MICROBIOLOGIA: es la ciencia encargada del estudio de los microorganismos, seres vivos pequeños

(de mikros "pequeño", bios, "vida" y logos, "estudio"), también conocidos como microbios. Es la rama de
la biología dedicada a estudiar los organismos que son sólo visibles a través del microscopio:
organismos procariontes y eucariontes simples. Son considerados microbios todos los seres vivos
microscópicos, estos pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños
agregados celulares formados por células equivalentes (sin diferenciación celular); estos pueden
ser eucariotas (células con núcleo) tales como hongos y protistas, procariotas (células sin núcleo definido)
como las bacterias]. Sin embargo la microbiología tradicional se ha ocupado especialmente de los
microorganismos patógenos entre bacterias, virus y hongos, dejando a otros microorganismos en manos de
la parasitología y otras categorías de la biología.

Tipos de microbiología
El campo de la microbiología puede ser dividido en varias sub-disciplinas:

• Fisiología Microbiana: estudio a nivel bioquímico del funcionamiento de las células microbianas.
Incluye el estudio del crecimiento, el metabolismo y la estructura microbianas.

• Genética Microbiana: estudio de la organización y regulación de los genes microbianos y como éstos
afectan el funcionamiento de las células. Está muy relacionada con la biología molecular.
• Microbiología Clínica: estudia la morfología de los microbios.
• Microbiología Médica: estudio del papel de los microbios en las enfermedades humanas. Incluye el
estudio de la patogénesis microbiana y la epidemiología y está relacionada con el estudio de
la patología de la enfermedad y con la inmunología.
• Microbiología Veterinaria: estudio del papel de los microbios en la medicina veterinaria.
• Microbiología Ambiental: estudio de la función y diversidad de los microbios en sus entornos
naturales. Incluye la ecología microbiana, la geomicrobiología, la diversidad microbiana y
la biorremediación.
• Microbiología Evolutiva: estudio de la evolución de los microbios. Incluye la sistemática y la
taxonomía bacterianas.
• Microbiología Industrial: estudia la explotación de los microbios para uso en procesos industriales.
Ejemplos son la fermentación industrial y el tratamiento de aguas residuales. Muy cercana a la
industria de la biotecnología.
• Aeromicrobiología: estudio de los microorganismos transportados por el aire.
• Microbiología de los Alimentos: estudio de los microorganismos que estropean los alimentos.
• Microbiología Espacial: Estudio de los microorganismos presentes en el espacio extraterrestre, en
las estaciones espaciales, en las naves espaciales.

BACTERIOLOGÍA: Es una sub-disciplina de la microbiología. Es el estudio de las bacterias y las

enfermedades que éstas provocan. Queda incluida la cadena epidemiológica (reservorio, mecanismos de
transmisión, inmunidad, factores que hacen que existan más o menos defensas contra ellas...)

BACTERIAS: son seres microscópicos estudiadas mediante microscopios ópticos en preparaciones teñidas o
sin teñir (en fresco) para estudiar su estructura o morfología, pero para estudiar su estructura interna se
necesita un microscopio electrónico.
ESTRUCTURA BACTERIANA

• PARED CELULAR: Es una característica de las bacterias y es una pared que está por encima de la
membrana citoplasmática con función exoesquelética. La pared tiene poros y es una parte morfológica
que tienen TODAS las bacterias ya que es importante para su supervivencia porque incluso la presión
osmótica interna hace que la pared le dé una rigidez. A veces algunas bacterias pierden esta pared y
se convierten en PROTOPLASTOS.

Hay unas bacterias (sólo de un tipo) que NO tienen pared celular: las del género Mycoplasma que tiene 2
especies:

• M. Hominis

• M. Pneumonie
•

Son las únicas bacterias que no tienen pared celular.

Familia: Mycoplasmae

Género: Ureoplasma (con pared) - Mycoplasma

Especie: M. hominis M. Pneumonie

El mucopéptido (polímero) más importante que forma la pared celular y el más característico de las células
procariotas es la MUREÍNA, la célula sintetiza esta mucoproteína para hacer su pared y hay antibióticos que
actúan sobre la pared celular inhibiendo la producción de la proteína.

