- Algodón
- Alcohómetro
- Asa de platino
- Soporte universal
- Cajas Petri estériles
- Placa de calentamiento
- Pinzas para soporte universal
- Matraces Erlenmeyer de 125 mL
- Matraces Erlenmeyer de 1 000 mL
- Tubo refrigerante para destilación
- Pipetas estériles de 5 y 10 mL
- Probeta graduada de 100 mL
- Tapón de hule horadado
- Mangueras de hule
- Mecheros Fisher
- Espectrofotómetro
- Incubadora
- Autoclave
- Estufa

74
Medios de Cultivo
- Medio típico para levaduras

III.II.III Métodos

1.- Preparar dos matraces de 125 mL con 60 mL de medio típico para levaduras cada
uno, e inocularlos con un cultivo puro de una cepa silvestre de levadura empleando un
asa de platino. Tapar los matraces con tapones de hule horadados, los cuales estén
conectados a mangueras de hule, y estas se colocarán dentro de matraces Erlenmeyer
de 125 mL llenos de agua, a manera de candado de fermentación. Incubar a 30°C con
agitación constante de 100 rpm durante 24 horas. Estos cultivos constituirán el
preinóculo.

2.- Una vez terminado el tiempo de incubación, inocular con estos cultivos iniciadores
dos matraces Erlenmeyer de 1 000 mL, los cuales contengan 600 mL de medio típico
para levaduras cada uno (emplear un preinóculo para cada matraz). Colocar ambos
matraces en las mismas condiciones de incubación que los preinóculos (incluyendo
anaerobiosis mediante candados de fermentación).

3.- Uno de los matraces será empleado para determinar el incremento de la

absorbancia en función del tiempo a una longitud de onda de 540 nm. A partir del
momento de inoculación el cual representará el tiempo cero, las mediciones serán
realizadas cada hora durante 24 horas. Los datos deberán graficarse registrando el
logaritmo natural de la absorbancia (Ln A540nm) en el eje de las ordenadas y el tiempo en
el eje de las abscisas.

4.- Al finalizar la fase de crecimiento exponencial, tomar el segundo matraz (que debió
permanecer intacto durante la incubación) y separar el etanol del medio de cultivo
mediante el proceso de destilación. Cuantificar la concentración empleando un
alcohómetro y determinar el rendimiento de conversión de sustrato a producto (YS/P).

75
ANEXOS

76
A.I Composición de medios de cultivo

Caldo para bacterias acidolácticas, pH 6.0-7.0.

Componente Concentración

Sacarosa 20 g/L

Peptona de caseína 15 g/L

Extracto de levadura 5 g/L

Caldo nutritivo 8 g/L

K2HPO4 2 g/L

MgSO4 0.1 g/L

CH3COONa 5 g/L

Medio para obtención de ácido cítrico mediante fermentación en cultivo

sumergido, ajustar pH a 4.5 con ácido tartárico al 10% o HCL 0.1 N.

Componente Concentración

Sacarosa 150 g/L

Peptona 0.5 g/L

NH4NO3 1.5 g/L

KH2PO4 1 g/L

MgSO4*7H2O 0.25 g/L

CuSO4*5H2O 40 mg/L

K4Fe(CN)6 6 mg/L

77
Medio típico para levaduras, ajustar pH a 4.5 con ácido tartárico al 10% o HCL 0.1
N.

Componente Concentración

Glucosa 100 g/L

Extracto de levadura 8.5 g/L

NH4Cl 1.32 g/L

MgSO4 0.11 g/L

CaCl2 0.06 g/L

Antiespumante 0.2 mL/L

78
A.II Tinción diferencial por el método de Gram

En 1884 el bacteriólogo Christian Gram desarrolló una técnica de tinción que separa a
las baterías en dos grupos: Gram-positivas y Gram-negativas. El procedimiento se basa
en la capacidad de los microorganismos para retener el colorante cristal violeta durante
la decoloración con alcohol. Las bacterias Gram-negativas se decoloran por el alcohol,
perdiendo el tono purpura. Después de la decoloración, se agrega el colorante de
contraste safranina de color rojo, que confiere un tono rosa a las bacterias Gram-
negativas decoloradas.

