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DIN EN ISO 13366-1:2008-06

Nationales Vorwort
Die Europäische Norm (EN ISO 13366-1:2008) fällt in den Zuständigkeitsbereich des Technischen Komitees
CEN/TC 302 „Milch und Milchprodukte — Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN,
Niederlande). Die ihr zugrunde liegende Internationale Norm ISO 13366-1:2008 wurde vom Unterkomitee
SC 5 „Milk and milk products“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) des Technischen Komitees ISO/TC 34 „Food
products“ (Sekretariat: MSZT, Ungarn) ausgearbeitet.

Aufgrund der Ergebnisse des parallelen Abstimmungsverfahrens wurde ISO 13366-1:2008 als Europäische
Norm EN ISO 13366-1:2008 übernommen.

Die Mitarbeit des DIN beim Europäischen Komitee für Normung (CEN) wird für das CEN/TC 302 „Milch und
Milchprodukte — Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) über den
DIN-Arbeitsausschuss „Milch und Milchprodukte — Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ des
Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen.

DIN EN ISO 13366, Milch — Zählung somatischer Zellen besteht aus:

— Teil 1: Mikroskopisches Verfahren (Referenzverfahren)

— Teil 2: Leitfaden zum Betrieb fluoreszenzoptoelektronischer Zählgeräte

Für die in diesem Dokument zitierten internationalen Dokumente wird im Folgenden auf die entsprechenden
deutschen Dokumente hingewiesen:

ISO 707 siehe DIN EN ISO 707

ISO 5725-1 siehe DIN ISO 5725-1
ISO 5725-2 siehe DIN ISO 5725-2

Änderungen
Gegenüber DIN EN ISO 13366-1:1997-09 wurden folgende Änderungen vorgenommen:
a) der Abschnitt Normative Verweisungen wurde eingefügt;
b) die Abschnitte Durchführung sowie Berechnung und Darstellung der Ergebnisse wurden grundlegend
überarbeitet, um insbesondere die Auszählung der Zellen genauer zu beschreiben;
c) in einem Anhang A (informativ) werden die Ergebnisse eines Ringversuchs dargestellt, im Anhang B
(informativ) werden Hinweise zum Färben von Ziegenmilch gegeben, und der Anhang C (informativ)
beschreibt die Poisson-Verteilung der Zellen in Milch;
d) die Norm wurde technisch und redaktionell überarbeitet und ergänzt und damit an die derzeit gültigen
Gestaltungsregeln angepasst;
e) die Literaturhinweise wurden ergänzt.

Frühere Ausgaben
DIN EN ISO 13366-1: 1997-09

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 DIN EN ISO 13366-1:2008-06

Nationaler Anhang NA
(informativ)

Literaturhinweise

DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte — Leitfaden zur Probenahme

DIN ISO 5725-1, Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Messverfahren und Messergebnissen — Teil 1:
Allgemeine Grundlagen und Begriffe

DIN ISO 5725-2, Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Messverfahren und Messergebnissen — Teil 2:
Grundlegende Methode für die Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpräzision eines vereinheitlichten
Messverfahrens

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DIN EN ISO 13366-1:2008-06

— Leerseite —

4
EUROPÄISCHE NORM EN ISO 13366-1
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE Februar 2008

ICS 67.100.10 Ersatz für EN ISO 13366-1:1997

Deutsche Fassung

Milch —
Zählung somatischer Zellen —
Teil 1: Mikroskopisches Verfahren (Referenzverfahren)
(ISO 13366-1:2008)

Milk — Lait —
Enumeration of somatic cells — Dénombrement des cellules somatiques —
Part 1: Microscopic method (Reference method) Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)
(ISO 13366-1:2008) (ISO 13366-1:2008)

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 3. Februar 2008 angenommen.

Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen
dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen
dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN oder bei jedem CEN-Mitglied auf
Anfrage erhältlich.

Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache,
die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum
mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich,
Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal,
Rumänien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Königreich
und Zypern.

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG

EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

Management-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brüssel

© 2008 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Ref. Nr. EN ISO 13366-1:2008 D
Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.
DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

Inhalt

Seite

Vorwort ................................................................................................................................................................3
1 Anwendungsbereich .............................................................................................................................4
2 Begriffe ...................................................................................................................................................4
3 Kurzbeschreibung .................................................................................................................................4
4 Chemikalien............................................................................................................................................4
4.1 Farblösungen .........................................................................................................................................4
4.2 Phosphat-Pufferlösung (PBS) ..............................................................................................................6
5 Geräte......................................................................................................................................................7
6 Probenahme ...........................................................................................................................................7
7 Vorbereitung der Untersuchungsprobe ..............................................................................................7
7.1 Lagerung.................................................................................................................................................7
7.2 Vorbereitung...........................................................................................................................................8
8 Durchführung .........................................................................................................................................8
8.1 Vorbereitung des Ausstrichs und Färbung ........................................................................................8
8.2 Bestimmung ...........................................................................................................................................9
9 Berechnung und Darstellung der Ergebnisse ................................................................................. 13
9.1 Auszählen einer rechteckigen Fläche in aufeinander folgenden Feldern .................................... 13
9.2 Auszählen einer rechteckigen Fläche mit Streifen.......................................................................... 14
9.3 Auszählen einer kreisrunden Fläche in aufeinander folgenden Feldern ...................................... 14
9.4 Darstellung der Ergebnisse ............................................................................................................... 15
10 Präzision .............................................................................................................................................. 15
10.1 Wiederholpräzision............................................................................................................................. 15
10.2 Vergleichpräzision .............................................................................................................................. 15
11 Untersuchungsbericht ....................................................................................................................... 16
Anhang A (informativ) Ringversuch ............................................................................................................... 17
Anhang B (informativ) Färben von Ziegenmilch ........................................................................................... 18
Anhang C (informativ) Poisson-Verteilung .................................................................................................... 19
Literaturhinweise ............................................................................................................................................. 20

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 DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

Vorwort
Dieses Dokument (EN ISO 13366-1:2008) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 „Food products“ in
Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 302 „Milch und Milchprodukte — Probenahme- und
Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird.

Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis August 2008, und etwaige entgegenstehende nationale
Normen müssen bis August 2008 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berühren können.
CEN [und/oder CENELEC] sind nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu
identifizieren.

Dieses Dokument ersetzt EN ISO 13366-1:1997.

Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden

Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland,
Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta,
Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien,
Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Königreich und Zypern.

Anerkennungsnotiz
Der Text von ISO 13366-1:2008 wurde vom CEN als EN ISO 13366-1:2008 ohne irgendeine Abänderung
genehmigt.

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DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

1 Anwendungsbereich
Dieser Teil der ISO 13366|IDF 148 legt ein mikroskopisches Verfahren (Referenzverfahren) für die Zählung
somatischer Zellen sowohl in roher als auch in chemisch konservierter Milch fest.

Dieser Teil von ISO 13366|IDF 148 ist für die Zählung somatischer Zellen in Kuhmilch anwendbar,
vorausgesetzt, dass die möglicherweise erwähnten Forderungen erfüllt sind.

Dieses Verfahren ist geeignet für die Herstellung von genormten Untersuchungsproben und für die
Bestimmung von Werten für das Referenzverfahren, die für die Kalibrierung mechanisierter und
automatisierter Zellzählverfahren verwendet werden.

WARNUNG — Die Anwendung dieser Norm ist möglicherweise mit der Anwendung gefährlicher Stoffe,
Verfahrensschritte und Ausrüstungsgegenstände verbunden. Die Norm kann jedoch nicht alle mit
ihrer Anwendung verbundenen Sicherheitsprobleme anführen. Es liegt in der Verantwortung des
Anwenders dieser Norm, angemessene Sicherheits- und Gesundheitsvorkehrungen zu treffen und vor
der Anwendung die Anwendbarkeit einschränkender Vorschriften zu bestimmen.

2 Begriffe
Für die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff.

2.1
somatische Zellen
Zellen, einschließlich ihrer Kerne, dies bedeutet alle Leukozyten und Epithelzellen, die nach dem in diesem
Teil von ISO 13366|IDF 148 beschriebenen Verfahren bestimmt werden

3 Kurzbeschreibung
Eine Menge der zu untersuchenden Milchprobe wird auf einem Objektträger dünn ausgestrichen, um einen
Film auszubilden. Der Ausstrich wird getrocknet und gefärbt, und anschließend werden die gefärbten Zellen
unter einem Mikroskop gezählt. Multiplikation der Anzahl der von einer festgelegten Fläche ausgezählten
Zellen mit einem Arbeitsfaktor, woraus sich die Anzahl der Zellen je Milliliter ergibt.

4 Chemikalien
Soweit nicht anders angegeben, sind nur analysenreine Chemikalien und destilliertes oder deionisiertes
Wasser oder Wasser von entsprechender Reinheit zu verwenden.

4.1 Farblösungen

WARNUNG — Tetrachlorethan ist giftig. Ethidiumbromid ist mutagen. Geeignete Handlungsweisen für
eine Deaktivierung im Falle von Verschütten müssen getroffen werden. Die Herstellung und
Verwendung der Farblösung muss unter einem Abzug vorgenommen werden, dabei ist eine
persönliche Schutzausrüstung zu verwenden.

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 DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

4.1.1 Modifizierte Newman-Lampert-Farblösung (Levowitz-Weber-Modifikation)

4.1.1.1 Zusammensetzung

Ethanol, 95 % (Volumenanteil) 54,0 ml

Tetrachlorethana 40,0 ml
Methylenblau 0,6 g
Eisessig 6,0 ml
a Wahlweise kann Tetrachlorethan durch die angegebene
gleiche Menge Xylol ersetzt werden.

4.1.1.2 Herstellung

Das Ethanol und das Tetrachlorethan werden in eine Flasche gegeben und gemischt. Die Mischung wird in
einem auf 65 °C eingestellten Wasserbad (5.1) erwärmt. Das Methylenblau wird zugefügt und sorgfältig
durchmischt. Die Mischung wird in einem Kühlschrank auf 4 °C abgekühlt.

Dann wird der Eisessig zugefügt und nochmals durchmischt. Die entstandene Lösung wird durch einen
geeigneten Filter (5.2) filtriert und in einer luftdicht verschlossenen Flasche aufbewahrt.

Die Newman-Lampert-Farblösung wird vor Gebrauch nochmals filtriert.