• MEMBRANA CITOPLASMÁTICA: Vital para la supervivencia de TODAS las células. Es

semipermeable (sometida a las leyes de la OSMOSIS). Está formada por una estructura de lípidos
(bicapa fosfolipídica) y proteínas.

• CITOPLASMA: Donde se encuentran las substancias internas, orgánulos, ribosomas (encargados de

la síntesis de proteínas), inclusiones citoplasmáticas (algunas de ellas puedes ser cromáticas, pueden
tener color), vacuolas...

• CÁPSULA: ALGUNAS bacterias pueden formarla.

TAMAÑO: El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 μm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10 μm.
Las bacterias de interés médico tienen un tamaño entre 0.4 y 2 μm. Solo son visibles entonces, al microscopio
óptico o microscopio electrónico. Para observarlas con el microscopio óptico se usa el objetivo de inmersión
(100X), sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersión) en el preparado a observar. A
modo comparativo, una célula eucariota mide más de 5 μm (un eritrocito tiene un diámetro de 7μm), mientras
que un reovirus mide menos de 0.1μm. Su tamaño pequeño determina una relación entre la superficie y el
volumen elevado, con alta tasa metabólica.

CLASIFICACIÓN BACTERIANA.

Las especies están divididas en CEPAS y CLONES.

• Cepa: cultivo puro derivado de 1 SOLO aislamiento (grupo de gérmenes)

• Clon: cultivo formado por los descendientes de 1 SOLA bacteria (1 sólo germen)

En una cadena epidemiológica es muy importante saber cual es el FOCO de infección original, si es de una
misma cepa o de diferentes para investigar su diseminación en la población. Hay una CEPA TIPO que ha
partir de ella se hacen las comparaciones y se conocen las características y a partir de ella también se
clasifican el resto.

Las ESPECIES también se acaban dividiendo en subespecies, etc. Todo esto es importante desde el punto de
vista epidemiológico para saber el origen de las especies y saber en qué han variado como p.ej.
patogeneidad, etc...

Todas estas clasificaciones se hacen de acuerdo a muchos criterio y características:

• Fenotípicas (que se manifiestan):

Genotipo: gen que contiene información de las características

Fenotipo: es lo que manifiesta en el organismo

• Genotípicas

• Fisiológicas (unas necesitan una temperatura de crecimiento determinado, otras son sensibles a unos
ambientes...)
 • Nutricionales (heterótrofos, autótrofos)

• Características de afinidad al medio de cultivo

• Bioquímicas (pH, iones...)

• Tinción (gram +, gram -)

• Estructurales

Hoy en día, la forma más usual, aunque nueva, de clasificación es la GENÉTICA (características
Genotípicas). A través de la cual se ha conseguido que las bacterias tengan unas similitudes muy importantes
(70-80%). Pero las clasificaciones bacterianas siguen siendo muy variadas, van cambiando y actualizándose.

Según su morfología: La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared
celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de
bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas últimas se encuentran: Treponema, Borrelia y
Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varían en el número de vueltas, desde pocas (Borrelia) a muchas
(Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras después de la división celular, pero
conservando siempre la independencia celular. Si el plano de división es único, podemos encontrar
diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género Streptococcus). Si los planos de división son
muchos, los cocos pueden agruparse en tétradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy
cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, en
cadenas, en filamentos o formando letras chinas (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma
de coma (Vibrio cholerae).

La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el microscopio electrónico, dado el
tamaño pequeño de estos microorganismos. El más usado en el laboratorio es el microscopio óptico de
campo claro, pero existen otros como el microscopio óptico de campo oscuro en los que los organismos
aparecen brillantes en fondo oscuro. Este microscopio permite la visualización de bacterias difíciles de
colorear como el Treponema pallidum, agente de la sífilis.