El procedimiento se realiza de la siguiente manera:

1.- En un portaobjetos, cubrir una preparación bacteriana con cristal violeta y dejar en
reposo por 20 segundos, enseguida enjuagar suavemente con agua. Todas las células
se encuentran teñidas de violeta.

2.- Cubrir la preparación con solución de yodo-lugol durante 1 minuto. El cristal violeta
forma un complejo con la solución yodo-lugol dentro de las células. Todas las células
permanecen de color violeta.

3.- Agregue a la preparación una solución de etanol al 95% por 10-20 segundos y
enjuague con agua. Las células Gram-positivas permanecen de color violeta, pero las
Gram-negativas se han decolorado.

4.- Cubra ahora con safranina, el colorante de contraste, por 20 segundos, enjuague
por algunos segundos y seque. Las células Gram-positivas permanecen violetas, pero
las Gram-negativas se han tornado rojas.

79
A B

D C

Tinción de Gram. A, B y C: Cultivos mixtos de bacterias encontradas en

heces fecales, nótese el característico color azul-violeta de las bacterias
Gram-positivas y el tono rosado de las bacterias Gram-negativas. D: Cultivo
axénico de E. coli bacteria Gram-negativa

80
A.III Imágenes siembra por estría en placa

A B

C D

Siembra por estría en placa. A y B: Siembra por estría cruzada en agar

EMB, colonias de color verde metálico con centro negro características de E.
coli. C y D: Estría por agotamiento (C) y estría cruzada (D), colonias de
levaduras lisas y de aspecto cremoso en medio PDA. E: Colonias de
bacterias acidolácticas de color blanco-amarillo en agar Lactobacillus-MRS.
Nótese como en todos los casos se obtienen colonias aisladas, de donde es
posible obtener cultivos axénicos.

81
A.IV Cinéticas de crecimiento microbiano

Ln (A 540 nm * 1000) 4

0
0 50 100 150 200 250 300 350
t, minutos

Cinética de Crecimiento de E. coli por turbidimetría. Determinación de

absorbancia a 540 nm en caldo nutritivo a 37°C. En el gráfico se aprecian
claramente las fases del crecimiento microbiano: Lag, Crecimiento
Exponencial y Estacionaria.
5
4.5
4
3.5
Ln Diametro

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
t, h

Comportamiento cinético del crecimiento una cepa silvestre de

Aspergillus niger aislada de pan. Medio PDA a 30°C. Nótese que
en este caso no se presenta fase Lag, debido muy probablemente a
la gran afinidad del microorganismo por el sustrato disponible.

82
A.V Mohos y levaduras ante el microscopio

A B

C D

Levaduras anaerobias facultativas. A y B: Preparaciones en fresco

observadas directamente al microscopio. C y D: Tinción simple con el
colorante azul de metileno. Puede observarse como algunas se
encuentran en estado de gemación. Estas cepas fueron obtenidas a
partir de cascara de piña.

83
A B

C D

Mohos observados mediante microcultivo. A y B: Rhizopus sp

caracterizado por la presencia hifas rizoidales, esporangióforos e hifas
cenocíticas. C: Aspergillus sp. teñido con el colorante lactofenol azul de
algodón, presenta esporas asexuales en conidióforos. D: Aspergillus
niger, característico color negro y abundantes conidiosporas.

84
A.VI Pruebas bioquímicas

Agar Hierro Triple Azúcar (TSI)

Inoculación: Picadura y estría.

Empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de

glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

En este medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona aportan los nutrientes

adecuados para el desarrollo bacteriano, la lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el

sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan gracias al rojo de

fenol, un indicador de pH el cual vira al color amarillo en medio ácido.

