CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

La Cromatografía en capa fina (Thin layer chromatography, TLC) es un método muy

valioso utilizado en química y bioquímica para la separación y análisis de una amplia
variedad mezclas de moleculares. Las TLC’s se pueden utilizar para separar mezclas de
iones inorgánicos, moléculas orgánicas y compuestos biorgánicos tales como pigmentos,
lípidos, aminoácidos, nucleótidos y azúcares. La placa de la TLC consiste típicamente en
una gruesa capa de 0,1 mm de material adsorbente unido a una capa o soporte de plástico.
El adsorbente se compone de muchas placas microscópicas. Estas superficies proporcionan
un área grande para la separación cromatográfica. Después se aplica un pequeño volumen
de solución de muestra a la superficie adsorbente y se deja secar, la placa se coloca en un
vaso de precipitados que contiene el disolvente apropiado. Sólo el borde de la placa más
cercano a las muestras está en contacto con el disolvente. El disolvente se introduce en el
material adsorbente seco y se desplaza hacia arriba a través de la placa arrastrando las
muestras. La tasa de migración de los componentes de la muestra sobre el adsorbente
depende de su estructura química.
la TLC puede ser, de acuerdo con la composición de la capa cromatográfica y de su forma
de preparación, bien de reparto o de adsorción. Así, si la capa de adsorbente se deposita
como una suspensión acuosa que se deja secar a temperatura ambiente (caso más
frecuente), será la película de agua depositada sobre las partículas de adsorbente quien
actuará de fase estacionaria, por lo que con solventes orgánicos la partición supondrá, al
menos mayoritariamente, equilibrios de reparto líquido-líquido (cromatografía de reparto).
Por el contrario, si la capa de adsorbente se seca por calentamiento en estufa, la partición
supondrá equilibrios de adsorción sólido líquido (cromatografía de adsorción).
En este método se utilizan como soporte placas de vidrio, plástico, aluminio, etc. en las que
se deposita una fina capa de adsorbente (gel de sílice, almidón, polvo de celulosa, etc.)
cuyo espesor puede ajustarse a conveniencia. En el mercado se encuentran disponibles ya
fabricadas placas comerciales.
A la altura de 1,5 cm (aproximadamente) de una de las bases se marca débilmente con un
lápiz fino una línea teniendo cuidado de no romper la capa adsorbente. Esta línea servirá de
base para situar las muestras a analizar. Con una micropipeta de vaciado automático se
depositan 5 µl sobre un punto o varios en la línea de base (línea de aplicación) teniendo
siempre cuidado de no tocar la placa con la punta de la pipeta para no dañarla.
Tras aplicación de la muestra, se deja secar a temperatura ambiente o con ayuda de un
pequeño secador. A continuación la placa se introduce en una cubeta que contiene el
disolvente de desarrollo adecuado en cada caso, cuyo nivel no debe nunca llegar a la línea
de siembra. Su ascenso por capilaridad produce el efecto cromatográfico. Si se realizan dos
desarrollos consecutivos con eluyentes apropiados en cada caso, se habla de cromatografía
bidimensional. Las sustancias se visualizan en la placa una vez desarrollada mediante su
color, absorción ultravioleta o revelado específico que produce una reacción coloreada.
Para su cuantificación, se raspa la parte donde se ubique el componente que se quiere
medir, se extrae con los disolventes adecuados y se analiza según el método empleado.
La diversidad de adsorbentes y eluyentes disponibles, permiten que esta técnica sea de
utilidad para separar e identificar un amplio repertorio de biomoléculas: aminoácidos,
hidratos de carbono, lípidos, proteínas, etc.
Una vez revelada la placa se puede establecer un coeficiente de relación entre la distancia
alcanzada por el frente y la distancia alcanzada por una sustancia específica, a esta relación
se conoce con el nombre de Rf.
(Rf = distancia de la sustancia/frente de la fase móvil).
.
La cromatografía de capa delgada es generalmente más rápida que la cromatografía sobre
papel y da valores de R más reproducibles. Se usa mucho para la identificación de
F
componentes en drogas, preparaciones bioquímicas y productos naturales.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC)

La cromatografía en columna se usa en la separación de grandes cantidades de material (por

ejemplo >100 mg).
Todas las geometrías cilíndricas posibles están comprendidas entre las dos configuraciones
extremas siguientes.
- Columnas capilares abiertas
Constituyen la configuración más sencilla. Se trata de un tubo hueco en cuya pared interior
se sitúa la fase estacionaria cromatográfica. Su dimensión característica, el diámetro interno
suele oscilar entre 100-500 µm para cromatografía de gases, 25-100 µm en cromatografía
de fluidos supercríticos y 3-20 µm en cromatografía de líquidos. Sus longitudes pueden
varias entre 10 y 100 m en cromatografía de gases y 1-35 m en cromatografía de fluidos
supercríticos, si bien en cromatografía de líquidos raramente exceden de 1 m.
- Columnas de relleno
Poseen la configuración más compleja. El tubo se rellena con un material granular que
puede actuar directamente como fase estacionaria o servir de soporte a la misma. La fase
móvil circula por los intersticios formados entre las partículas. Estas columnas poseen las
relaciones de fases más bajas, es decir, retenciones elevadas y los valores menores para la
permeabilidad. Su diámetro interno suele oscilar entre 100 µm para las columnas
capilares rellenas en cromatografía de líquidos y de fluidos supercríticos, y de varias
decenas de centímetros en unidades industriales. El tamaño medio de partículas que es la
magnitud más característica de la columna oscila también ampliamente, dependiendo de la
naturaleza de la fase móvil y la escala que desee utilizarse. Los tamaños menores se sitúan
en torno a 1-5 µm para cromatografía de líquidos. La figura 1.1 esquematiza el corte
transversal de una columna de este tipo.
Ilustración 1 Sección transversal de una columna abierta y otra de relleno