Las bacterias pueden observarse sin tinción (examen en fresco) si se las coloca en glicerol o soluciones no
acuosas que aumenten el índice de refracción o con tinción usando distintas coloraciones que mejoran su
visualización ya que son células incoloras. Dichas tinciones se basan en la afinidad que presentan los
colorantes por las estructuras bacterianas. Los colorantes catiónicos por ejemplo, son atraídos por los
componentes de carga negativa como los ácidos nucleicos y los polisacáridos. Ejemplo de este tipo son: el
azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
 Figura 2. Morfología:
1. cocos;
2. diplococo;
3. cocos en cadenas;
4. cocos en racimos;
5. cocos en tetradas;
6. cocobacilos;
7. bacilos;
8.bacilos bordes redondeados;
9. bacilos bordes rectos;
10. bacilos fusiformes;
11, 12. bacilos curvos;
13 al 15. espiroquetas

El examen en fresco no es el más usado para observar la

morfología bacteriana porque las bacterias tienen citoplasma
incoloro y su índice de refracción no difiere mucho del vidrio
y del agua.

Las coloraciones que se usan para teñir los preparados de

bacterias, se pueden dividir en: simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo el azul de
metileno, nos permiten observar la existencia de bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de
esporos y la existencia de otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo la coloración de Gram y la de
Ziehl Nielseen) además de lo anterior, permiten la diferenciación de las bacterias porque usan diferentes
colorantes que se comportan distinto según el microorganismo en cuestión. Las tinciones especiales se usan
para objetivar distintas estructuras como la cápsula, el núcleo,los flagelos, los esporos, etc. Antes de la
coloración hay que realizar la preparación y la fijación del frotis. La preparación del frotis consiste en extender
homogéneamente la muestra (por ejemplo un cultivo bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una
lámina. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por ejemplo con calor).

Con la fijación del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesión a la lámina y la
conservación de su morfología. Después de preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier tipo de
coloración (simple o diferencial).

La coloración de Gram es la más usada en bacteriología; debe su nombre a quién la describió en 1884. Es
una coloración diferencial, dado que las bacterias pueden clasificarse según su respuesta en grampositivas o
gramnegativas. Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo. La
diferente reacción de las bacterias a la
coloración de Gram se relaciona con diferencias fundamentales de la envoltura celular de estas dos clases de
células.

En el cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su tiempo de aplicación y la diferente coloración que
adoptan las bacterias grampositivas y gramnegativas en cada paso de la coloración de Gram.
Cuadro 1. Tinción de Gram

Tiempo de Bacterias Bacterias

Solución aplicación grampositivas gramnegativas

Colorante: cristal violeta 30 s Violeta Violeta

Mordiente: lugol 1min Violeta Violeta
Decolorante: alcohol
10-15 min Violeta Incolora
Acetona
Colorante de contraste:
1min Violeta Rosada
safranina

Macroscópica: La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como colonias cuando
se las siembra en medios de cultivo sólidos adecuados. Requieren una incubación de aproximadamente 24
horas en una atmósfera que favorezca su desarrollo, a temperatura óptima. Existen excepciones como M.
tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a ocho semanas de incubación.