4.1.2 Ethidiumbromid-Farblösung

4.1.2.1 Farb-Stammlösung

4.1.2.1.1 Zusammensetzung

Ethidiumbromid 0,25 g
demineralisiertes Wasser 100 ml

4.1.2.1.2 Herstellung

Das Ethidiumbromid wird in auf 40 °C vorgewärmten demineralisierten Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf
Raumtemperatur abgekühlt. Mit demineralisiertem Wasser wird auf 100 ml aufgefüllt.
Die Ethidiumbromid-Farbstammlösung kann maximal 2 Monate verwendet werden, wenn sie im Dunkeln bei
2 °C ± 2 °C aufbewahrt wird.

4.1.2.2 Pufferlösung

4.1.2.2.1 Zusammensetzung

Kaliumhydrogenphthalat 0,51 g
Kaliumhydroxid 0,162 g
demineralisiertes Wasser 100 ml

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DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

4.1.2.2.2 Herstellung

Das Kaliumhydrogenphthalat und das Kaliumhydroxid werden getrennt in dem demineralisierten Wasser
gelöst.

Die Pufferlösung kann maximal 2 Monate verwendet werden, wenn sie im Dunkeln bei 2 °C ± 2 °C aufbewahrt
wird.

4.1.2.3 Ethidiumbromid-Farbarbeitslösung

4.1.2.3.1 Zusammensetzung

Ethidiumbromid-Farbstammlösunga
2 ml
(4.1.2.1)
Pufferlösung (4.1.2.2) 8 ml
Triton X-100 0,1 ml
demineralisiertes Wasser 90 ml
a Eine hohe Temperatur kann die Färbungsfähigkeit des
Ethidiumbromids verringern.

4.1.2.3.2 Herstellung

Der Reihe nach werden die Ethidiumbromid-Farbstammlösung, die Pufferlösung und das Triton X-100 in das
demineralisierte Wasser gegeben und durchmischt.

Die Ethidiumbromid-Farbarbeitslösung ist direkt, bevor sie verwendet wird, frisch herzustellen.

4.2 Phosphat-Pufferlösung (PBS)

4.2.1 Zusammensetzung

NaCl 8g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 · 7 H2O 1,15 g
KH2PO4 0,2 g
demineralisiertes Wasser 1 000 ml

4.2.2 Herstellung

Die Salze werden in demineralisiertem Wasser gelöst. Mit dem restlichen demineralisierten Wasser wird auf
1 000 ml aufgefüllt.

Der pH-Wert wird auf 7,2 ± 0,1 eingestellt.

ANMERKUNG Es kann auch eine handelsübliche Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert = 7,2 verwendet werden.

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 DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

5 Geräte
Übliche Laborgeräte und besonders folgende:

5.1 Wasserbäder, einstellbar auf die Temperaturen von 40 °C ± 2 °C, 50 °C ± 2 °C und 65 °C ± 2 °C.

5.2 Filter, beständig gegen die verwendeten Lösemittel mit einer Porengröße von 10 µm bis 12 µm.

5.3 Mikroskop, mit 500- bis 1 000-facher Vergrößerung. Objektive für Öl-Immersion können verwendet
werden.

Falls Ethidiumbromid verwendet wird, muss das Mikroskop mit einer Fluoreszenzeinrichtung ausgestattet sein.

5.4 Mikrospritze, die ein Nennvolumen von 0,01 ml Milch aufnehmen kann, mit Grenzabweichungen von
2 %.

5.5 Mikrometer, zertifiziert.

5.6 Objektträger, mit eingezeichnetem Strichfeld (rechteckig oder kreisrund), mit einer Fläche von
1 cm2 ± 5 % (95 mm2 bis 105 mm2), oder ein Standardobjektträger, mit einer Schablone von 20 mm × 5 mm
oder einem Durchmesser d von 11,28 mm.

5.6.1 Auswahl der Objektträger

Mit einer festgelegten Fläche oder einer Schablone zu arbeiten, ist vorzuziehen, um die Rückrechnung des
Arbeitsfaktors bei jeder Zählung zu vermeiden.

5.6.2 Strichfelder

Bei einem rechteckigen Feld sollten die oberen und unteren Innenbreiten einerseits und die linken und
rechten Innenhöhen andererseits um nicht mehr als 0,2 mm abweichen.

Bei kreisrundem Feld sollten die vertikalen und horizontalen Innendurchmesser um nicht mehr als 0,2 mm
abweichen.

6 Probenahme
Dem Labor sollte eine repräsentative Probe zur Verfügung gestellt werden. Diese sollte während des
Transports oder der Lagerung nicht beschädigt oder verändert worden sein.

Die Probenahme ist kein Bestandteil des in diesem Teil von ISO 13366|IDF 148 festgelegten Verfahrens. Ein
als geeignet zu empfehlendes Probenahmeverfahren ist in ISO 707|IDF 50 angegeben.

Falls automatische Probenahmegeräte verwendet werden, müssen diese ausreichend validiert sein.

7 Vorbereitung der Untersuchungsprobe

7.1 Lagerung

Vor Untersuchung oder Konservierung sind die Untersuchungsproben bei einer Temperatur von 4 °C ± 2 °C
zu lagern.