Resultados:

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc): No hay fermentación de azúcares.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A): Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa

fermentadas.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/H2S+): Glucosa fermentada. Lactosa y sacarosa no

fermentadas, producción de ácido sulfhídrico.

Pico ácido/fondo ácido (A/A): Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede
producirse o no H2S.

85
Agar Hierro Lisina (LIA)

Inoculación: Picadura y estría

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, basado en la

decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

La peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo

bacteriano, la glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la

producción de ácido sulfhídrico.

El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual

o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el

medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la
lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario, que la glucosa sea
previamente fermentada.

86
Resultados:

Decarboxilación de la lisina:

Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.

Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

Desaminación de la lisina:

Pico rojizo/fondo amarillo.

Producción de ácido sulfhídrico:

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y

fondo)

87
Agar Citrato de Simmons

Inoculación: Picadura y estría

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de

usar citrato como única fuente de carbono y energía.

En el medio de cultivo, el fosfato de amonio es la única fuente de nitrógeno y el citrato

de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el
desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfato forman un sistema buffer y el magnesio es un cofactor enzimático.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el azul de bromotimol es el indicador

de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar

citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de
nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza en bacterias poseedoras de citrato permeasa. El

desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato durante el ciclo
de los ácidos tricarboxílicos. En presencia de un medio alcalino, el piruvato da origen a
ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa.

Resultados

Positivo: Crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Negativo: El medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo

bacteriano y no hay cambio de color.

88
Medio SIM

Inoculación: Picadura

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de

sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de

la tripteína, puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasas. El indol producido se
combina con el aldehído del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto
de color rojo.

Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio por la turbidez que producen
alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de ácido
sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

89
Resultados:

Cepas móviles: Producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de
siembra.

Cepas inmóviles: El crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.

Cepas SH2 positivas: Ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el

medio.

Cepas SH2 negativas: El medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: Desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs
o de Erlich.

Cepas indol negativas: Sin cambio de color.

90
Urea

Inoculación: Agitación en el medio

Este medio de cultivo presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. El
extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y cofactores, y
aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos
constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el
sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno

proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos
productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo de fenol de
amarillo a rojo.

Rojo de Metilo – Voges-Proskauer

Inoculación: Agitación en el medio

Rojo de metilo:

Una de las características metabólicas que se utiliza para identificar los diferentes
géneros de enterobacterias, lo constituye el tipo y la proporción de productos de
fermentación, que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos
generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3-butanodiol. En la
fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente ácido láctico, acético y
succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades
menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol,
etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido
mixta.

Resultados: La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la
producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo

91
fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el
amarillo no es considerado como positivo.

Voges-Proskauer:

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol.

El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de
butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a
diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Resultados: El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia

de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

92
 A

Pruebas bioquímicas de identificación bacteriana. Pruebas bioquímicas

antes (A) y después (B) de ser inoculadas con una cepa de Escherichia coli
aislada de heces fecales de perro.

93
A.VII Análisis de azúcares reductores mediante el método del ácido
dinitrosalicílico (DNS).

El total de azucares reductores producido o consumido por la hidrólisis enzimática de

polisacáridos puede determinarse por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller,
1959; Andreotti, 1980), como sigue:

Materiales y Reactivos:

1. Ácido 3,5-dinitrosalicilico
2. NaOH
3. Agua destilada
4. Sales de Rochelle (tartrato de sodio y potasio)
5. Fenol (disuelto a 50°C)
6. Metabisulfito de sodio
7. Solución de fenolftaleína
8. HCl 0.1 N
9. Solución estándar de α-D glucosa (Dextrosa) 1 g/L
10. Espectrofotómetro

Preparación de Reactivos

1. Disolver 10.6 g de ácido 3,5-dinitrosalicilico y 19.8 g de NaOH en 1 416 mL de

agua destilada en un vaso de precipitado con agitación, entonces agregar 306 g
de sales de Rochelle, 7.6 mL (8.132 g) de fenol y 8.3 g de metabisulfito de sodio.
2. Valorar 3 mL de muestra con fenolftaleína con 0.1 N de HCl. Debe tener de 5 a 6
mL de HCl 0.1 N. Agregar NaOH en la solución anterior de DNS (2 g de NaOH
por 1mL de HCl 0.1 N agregado).