Una colonia está constituida por los descendientes de una o unas pocas células. Las características de la
colonia también dependen de la movilidad de la bacteria. El tamaño puede variar desde 0.5 mm (Haemophilus
sp. o N. gonorrhoeae) a más grandes como las enterobacterias. La forma de la colonia puede ser circular
(Staphylococcus), irregular o filamentosa (Bacillus). Los bordes pueden ser ondulados (característicos de los
bacilos largos como Bacillus anthracis), en sierra o dentados (Yersinia pestis) o lisos (por ejemplo Proteus
vulgaris o Escherichia coli). La superficie de la colonia también es orientadora y puede ser: plana, convexa,
mamelonada, umbilicada (S. pneumoniae). En relación al pigmento que adquieren, éste puede ser: verde (P.
aeruginosa), amarillo (S. aureus), grisáceo (N. meningitidis). También es diferente el comportamiento frente a
la luz: brillante (Streptococcus) u opaca (Staphylococcus). Pueden presentar olores particulares como el frutal
de P. aeruginosa o el putrefacto de los anaerobios. Por último hay que destacar la consistencia: mucoide (M),
liso (S) o rugoso (R). Las colonias M tienen aspecto acuoso, brillante, propio de las bacterias capsuladas o
que forman cubiertas polisacáridas como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae. Los polímeros capsulares pueden ser específicos de grupo y son generalmente antigénicos. Entre
las bacterias patógenas, las formas capsuladas suelen ser más virulentas. Por otra parte, las colonias S son
de aspecto homogéneo, de textura uniforme y son características de microorganismos de tipo salvaje
recientemente aislados de su hábitat natural como las enterobacterias. Las colonias R son de aspecto
granulado, en general son cepas mutantes que carecen de proteínas o polisacáridos de superficie. Las formas
R de enterobacterias, por ejemplo, generalmente no son virulentas, en oposición a la mayor resistencia de las
bacterias procedentes de colonias S de tipo salvaje. Un cuarto tipo de colonia es la L y se asocia a la ausencia
de la pared celular como resultado de la exposición a antibióticos; en general estas formas vuelven a sintetizar
la pared celular una vez que el fármaco se extrae del medio.

Clasificación analítica: Las características analíticas de las bacterias se han utilizado también para clasificarlas
en géneros, especies y subespecies (cuadro 2-2). El patrón cromatográfico de los ácidos micólicos de la pared
celular es característico de un gran número de especies de micobacterias, por lo que durante muchos años se
ha utilizado en la identificación de las especies aisladas con mayor frecuencia. El análisis de los lípidos
presentes en la totalidad de la célula también es un método útil para la descripción de numerosas especies
bacterianas yde levaduras. Otras técnicas empleadas para la caracterización, fundamentalmente a nivel de
subespecie y con fines epidemiológicos, son el análisis de las proteínas celulares (análisis proteómico
mediante espectroscopia de masas) y las enzimas celulares (electroforesis enzimática tipomulti-
loci). Sin embargo, y pese a que estos métodos analíticos son precisos y reproducibles, requieren un gran
trabajo y una instrumentación muy cara. Por tal motivo, estos análisis se emplean principalmente ne los lab de
referencia.

Clasificación genotípica: El método más preciso de clasificación de las bacterias es el análisis de su material
genético. Aunque inicial-mente los microorganismos se clasificaron según la relación guanina/citosina, este
procedimiento se ha abandonado en gran medida a favor de otros métodos con mayor poder de
discriminación. Aunque la hibridación del ADN (ácidodesoxirribonucleico) se utilizó en un principio para
establecer la relación existente entre las cepas bacterianas (es decir, para determinar si dos cepas pertenecían
al mismo género o especie), más recientemente esta técnica se ha empleado para conseguir una rápida
identificación de los microorganismos mediante el uso de sondas moleculares. Se extrae el ADN del
microorganismo a identificar y se expone a unas sondas moleculares específicas de unas especies concretas.
La fijación de la sonda al ADN permite confirmar la identidad del microorganismo. Esta técnica también se ha
utilizado para la identificación directa de microorganismos en muestras clínicas, lo cual evita la necesidad de
cultivarlos. La hibridización del ADN también constituye una valiosa herramienta diagnóstica para la rápida
detección e identificación de microorganismos de crecimiento lento, como micobacterias y hongos.

Una ampliación del método de hibridación es el llamado análisis de secuencias de ácidos nucleicos. Se
utilizan sondas para localizar unas secuencias específicas en los ácidos nucleicos que son características de un
género, especie o subespecie determinado. Estas secuencias se amplifican hasta producir millones de copias, tras
lo cual se secuencia el material genético amplificado con el propósito de definir la identidad exacta de a cepa. La
aplicación más frecuente de este método es el análisis de secuencias de ADN ribosómico, puesto que existen tanto
secuencias de ADN muy conservadas (específicas de familia o de género) como secuencias muy variables
(específicas de especie o de subespecie). Esta técnica también se ha empleado para definir la relación evolutiva
existente entre distintos microorganismos, así como para identificar microorganismos de crecimiento difícil o
imposible. La mayor parte de los cambios recientes introducidos en la nomenclatura taxonómica se han relacionado
con la aplicación del análisis de secuencias de ácidos nucleicos. Una ampliación de este método es la
secuenciación del genoma completo de una bacteria, la cual es ya posible desde el punto de vista técnico, aunque
aún no se haya utilizado con fines diagnósticos.