Die Untersuchungsproben werden innerhalb von 6 h nach der Probenahme untersucht. Bei einer längeren
Lagerung werden chemische Konservierungsmittel wie Borsäure, Bronopol oder Kaliumdichromat zugegeben.
Die Endkonzentration der Borsäure darf 0,6 g je 100 ml der Untersuchungsprobe nicht überschreiten. Die
Endkonzentration des Bronopols darf 0,05 g je 100 ml der Untersuchungsprobe nicht überschreiten. Die
Endkonzentration des Kaliumdichromats darf 0,1 g je 100 ml der Untersuchungsprobe nicht überschreiten.
Die so konservierten Untersuchungsproben sind bei einer Temperatur von 4 °C ± 2 °C nicht länger als 6 Tage
zu lagern.

7
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EN ISO 13366-1:2008 (D)

Aus Gründen des Umweltschutzes wird empfohlen, die Verwendung von Kaliumdichromat auf Proben zu
beschränken, die eine lange Haltbarkeit erfordern.

7.2 Vorbereitung

Die Untersuchungsprobe (siehe 7.1) wird in einem auf 40 °C eingestellten Wasserbad (5.1) erwärmt. Die
Untersuchungsprobe wird gründlich durchmischt. Die Probe wird auf die Temperatur abgekühlt, bei der die
Mikrospritze (5.4) kalibriert worden ist, z. B. 20 °C.

Die Untersuchungsprobe mit einem geschätzten Gehalt an somatischen Zellen von über 1 000 000 Zellen/ml
wird mit Phosphat-Pufferlösung (4.2) verdünnt, sodass ein Gehalt an somatischen Zellen von etwa
500 000 Zellen/ml für jede verdünnte Untersuchungsprobe erreicht wird.

Vs
d=
Vs × Vb

Dabei ist

d der Verdünnungsfaktor, um einen geeigneten Gehalt an somatischen Zellen in der Untersuchungsprobe

von etwa 500 000 Zellen/ml zu erhalten;

Vs das Volumen der Untersuchungsprobe, in Milliliter;

Vb das Volumen des Puffers, das zur Verdünnung der Untersuchungsprobe verwendet wurde, in Milliliter.

Der erforderliche Verdünnungsfaktor d, das Volumen der Untersuchungsprobe Vs und das Volumen des
Puffers für die notwendige Verdünnung Vb werden aufgezeichnet.

8 Durchführung
Von jeder Untersuchungsprobe werden mindestens zwei Ausstriche hergestellt, und der günstigste (z. B. ein
Ausstrich, der nicht durch den Färbungsprozess beschädigt wurde) wird gezählt. Die Objektträger (5.6)
werden in Ethanol (95 %) getaucht. Sie werden abgeflammt und abgekühlt.

8.1 Vorbereitung des Ausstrichs und Färbung

Es wird entweder 8.1.1 oder 8.1.2 für die Herstellung des Ausstrichs und Färbung befolgt.

ANMERKUNG Die Färbung von Ziegenmilch ist im Anhang B beschrieben.

8.1.1 Vorbereitung des Ausstrichs und Färbung mit modifizierter Newman-Lampert-Farblösung

Unter Verwendung der Mikrospritze (5.4) werden 0,01 ml von der vorbereiteten Untersuchungsprobe
(letztendlich verdünnt) (siehe 7.2) entnommen. Die Mikrospritze wird mit der Untersuchungsprobe gespült.
Wenn notwendig, wird die in Berührung mit der Untersuchungsprobe gekommene Außenseite der
Mikrospritze vorsichtig und gründlich gereinigt.

Die Untersuchungsmenge wird auf einen sauberen Objektträger mit einer Fläche von 1 cm2 (5.6) aufgebracht.
Unter Verwendung der Nadel wird die Untersuchungsmenge flach über die ganze festgelegte Fläche so lange
verteilt, bis erreicht wird, dass die Fläche genau bis zum Rand gleichmäßig bedeckt ist. Der Ausstrich wird bei
Raumtemperatur bis zur vollständigen Trockne getrocknet.

Der auf dem Objektträger getrocknete Ausstrich wird in die modifizierter Newman-Lampert-Farblösung (4.1.1)
für mindestens 15 min eingetaucht. Der Ausstrich wird bei Umgebungstemperatur getrocknet.

8
 DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

Dann wird der Ausstrich vorsichtig in Leitungswasser eingetaucht, bis alle überschüssige Farbe abgewaschen
ist. Der Ausstrich wird noch einmal getrocknet und staubgeschützt aufbewahrt.

8.1.2 Färbung mit Ethidiumbromid-Farblösung und Vorbereitung des Ausstrichs

1 ml der vorbereiteten Untersuchungsprobe (siehe 7.2) wird mit 1 ml Ethidiumbromid-Farbarbeitslösung

(4.1.2.3) in einem Reagenzglas gemischt. Die Untersuchungsproben werden vor Licht geschützt aufbewahrt.
Das Glas wird in einem auf 50 °C eingestellten Wasserbad (5.1) für 3 min erwärmt. Bei Raumtemperatur wird
abgekühlt.

Unter Verwendung der Mikrospritze (5.4) werden 0,01 ml von der vorbereiteten Mischung entnommen. Die
Mikrospritze wird mit der Untersuchungsprobe gespült. Wenn notwendig, wird die in Berührung mit der
Untersuchungsprobe gekommene Außenseite der Mikrospritze vorsichtig und gründlich gereinigt.