Procedimiento:

1. Diluir la solución de glucosa estándar haciendo concentraciones de 0.2, 0.4, 0.6,

0.8 y 1.0 g/L. Use estas soluciones de concentración de glucosa conocida como
muestras para los pasos 3 y 4. Prepare la curva de calibración midiendo la
absorbancia contra la concentración de glucosa.
2. Diluir una muestra de tal manera que se espere que la concentración esté
dentro del rango de la curva de calibración.
3. Coloque 1 mL de muestra en un tubo y adicione 3 mL de reactivo DNS. Coloque
en agua hirviendo por 5 minutos. Enfríe a temperatura ambiente.
4. Lea la absorbancia a 550 nm.
5. Lea el valor de la concentración de glucosa correspondiente a la absorbancia de
la curva de calibración.

94
 RECOMENDACIONES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO
1.- En todo momento usar bata limpia y bien abotonada

2.- Usar cubre boca para resguardar nuestra salud, pues nunca se sabe en qué
momento se puede estar en contacto con un posible patógeno, así como para proteger
a los cultivos microbianos con que se trabajamos de contaminación por las bacterias
que se encuentran en nuestra saliva.

3.- Procurar conservar las uñas cortas, pues en ellas se puede acumular tierra, restos
de alimentos o restos de piel, convirtiéndose en un vector de contaminación tanto para
los microorganismos del exterior como para los que se manipulan en el laboratorio.

4.- En el caso de las mujeres, es importante portar el cabello recogido (en especial
cuando el mechero se encuentre encendido, pues podría suscitarse un accidente) y no
portar maquillaje, sobre todo cuando se maneje el microscopio, pues los oculares se
manchan con sus pestañas depreciando en gran proporción la calidad de las imágenes
que pudieran observarse.

5.- Limpiar el área de trabajo meticulosamente con algodón y alcohol etílico a una
concentración no menor del 70% inmediatamente antes de empezar las actividades y
después de concluidas.

6.- Evitar comer e introducir alimentos en el laboratorio, esto es sumamente riesgoso.

7.- Siempre y en todo momento que se manipulen microorganismos se debe trabajar lo

más cercanamente posible de la flama del mechero, y de ser posible emplear dos
mecheros a la vez, uno de cada lado, para asegurar condiciones de esterilidad en el
área de trabajo.

8.- Asegurarse de que todos los medios de cultivo empleados hayan sido previamente
esterilizados antes de trabajar con ellos, así como también esterilizarlos antes de
desecharlos, para evitar la propagación de microorganismos fuera de su hábitat natural
o el riesgo infectocontagioso por la posible presencia de patógenos. Es por ello que en
todas las prácticas se incluyen como equipos el autoclave y la estufa, pues aunque no
se empleen de forma directa en el procedimiento, son indispensables para la
preparación del material y de los medios de cultivo.
95
9.- En la medida de lo posible usar guantes para trabajar, en especial cuando se
manipulen muestras de origen fecal, e independientemente de la presencia de guantes
o no, es indispensable lavarse meticulosamente las manos con abundante jabón antes
y después de iniciar una práctica.

10.- Evitar tocarse la cara o tallarse los ojos con las manos durante el desarrollo de una
práctica.

11.- No hablar al manipular cultivos microbianos expuestos, por ejemplo al abrir una
caja Petri para sembrar o para tomar una muestra de inóculo.

12.- En caso de entrar en contacto directo con un cultivo microbiano, lavar

inmediatamente con abundante jabón y de ser posible con cloro diluido la zona
afectada.