Otros métodos utilizados fundamentalmente para clasificar los microorganismos a nivel de subespecie y con
fines epidemiológicos son el análisis de plásmidos, el ribotipado y el análisis de fragmentos del ADN
cromosómico. A lo largo de los últimos años se han simplificado los aspectos técnicos de todos estos
métodos hasta lograr que la mayor parte de los laboratorios clínicos utilicen diferentes variaciones en su
práctica habitual.

En los cuadros 2-4 a 2-8 se ofrece un esquema de clasificación de gran utilidad para organizar las numerosas
bacterias que se describirán en los capítulos posteriores del texto. Sin embargo, es preciso destacar que la lista
de microorganismos no es exhaustiva. De este modo, se han omitido muchos géneros que suelen aislarse en
las muestras clínicas con el fin de simplificar la presentación. Los microorganismos incluidos en estos cuadros
de resumen son aquellos que se estudiarán en los capítulos posteriores. Asimismo, debe tenerse en cuenta que
la organización exacta de las bacterias en familias, género y especie continua cambiando.
Clasificación fenotípica: Las morfologías microscópica y macroscópica de las bacterias fueron las
primeras características utilizadas para identificarlas y aún constituyen unos elementos fundamentales en la
mayoría de los algoritmos de identificación utilizados actualmente (cuadro 2-1). Por ejemplo, las bacterias se
pueden clasificar según su capacidad de retención de la tinción de Gram (microorganismos grampositivos y
gramnega-tivos) y por la forma de cada célula (cocos, bacilos, espirilos).Además, el aspecto macroscópico de
las colonias bacterianas (p. ej., las propiedades hemolíticas en un medio de agarsangre, la pigmentación, el
tamaño y la forma de las colonias y el olor de las colonias) también se emplea en la identificación de las
bacterias. Streptococcus pyogenes es una bacteria grampositiva que forma largas cadenas de cocos y
aparecen en forma de pequeñas colonias hemolíticas de color blanco en las placas de la sangre. Las
características morfológicas se utilizan para realizar una identificación provisional del microorganismo y poder
seleccionar otros métodos de clasificación con un mayor poder de discriminación, ya que muchos
microorganismos pueden presentar un aspecto muy similar en el examen macro y microscópico.

Los métodos más frecuentes y que todavía se utilizan en la identificación de las bacterias consisten en
determinar la presencia o la ausencia de unos marcadores bioquímicos específicos (p. ej., capacidad de
fermentación de hidratos de carbono específicos o la utilización de diferentes compuestos como fuente de
carbono para poder proliferar; presencia de proteasas, lipasas o nucleasas específicas; o presencia de enzimas
hidrolíticas específicas como lipasas y nucleasas). El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar
con un alto grado de precisión la mayoría de las cepas clínicamente significativas. Además, estos métodos se
han empleado para subdividir los grupos de microorganismos más allá del nivel de especie, principalmente con
fines epidemiológicos (p. ej., para determinar si un grupo de microorganismos pertenecientes al mismo género y
especie comparten un origen común o bien proceden de fuentes distintas). Estas técnicas son conocidas como
determinación del biotipo o biotipado.

Dado que numerosas bacterias poseen antígenos característicos, los anticuerpos utilizados para su detección
constituyen una potente herramienta diagnóstica (serotipado). Estas pruebas serológicas se realizan con el fin
de identifica microorganismos que son inertes frente a las pruebas bioquímicas (por ej., Francisella, el
microorganismo causante de la tularemia), cuyo cultivo es difícil o imposible (p. ej., Trepo-nema pallidum, el
microorganismo responsable de la sífilis), asociados a síndromes específicos (p. ej., el serotipo
0157de Escherichia coli, responsable de la colitis hemorrágica) o deben identificarse de forma rápida (p.
ej., S. pyogenes, responsable de la faringitis estreptocócica). Por otra parte, la determinación de los serotipos
se emplea también con fines epidemiológicos.