Die Untersuchungsmenge wird auf einen sauberen Objektträger mit einer Fläche von 1 cm2 (5.6) aufgebracht.
Unter Verwendung der Nadel wird die Untersuchungsmenge flach über die ganze festgelegte Fläche so lange
verteilt, bis erreicht wird, dass die Fläche genau bis zum Rand gleichmäßig bedeckt ist. Der Ausstrich wird bei
Raumtemperatur bis zur vollständigen Trockne getrocknet.

8.2 Bestimmung

8.2.1 Optimierung der Zählung

Unter Verwendung des Mikroskops (5.3) werden die Zellkerne in dem erhaltenen Ausstrich (8.1.1 oder 8.1.2)
gezählt. Nur die mit Milchausstrich vollständig gefüllten Felder sind auszuzählen. Die günstigste Vergrößerung
(von 500- bis 1 000-fach) wird ausgewählt, um eine durchschnittliche Höchstzahl von 20 Zellen in jedem Feld
zu erhalten.

Die Zellen haben gefärbte Kerne. Im Allgemeinen sind die Zellen 8 µm groß oder größer. Zellen von weniger
als 4 µm (siehe Bild 1) werden nicht gezählt. Fragmente werden nur gezählt, wenn mehr als 50 % des
Kernmaterials sichtbar ist. Zellklumpen werden als eine Zelle gezählt, wenn die Zelleinheit(en) nicht sauber
voneinander getrennt ist/sind. Siehe auch Bilder 2 und 3.

Makrophage PMN Lymphozyt Epithelzellen

8 µm bis 30 µm
Das Verhältnis zwischen
Zytoplasma/Kernen ist groß.
Phagozytose, antigene
Erscheinung, Absonderung von
Chenotaktin
10 µm bis 14 µm 5 µm bis 10 µm 10 µm bis 14 µm
90 % akute Das Verhältnis zwischen Zellkerne rund
Brustdrüsenentzündung, 60 % Zytoplasma/Kernen ist klein. Zytoplasma schwächer gefärbt
chronisch Kerne intensiv gefärbt,
Das Verhältnis zwischen T Helfer, T Hemmer, B Zelle
Zytoplasma/Kernen ist klein.
Phagozytose.
Erster Hinweis auf Abwehr
gegen Brustdrüsenentzündung.

Bild 1 — Beispiele von Zellen

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EN ISO 13366-1:2008 (D)

Zellenlänge: L1 = 9,79 µm und L2 = 2,77 µm

Bild 2 — Beispiele von Zellen von Sammelkuhmilch (1 000-fache Vergrößerung)

(500-fache Vergrößerung)

(1 000-fache Vergrößerung)

Zellenlänge: L22 = 9,08 µm; L23 = 8,27 µm; L24 = 4,95 µm; L25 = 7,39 µm; L26 = 6,37 µm; L27 = 3,58 µm

Bild 3 — Beispiele von Zellen von Sammelkuhmilch

Im Beispiel eines Klumpens, wie in Bild 3 gezeigt, konnten fünf Zellen gezählt werden. L27 ist auszulassen,
weil der Durchmesser geringer als 4 µm ist.

ANMERKUNG Die Ausbildung und Fertigkeit des Analytikers ist der wichtigste entscheidende Erfolgsfaktor für eine
ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens. Eine wiederholte Durchführung des Verfahrens und Beteiligung an
Ringversuchen sind notwendige Faktoren, um ein korrektes Niveau der Zählung abzusichern.

Im Allgemeinen sind die Zellen in Milch gemäß einer Poisson-Verteilung (siehe Anhang C) verteilt. Die
Mindestanzahl (N) der Zellen, die im Verhältnis zum Zellzählungsniveau zu zählen ist, um auf den
aufgeführten Variationskoeffizienten zu kommen, ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Für eine ordnungsgemäße Ausführung des Verfahrens ist es unerlässlich, dass die aufgeführte Mindestanzahl
an Zellen gezählt wird. Auszuzählende Felder und Streifen müssen so gewählt werden, dass eine für den
gesamten Ausstrich repräsentative Zählung erhalten wird.

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 DIN EN ISO 13366-1:2008-06
EN ISO 13366-1:2008 (D)

Tabelle 1 — Mindestanzahl (N) der Zellen

Konzentration CV N
(× 1 000 Zellen/ml) % Zellen
< 150 10 100
150 bis 250 7 200
250 bis 400 6 300
≥ 400 5 400

8.2.2 Auszählung in aufeinander folgenden Feldern

Kerne werden in aufeinander folgenden Feldern in vertikalen Streifen in regelmäßig räumlich eingeteilten
Feldern (siehe Bild 4 und Tabelle 1) ausgezählt:

a) Begonnen wird bei einem Abstand dL von der linken Seite. Bei runden Flächen wird bei einem
ausreichenden Abstand dL von der linken Seite des horizontalen Durchmessers begonnen, sodass
ermöglicht wird, ein Minimum von 5 Feldern vom oberen Ende des Streifens auszuzählen. Ein Abstand dL
von 0,5 mm ist geeignet für beide rechteckige und kreisrunde Flächen.

b) Die obere oder untere Ecke des Feldumfanges wird tangential auf den inneren oberen oder unteren Rand
der Schablone eingestellt (der Letztere sollte nicht in dem Feld erscheinen). Im Fall einer unbedeckten
Oberfläche nahe des Randes der Schablone wird das Feld auf den Rand des Ausstriches angepasst.

c) Nachdem das erste Feld ausgezählt wurde, wird das Objektiv mit einem festgelegten räumlichen Abstand
dH unter oder über der nächsten Abstufung in die Richtung der unteren oder oberen Ecke bewegt, und
das neue Feld wird ausgezählt. Ein Abstand dH von 1 mm wird für geeignet gehalten.

d) Von dem Feld, das zuletzt ausgezählt wurde, wird der Arbeitsvorgang nach c) wiederholt, bis der Punkt
beginnend von der gegenüberliegenden Richtung (nach unten oder nach oben) auf dem Streifen erreicht
wurde. Es wird zwischen beiden folgenden Optionen gewählt:

 Option 1: Das letzte Feld ist nicht auszuzählen.