- Difusión longitudinal
Cuando una sustancia está disuelta en un fluido, sus moléculas se mueven al
azar difundiéndose de acuerdo con la ecuación de Einstein de la difusión
σ 2=2 Dt

Donde t es el tiempo que dura la difusión y D el coeficiente de la difusión o difusividad del

soluto en el fluido. Este fenómeno se produce en todas las direcciones del espacio, pero, en
una columna cromatográfica solamente contribuye a la dispersión la componente paralela al
eje de la columna.
- Dispersión en la fase móvil
Los fenómenos que se producen en la fase móvil pueden ser de una extraordinaria
complejidad. Cuando un fluido circula por un tubo cilíndrico recto, sin rellenos
ni irregularidades impulsado por un gradiente de presión mecánica, se produce
una distribución de velocidades, función de la distancia de cada punto al eje del tubo.
Para modelo de flujo laminar, que se puede aplicar sin problemas a los
procesos cromatográficos, la velocidad lineal máxima se produce en el eje del tubo y es el
doble de la velocidad media; en la lámina más próxima a la pared, la velocidad tiende a
cero

El tubo cilíndrico es la geometría más simple que puede tener una columna cromatográfica.
Cuanto más se complica la geometría, dándole forma helicoidal al tubo, utilizando distintos
tipos de rellenos, etc., mayores diferencias existen entre los tamaños y formas de los
canales por donde debe pasar la fase móvil y mayor será la dispersión de los valores
puntuales de la velocidad de fluido.
Otro fenómeno importante es la solubilidad, la cual se define como la cantidad máxima de
soluto que se puede diluir en un disolvente antes de comenzar a precipitarse, debe tomarse
en cuenta que la solubilidad depende de la temperatura. A su vez la solubilidad
está relacionada con la polaridad, pues los disolventes y los solutos de polaridad
semejante interaccionan entre si (son solubles) y los de polaridad diferente tienden a no
hacerlo.
Los datos experimentales directos que se producen en un proceso de
separación cromatográfica en columna son: El tiempo medio de permanencia de las
moléculas de un soluto en la columna. En cromatografía se le llama tiempo de retención
(t R ). Este tiempo se mide en el máximo de la distribución, que coincide con el centro de
gravedad en las distribuciones simétricas.
Durante el recorrido en una columna cromatográfica, las moléculas de un soluto se
distribuyen entre las fases móvil y estacionaria, permaneciendo un tiempo t en la
M
primera y otro tR 'en la segunda. Naturalmente t = t ' + t
R R M
Donde t se denomina tiempo básico* y se define como el tiempo medio que tarda en
M
recorrer la columna una sustancia que no se retiene en la fase estacionaria o, lo que es lo
mismo, el tiempo de retención de la fase móvil. A t ' se le denomina tiempo de
R
retención ajustado y es la magnitud relacionada con el tiempo que las moléculas del soluto
permanecen retenidas en la fase estacionaria. Las diferencias de esta magnitud
para distintos solutos reflejan la facilidad de su separación en el sistema.
El flujo cromatográfico. La velocidad lineal media de la fase móvil ´u, puede estimarse a
partir del tiempo básico y la longitud de la columna L
´ u=L/t M

- La retención cromatográfica
Cuando una zona cromatográfica progresa a lo largo de una columna y la fase móvil circula
a una velocidad lineal u, la velocidad de la zona, v, será inferior o igual a la de la fase
móvil, de tal manera que:
v=Ru
v =Ru
Donde los valores de R están comprendidos entre cero (para las sustancias que se quedan
retenidas en la columna) y la unidad (para las no retenidas). Si se tiene en cuenta que, en
una columna de longitud L, v = L / t y u= L /t , puede deducirse que
R M

tM
R= tR
R es el factor de retardo.

Esta magnitud se utiliza con mucha frecuencia en cromatografía por su facilidad de medida.
En la cromatografía en columna, la retención se suele expresar mediante el factor de
retención (k), que se define como la relación entre el tiempo de retención ajustado y el
tiempo básico.
 tR ' t −t
k= tM = R M t
El tiempo de retención se puede expresar como
tR=tM (1+ k )

Existe una evidente relación entre k y R, ya que son dos formas de medir el mismo
fenómeno. A partir de las ecuaciones anteriores se puede deducir que k = 1 - R / R
R
Para trabajar en una columna cromatográfica se debe seguir una serie de
pasos fundamentales tales como: el empaque, la adición, la elución y la recuperación.
En el empaque se debe poner especial atención, un error en este procedimiento puede
echar a perder los datos obtenidos experimentalmente, es decir, los datos no serán los reales
y por tanto no serán reproducibles por ser poco exactos. Se suele seguir el siguiente
esquema de empaquetamiento.