Otros ejemplos de los métodos fenotípicos utilizados en la clasificación de las bacterias son el estudio de los
patrones de sensibilidad del microorganismo frente a distintos antibióticos (antibiograma) y el
lisotipado (susceptibilidad a determinados virus que infectan a las bacterias). Las técnicas de susceptibilidad a
los antibióticos tienen un menor poder de discriminación. El lisotipado es una técnica engorrosa, por lo que
actualmente ha sido sustituida por técnicas genéticas con mayor sensibilidad.

Importancia: Los microbiólogos han hecho contribuciones a la biología y a la medicina, especialmente en los
campos de la bioquímica, genética y biología celular. Los microorganismos tienen muchas características que
los hacen "organismos modelo" ideales:

• Son pequeños, por lo cual no consumen muchos recursos.

• Algunos tienen tiempos de generación muy cortos (el tiempo necesario para que una célula
bacteriana se divida en dos en condiciones óptimas es de 30 minutos aprox. para E. coli y de 12 a
24 horas para Mycobacterium tuberculosis).
• Las células pueden sobrevivir fácilmente separadas de otras células.
 • Los eucariontes unicelulares se reproducen por división mitótica y los procariontes mediante fisión
binaria. Esto permite la propagación de poblaciones clónicas genéticamente iguales.
• Pueden permanecer congelados por grandes períodos de tiempo. Aún y cuando el 90% de las
células mueran en el proceso de congelación, existen millones de células en cada mililitro de
líquido corporal.

En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana,
lográndose una identificación bioquímica de muchas fracciones subcelulares; estos avances han permitido
ubicar a las bacterias en el reino Procaryotae. El conocimiento de las diferentes estructuras y composición ha
permitido comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como integrantes de la
flora normal o como agresoras para el mismo.
El descubrimiento de que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son inmunógenos importantes,
permitió el desarrollo de vacunas que han sido verdaderos avances en la medicina de los últimos años.
Ejemplo de ello son las vacunas contra microorganismos causantes de meningoencefalitis supurada como
Haemophilus influenzae tipo b y Neisseria meningitidis (meningococo) A, B y C. El conocimiento de la
composición bioquímica de las diferentes estructuras bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo
bacteriano, permite hoy la comprensión del mecanismo de acción de los diferentes antibióticos.
Recientemente, los avances de la genética bacteriana hicieron posible el desarrollo de técnicas de biología
molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y el diagnóstico. La observación al microscopio
óptico con distintas coloraciones y de los cultivos bacterianos,

MEDIOS DE CULTIVO: Para que las bacterias en un medio de cultivo crezcan adecuadamente deben reunir
una serie de condiciones como son temperatura, grado de humedad, preso de oxigeno adecuado, así como
una grado correcto de acidez o alcalinidad.

Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean como fuente de
energía, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos son los nutrientes.

Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo, Cu y Zn.

REQUERIMIENTOS DE LOS MICROORGANISMOS

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS: En función de la fuente de energía, los microorganismos se clasifican

en :

• Fotótrofos
• Quimiótrofos: Oxidan compuestos químicos.

REQUERIMIENTOS DE CARBONO: En función de la fuente de carbono, los microorganismos se clasifian

en :

• Autótrofos: CO2
 • Heterótrofos: Compuestos orgánicos carbonados.

Uniendo ambas clasificaciones, podemos clasificar los microorganismos en cuatro grupos:

• Fotoautótrofos: Luz + CO2. Bacterias fotosintéticas.

• Fotoheterótrofos: Algunas bacterias fotosintéticas.

• Quimioautótrofos o quimiolitotrofos: Descubiertos por Winogradsky, usan como fuente de energía

compuestos inorgánicos reducidos: NH4, NO2, H2, SH2, Fe++...

REQUERIMIENTOS DE NITRÓGENO: Los microorganismos son muy versátiles en cuanto a la forma de

conseguir el N:

Algunos organismos son capaces de fijar nitrógeno atmosférico (N2).