 Option 2: Wenn der untere oder obere Rand erscheint und dieser weniger als die Hälfte der
Feldoberfläche ausfüllt, ist die Zählung durchzuführen, nachdem das Objektiv nach oben bewegt
wurde, bis der Rand wieder vollständig aus dem Feld verschwindet, das dann nur vom Ausstrich
bedeckt ist.

e) Dann wird das Objektiv nach rechts mit einem Abstand dW bewegt (z. B. dW = 1,5 mm oder dW = 2 mm
abhängig von der benötigten Anzahl der Felder), und ein neuer Streifen wird in der entgegengesetzten
Richtung begonnen (oben oder unten).

f) Von b) bis e) wird wiederholt, bis die rechte Seite auf der Schablone erreicht ist.

g) Falls eine unzureichende Anzahl von Feldern ausgezählt wurde (siehe Tabelle 1), können ergänzende
Felder ausgezählt werden. Dabei wird das Mikroskopobjektiv an anderer Stelle so fokussiert (z. B. durch
Veränderung des Anfangsortes und/oder Anpassung der sich Schritt für Schritt bewegenden Abstände)
bis eine geeignete Feldanzahl erreicht wird, die repräsentativ für den gesamten Ausstrich ist.

h) Das Ergebnis wird, wie in 9.1 für eine rechteckige Fläche beschrieben oder wie in 9.3 für eine kreisrunde
Fläche beschrieben, berechnet.

ANMERKUNG Bei rechteckigen Flächen sind 5 Felder mit 1 mm Abstand in vertikalen Streifen und 10 Streifen mit
2 mm Abstand möglich, wodurch die Auszählung von 50 Feldern ermöglicht wird. Ungefähr die gleiche Anzahl von
Feldern wird bei kreisrunden Flächen bei Verwendung gleicher Abstände erhalten. Die Abstände der Verschiebungen
(Zwischenräume) werden vom gleichen Ort auf den Feldern mit der Feineinstellung (Ausrichtung auf der oberen oder
unteren Kante) gemessen, damit sie den Felddurchmesser enthalten.

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8.2.3 Auszählen einer rechteckigen Fläche mit Streifen

Kerne werden in regelmäßig räumlich angeordneten Streifen (siehe Bild 5 und Tabelle 1) gezählt:

a) Begonnen wird bei einem Abstand dL von der linken Seite. Ein Abstand dL von 0,5 mm ist als geeignet
anzusehen.
b) Mit dem Auszählen wird von dem oberen oder unteren Rand der rechteckigen Fläche begonnen. Der
Rand der Fläche ist in der Mitte des Gesichtsfeldes im Mikroskop anzuordnen. Nachdem alle Zellen
ausgezählt wurden, wird das Objektiv in die Richtung des gegenüberliegenden Randes bewegt, und alle
Zellen, die in diesem Streifen bis der gegenüberliegende Rand erreicht ist, erscheinen, werden
ausgezählt. Die Anzahl der gezählten Zellen wird festgehalten.
c) Dann wird das Objektiv mit einem Abstand dW nach rechts bewegt, und ein neuer Streifen wird
ausgezählt (z. B. dW = 3 mm bis dW = 4 mm, abhängig von der Anzahl der benötigten Streifen, die für eine
repräsentative Auszählung des gesamten Ausstrichs notwendig sind.)

Bis die rechte Seite der Schablone erreicht ist, wird b) und c) wiederholt.

Im Fall einer unzureichenden Anzahl von ausgezählten Streifen (siehe Tabelle 1) können zusätzliche Streifen
ausgezählt werden. Dabei wird das Mikroskopobjektiv auf andere Stellen fokussiert (z. B. durch Verändern
des Ausgangsortes und/oder Anpassen von dW), damit eine geeignete Streifenanzahl erreicht wird, die
repräsentativ für den gesamten Ausstrich ist.

Das Ergebnis wird, wie in 9.2 beschrieben, berechnet.

Legende
1 herunter bis zur unteren Ecke

Bild 4 — Vertikale Streifen in regelmäßig räumlich eingeteilten Feldern

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Bild 5 — Regelmäßig räumlich angeordnete vertikale Streifen

9 Berechnung und Darstellung der Ergebnisse

9.1 Auszählen einer rechteckigen Fläche in aufeinander folgenden Feldern

Überprüft werden die 20,0-mm- und 5,0-mm-Zielwerte für die Länge Ls und die Weite Ws des Ausstriches
mithilfe der Einteilungen und Feineinstellung des Mikroskops.