La cantidad de adsorbente con respecto a la altura/diámetro de la columna debe ser 10:1,

por ejemplo, para una columna de 1 cm de diámetro, la cantidad de adsorbente deberá ser
tal, que se alcance una altura de 10 cm.
La adición consiste en colocar la muestra a separar en la parte superior, en este punto
podemos diferir de la Fig. 1.3 la cual muestra la mezcla de sustancias debajo de la arena,
para muestras que no han sido estudiadas a profundidad lo recomendable es cambiar el
orden de colocación, dejando a la arena debajo de la muestra. La adición de los disolventes
puros generalmente es del menos polar al más polar.
Por otro lado, la elución significa dejar pasar el disolvente en la columna para comenzar
con la separación de los componentes de la mezcla (el tipo de elución corresponde a favor
de gravedad o a favor de corriente). En la parte superior de la columna se debe dejar un
volumen constante de eluyente de dos o tres centímetros cúbicos dependiendo de las
características específicas de cada columna, esto con el propósito de mantener
una concentración grande (si la concentración es baja se tiene el riesgo de estar
desperdiciando recursos por efectos de la difusión), también se evita romper la
homogeneidad de la capa de arena y de adsorbente.
Finalmente, la recuperación no es más que colectar los componentes ya separados, los
cuales vendrán diluidos en el disolvente y se diferenciarán por los distintos colores que
presentan (de acuerdo al disolvente usado).

https://www.researchgate.net/publication/341718125_CROMATOGRAFIA_EN_CAPA_F
INA_Y_COLUMNA

https://ri.conicet.gov.ar/bitstream/handle/11336/75465/CONICET_Digital_Nro.3655a360-
b03b-44c8-8519-bc747d073f7c_A.pdf?sequence=2&isAllowed=y
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/12%20CROMATOGRAFIA%20DE
%20CAPA%20FINA%20DE%20LIPIDOS.pdf

La cromatografía de capa fina, TLC, es un tipo de cromatografía donde la fase estacionaria

es una capa delgada de un material depositado sobre un soporte, a este conjunto se le llama
placa. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, llamada eluyente, que se
mueve por la fase estacionaria por capilaridad. Generalmente las placas están formadas por
una capa de gel de sílice u otro material con propiedades absorbentes
Para la obtención del cromatograma, la muestra se disuelve en muy poca cantidad de un
disolvente volátil. Si se va a utilizar patrones de alguna sustancia se preparan de la misma
manera. A continuación se dibuja una línea base con lápiz y unos puntos e referencia donde
se pincharán las muestras con un capilar.
Se debe preparar la cubeta donde se va a realizar la cromatografía. Esta cubeta es un
recipiente de vidrio donde se añade el eluyente a utilizar, siempre en un nivel inferior a la
línea base antes dibujada e la placa.
En la cubeta se introduce una tira de papel filtro para que el papel filtro del eluyente esté
por toda la cubeta.
En ese momento se introduce con cuidado la placa en la cubeta y se tapa, esperando a que
el nivel del eluyente ascienda por la placa.

Cuando el nivel se encuentra casi en el borde superior, se extrae la placa y se dibuja una
nueva línea en ese nivel. El disolvente al ser volátil se evapora en poco tiempo dejando la
placa seca.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELUCIÓN
El factor que más influye en la separación de los componentes e este tipo de cromatografía
es la polaridad de estos componentes.
La placa está formada por una capa de gel de sílice, una sustancia muy polar, y por lo tanto,
atraerá en mayor medida a componentes más polares.
Al realizar el cromatograma, las sustancias más polares interaccionarán más con el soporte
y su velocidad de desplazamiento será menor, lo que significa que al revelar la placa
cromatográfica, el componente más polar se encontrará en un lugar más cercano a la línea
base que se ha dibujado, y por el contrario, el componente menos polar se moverá más
rápido y se encontrará más alejado de la línea base.

La polaridad del eluyente es un factor que consigue que

los componentes semuevan más rápido o más lento en una cromatografía.
Es decir, para un eluyente con mayor polaridad, éste estará más atraído por el soporte y los
componentes serán más libres para moverse mejor, por lo que , al revelar la placa, los
componentes saldrán más alejados de la línea base.
ALICACIONES
La cromatografía en capa fina es un método útil y rápido que se puede usar para:
- Identificación de alguna sustancia conocida en una mezcla por su comparación
con un patrón de la sustancia pura.
- Medir el grado de pureza de una muestra, si existen varias manchas en el
cromatograma, es señal de que existen varios componentes en la muestra.
- Obtener una medida semicuantitativa de algún componente. Pinchando la misma
cantidad en la placa cromatrográfica, cuanto mayor sea la mancha obtenida en el
cromatograma, la concentración de una sustancia será mayor.