Otros lo toman en forma de NH4+.

Otros son capaces de usar NO3- o NO2- como fuente de amonio, reduciéndolo.

Algunos son capaces de utilizar aminoácidos como fuente de nitrógeno.

REQUERIMIENTOS DE AZUFRE: El azufre forma parte de dos aminoácidos; es esencial. Los

microorganismos lo obtienen:

En forma S.

En forma de SO42-.

En forma orgánica (aminoácidos)

REQUERIMIENTOS DE FÓSFORO: Los microorganismos lo toman a partir de fosfatos disueltos en el medio.

REQUERIMIENTO DE MACRO Y MICRONUTRIENTES: Los macronutrientes son requeridos por los

microorganismos en concentraciones de entre 10-3 y 10-4 molar. Son Ca, Na, K y Mg . Son asimilados en
forma de sales: MgSO4, CaCl2, etc.
Los micronutrientes (oligoelementos) son: Cu, Zn, Mo, Mn, Cr, Fe, etc. Y son necesarios en concentraciones
de 10-5 a 10-6 molar. Se aportan a los medios de cultivo añadiendo una solución de elementos traza.

REQUERIMIENTO DE FACTORES DE CRECIMIENTO: Los factores de crecimiento son componentes que

los microorganismos utilizan como precursores o constituyentes de su materia celular, y que pueden sintetizar
a partir de formas de carbono más sencillas.

Son esenciales y deben ser añadidos como nutrientes en función del microorganismo que cultivemos:

• Aminoácidos.

• Bases púricas y pirimidínicas.

• Vitaminas, que actúan como coenzimas de distintos complejos enzimáticos. Ej. B2 (riboflavina) es
esencial para la síntesis de FAD.

La necesidad de un factor de crecimiento se denomina auxotrofía, y la prototrofía implica que un

microorganismo no requiere ningún factor de crecimiento para desarrollarse.

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo pueden ser:

• Líquidos: Se preparan todos los constituyentes en una disolución acuosa (agua destilada). Una vez
disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor.

• Solidos: Hacemos lo mismo que para los medios líquidos, pero, al disolver en agua destilada,
añadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas petri cuando está a unos
60º. Cuando alcance los 50º, ya será sólido.

• Semisólidos: Su apariencia es de gel. Sólo llevan 5 g/l de agar.

RELACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS CON EL OXÍGENO: El oxígeno, como constituyente del agua, es
esencial para todos los organismos. Sin embargo, el oxígeno molecular es requerido de diferentes maneras
por los microorganismos:
MICROORGANISMOS AEROBIOS: El oxígeno actúa como aceptor final de electrones en la respiración
aeróbica. Existen dos grupos de organismos aeróbicos:

• Aerobios estrictos. Requieren oxígeno en concentraciones similares a la atmosférica (20%)

• Aerobios microaerófilos. Requieren oxígeno en concentraciones inferiores a las de la atmósfera; 5-
10%. Presentan enzimas como la hidrogenasa, que son activadas por las presiones parciales del
oxígeno. La hidrogenasa proporciona energía para crecer. En concentración atmosférica, la
hidrogenasa no se activa y la célula no crece y muere.

MICROORGANISMOS ANAEROBIOS: Son aquellos organismos que no requieren oxígeno. Distinguimos

entre:

• Anaerobios facultativos. Crecen en ausencia y en presencia de oxígeno, pero crecen mejor con
oxígeno. En ausencia, realizan la fermentación, y en presencia, la respiración aeróbia. Esta última es
mucho más rentable, y por ello crecen mejor.

• Anaerobios estrictos. Aquellos que, no solo no requieren oxígeno, sino que su presencia los
destruye. Su metabolismo no requiere oxígeno, o realizan fermentación o respiración anaerobia.