Nach folgender Gleichung wird die Gesamtkonzentration c der Zellen berechnet:

Ws × Ls × N t 1
c= 2
× (1)
§D · d
ʌ × ¨¨ f ¸¸ × N f × Vm
© 2 ¹

oder

ªN 1º
c = fw × « t × »
¬ Nf d ¼

oder mit dem konstanten Arbeitsfaktor fw

W s × Ls
fw =
2
§D ·
π × ¨¨ f ¸¸ × Vm
© 2 ¹

Dabei ist

c die Gesamtkonzentration, angegeben in Anzahl der Zellen je Milliliter;

Ws die Weite des Ausstriches, in Millimeter;

Ls die Länge des Ausstriches, in Millimeter;

Nt die Gesamtanzahl der gezählten Zellen;

Df der Durchmesser des Gesichtsfeldes im Mikroskop, in Millimeter;

Nf die Anzahl der vollständig ausgezählten Felder;

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Vm das Volumen der ausgestrichenen Untersuchungsprobe (siehe 8.1.1 oder 8.1.2), in Milliliter [wenn
die modifizierte Newman-Lampert-Farbarbeitslösung für die Färbung (8.1.1) verwendet wurde:
Vm = 0,01 ml. Wenn die Ethidiumbromid-Farblösung für die Färbung (8.1.2) verwendet wurde:
Vm = 0,005 ml];

d der in 7.2 verwendete Verdünnungsfaktor (falls keine Verdünnung notwendig war, d = 1, mit einer
1 : 1-Verdünnung, d = 0,5).

9.2 Auszählen einer rechteckigen Fläche mit Streifen

Überprüft werden die 20,0-mm- und 5,0-mm-Zielwerte für die Länge und die Weite des Ausstriches mithilfe
der Einteilungen und Feineinstellung des Mikroskops.

Nach folgender Gleichung wird die Gesamtkonzentration c der Zellen berechnet:

Ws × N t 1
c= × (2)
Df × N b × Vm d

oder

ªN 1º
c = fw × « t × »
¬ b
N d ¼

mit dem konstanten Arbeitsfaktor fw

Ws
fw =
Df × Vm

Dabei ist

Nb die Anzahl der vollständig ausgezählten Streifen.

Die anderen Symbole sind in 9.1 definiert.

9.3 Auszählen einer kreisrunden Fläche in aufeinander folgenden Feldern

Überprüft wird der 11,28-mm-Durchmesser des Ausstriches mithilfe der Einteilungen und Feineinstellung des
Mikroskops.

Nach folgender Gleichung wird die Gesamtkonzentration c der Zellen berechnet:

D2 × Nt 1
c
c= × (3)
Df2 × N f × Vm d

oder

ªN 1º
c = fw × « t × »
¬ Nf d ¼

mit dem konstanten Arbeitsfaktor fw

Dc2
fw =
Df2 × Vm

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Dabei ist

Dc der Durchmesser des Ausstrichs, in Millimeter.

Die anderen Symbole sind in 9.1 definiert.

9.4 Darstellung der Ergebnisse

Das Untersuchungsergebnis wird in ganzen Tausenderziffern angegeben (z. B. 401 586 Zellen/ml werden als
402 000 Zellen/ml angegeben).

10 Präzision
Die Werte für die Wiederholpräzision und Vergleichpräzision wurden durch das Ergebnis eines Ringversuchs
erhalten, der nach ISO 5725-1 und ISO 5725-2 durchgeführt wurde. Einzelheiten des Ringversuches sind im
Anhang A zusammengefasst.

Die Werte können auf andere Konzentrationsbereiche und Matrizes als die angegebenen nicht anwendbar
sein.

10.1 Wiederholpräzision

Die absolute Differenz der Ergebnisse von zwei voneinander unabhängigen Bestimmungen, die nach dem
gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial durch einen einzigen Bearbeiter in demselben
Labor mit derselben Geräteausstattung innerhalb einer kurzen Zeitspanne ermittelt werden, sollte in nicht
mehr als 5 % der Fälle größer sein als die in Tabelle 2 angegebenen Werte.

Tabelle 2 — Wiederholpräzisionswerte

Konzentration sr r
(× 1 000 Zellen/ml) (× 1 000 Zellen/ml) (× 1 000 Zellen/ml)
245 38 107
455 43 121
679 69 192
791 110 308

10.2 Vergleichpräzision

Die absolute Differenz der Ergebnisse von zwei voneinander unabhängigen Bestimmungen, die nach dem
gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen Labors innerhalb einer kurzen
Zeitspanne ermittelt wurden, sollte in nicht mehr als 5 % der Fälle größer sein als die in Tabelle 3
angegebenen Werte.

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Tabelle 3 — Vergleichpräzisionswerte

Konzentration sR R
(× 1 000 Zellen/ml) (× 1 000 Zellen/ml) (× 1 000 Zellen/ml)
245 41 114
455 62 174
679 78 218
791 110 308

11 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht ist anzugeben:

a) alle zur vollständigen Identifizierung der Probe erforderlichen Angaben;

b) das Verfahren, nach dem die Probenahme durchgeführt wurde (falls bekannt);

c) das verwendete Untersuchungsverfahren nach diesem Teil von ISO 13366|IDF 148;

d) alle Arbeitsbedingungen, die nicht in diesem Teil von ISO 13366|IDF 148 festgelegt sind oder als wahlfrei
erachtet wurden, sowie alle Umstände, die das (die) Ergebnis(se) beeinflusst haben können;

e) das/die erhaltene(n) Untersuchungsergebnis(se) oder, falls die Wiederholpräzision (r) überprüft wurde,
das endgültige erhaltene Ergebnis.