13.- De igual manera, en el caso de derrame de un cultivo microbiano sobre superficies

como mesas de trabajo o el piso, es necesario limpiar y desinfectar perfectamente con
cloro el área de contacto.

14.- Evitar manipular teléfonos celulares pues son una fuente increíblemente abundante
de bacterias y esporas.

15.- Antes de empezar a trabajar es preciso rotular adecuadamente tubos y cajas Petri.
Los tubos deben identificarse por la dilución correspondiente (-1,-2,-3,…), o al inocular
un tubo con agar inclinado para conservar alguna cepa, este debe indicar el medio de
cultivo, cepa en cuestión y la fecha de almacenamiento. Las cajas Petri deben contener
información concerniente a medio de cultivo, microorganismo o tipo de análisis, número
de dilución (si es que se realizó), nombre de la persona o número de equipo al que
pertenece y fecha de realización.

96
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aguilar-Rivera, C. y Vanegas-López, M. C. (2007). Inhibición de Listeria monocytogenes

con Bacterias Acidolácticas productoras de Bacteriocinas. Facultad de Ciencias
de La Universidad de Los Andes.

Aguirre-Ezkauriatza, E., Ramirez, A., y Alvarez, M. M. (2009). Producción de

Lactobacillus casei a Partir de Suero de Leche en Cultivos Batch, Fed-Batch Y
Continuo. Centro de Biotecnología FEMSA, Monterrey, Nuevo León, México.

Bamforth, C. W. (2005). Food, Fermentation and Micro-organisms. First Edition.

Blackwell Science Ltd a Blackwell Publishing company. USA.

Bolívar-Zapata, F. G. (2004). Fundamentos y casos exitosos de la biotecnología

moderna. Primera Edición. El Colegio Nacional. México D.F.

Ertola, R. (2005). Microbilogía Industrial. Secretaría General de la Organización de los

Estados Americanos.

Guerrero-Prieto, V. M. et al., (2004). Identificación de Levaduras Epifitas Obtenidas de

Manzana [Malus sylvestris (L.) Mill. Var. Doméstica (Borkh.) Mansf.] para Control
Biológico Poscosecha. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo,
A.C. Unidad Cuauhtémoc, Revista Mexicana de Fitopatología.

Gutiérrez-López, G. F. and Barbosa-Cánovas, G. V. (2003). Food Science and Food

Biotechnology. First Edition. CRC Press. USA.

Herrera, T. y Ulloa, M. (2004). El Reino de Los Hongos Micología Básica y Aplicada.

Fondo de Cultura Económica. México.

Ingraham, J. L. and Ingraham, C. A. (1994). Introducción a la Microbiología. Editorial

Reverté, Barcelona, España.

Kavanagh, K. (2005). Fungi Biology and Applications. First Edition. John Wiley & Sons.
England.

97
Kristiansen, B., Mattey, M., Linden, J. (2002). Citric Acid Biotechnology. Taylor &
Francis.

Lee, J. M. (1992). Biochemical Engineering. First Edition. Prentice-Hall, Inc. USA.

Najafpour, G.D. (2007). Biochemical Engineering and Biotechnology. First Edition.

Elsevier B.V. Israel.

Okafor, N. (2007). Modern Industrial Microbiology and Biotechnology. First Edition.

Science Publishers, India.

Satyanarayana, T. (2009). Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. First Edition.

Springer Science.

Scragg, A. (2002). Biotecnología para Ingenieros, Sistemas Biológicos en Procesos

Biotecnológicos. Editorial Limusa.

Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A. and Levin R. E. (2006). Food Biotechnology.
Second Edition, CRC Press Taylor & Francis Group. USA.

Stanier, R. Y., Ingraham, J. L., Wheelis, M. L., Painter, P. R. (1992). Microbiología.

Segunda Edición. Editorial Reverté. Barcelona, España.

Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunnill, P., Humphrey, A. E. and Lilly M. D.
(1979). Fermentation and Enzyme Technology. First Edition. Wiley-Interscience.
USA.

98