• Anaerobios aerotolerantes. Aquellos que no requieren oxígeno pero lo toleran; no mueren en su

presencia. Son microorganismos fermentativos, y se diferencian de los facultativos en que no crecen
más con oxígeno.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS ESTRICTOS: En placas petri sobre medios sólidos. La

superficie del medio de cultivo está en contacto con el oxígeno atmosférico, luego no hay ningún problema
para cultivar este tipo de microorganismos. En medio líquido, el microorganismo crece en la disolución, donde
la concentración de oxígeno es menor, y disminuye en función del crecimiento del microorganismo. Para evitar
esa disminución de oxígeno, utilizamos dos recursos: Agitación y Adición de aire u O2 estéril mediante
burbujeo
CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS ESTRICTOS: En medio líquido, añadimos al medio de
cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el agua y forman H2o. Estos agentes son cisteína o
tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es bombeando CO2 o N2 libre de 02 al medio, mediante burbujeo. En
medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas-Pak. Su tamaño es similar al de un termo. En
su interior se colocan las placas petri invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermética. En la parte
inferior hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis, introducimos sobres de anaerobiosis,
que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxígeno
presente se reduce a agua. Para verificar la anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una tira de papel
impregnada con azul de metileno. En condiciones aeróbicas, la tira es azul, pero sino, es transparente. En la
tapa hay un manómetro con el que medimos la presión interna, ya que se están desprendiendo CO2 y H2.

MEDIOS DE CULTIVO: En función de su composición, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:

• Medios sintéticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias
orgánicas e inorgánicas puras disueltas en agua destilada.

• Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composición

indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril...
La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que
podemos cultivar en él gran número de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo
que el microorganismo está consumiendo. Ejemplos:

Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua

Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS ENRIQUECIDOS: Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo

normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos
de tejidos animales... Estos medios son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos
son microorganismos exigentes o fastidiosos.Ejemplo: agar-sangre.

MEDIOS SELECTIVOS: Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado
tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram +. Otra manera es
modificar la fuente de carbono; si sustituimos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos
microorganismos capaces de digerirla.

MEDIOS DIFERENCIALES: Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que
determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera determinada.

Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten diferenciar a las
colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde claro, mientras
que enterobacter forma colonias de color rosa salmón.

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares. Es un medio específico para enterobacterias.
Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hace que sólo se desarrollen las gram - que puedan
tolerar estas sales; las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e incoloro a pH
básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa.

Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla, libera ácidos, por lo
que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella no tolera la lactosa, por lo que no formará
ácidos y formará colonias incoloras.

CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIÓN: Los microorganismos en estado natural crecen de forma
heterogénea o mixta. Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo.

Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos
consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos
para obtenerlas:

MÉTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRÍA

Necesitamos:

• Placa petri con medio de cultivo

• Muestra (sólida o líquida)

• Asa de siembra de platino

Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de
siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de
siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la
operación.

Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte
de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún.

Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.

MÉTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS

Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo,
generen colonias aisladas. Metodología:

Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo. Con un asa de
vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 ºC durante 24 horas.

En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos número de
colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas.

Este método nos permite calcular el número de microorganismos viables que existen en la muestra que
estamos analizando:

N=C · 1/D · 1/i donde:

N es el número de microorganismos presentes en la muestra

C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)

D es la dilución

I es el inóculo

Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una contaminación)
y, si hay más, no están aisladas.

TÉCNICA DEL CULTIVO POR ENRIQUECIMIENTO

Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar.
Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a
la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas.

Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de
carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoautótrofos.

Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37º, mientras que para incubar otra
enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45º.

CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PUROS

ALMACENAMIENTO A TEMPERATURAS BAJAS: Ponemos las bacterias con glicerol al 20 - 50% a -70º y
podemos mantenerlas así durante años, décadas...

LIOFILIZACIÓN: Es un método más eficaz. En un vial de liofilización ponemos leche desnatada y las
bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilización.

La liofilización es una evaporación por condensación. Se basa en el punto triple del agua; podemos pasar de
sólido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y
podemos almacenar el cultivo durante décadas.

COLECCIONES DE CULTIVO: En todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan
colecciones de cultivos puros o tipo. En España existe la C.E.C.T (Colección española de cultivos tipo), que
está en Valencia. La más grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).