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Anhang A
(informativ)

Ringversuch

A.1 Allgemeines
Ein internationaler Ringversuch für Kuhmilch, an dem 18 Laboratorien und 13 Länder beteiligt waren, wurde
im Oktober 2005 durchgeführt. Der Versuch enthielt 8 Proben von vier Niveaus an Zellen/ml, die in 16
Doppelblindproben geteilt wurden.

Die Mittelwerte für jedes Niveau waren in dieser Reihenfolge:

 Niveau 1, Probe A und B: 245 000 Zellen je ml;

 Niveau 2, Probe C und D: 455 000 Zellen je ml;

 Niveau 3, Probe E und F: 679 000 Zellen je ml;

 Niveau 4, Probe G und H: 791 000 Zellen je ml.

Der Versuch wurde vom A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Maccaresa — Roma (Italien) organisiert, das auch
die statistischen Analysen nach ISO 5725-1 und ISO 5725-2 durchführte, wobei sich die in Tabelle A.1
aufgeführten Präzisionsdaten ergaben.

Tabelle A.1 — Ergebnis des Ringversuchs

Niveau Niveau Niveau Niveau

Parameter
1 2 3 4
Anzahl der beteiligten Laboratorien
24 23 24 24
nach Eliminierung der Ausreißer
Mittelwert (× 1 000 Zellen/ml) 245 455 679 791
Wiederholstandardabweichung sr
38 43 69 110
(× 1 000 Zellen/ml)
Variationskoeffizient der
169 9 10 14
Wiederholpräzision (%)
Wiederholgrenze r (2,8 × sr)
107 121 192 308
(× 1 000 Zellen/ml)
Vergleichstandardabweichung sR
41 62 78 110
(× 1 000 Zellen/ml)
Variationskoeffizient der
17 14 11 14
Vergleichpräzision (%)
Vergleichgrenze R (2,8 × sR)
114 174 218 308
(× 1 000 Zellen/ml)

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Anhang B
(informativ)

Färben von Ziegenmilch

B.1 Farblösungen für Ziegenmilch [8]

B.1.1 Carnoyǥs Fixiermittel

B.1.1.1 Zusammensetzung

Chloroform 60 ml
Eisessig 20 ml
100%iger Ethylalkohol 120 ml

B.1.1.2 Herstellung

Nacheinander werden das Chloroform und der Eisessig in den Ethylalkohol gegeben und durchmischt.

B.1.2 Pyronin-Y-Methylgrün-Farblösung

B.1.2.1 Zusammensetzung

Pyronin Y 1,0 g
Methylgrün 0,56 g
demineralisiertes Wasser 196 ml

B.1.2.2 Herstellung

Nacheinander werden das Pyronin Y und das Methylgrün in eine Flasche mit demineralisiertem Wasser
gegeben. Durch einen geeigneten Filter (5.2) wird filtriert und das Filtrat in einer braunen Flasche aufbewahrt.
Vor der Verwendung wird die Lösung wieder durch einen geeigneten Filter (5.2) gefiltert.

B.2 Vorbereitung des Ausstriches

Der Objektträger ist nach dem folgenden Färbungsschema zu behandeln:

1) Carnoyǥs Fixiermittel (B.1.1) für 5 min;

2) 50%iger Ethanol für 1 min;

3) 30%iger Ethanol für 1 min;

4) Wasser für 1 min;

5) Pyronin-Y-Methylgrün-Farblösung (B.1.2) zum Färben für 6 min;

6) kurz mit n-Butylalkohol und dann mit Xylol spülen;

7) die Objektträger werden staubgeschützt aufbewahrt.

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Anhang C
(informativ)

Poisson-Verteilung

Im Allgemeinen sind Zellen in der Milch nach der Poisson-Verteilung verteilt. Die Poisson-Verteilung setzt
voraus, dass:

M = V = s2

Dabei ist

M der Mittelwert;

V die Varianz;

s die Standardabweichung.

Der Variationskoeffizient CV ist dann:

s
CV = × 100 %
M

oder

100 %
CV =
s

oder

100 %
CV =
M

Dabei ist M der Mittelwert, der, sofern die somatischen Zellen ausgezählt wurden, die Anzahl der
ausgezählten Partikel (Zellen) ist.

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Literaturhinweise

[1] ISO 707|IDF 50, Milk and milk products — Guidance on sampling

[2] ISO 5725-1, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1:
General principles and definitions

[3] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic
method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method

[4] ISO 13366-2|IDF 148-2, Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of
fluoro-opto-electronic counters

[5] Department of Health and Human Services. Public Health Services. Food and Drug Administration.
Milk laboratory evaluation form. „Direct microscopic somatic cell count“ form fda/2400d, check list

[6] Packard, V. S. et al. 1992. Direct microscopic methods for bacterial or somatic cells. In Standard
methods for the examination of dairy products. American Public Health Association. Washington, DC,
S. 309–325

[7] Dulin et al. 1982, Differentiation and enumeration of somatic cells in goat milk. J. Food Prot., 45,
S. 435–439

[8] Quervel, X. und Trossat, Ph., 2005, Study report — Enumeration of somatic cells in goat milk. Cecalait
(France)

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